本发明属于生物能源领域和 /或微藻生物技术领域， 涉及一种微藻培养方法， 尤其是 快速积累微藻胞内生物活性物质， 特别是油脂和叶黄素的方法。 背景技术

微藻能源发展前景广阔、 优势独特已获国内外公认。 迄今， 世界各国在该领域的研 发工作还停留在实验研究和中试论证的起步阶 段（李元广、 谭天伟、 黄英明， 微藻生物 柴油产业化技术中的若干科学问题及其分析， 中国基础科学， 2009， 5， 64-70 ) ， 但均 遇到技术不成熟而导致成本高这一瓶颈， 因而微藻能源在全球尚未实现规模化制备。

掌握能源微藻的高效培养模式是实现微藻能源 规模化制备的基础。 现有生长快的藻 种一般油脂含量较低， 而含油量高的藻种生长大多比较缓慢。 这一矛盾是能源微藻高效 培养模式开发的现实障碍。 微藻培养包括自养、 异养和混合营养三种模式 （Yanna Liang, Nicolas Sarkany, Yi Cui. Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions. Biotechnology Letters, 2009, 31 : 1043-1049 )。异养培养模式 (Han Xu, Xiaoling Miao, Qingyu Wu. High quality biodiesel production from a microalga Chlorella protothecoides by heterotrophic growth in fermenters. Journal of Biotechnology, 2006, 126:499-507 )存在 "不能直接利用太阳能、不能固定 C0 ₂ 、 能耗大"等问题， 因而难以用于能源微藻的大规模培养。 美国 1998年的 ASP计划工作 总结报告指出： 相对低成本的开放式光自养培养是最有前景的 培养模式 （Sheehan J, Dunahay T, Benemann J, et al. A Look Back at the U. S. Department of Energy's Aquatic Species Program—- Biodiesel from Algae. National Renewable Energy Laboratory, 1998 ) 。 但 是， 开放式光自养存在的 "培养密度低、 易被污染、 水分蒸发、 受环境因素影响大"等 问题， 也使其难以满足能源生产的规模需求。

针对开放式光自养培养存在的问题， 人们试图采用封闭式光生物反应器进行微藻的 光自养培养。封闭式光生物反应器包括管道式 、平板式、柱式等（Ogbonna J C, Tanaka H. Industrial- size photobioreactors. Chemical technology, 1997, 27(7):43~49 )，虽然具有细胞密 度高、 生长快等优点， 但由于成本高、 放大技术不成熟等原因， 目前尚未应用于微藻的 大规模培养。

此外， 近年来人们试图采用封闭式光生物反应器和开 放池组合进行微藻的光自养培 养： 即先利用密闭式光生物反应器实现微藻的高密 度培养， 再利用开放池降低生产成本。 该模式基本具备 "可利用太阳能、 高密度、 固定 co ₂ 、 低成本、 高效" 的特征， 但如何 实现全过程的有效控制和系统工程优化， 还有待深入研究。

学者公认能源微藻培养模式应具备 "可利用太阳能、 高密度、 固定 co ₂ 、 低成本、 高效" 的特征， 为实现这一目标， 研究者先后又探索推出了 "混合营养"、 "先自养， 后异养"等培养模式：

( 1 ) 混合营养模式： 是指藻细胞利用光和有机物作为能源、 再利用有机物和无机 物作为碳源的培养方式 （Lee YK, Ding SY, Hoe CH, Low CS. Mixotrophic growth of Chlorella sorokiniana in outdoor enclosed photobioreactor. Journal of applied phycology, 1996, 8: 163-169)。在微藻的混合营养培养过程中，微藻� ��光合自养和化能异养可以同时进行。 该模式可以通过与富含碳、 氮等有机物废水处理结合而降低生产成本， 但其最大问题是 大规模培养过程中容易滋生大量杂菌， 难以实现微藻的高密度培养。

(2) "先自养， 后异养"模式： 是先利用密闭式光生物反应器自养以固定 C0 ₂ ， 后进行异养培养 ( Xiong W, Gao C, Yan D, et al. Double C0 ₂ fixation in photosynthesis - fermentation model enhances algal lipid synthesis for biodiesel production. Bioresource Technology, 2010, 101 :2287-2293 ) 。 该模式存在的最大问题是光诱导培养过程放大 后无 法 ί故至 lj无菌培养 ( Scott SA, Davey MP, Dennis JS, et al. Biodiesel from algae: challenges and prospects. Current Opinion in Biotechnology, 2010,21 : 1-10) ， 由于微藻的异养培养要求藻 种必须不带任何杂菌， 因此该模式无法放大， 不具有规模化应用价值。

叶黄素在医药和保健品、 食品和饲料、 化妆品及水产养殖行业等方面广泛的应用前 景， 使许多国内外研究机构和公司对叶黄素的生物 合成、 分离提取、 生理生化功能等进 行研究。 目前， 叶黄素主要从万寿菊、 金盏花等植物中提取获得， 但是利用这些植物生 产叶黄素存在着某些缺点。 首先， 叶黄素在这些植物中主要是酯化形式存在， 因此从万 寿菊、 金盏花等植物中提取叶黄素时需要进行皂化处 理， 该步骤不但降低了效率和收率， 同时残余的皂化剂容易污染叶黄素产品， 给纯化过程增加了难度。 其次， 种植万寿菊、 金盏花等植物需要大量的土地， 这些植物的生长周期一般为 3~4个月 （相对于可快速生 长的微藻而言， 周期太长） 。

相比较而言， 利用微藻来生产叶黄素具有某些优势。 首先叶黄素在微藻中主要是以 游离的形式存在， 因此在生产过程中不需要皂化步骤； 其次， 微藻的生长周期短、 生产 设备占地面积小， 同时利用微藻生产叶黄素不受季节、 气候及地域条件限制， 产品质量 和产量相对稳定； 最后， 微藻 （如小球藻等） 本身就是一种高价值的产品， 含有大量的 蛋白质、 油脂、 多糖等活性成分， 可以分离提取这些物质， 实现微藻细胞的综合利用。 此外， 微藻能源的产业化开发也迫切需要实现藻体的 资源化利用。 微藻提油后的非油脂 组分中含有丰富的色素、 蛋白质和多糖等生物活性物质， 可被开发成为医药、 食品及饲 料添加剂等高附加值产品。 通过对藻渣的高值化利用 （如提取叶黄素） ， 不仅可以实现 微藻细胞的综合利用， 还能够提高微藻能源生产过程的综合经济效益 和环保效益， 降低 微藻能源的生产成本。

至今， 利用微藻产叶黄素的培养模式主要有光自养和 异养两种。 微藻光自养培养的 缺点是微藻细胞生长速度慢、 细胞密度及叶黄素产率低。 目前光自养培养微藻的叶黄素 最高体积产率为 Sanchez J F等在 2L圆柱式光生物反应器中培养 Scenedesmus almeriensis 所获得的 4.8mg/L/d ( Sanchez J F, Fernandez-Sevilla J M, Acien F G.， et al. Biomass and lutein productivity of Scenedesmus almeriensis: influence of irradiance, dilution rate and temperature. Appl Microbiol Biotechnol , 2008, 79:719-729) ， 叶黄素的最高面积产率为 Fernandez等在 4000L管道式反应器中培养 Scenedesmus almeriensis所达到的 290mg/m2/d

( Del Campo J A, Mercedes Garcia Gonzalez, Guerrero M G. Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74: 1163-1174) 。

微藻异养培养的优点是微藻能够在生物反应器 中进行高密度培养， 细胞生长速率 快， 但存在细胞内叶黄素、 叶绿素等色素和蛋白质含量低等缺点。 异养培养能够获得高 细胞密度和高细胞生长速度， 从而使得叶黄素的产率相对于光自养培养有很 大提高。

微藻除异养培养和光自养培养模式外， 还有一种不常用的培养模式即混合营养培 养。 迄今， 微藻培养产叶黄素的最高体积产率 （145mg/L/d) 和胞内叶黄素的最高含量

( 7.6mg/g) 均是在连续光照的混合营养培养条件下获得的 （Martin, Lucia. Process for obtaining lutein from algae. EP180843A1, 2007) 。 但该培养模式只能在可蒸汽灭菌的封闭 式光生物反应器中进行， 且培养过程必须保证绝对的无菌， 同时需要光源的合理配置， 这在实际生产中无法实现。 因此， 利用混合营养模式培养微藻生产叶黄素不具有 产业化 价值。

由上述可见， 无论是采用光自养培养模式还是异养培养模式 ， 较低的胞内叶黄素含 量和叶黄素产率， 同时加上微藻大规模培养较高的成本， 制约了应用微藻培养来生产叶 黄素的产业化进程。 因此， 有必要探索新的微藻培养工艺或方法使叶黄素 产率及含量大 幅度提高， 同时又使微藻大规模培养的成本大幅度下降， 这样才能够满足利用微藻培养 产叶黄素的产业化要求。

