牛蒡苷元的微乳制剂 技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种微乳制剂。具 体而言，本发明涉及牛蒡苷元的微乳制 剂。 背景技术

牛蒡子为菊科植物牛蒡的干燥成熟果实， 是常用中药， 具有疏散风热、宣肺透疹、解 毒利咽的功能， 用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉 肿痛、痒腮丹毒、痈肿疮毒。 该中药含有木脂素类化合物，主要是牛蒡苷 (arctiin)和牛蒡苷元 (arctigenin)等。虽然牛蒡苷 元（也称牛蒡子苷元）在牛蒡子中的含量很低 ，但是其前体牛蒡苷在中药牛蒡和毛头牛蒡 果实中含量较高，所以通过牛蒡苷转化可以获 得大量的牛蒡苷元。据文献报道， 牛蒡苷在 体内被分解为牛蒡苷元而产生众多药理作用， 并且牛蒡苷元比牛蒡苷具有更强的生物活 性， 比如显著的抗菌、 抗病毒、 抗肿瘤、 抗 PAF受体及钙拮抗活性。

牛蒡苷元为白色粉末或无色块状结晶， 在氯仿、 甲醇、 乙醇等有机溶剂中易溶， 在石 油醚中难溶， 熔点为 111-112 °C。 不易挥发， 空气中不易被氧化， 物理及化学性质均较为 稳定。但牛蒡苷元难溶于水， 生物利用度低， 在一定程度上限制了其作为新药的应用。牛 蒡苷元的分子结构如下：

牛勞苷元 (Arctigenin)

关于牛蒡苷元在小鼠、家兔体内的药物动力学 特征已有报道。对牛蒡苷元小鼠胃肠道 吸收、家兔静脉注射、灌胃牛蒡苷元的药物动 力学特征以及牛蒡苷元在大鼠体内分布研究 结果表明： （1 )牛蒡苷元在胃肠道内较为稳定， 转化、破坏较少。 （2)家兔静脉注射不同 剂量牛蒡苷元时， 各剂量的半衰期 T _1/2 等主要动力学参数十分接近， 且药-时曲线下面积 (AUC) 随剂量增加而成比例增加； 说明牛蒡苷元的消除为线性动力学； （3 ) 家兔灌胃 牛蒡苷元的绝对生物利用度为 9.5 % ; (4) 牛蒡苷元在大鼠体内分布广泛， 在肝、 肺中分 布浓度较高， 其次为心、脾、 肾等。血浆蛋白结合率实验表明， 牛蒡苷元与大鼠血聚蛋白 平均结合率为 78.3 %。

家兔灌胃给药的生物利用度仅仅为 9.5%, 分析主要的原因在于牛蒡苷元属于脂溶性 化合物， 水溶性较差， 才导致口服生物利用度很低。 发明专利申请公布说明书 CN 101036644A公开了一种含牛蒡子苷元的药物组合� �， 该发明将牛蒡苷元包合在环糊精衍 生物中，以解决牛蒡子苷元水溶性差及其生物 利用度低的问题。发明专利申请公布说明书 CN101036643A也公开了一种含牛蒡子苷元的药物组 合物， 该药物组合物包含牛蒡苷元、 油、乳化剂和水，具体的提供的是一种口服或 静脉乳剂，该乳剂的平均粒径均大于 100nm， 每 100ml乳剂中含牛蒡苷元 0.05-2.0g、 油 5-20g、 乳化剂 0.5-5.0g、 油酸 0.02-0.2g， 余量 为水。

微乳给药系统是由药物、 油相 (即油相组分)、 水、 乳化剂以及助乳化剂以适当比例混 合形成的一种混合物， 平均粒径为 10-100nm， 体外可形成热力学稳定体系， 由乳化剂以 及助乳化剂共同起稳定作用；对水溶性、脂溶 性及难溶性药物均有较好的溶解力，物理稳 定性较高；因表面张力较低，故易透过胃肠壁 的水化层，药物可直接和胃肠上皮细胞接触， 促进药物吸收，提高生物利用度； 口服后可经淋巴管吸收，克服了首过效应及大 分子通过 胃肠道上皮细胞膜时的障碍。

但是，微乳的制备也存在很多的困难。 由于微乳中需要大量的乳化剂， 随着乳化剂含 量的增高及其在体内的蓄积势必产生一定的毒 性，并且助乳化剂、油相及它们之间的配比 关系都会对微乳的粒径及其稳定性产生重大的 影响。 发明内容

为提高牛蒡苷元的水溶性及其在体内的口服生 物利用度，本发明提供了牛蒡苷元的一 种新型微乳制剂。 本发明所述的微乳粒径大小均匀， 一般为 10-100nm。 本发明通过利用 微乳作为牛蒡苷元的药物载体，将其制备成为 牛蒡苷元微乳浓缩物，也可以加入赋形剂将 其制备成含有牛蒡苷元的各种微乳制剂， 包括固体微乳制剂和液体微乳制剂。

本发明的牛蒡苷元的微乳制剂，含有牛蒡苷元 ^微乳载体，所述微乳载体包含油相和 乳化剂，所述微乳制剂的平均粒径为 10-90nm。牛蒡苷元与微乳载体组成牛蒡苷元的� �乳 浓缩物。 根据本发明的牛蒡苷元的微乳制剂， 其中所述微乳载体可以进一步含有赋形剂。 本发明所述的牛蒡苷元微乳浓缩物在室温下可 以为液体、固体或半固体。本发明的微乳制 剂包含牛蒡苷元和微乳载体，所述微乳载体包 括油相和乳化剂，还可以进一步包括助乳化 剂， 优选地， 在本发明的微乳制剂中牛蒡苷元、油相、乳化 剂和助乳化剂重量比为： 牛蒡 苷元 1-10份、油相 5-85份 乳化剂 20-60份、助乳化剂 5-60份。本发明还分别对油相、 乳化剂和助乳化剂分别进行优选。

油相对于牛蒡苷元微乳制剂是必不可少的组分 之一。 油相可促进药物在体内的转运， 增强人体的吸收， 提高药物的生物利用度。一定范围内， 油相分子体积越大， 对药物的溶 解力越强，但油相分子体积过大不能形成微乳 。为了增加药物溶解度，增大微乳形成区域， 应选择与药物相适应的油相。

优选地，上述微乳制剂的油相为固体或半固体 油相组分，其选自脂肪酸甘油酯、醇酯、 脂肪醇和多糖基化的饱和甘油酯中的一种或几 种。进一步优选地，脂昉酸甘油酯选自氢化 椰油甘油酯、 氢化棕榈油 PEG-6酯和氢化棕榈橄榄油 PEG-6酯中的一种或多种， 醇酯选 自丙二醇硬脂酸酯、 PEG-2-硬脂酸酯和鲸蜡醇十六酸酉旨中的一种或 多种， 脂肪醇为肉豆 蔻醇， 多糖基化的饱和甘油酯为月桂酰基聚乙二醇 -32-甘油酯。

优选地，上述微乳制剂的油相为液体油相组分 ，其选自甘油酯类、天然植物油及其级 分、 精油、 挥发油和合成油中的一种或多种。 甘油酯类为单甘油酯和二甘油酯的混合物、 辛酸甘油酯、中链脂肪酸甘油酯、单亚油酸甘 油酯或辛癸酸甘油酯，所述的天然植物油及 其级分为红花油、芝麻油、玉米油、蓖麻油、 椰子油、棉籽油、大豆油、柠檬油、薄荷油、 薄荷醇、 香芹芬、 麝香草酚或它们的任意