综合上述几种微藻培养模式的优缺点， 本发明设计了一种 "异养 -稀释 -光诱导串联 培养"模式， 该模式满足了 "可利用太阳能、 高密度、 固定 C0 ₂ 、 低成本、 高效" 的要 求。 以小球藻为例， 其流程如下： 首先利用生物反应器异养培养小球藻以获得高 密度细 胞， 待培养液中有机碳源消耗完毕后， 用不含有机碳源的培养基稀释藻液， 经短时间内 ( 8~24h) 的光照诱导， 使藻细胞内的油脂和 /或叶黄素快速大量积累。 该模式中的异养 阶段是在摇瓶、 机械搅拌式、 气升式、 鼓泡式等可异养培养的生物反应器中进行， 目的 是为了在短时间内获得较高密度的细胞； 光诱导阶段可在任何可用于微藻光自养培养的 系统中进行， 目的是通过光诱导作用提高胞内油脂和 /或叶黄素的含量； 异养阶段与光诱 导阶段分开独立进行， 异养阶段放出的藻液先用光诱导培养基进行稀 释后再转入光诱导 培养阶段。 过程中需确保进入光诱导阶段的藻液中不含有 机碳源， 这样可避免光诱导阶 段滋生过多的杂菌； 而通过稀释作用可以确保光诱导阶段的藻细胞 能获得充足的光照， 实现胞内油脂和 /或叶黄素含量的快速提高。 该模式和上述其他模式相比， 具有生产效率 高、 不存在因不同系统的组合而造成的异养培养过 程染菌问题 （光自养培养过程有杂菌 并不影响生长） 、 所用培养系统的组合方式灵活和生产成本低等 优点， 可充分发挥小球 藻在光诱导阶段油脂和 /或叶黄素快速积累的优势， 本发明为解决生物柴油规模化制备过 程中的原料不足的瓶颈、 源于微藻的叶黄素产业化以及微藻能源和藻渣 高值化利用耦合 降低生产成本等问题提供了重要的技术手段。 发明内容

本发明提供一种微藻培养方法， 该方法包括微藻异养培养的步骤， 和将异养培养所 获得的微藻培养液稀释后进行光诱导培养的步 骤。

本发明还提供一种快速积累微藻胞内油脂的方 法， 该方法包括微藻异养培养的步 骤， 将异养培养所获得的微藻培养液稀释后进行光 诱导培养的步骤， 以及任选的藻细胞 采收、 油脂分离提取的步骤。

本发明还提供一种微藻油脂的生产方法， 该方法包括微藻异养的步骤， 将微藻的异 养培养液稀释后进行光诱导培养的步骤， 以及藻细胞采收、 油脂分离提取的步骤。 该方 法能够实现胞内油脂的快速积累， 具有占地面积少、 面积产率高、 相对微藻光自养而言 因细胞密度高而带来的采收成本低 （光诱导时的细胞密度较高， 一般为 2~5 g/L) ， 因而 大大提高了生产效率， 降低了生产成本。

本发明还提供一种快速积累微藻胞内叶黄素的 方法， 该方法包括微藻的异养培养步 骤， 将所获得的微藻异养培养液稀释后进行光诱导 培养的步骤， 以及任选的藻细胞采收、 叶黄素分离提取的步骤。

本发明还提供一种源于微藻的叶黄素生产方法 ， 该方法包括微藻异养的步骤， 将微 藻的异养培养液稀释后进行光诱导培养的步骤 ， 以及藻细胞采收、 叶黄素分离提取的步 骤。 本发明的方法能够实现胞内叶黄素的快速积累 ， 大大提高了生产效率， 降低了生产 成本， 且提供了高品质的叶黄素。

在一个具体实施方式中， 所述的微藻选自： 绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻 ( Chlorella pyrenoidosa) ， 普通小球藻 ( Chlorella vulgaris ， #有圆小球藻 ( Chlorella ellipsoidea)， Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella saccharophila, Chlorella regular is, Chlorella minutissima, Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis, 以及绿 藻门中的 Brachiomonas submarina， Chlamydobonas reinhardtii， Chlamydomonas acidophila, Haematococcus pluvialis , Haematococcus lacustris, Scenedesmus obliquus , Spongiococcum exetriccium Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum; 藻门的 Cylindrotheca fusiformis, Nitzschia laevis , Nitzschia alba, Nitzschia fonticola, Navicula incerta, Navicula pelliculosa 蓝藻门 的 Anabaena variabilis; 金藻门的 Poterioochromonas malhame is; 甲藻门的 Amphidinium carterae， Crypthecodinium cohnii； 裸藻门的 Euglena gricilis； 红藻门的 Galdieria sulphur aria

在一个具体实施方式中， 所述微藻选自绿藻门小球藻属的藻类。 尤其是， 所述微藻 选自绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻 Ch re py idoscd， 普通小球藻 ( Chlorella vulgaris)， ( Chlorella ellipsoidea ， Chlorella enter onii, Chlorella sorokiniana, Chlorella saccharophila, Chlorella regular is, Chlorella minutissima, Chlorella protothecoides 禾口 Chlorella zofingiemis

在一个具体实施方式中， 所述微藻选自蛋白核小球藻 Ch rena pyrenoidoscO ， 普 通小球藻 ( Chlorella vulgaris) 禾口椭圆小球藻 ( Chlorella ellipsoidea) 。

在一个具体实施方式中， 所述微藻异养的步骤包括： 在生物反应器中加入 pH 为 4.0 10.0的培养基， 按工作体积的 0.1~30%接入微藻藻种进行分批培养、 补料分批培养、 连续培养或半连续培养， 培养温度为 10~50°C， 控制 pH小于 10.0， 控制溶氧在 1 %以上。

在另一具体实施方式中， 例如， 在生产叶黄素的实施例中， 所述微藻异养培养的步 骤可包括： 在生物反应器中加入 pH为 4.0 10.0 (例如 4.0〜9.0 ) 的培养基， 按工作体积 的 0.1~30%接入微藻藻种进行分批培养、 补料分批培养、 半连续培养或连续培养， 培养 温度为 10~50°C (例如 10〜40°C ) ， 控制 pH小于 10.0 (例如， 小于 9.0 ) ， 控制溶氧在 1 %以上。

在一个具体实施方式中， 所述藻液稀释包括用培养基将异养获得的藻液 稀释至细胞 密度为 0.1 50克 /升， 所述培养基不含有机碳源， 其 pH为 4.0 10.0。

在另一具体实施方式中， 例如， 在生产叶黄素的实施例中， 所述藻液稀释可包括用 培养基将异养获得的藻液稀释至细胞密度为 0.1 20克 /升， 所述培养基不含有机碳源， 其 pH为 4.0~9.0。

在一个具体实施方式中， 所述光诱导培养包括将稀释后的藻液转入光诱 导装置中进 行光诱导， 连续光照或间歇光照， 培养温度为 5~50°C， 光照强度为 0.1~150kk， 光诱导 培养周期为 1 150小时。

在一个具体实施方式中， 异养培养基由氮源、 有机碳源以及少量无机盐、 微量元素 和水组成； 光诱导培养基由氮源、 无机盐和水组成。

在一个具体实施方式中， 所述异养步骤在摇瓶、 机械搅拌式、 气升式或鼓泡式可异 养培养的生物反应器中进行，所述光诱导培养 步骤在摇瓶或选自敞开式的跑道池或圆池、 封闭式的平板式光生物反应器或管道式光生物 反应器或柱式光生物反应器或薄膜立袋与 吊袋光生物反应器等任何可用于微藻光自养培 养的装置中进行， 光照条件为自然光或人 工光照射。

在一个具体实施方式中， 例如， 在产油脂的实施例中， 当小球藻为普通小球藻时， 异养所使用的培养基基本上由以下成分组成： KN0 ₃ 5-15克 /升、 葡萄糖 10~60克 /升、 KH ₂ P0 ₄ 0.3-0.9克 /升、 Na ₂ HP0 ₄ '12H ₂ 0 1.0-10.0克 /升、 MgS0 ₄ '7H ₂ 0 0.2-1.0克 /升、 CaCl ₂ 0.05~0.3克 /升、 FeS(V7H ₂ 0 0.01 0.05克 /升； 微量元素 0.5~4ml， 其中微量元素的组成为 H ₃ B0 ₃ 5-15 克 /升， ZnS0 ₄ '7H ₂ 0 5.0-10.0 克 /升， MnCl ₂ 'H ₂ 0 1.0-2.0 克 /升， ( Η ₄ ) ₆ Μο ₇ 0 ₂₄ ·4Η ₂ 0 0.5-1.5克 /升， CuS0 ₄ '5H ₂ 0 1.0-2.0克 /升， Co(N0 ₃ ) ₂ '6H ₂ 0 0.1-0.9克 / 升； 水。 在一个具体实施方式中， 当小球藻为蛋白核小球藻时， 异养所使用的培养基基 本上由以下成分组成： 葡萄糖 10~60 克 /升， 尿素 2~8 克 /升， KH ₂ P0 ₄ 1-2 克 /升， Na ₂ HP0 ₄ -12H ₂ 0 1.0-10.0克 /升， MgS0 ₄ '7H ₂ 0 1-2克 /升， CaCl ₂ 0.05-0.1克 /升， 柠檬酸三 钠 0.1~2.0克 /升， Fe-EDTA溶液 0.5~1 mL, A5溶液 l~5mL; 其中 Fe-EDTA溶液配方为 FeS0 ₄ -7H ₂ 0 20-30克 /升和 EDTA 20-40克 /升； A5溶液配方为 H ₃ B0 ₃ 2.5-4.0克 /升， MnCl ₂ -4H ₂ 0 1.0-2.0克 /升， ZnS0 ₄ '7H ₂ 0 0.1-0.6克 /升， CuS0 ₄ '5H ₂ 0 5-10克 /升， Na ₂ Mo0 ₄ 0.01-0.05克 /升； 水。

在另一具体实施方式中， 例如在产叶黄素的实施例中， 当藻种为普通小球藻时， 异 养所使用的培养基基本上由以下成分组成: KN0 ₃ 5~15克 /升、葡萄糖 10~60克 /升、 KH ₂ P0 ₄ 0.3-0.9克 /升、 Na ₂ HP0 ₄ '12H ₂ 0 1.0-10.0克 /升、 MgS0 ₄ '7H ₂ 0 0.2-1.0克 /升、 CaCl ₂ 0.05-0.3 克 /升、 FeS(V7H ₂ 0 0.01-0.05克 /升、微量元素 0.5~4ml和水，其中微量元素的组成为 H ₃ B0 ₃ 5~15克 /升、 ZnS0 ₄ '7H ₂ 0 5.0~10.0克 /升、 MnCl ₂ 'H ₂ 0 1.0~2.0克 /升、 （ Η4) ₆ Μο ₇ 0 ₂₄ ·4Η ₂ 0 0.5-1.5克 /升、 CuS0 ₄ '5H ₂ 0 1.0-2.0克 /升和 Co(N0 ₃ ) ₂ '6H ₂ 0 0.1-0.9克 /升。

在一个具体实施方式中， 例如在产叶黄素的实施例中， 当小球藻为蛋白核小球藻时， 异养所使用的培养基基本上由以下成分组成： 葡萄糖 10~60克 /升、尿素 2~8克 /升、 KH ₂ P0 ₄ 1~2克 /升、 Na ₂ HP0 ₄ '12H ₂ 0 1.0~10.0克 /升、 MgS0 ₄ '7H ₂ 0 1~2克 /升、 CaCl ₂ 0.05-0.1 1 升、 柠檬酸三钠 0.1~2.0克 /升、 Fe-EDTA溶液 0.5~1 mL、 A5溶液 l~5mL和水； 其中 Fe-EDTA溶液配方为 FeS(V7H ₂ 0 20-30克 /升和 EDTA 20-40克 /升； A5溶液配方为 H ₃ B0 ₃ 2.5-4.0克 /升、 MnCl ₂ '4H ₂ 0 1.0-2.0克 /升、 ZnS0 ₄ '7H ₂ 0 0.1-0.6克 /升、 CuS0 ₄ '5H ₂ 0 5-10克 /升和 Na ₂ Mo0 ₄ 0.01-0.05克 /升。

在一个具体实施方式中， 采用超临界 co ₂ 萃取法、 有机溶剂提取法或超声辅助溶剂 提取法提取叶黄素。

在一个具体实施方式中， 本发明的方法还包括： 将提取叶黄素后的藻体与其他色素 混合进行喷雾干燥制成藻粉， 或对藻体中的生物活性物质进行分离提取。

在一个具体实施方式中， 所述其他色素包括叶绿素。 在一个具体实施方式中， 所述 生物活性物质包括蛋白质、 叶绿素、 多糖、 脂肪酸、 小球藻生长因子等。

在一个具体的实施方式中， 所述油脂分离提取方法采用有机溶剂提取法。

在另一具体实施例中， 所述微藻培养方法还包括提取微藻油脂的步骤 。

本申请还提供一种油脂生产方法， 该方法包括异养培养微藻的步骤， 将异养培养的 微藻藻液稀释后进行光诱导培养的步骤， 以及藻细胞采收、 油脂分离提取的步骤。

本申请的油脂生产方法中使用到的微藻、 培养基以及培养条件等如本文上文以及下 文具体实施方式部分所详述。

用本发明公开的异养-稀释-光诱导串联技术培� ��小球藻， 首先在密闭式生物反应器 中高密度异养培养小球藻， 待培养液中有机碳源消耗完毕后， 用不含有机碳源的培养基 稀释藻液， 经短时间内 （8~24h) 的光照诱导， 可使藻细胞内的油脂含量快速大量积累， 油脂含量在短时间内 （例如 8~24小时） 比异养阶段的藻细胞提高约一倍（异养阶段胞 内 油脂含量一般不超过 10%， 经光诱导后可达 20~30%) 。 附图简述

图 1显示在 50L生物反应器 /3L平板式光生物反应器串联系统中采用异养-� �释-光 诱导串联培养蛋白核小球藻快速积累油脂的结 果 （同时测定了细胞内其他主要生化成 分） 。

图 2显示 5T发酵罐串联至户外 30L平板和 60L大盆连续培养普通小球藻光诱导阶 段户外自然光强和自然温度的变化曲线。

图 3显示 5T发酵罐串联至户外 30L平板培养普通小球藻快速积累油脂的过程曲 线 (同时测定了细胞内其他主要生化成分） 。

图 4显示 5T发酵罐串联至户外 60L大盆培养普通小球藻快速积累油脂的过程曲 线 (同时测定了细胞内其他主要生化成分） 。

图 5显示 5T发酵罐串联至户外 20m ² 跑道池和 3.14m ² 圆池连续培养普通小球藻光 诱导阶段户外自然光强和自然温度的变化曲线 。

图 6显示 5T发酵罐串联至户外 20m ² 跑道池培养普通小球藻快速积累油脂的过 程曲 线 （同时测定了细胞内其他主要生化成分） 。

图 7显示 5T发酵罐串联至户外 3.14m ² 圆池培养普通小球藻快速积累油脂的过程 曲 线 （同时测定了细胞内其他主要生化成分） 。

图 8显示 500mL摇瓶 /3L圆柱式光反应器串联培养椭圆小球藻胞内主 要生化成分的 变化曲线。

图 9和图 10显示 5L生物反应器 /3L平板式光生物反应器串联系统中采用异养-� �释- 光诱导串联培养蛋白核小球藻生产叶黄素的过 程。其中， 图 9显示蛋白核小球藻在 5L生 物反应器异养培养过程； 图 10显示蛋白核小球藻在 3L平板式光生物反应器内光诱导培 养过程。

图 11和图 12显示 50L生物反应器 /10L圆柱式光生物反应器串联系统中采用异养- 稀释-光诱导串联培养蛋白核小球藻生产叶黄� �的过程。 其中， 图 11 显示蛋白核小球藻 在 50L生物反应器异养培养过程；图 12显示蛋白核小球藻在 10L圆柱式光生物反应器内 光诱导培养过程。

图 13和图 15显示 50L生物反应器 /30L平板式光生物反应器串联系统中采用异养- 稀释-光诱导串联培养普通小球藻生产叶黄素� �过程。其中， 图 13显示普通小球藻在 50L 生物反应器中异养培养过程；图 15显示普通小球藻在户外 30L平板式光生物反应器内光 诱导培养。

图 14和图 16显示 5L生物反应器 /3L平板式生物光生物反应器串联系统中采用异 养 -稀释-光诱导串联培养椭圆小球藻生产叶黄素� ��过程。其中， 图 14显示椭圆小球藻在 5L 生物反应器异养培养过程； 图 16显示椭圆小球藻在 3L平板式光生物反应器中光诱导过 程。 具体实施方案

适用于本申请的微藻包括但不限于绿藻门小球 藻属中的蛋白核小球藻 （ Chlorella pyrenoidosa) ， 普通小球藻 ( Chlorella vulgaris ) ， #有圆小球藻 (. Chlorella ellipsoidea) ， Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella saccharophila, Chlorella regularis, Chlorella minutissima, Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis , 以及绿藻门中的 Brachiomonas submarina， Chlamydobonas reinhardtii， Chlamydomonas acidophila， Haematococcus pluvialis, Haematococcus lacustris, Scenedesmus obliquus, Spongiococcum exetriccium, Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii, Tetraselmis tetrathele , Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum-, Cylindrotheca fusiformis, Nitzschia laevis, Nitzschia alba , Nitzschia fonticola , Navicula incerta , Navicula pelliculosa； 蓝藻门的 Anabaena variabilis-, 金藻门的 Poterioochromonas malhamensis; 甲藻门的 Amphidinium carterae， Crypthecodinium cohnii； 裸藻门的 Euglena gricilis； 红藻门的 Galdieria sulphur aria ₀

在优选的实施方式中， 本发明采用绿藻门小球藻属的藻类来生产油脂 。 在更优选的 实施方式中， 本发明采用蛋白核小球藻、 普通小球藻或椭圆小球藻来生产油脂。 在优选 的实施方式中， 本发明采用蛋白核小球藻、 普通小球藻和椭圆小球藻来生产叶黄素。

1. 微藻在生物反应器中的高密度异养培养

此步骤的目的是为了快速获得大量藻细胞， 以供光诱导阶段快速合成积累各种活性 成分， 尤其包括油脂、 色素、 蛋白质、 多糖等。 可采用本领域熟知的各种培养基来进行微藻异 养培养。通常，异养培养基含有氮源、 有机碳源、 少量无机盐、 微量元素和水。 适用于微藻培养的氮源、 有机碳源、 无机盐、 微量元素等是本领域周知的。例如， 作为氮源， 可使用的有尿素或各种硝酸盐， 如 KN0 ₃ 等； 作为有机碳源， 可使用的有例如葡萄糖等。

这类培养基包括 HA-SK 培养基 （中国专利 ZL 200610024004.9 ) 、 Endo 培养基 ( Ogbonna J.C., Masui. H.， Tanaka.H. Sequential heterotrophic: autotrophic cultivation一 an efficient method of producing Chlorella biomass for health food and animal feed. J. Appl. Phycol.1997, 9, 359-366) 等。

本发明所用的 HA-SK培养基是基本上由 KN0 ₃ 、葡萄糖以及少量无机盐、微量元素 和水组成。 在所述技术方案中， 所述微量元素宜选自 H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ -7H ₂ 0, MnCl ₂ -H ₂ 0, ( Η ₄ ) ₆ Μο ₇ 0 ₂₄ ·4Η ₂ 0, CuS0 ₄ -5H ₂ 0, Co(N0 ₃ ) ₂ ·6Η ₂ 0中的一种或多种或全部。

本文所用的术语 "基本上由……组成"表示本发明的组合物中除� ��含有主要组分 KN0 ₃ 葡萄糖以及少量无机盐、 微量元素和水外， 还可包含一些对于组合物的基本特性 或新的特性 （即可维持微藻在较短的培养周期内细胞密度 达到较高的水平， 同时活性物 质含量与常规异养培养相比有较大幅度提高） 没有实质上影响的组分。 本文所用的术语 "由……组成"表示本发明的组合物由所指出的� ��体组分组成， 没有其他组分， 但是可 以带有含量在通常范围内的杂质。

在该培养基中， 培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对 微藻细胞密度和品质 有很大的实质影响。 因此， 这些组分的用量不应受实施例的严格限制。 如本领域技术人 员所熟知的， 培养基中还可加入少量无机盐， 例如硫酸镁、 氯化钙、 硫酸亚铁和磷酸盐 等， 以及少量微量元素如 Μη、 Ζη、 Β、 I、 M、 Cu、 Co等。

在本发明中， 较佳的微量元素组分宜选自 H ₃ B0 ₃ , ZnS0 ₄ -7H ₂ 0, MnCl ₂ -H ₂ 0, ( Η ₄ ) ₆ Μο ₇ 0 ₂₄ ·4Η ₂ 0, CuS0 ₄ -5H ₂ 0, Co(N0 ₃ ) ₂ -6H ₂ 0中的一种或多种。无机盐和微量元素的 用量可根据常规知识确定。

本发明所采用的 HA-SK培养基基本上由以下成分组成： KN0 ₃ 5~15克 /升、 葡萄糖 10-60克 /升、 KH ₂ P0 ₄ 0.3-0.9克 /升、 Na ₂ HP0 ₄ ' 12H ₂ 0 1.0-10.0克 /升、 MgS0 ₄ '7H ₂ 0 0.2-1.0 克 /升、 CaCl ₂ 0.05 0.3克 /升、 FeS0 ₄ '7H ₂ 0 0.01~0.05克 /升; 微量元素 0.5~4ml， 其中微量 元素的组成为 H ₃ B0 ₃ 5~15克 /升， ZnS0 ₄ -7H ₂ 0 5.0~10.0克 /升， MnCl ₂ -H ₂ 0 1.0~2.0克 /升, ( Η ₄ ) ₆ Μο ₇ 0 ₂₄ ·4Η ₂ 0 0.5-1.5克 /升， CuS0 ₄ '5H ₂ 0 1.0-2.0克 /升， Co(N0 ₃ ) ₂ '6H ₂ 0 0.1-0.9克 / 升； 水。

在一个较佳的实施方案中，本发明的 HA-SK培养基组合物宜由以下成分组成: KN0 ₃ 7克 /升、葡萄糖 40克 /升、 KH ₂ P0 ₄ 0.6克 /升、 Na ₂ HP(V 12H ₂ 0 2.0克 /升、 MgS0 ₄ '7H ₂ 0 0.8 克 /升、 CaCl ₂ 0.2克 /升、 FeS(V7H ₂ O 0.03克 /升； 微量元素 1.5mL， 其中微量元素的组成 为 H ₃ B0 ₃ 11-12 克 /升， ZnS0 ₄ -7H ₂ 0 8.5-9.5 克 /升， MnCl ₂ 0 1.4-1.5 克 /升， ( Η ₄ ) ₆ Μο ₇ 0 ₂₄ ·4Η ₂ 0 0.8-0.9克 /升， CuS0 ₄ '5H ₂ 0 1.5-1.6克 /升， Co(N0 ₃ ) ₂ '6H ₂ 0 0.45-0.55克 /升； 水 1000mL。

本发明所用的 Endo培养基基本上由以下成分组成： 葡萄糖 10 60克 /升， 尿素 2~8 克 /升， KH ₂ P0 ₄ 1-2克 /升， Na ₂ HP0 ₄ ' 12H ₂ 0 1.0-10.0克 /升， MgS0 ₄ '7H ₂ 0 1-2克 /升， CaCl ₂ 0.05~0.1克 /升， 柠檬酸三钠 0.1~2.0克 /升， Fe-EDTA溶液 0.5~1 mL， A5溶液 l~5mL; 其中 Fe-EDTA溶液配方为 FeS(V7H ₂ 0 20-30克 /升和 EDTA 20-40克 /升； A5溶液配方 为 H ₃ B0 ₃ 2.5~4.0克 /升， MnCl ₂ '4H ₂ 0 1.0~2.0克 /升， ZnS0 ₄ '7H ₂ 0 0. 〜 0.6克 /升， CuS0 ₄ '5H ₂ 0 5~10克 /升， Na ₂ MoO ₄ 0.01~0.05克 /升； 水。

在一个较佳的实施方案中， 所述 Endo培养基由以下成分组成： 葡萄糖 40克 /升， 尿 素 6.0克 /升， KH ₂ P0 ₄ 1.5克 /升， Na ₂ HP0 ₄ ' 12H ₂ 0 5.0克 /升， MgS0 ₄ '7H ₂ 0 1.8克 /升， CaCl ₂ 0.05克 /升，柠檬酸三钠 0.4克 /升， Fe-EDTA溶液 0.8mL， A5溶液 2.0mL，其中 Fe-EDTA 溶液配方为 FeS(V7H ₂ 0 25克 /升和 EDTA 33.5克 /升， A5溶液配方为 H ₃ B0 ₃ 2.86克 /升， MnCl ₂ -4H ₂ 0 1.81克 /升， ZnS0 ₄ '7H ₂ 0 0.222克 /升， CuS0 ₄ '5H ₂ 0 0.07克 /升， Na ₂ Mo0 ₄ 0.021 克 /升； 水。

在根据上述配方配制培养基后， 可用常规手段如酸或碱将所述培养基的 pH调为 4.0-9.0, 并在 115~120°C下高压灭菌 15~20分钟。 可采用分批培养、 补料分批培养、 半 连续培养 （带放） 或连续培养等四种方式实施异养培养。

当进行异养培养时， 将相应配制好的培养基加入到生物反应器中， 补加水至工作体 积，通常装料系数为 0.6 0.8，然后蒸汽灭菌（121 °C，维持约 20分钟），当温度降至 30~35 °C时， 按工作体积的 1~15%接入微藻开始异养培养。

在异养培养一段时间后， 当培养基中葡萄糖被消耗完 （通常为 27~45小时） 时需要 进行补料， 补加碳源 （如葡萄糖） 、 氮源 （如， 培养普通小球藻的氮源为 KN0 ₃ 、 培养蛋 白核小球藻的氮源为尿素） 和无机盐等营养盐， 补加的营养盐是经浓缩后的上述相应培 养基， 促使微藻继续生长。 可每隔 5~8小时补料， 葡萄糖的补加浓度可为 15 25克 /升， 氮源溶液的补加浓度可为 2~5克 /升。 当补加一定次数 （一般为 4~7次） 的营养盐后， 微 藻细胞密度达到最高时， 异养培养阶段结束。

无论采用何种培养方式， 在培养过程中， 须控制适合的培养条件使微藻正常生长。 通常， 控制温度为 20~35 °C， 例如 28~30°C， 溶氧不低于 5%的空气饱和浓度， pH不高于 9.0。 在优选的实施例中， 溶氧不低于 10%的空气饱和浓度， pH不高于 8.5。 在其它优选 的实施例中， 溶氧不低于 15%的空气饱和浓度， pH不高于 8。

在培养过程中， pH不宜过高或过低， 一般随着培养的进行， pH会慢慢上升 （对于 普通小球藻此现象特别明显） ， pH过高会对藻细胞生长产生不利影响， 所以应用酸（例 如 10 %的硫酸） 进行调节， 使 pH不高于 9.0， 较佳的 pH应为 6.5~7.5。

通常， 当采用分批培养、 补料分批培养时， 异养培养阶段结束时生物反应器中有机 碳源需完全消耗完。 当采用半连续培养方式时， 带放操作是在生物反应器中有机碳源完 全消耗完时进行。 无论采用何种异养培养方式， 转入光诱导的藻液， 在更佳的方案中应 使藻液中有机碳源例如葡萄糖含量为零或接近 于零。

异养可以在摇瓶、机械搅拌式、气升式、鼓泡 式等可异养培养的生物反应器中进行。

2. 高浓度藻液的稀释

此步骤的目的是为了使转入光诱导培养的小球 藻高效地吸收光能， 提高光能利用效 率， 同时降低藻细胞的死亡率。 因为光强在藻液中呈 "时、 空、 非线性"衰减， 所以在 高细胞密度下， 反应器中藻细胞大部分处于暗区， 几乎接受不到光照， 这样藻细胞很容 易死亡而且会影响光诱导的效率。

异养培养获得的高密度藻液应进行稀释操作， 用水和不含有机碳源的培养基对高密 度的藻液进行稀释， 使细胞密度维持在 0.1 10克 /升， 调节 pH至 5.0 8.0。 在其它实施例 中，稀释藻液，使细胞密度维持在 1~8克 /升。在优选的实施例中，使细胞密度维持在 1.0 5.0 克 /升。 在其它实施例中， 使细胞密度维持在 2~5克 /升或者 2~4克 /升。 稀释的藻液的 pH 可以调节为 5.5~7.5， 例如 6.0 7.5等。

可采用各种已知的稀释培养基来稀释藻液。 通常， 可使用光诱导培养基进行稀释。 光诱导培养基通常含有氮源、 无机盐和水， 相对于异养培养基不含有有机碳源。 在优选 的实施方案中， 所述培养基的氮源浓度为 0.1 10克 /升， 例如 2~10克 /升、 2~8克 /升， 较 佳为 0.3 6克 /升， 更佳为 0.5 5克 /升。 所述氮源可以与异养培养步骤中所用的氮源相 同 或不同。

在一个优选的具体方案中， 异养培养获得的高密度藻细胞宜用氮源浓度为 0.1 10 克 /升 （例如 2~10克 /升） 而不含有机碳源的初始培养基 （例如， 培养普通小球藻时采用 不含葡萄糖的 HA-SK培养基， 培养蛋白核小球藻时采用不含葡萄糖的 Endo培养基） 进 行适当稀释。

稀释采用的培养基无需高压灭菌， 配制好后调节 pH至 5.0 8.0即可使用。

在具体实施方式中， 对普通小球藻， 稀释培养基（光诱导培养基） 由以下成分组成：

KN0 ₃ 0.1-5 克 /升、 MgS0 ₄ -7H ₂ 0、 0.5-5.0 克 /升、 CaCl ₂ 0.01-0.06 克 /升、 FeS0 ₄ -7H ₂ 0

0.01-0.06克 /升、 EDTA 0.020 0.052克 /升。

对蛋白核小球藻， 稀释培养基 （光诱导培养基） 由以下成分组成： 尿素 0.1 5.0克 / 升、 MgS0 ₄ -7H ₂ 0、 0.5~5.0克 /升、 CaCl ₂ 0.01~0.06克 /升、 FeS0 ₄ -7H ₂ 0 0.01~0.06、 EDTA

0.020-0.052克 /升、 柠檬酸钠 0.02 0.5克 /升。

在其它实施方式中， 对普通小球藻， 稀释培养基（光诱导培养基） 由以下成分组成：

KN0 ₃ 1-8克 /升、 MgSO ₄ '7H ₂ O、0.5~1.0克 /升、 CaCl ₂ 0.01-0.06克 /升、 FeS0 ₄ '7H ₂ 0 0.01-0.06 克 /升、 EDTA 0.020~0.052克 /升； 对蛋白核小球藻， 稀释培养基（光诱导培养基） 由以下 成分组成： 尿素 0.1-2.0 克 /升、 MgS0 ₄ -7H ₂ 0、 0.5-1.0 克 /升、 CaCl ₂ 0.01-0.06 克 /升、 FeS0 ₄ -7H ₂ 0 0.01~0.06 EDTA 0.020~0.052克 /升、 柠檬酸钠 0.08~0.5克 /升。

3. 光诱导培养

该步骤的目的是让微藻接受光照， 通过光诱导使藻细胞快速大量合成积累各种活 性 成分。

如上所述高密度微藻培养液经稀释后， 将所得稀释液转入光诱导装置中进行光诱导 培养。 添加的光诱导培养基如上文所述， 温度控制在 5~50°C， 光照强度为 0.11~150kk， 连续光照或间歇光照， 光诱导培养周期为 1~150小时， 通气量为 0.1 2.0 wm。 其中所述 的光生物反应器包括所有的封闭式光生物反应 器 （摇瓶、 管道式、 平板式、 柱式、 薄膜 立袋与吊袋等） 和所有的开放式光生物反应器 （跑道池、 圆池和鼓泡式大盆等） 。

通常， 培养温度可控制在 15~35°C的范围内， 例如 18~35°C、 20-35 °C 20~30°C等。 通常， 光照强度为 l~70kk， 例如， 1~60、 1~50、 1~40、 1~30、 1~20、 l~10kk等， 可视 具体生产情况而定。通常，通气量可控制为 0.15~2.0 wm,例如， 0.2-1.8 0.5-1.5 0.8-1.5 1.0 1.5wm等。 在其它实施方式中， 培养温度控制在 10~50°C， 光照强度为 l~10kk， 通 气量为 0.05~2.0wm。

在其它实施例中， 光诱导培养周期为 8 100小时， 例如， 根据实际的天气情况， 光 诱导培养周期可以为 8~90小时、 8~80小时、 8~60小时、 8~48小时、 8~24小时不等； 或 者， 光诱导培养周期可以为 12 72小时、 12 60小时、 12 48小时、 12 36小时、 12 24 小时不等或 24 60小时、 24~48小时不等。

在本申请中， "光诱导培养周期"包括了整个光诱导培养过程� �� 例如， 户外培养 时光诱导培养周期包括夜晚没有光照的时间。

在本申请中， "光照时间"指使用本申请所述光照强度对微藻� ��施光诱导培养的时 间， 即该时间不包括夜晚没有光照的时间。 在一些实施例中， 光诱导培养步骤的光照时 间为 8-48小时， 例如 8~36小时、 8-24小时、 8-18小时、 8-12小时、 12-36小时、 12-24 小时不等， 以及上述范围内的任意时长。

因此， 本申请的光诱导培养步骤也包括光照时间为 8~48 小时范围内的光诱导培养 步骤。 可采用人工光照的方式进行光诱导培养， 也可在户外利用自然光照的方式进行光 诱导培养。

在光诱导过程中，当油脂含量达到最高值（不 同微藻油脂含量达到的最大值不一样， 可通过测定光诱导过程中胞内油脂含量曲线判 断， 小球藻一般为 20~30%左右）时可结束 光诱导培养， 收获藻细胞进行后续的油脂的分离提取。 在生产叶黄素时， 当培养液中叶 黄素浓度达到最高时， 结束光诱导培养， 收获藻细胞进行叶黄素的分离提取或直接采收 藻细胞进行藻粉制备。 4. 藻细胞采收、 油脂的提取及藻体综合利用

光诱导培养结束后， 对小球藻进行离心采收， 获得湿藻体。 藻细胞的采收方法包括 但不限于高速离心、 絮凝， 气浮或过滤等技术； 藻细胞破壁方法包括但不限于藻体自溶、 高压匀浆、 酶水解、 水相热解等湿法破壁方法。

胞内油脂的提取测定方法包括但不限于有机溶 剂萃取法， 即： 将藻体于 80~105 °C下 干燥至恒重， 研磨藻粉后采用氯仿甲醇标准萃取溶剂从干藻 粉中提取油脂， 萃取溶剂反 复提取直至藻粉颜色变为白色， 旋转蒸发去除溶剂。

小球藻内叶黄素的提取可采用传统的有机溶剂 提取法进行。 首先将有机溶剂加入到 藻泥中进行萃取， 然后进行搅拌离心获得上清液和藻体沉淀， 对上清液进行减压浓缩、 搅拌加水、 过滤获得叶黄素晶体。 在一个较佳的方案中， 采用超临界 C0 ₂ 萃取技术对小 球藻进行叶黄素的分离提取。 在一个更佳的方案中， 将获得的小球藻液浓缩后直接喷雾 干燥获得小球藻粉。 由此获得的小球藻粉可用于开发成动物饲料、 水产养殖用饵料、 食 品、 食品添加剂、 药品和营养品等。

本发明中， 可对培养所得的微藻进行综合利用， 提取其中的多不饱和脂肪酸、 蛋白 质、 叶绿素、 多糖等各种活性成分。 活性成分的提取顺序并无特殊限制， 但通常要满足 先提取的步骤不能导致后提取的成分损失这一 前提。

上清液中的其他成分可逐步分离提取获得脂肪 酸、 叶绿素等， 或直接将上清液中的 所有成分与藻体沉淀混合喷雾干燥获得小球藻 粉。 所得藻粉可用于开发成动物饲料、 水 产养殖用饵料、 食品、 食品添加剂、 药品和营养品等。

本发明中， 可对培养所得的微藻进行综合利用， 提取其中的色素、 蛋白质、 多糖等 各种活性成分。 活性成分的提取顺序并无特殊限制， 但通常要满足先提取的步骤不能导 致后提取的成分损失这一前提。

本文中涉及到藻细胞干重、 油脂含量及胞内生化成分的测定方法如下：

藻细胞干重测定： 在微藻（如小球藻）培养过程中取培养液 V毫升， 8000 rpm离心 10分钟， 将离心后的藻体用去离子水洗涤 3次， 转移至称量瓶 （Wi (克） ） 中， 在 105 °C烘箱中烘干至恒重 W ₂ (克） 。 藻体干重 Cx可根据下式计算： Cx (克 /升） = (W ₂ -Wi ) /V/lOOOo

油脂测定： 取一定量各培养阶段烘干至恒重的藻细胞， 在研钵中研磨至粉末状， 称 取适量藻粉 （0.2 0.5 g) 小心转移至离心管中， 加入适量萃取溶剂 （氯仿：甲醇 =2: 1 ) 于 超声振荡器中超声振荡 30min， 8000rpm离心 10min， 将上清转移至已知重量的干燥旋转 蒸发瓶中， 重复上述步骤直至上清无色。 合并上清后旋转蒸干， 称重并计算油脂含量。

油脂含量 （％) 按下式计算：

油脂 （％) = (W ₂ -W。） / Wi X 100 式中： ——为藻粉重量， g; Wo——为烘干至恒重的旋转蒸发瓶重量， g; W ₂ —— 为油脂萃取液蒸干后蒸发瓶的重量， g。

碳水化合物的测定： 参照药典 2005版， 选择蒽酮-硫酸显色反应， 采用无水葡萄糖 作为对照品， 用比色法在 625nm处测定。

蛋白质含量测定：微藻（如小球藻）细胞中总 蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法（宁 正祥. 食品成分分析手册. 北京： 中国轻工业出版社， 1998, 76-78) 。

叶绿体色素含量测定： 微藻 （如小球藻） 叶绿体色素含量测定采用 Lichtenthaler等 对 Arnon法进行了修正后的方法 (Lichtenthaler HK, Wellburn AR. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different sovents. Biochemical Society Transactions, 1983, 11 :591-592) 。

灰分测定： 微藻 （如小球藻） 灰分采用 550°C灼烧至恒重测量， 即国标 GB6438-86 法。

叶黄素测定：采用高效液相色谱法（HPLC)，具� ��操作步骤见文献（Zheng Yun Wu, Chun Lei Shi et al. Modeling of lutein production by heterotrophic Chlorella in batch and fed-batch cultures. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2007, 23: 1233-1238) 。 与现有的能源微藻培养积累油脂的方法相比， 本发明的方法具有以下优点： 可在短 时间内获得高密度的微藻细胞， 同时可在短时间内使微藻细胞内的油脂含量快 速提高。 本发明将微藻培养合成油脂分成藻细胞生长和 油脂合成积累两个阶段， 即异养培养和光 诱导培养阶段。 异养培养微藻的目的是为了快速获得大量的藻 细胞， 而光诱导培养的目 的是为了诱导微藻细胞快速合成积累大量的油 脂，采用异养-稀释-光诱导串联培养方式培 养微藻提高了油脂的产率， 一定程度上解决了能源微藻细胞生长和油脂合 成不同时进行 的矛盾， 大大降低了成本， 为解决生物燃料规模化制备过程中由于原料不 足而导致的成 本过高问题提供新的技术手段。

此外， 本申请之前， 本领域的普遍认识是只有通过光自养的模式才 能够利用微藻来 大规模生产油脂。 然而， 光自养培养与本发明的光诱导培养完全不同。 光自养培养中， 培养基不含有有机碳源， 微藻利用大气中的 C0 ₂ 、 水、 光、 和少量无机营养盐进行光合 自养， 维持自身的生长， 一般接种密度较低 （ 0.1g/L左右） ， 生长慢 （有时候为了促进 生长， 还需要在培养过程中人工通入 C0 ₂ ) ， 培养周期长 （一般要一周以上， 户外光自 养培养细胞密度难以达到较高水平） ， 尤其在大规模培养的时候， 为了提供大规模培养 所需的接种藻液， 种子扩培需要的时间很长 （一般需要 1-2个月） ， 生产效率很低。 而 本申请的光诱导所用的培养基和光自养的培养 基不一样， 由于异养阶段藻液中含有丰富 的无机盐和微量元素等营养成分， 所以经过稀释后， 所需的光诱导培养基比光自养培养 基要简单很多， 例如和文献上常见的微藻光自养培养基 BG-11相比， 稀释用的光诱导培 养基中不需要添加磷酸盐、 碳酸钠、 柠檬酸铁铵以及微量元素， 同时添加的硝酸盐用量 也比光自养培养基用量要少很多。 通过异养阶段的培养， 可以在短时间内积累大量藻细 胞， 规模化培养时， 通过稀释后， 进入光诱导的藻细胞密度 （以小球藻为例， 密度范围 在 2~5g/L左右） 比光自养培养方式的接种密度要高 20倍以上， 很好的解决了光自养培 养方式接种密度低， 种子扩培周期长等缺点， 同时在较短时间的光照诱导周期内 （一般 8~24小时） ， 藻细胞密度几乎维持不变 （即它已经不再生长） ， 胞内油脂含量却能够快 速积累， 含量成倍增长（由 10%增加到 20~30%左右） ， 这样相对光自养而言， 占地面积 大大缩小， 面积产率大幅提高， 整个培养周期明显缩短， 采收成本降低， 生产效率大大 提高。

同样地， 迄今， 微藻培养产叶黄素的最高体积产率 （145mg/L/d) 和胞内叶黄素的 最高含量（7.6mg/g)均是在连续光照的混合营养� ��养条件下获得的（Martin, Lucia. Process for obtaining lutein from algae. EP180843A1, 2007)。但该培养模式只能在可蒸汽灭菌的封 闭式光生物反应器中进行， 且培养过程必须保证绝对的无菌， 同时需要光源的合理配置， 这在实际生产中无法实现。 因此， 利用混合营养模式培养微藻生产叶黄素不具有 产业化 价值。

本发明将微藻培养法生产叶黄素分成藻体生长 和产物 （叶黄素）积累两个阶段， 即 异养培养和光诱导培养。通过异养培养可在短 时间内获得大量的可产叶黄素的微藻细胞， 藻液稀释后转入光诱导培养， 藻体内叶黄素含量迅速提升至初始的两倍甚至 两倍以上。 本发明具有如下优势： （1 ) 光诱导的藻细胞密度很高 （2~10g/L) ， 是常规光自养培养 藻细胞密度 （约 0.2~lg /L) 的 10倍左右； （2) 光诱导时间很短 （约 ld~2d) ， 而微藻 光自养培养时间很长 （约 7d~14d) ， 因此， 叶黄素的生产效率大为提高； （3 ) 相对于 微藻光自养培养， 光诱导时较高的藻细胞密度使得光诱导所需的 占地面积很小， 同时高 细胞密度使得采收成本大幅度降低； （4)异养培养几乎不受气候、 天气的影响， 光诱导 培养可以在玻璃房内， 自然光照或人工光照条件下进行， 因而， 采用本发明的方法可以 实现叶黄素的连续生产； （5 )对富含油脂和叶黄素的藻体进行分步提取， 实现微藻能源 和高附加值产品开发的耦合和藻体的资源化利 用， 可获得额外的产品和经济效益， 降低 了微藻能源的生产成本。

以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一 步的说明。 除非另有所述， 本发明采 用的培养基中各组分含量均用克 /升 (g/L)表示。 应理解， 本申请中 "含有" 、 "包含"也 包括 "由……组成"、 "由……构成" 的含义。 实施例 1

在 50L生物反应器中加入下述异养培养基和自来水 至 25L后灭菌， 当温度降至 30 °。时按工作体积的 12%接入蛋白核小球藻， 开始异养培养。 异养培养条件： 温度为 30°C， 初始转速为 150r/min， 空气流量为 lvvm， pH小于 8.0， 培养过程中通过调节转速控制溶氧 15%以上。

将异养培养过程中葡萄糖耗完的高密度藻液稀 释到 2.70g/L左右， 并加入下述光诱 导培养基， 转入 3L平板式光反应器中进行光诱导培养， 温度 30°C， 光强 8000k， 空气 流量为 lvvm。光诱导培养 12h， 细胞密度从 2.70 g/L降低到 2.65 g/L, 油脂含量从 9.70% 上升至 19.70% (见图 1 ) 。

异养培养基： 葡萄糖 60.0克， 尿素 8.0克， MgS0 ₄ · 7H ₂ 0 2.0克， KH ₂ P0 ₄ 1.1克， Na ₂ HP0 ₄ · 12H ₂ 0 9.0克， CaCl ₂ 0.02克，柠檬酸三钠 1.8克， Fe-EDTA溶液 1.0ml 微 量元素溶液 4.5ml， 和水 1000ml; 其中 Fe-EDTA溶液配方为 FeS0 ₄ · 7H ₂ 0 15克 /升和 EDTA1.4 克 /升， 微量元素溶液配方为 H ₃ B0 ₃ 2.11 克 /升， MnCl ₂ · 4¾0 0.81 克 /升， ZnS0 ₄ · 7H ₂ 0 0.11克 /升， CuS0 ₄ · 5H ₂ 0 10.0克 /升， Na ₂ Mo0 ₄ 0.05克 /升。

光诱导培养基： 尿素 0.5克， MgS0 ₄ '7H ₂ 0 1.0克， 柠檬酸三钠 0.05克， CaCl ₂ 0.01 克， Fe-EDTA溶液 0.4ml， 和水 1000ml; 其中 Fe-EDTA溶液配方为 15克 /升和 EDTA1.4 克 /升。 实施例 2

在 5 T发酵罐中加入异养培养基和自来水至 2.5 T后灭菌， 当温度降至 30°C时， 以 500 L发酵罐作为种子罐培养的普通小球藻， 培养过程中根据细胞生长情况、发酵液中溶 氧水平来调节罐压、 通气量和搅拌转速， 维持培养液中充足的氧含量， 确保藻细胞的快 速生长。

将前期补料分批异养培养过程中葡萄糖耗完的 高密度藻液经光诱导培养基稀释后， 转至 30 L平板式光反应器及 60 L鼓泡式大盆中在户外进行光诱导培养。光诱� �培养条件: 自然温度， 温度在 13~30°C， 自然光照， 光强在 0~36 kk (见图 2) ， 空气流量为 1 vvm。 光诱导培养 8 h后， 30L平板式反应器中藻细胞密度从 1.60 g/L降低到 1.46 g/L, 油脂含 量从 7.87%上升至 13.27%，后进入夜晚，整个晚上藻细胞密度从 1.46 g/L降低至 1.16 g/L, 降幅较白天明显， 油脂含量也有小幅下降， 从 13.27%下降至 12.93%， 第二天白天经过 4h的短暂光诱导后， 藻细胞密度略有上升， 从 1.16 g/L上升至 1.18 g/L， 同时油脂含量 迅速上升， 从 12.93%升高至 18.58% (见图 3 ) ， 图 4为 60 L鼓泡式大盆中光诱导情况， 数据显示变化规律与 30 L平板式光反应器的规律相类似。

将半连续异养培养结束后的高密度普通小球藻 藻液， 经光诱导培养基稀释后， 转入 3 T跑道池及 3.14m ² 斜叶搅拌式圆池在户外进行光诱导培养。 光诱导培养条件： 较低自 然温度， 温度在 5~18°C， 自然光照， 光强在 0~34 kk (见图 5 ) ， 空气流量为 l vvm。 因 该批次 5 T发酵罐半连续培养结束时间在傍晚， 所以藻细胞转入光诱导后即进入夜晚， 光诱导阶段共进行了 90 h， 前 2天天气晴好， 但是气温较低， 放入藻液的当晚， 最低气 温只有 5 °C， 后面两天最高气温为 14°C， 第三天开始天气转阴有小雨， 气温开始小幅回 升， 第三天傍晚开始闷热潮湿， 整个晚上伴有雷阵雨， 第四天上午阴有小雨， 午后雨停， 结束培养并采收藻细胞。

由图 6、 7可以看出， 一方面由于气温较低， 不利于藻细胞的生长代谢； 另一方面 由于第三天开始陆续下雨， 雨水稀释了藻液， 造成了大池内细胞内浓度下降， 所以整个 光诱导过程藻细胞密度下降明显。

由于接种后的前 12 小时， 正好是晚上， 光合作用不能进行， 所以色素和碳水化合 物均大幅下降， 油脂含量却显著升高， 从 12%升至 18%左右， 当晚户外温度较低， 低温 胁迫可能诱导藻细胞内油脂的合成积累， 这也是藻细胞油脂代谢对外界环境变化的一种 响应机制。后面两天温度都较低， 最高气温不超过 14°C， 藻细胞胞内成分没有明显变化， 第三天开始， 虽然有雨水， 但是气温显著回升， 并且闷热潮湿， 从实验数据来看， 这种 户外实际气候情况反而有利于光诱导过程藻体 品质的提升， 但是上升速度比较缓慢。 在 整个 90h的户外光诱导过程中， 尽管出现低温、 阴雨及雷雨天气， 但通过延长光诱导时 间， 藻体的品质也能得到大幅提升， 最终油脂含量均大幅提升至 20%左右。

其中，异养培养基为：葡萄糖 60.0克，硝酸钾 10.0克， MgS0 ₄ ·7Η ₂ 0 0.2克， KH ₂ P0 ₄ 0.3克， Na ₂ HP0 ₄ ·12Η ₂ 0 8.8克， CaC12 0.02克， Fe-EDTA溶液 1.0ml，微量元素溶液 3.5ml， 水 1000ml; 其中 Fe-EDTA溶液配方为 FeS0 ₄ · 7H ₂ 0 15克 /升和 EDTA 1.4克 /升， 微量元 素溶液配方为 H ₃ B0 ₃ 2.86克 /升， MnCl ₂ · 4H ₂ 0 0.11克 /升， ZnS0 ₄ · 7H ₂ 0 9.22克 /升， CuS0 ₄ · 5H ₂ 0 1.00克 /升， （ Η ₄ ) ₆ Μο ₇ 0 ₂₄ ·4Η ₂ 0 0.1克 /升， Co(N0 ₃ ) ₂ '6H ₂ 0 0.9克 /升。

光诱导培养基为： 硝酸钾 0.5克， MgS0 ₄ · 7H ₂ 0 0.6克， CaCl ₂ 0.03克， Fe-EDTA 溶液 1.5ml， 水 1000ml; 其中 Fe-EDTA溶液配方为 8克 /升和 EDTA10.4克 /升。 实施例 3 : 异养 -稀释 -光诱导串联培养过程中椭圆小球藻主要生化� �分变化规律的 研究

本实施例在 500mL摇瓶 /3L圆柱式光生物反应器水平测定椭圆小球藻异 养-稀释-光 诱导串联培养过程中主要生化成分的变化。

采用与实施例 1和 2类似的方式以异养 -稀释 -光诱导串联培养技术培养椭圆小球藻， 500mL摇瓶， 装液量 200mL， 28 °C , 150rpm， 待藻细胞密度达到 10g/L以上且葡萄糖耗 尽时， 转入 3L圆柱式光生物反应器进行光诱导培养， 藻细胞密度约 2g/L， 温度 30°C， 光强 10Kk。异养和光诱导所采用的培养基和蛋白核� �球藻的相应培养基一致。异养结束 时藻细胞内油脂含量为 13.94%， 转入光诱导后 12h， 藻细胞油脂含量快速增加到 23.91% (见图 8 ) 。 实施例 4 在 5L生物反应器中加入下述异养培养基和水至 2.8L后进行蒸汽灭菌， 然后当温度 降到 30°C时接入蛋白核小球藻， 开始异养培养。 异养培养条件： 温度为 30士 1 °C， 空气 流量为 lvvm， pH小于 8.0， 控制溶氧 15%以上。

在接种后 53.9h后第一次补料，之后每隔 5~8h进行补料，共补加 4次，培养至 88.40h 细胞干重达到 132.2g/L (见图 9) ， 此时异养培养结束转入光诱导培养。

将异养培养结束后的高密度藻液稀释到 2.55g/L， 并加入下述光诱导培养基， 转入到 3L平板式光生物反应器中进行光诱导培养。 光诱导培养条件： 温度维持在 28~33 °C， 空 气流量为 lvvm， 双侧光照， 每侧光强为 15kk。 光诱导培养 27h后， 细胞干重从 2.55g/L 降低到 1.82g/L， 叶黄素从 1.57mg/gDcw上升至 3.64mg/gDcw， 光诱导 27h时叶黄素的产 率为 5.88mg/L/d; 若光诱导 12h时叶黄素的产率可达 12.1mg/L/d (为目前微藻光自养生产 叶黄素最高产率 4.8mg/L/d 的 2.5倍) (见图 10)。

异养及补料培养基为：葡萄糖 60.0克，尿素 8.0克， MgS(V7H ₂ 0 2.0克， KH ₂ P0 ₄ 1.1 克， Na ₂ HP0 ₄ - 12H ₂ 0 9.0克， CaCl ₂ 0.02克， 柠檬酸三钠 1.8克， Fe-EDTA溶液 1.0ml, 微量元素溶液 4.5ml， 水 1000ml; 其中 Fe-EDTA溶液配方为 FeS(V7H ₂ 0 15 克 /升和 EDTA1.4 克 /升， 微量元素溶液配方为 H ₃ B0 ₃ 2.11 克 /升， MnCl ₂ 4H ₂ 0 0.81 克 /升， ZnS0 ₄ -7H ₂ 0 0.11克 /升， CuS0 ₄ -5H ₂ 0 10.0克 /升， Na ₂ Mo0 ₄ 0.05克 /升。

光诱导培养基为：尿素 0.5克， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 1.0克，柠檬酸三钠 0.05克， CaCl ₂ 0.01 克， Fe-EDTA溶液 0.4ml， 水 1000ml; 其中 Fe-EDTA溶液配方为 FeS0 ₄ '7H ₂ 0 15克 /升 禾口 EDTA1.4克 /升。 实施例 5

在 50L生物反应器中加入下述异养培养基和自来水 至 25L后在 121 °C灭菌 20min， 然后当温度降至 30°C左右时按工作体积的 10%接入蛋白核小球藻， 开始异养培养。

异养培养条件：温度为 30°C， 空气流量为 lvvm， pH在 6.0 8.0，控制溶氧 15%以上。 在培养过程中， 当葡萄糖消耗完后， 进行补加碳源， 当尿素消耗完时， 补加氮源。 通过 6 次补加碳源， 3次补加氮源后在 98.89h藻细胞密度达 130.5g/L (见图 11 ) 。

将异养培养结束后的高密度藻稀释到 2.01g/L， 并加入光诱导培养基， 转入到 10L圆 柱光生物反应器内进行光诱导。

光诱导培养条件： 自然温度， 温度在 30°C， 光强在 3kk， 空气流量为 lvvm。 光诱 导培养 30h后， 细胞干重从 2.01g/L 降低到 1.66g/L， 叶黄素从 2.55mg/gDcw 上升至 3.47mg/gDcw, 光诱导 30h， 叶黄素产率为 4.61mg/L/d; 若只光诱导 24h， 叶黄素的产率 达 5.73mg/L/d (见图 12)。 培养基与实施例 4的培养基一致。 实施例 6 在 50L生物反应器中加入下述异养培养基和自来水 至 25L后在 121 °C灭菌 20min， 然后当温度降至 30°C左右时按工作体积的 13%接入普通小球藻， 开始异养培养。

异养培养条件： 温度为 30°C， 空气流量为 lvvm， pH小于 9.0。 在培养过程中， 当碳 源消耗完后， 进行补加葡萄糖， 当氮源消耗完时， 补加硝酸钾。 通过 5次补加碳源和氮 源， 58.20h藻细胞密度最高达 54.5g/L (见图 13 ) 。

将异养培养的高密度藻稀释到 3.2g/L左右， 并加入光诱导培养基， 转入到 30L平板 式光生物反应器在户外进行光诱导培养。 光诱导培养条件： 自然温度， 自然光照， 空气 流量为 1.0wm。 光诱导 28h， 叶黄素从初始的 1.10mg/gDcw上升至 1.82mg/gDcw; 光诱 导 23h时， 叶黄素含量为 1.67mg/gDcw， 叶黄素产率达 5.23mg/L/dC见图 15)。

异养和补料培养基为：葡萄糖 60.0克，硝酸钾 10.0克， MgS(V7H ₂ 0 0.2克， KH ₂ P0 ₄ 0.3克， Na ₂ HP(V 12H ₂ 0 8.8克， CaC12 0.02克， Fe-EDTA溶液 1.0ml,微量元素溶液 3.5ml， 水 1000ml; 其中 Fe-EDTA溶液配方为 FeS(V7H ₂ 0 15克 /升和 EDTA1.4克 /升，微量元素 溶液配方为 H ₃ B0 ₃ 2.86 克 /升、 MnCl ₂ -4H ₂ 0 0.11 克 /升、 ZnS0 ₄ -7H ₂ 0 9.22 克 /升、 CuS0 ₄ -5H ₂ 0 1.00克 /升、 （ Η ₄ ) ₆ Μο ₇ 0 ₂₄ ·4Η ₂ 0 0.1克 /升和 Co(N0 ₃ ) ₂ '6H ₂ 0 0.9克 /升。

光诱导培养基为： 硝酸钾 0.5克， MgS(V7H ₂ 0 0.6克， CaCl ₂ 0.03克， Fe-EDTA溶 液 1.5ml， 水 1000ml; 其中 Fe-EDTA溶液配方为 FeS0 ₄ '7H ₂ 0 8克 /升和 EDTA 10.4克 / 升。 实施例 7

在 5L生物反应器中加入下述异养培养基和水至 2.8L后进行蒸汽灭菌， 然后当温度 降到 30°C时按工作体积的 8%接入椭圆小球藻， 开始异养培养。 异养培养条件： 温度为 30士 1 °C， 空气流量为 lvvm， pH小于 8.5， 控制溶氧 5%以上。 补料两次后在 66h， 藻细 胞密度为 53.0g/L (见图 14) ， 此时异养培养结束转入光诱导培养。

将异养培养结束后的高密度藻液稀释到 4.0g/L， 并加入下述光诱导培养基， 转入到 3L平板式光生物反应器中进行光诱导培养。 光诱导培养条件： 温度维持在 28~33 °C， 空 气流量为 l .Ovvm, 双侧光照， 每侧光强为 15klx。 光诱导培养 48h后， 细胞干重从 4.0g/L 降低到 2.8g/L， 叶黄素从 1.5mg/gDcw上升至 3.6mg/gDcw， 叶黄素产率为 5.04mg/L/d; 光诱导 24h， 叶黄素产率可达 9.24mg/L/d (见图 16) 。 培养基与实施例 6的培养基一致。 尽管上面已经描述了本发明的具体例子， 但是有一点对于本领域技术人员来说是明 显的， 即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对 本发明作各种变化和改动。 因此， 所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内 的变动。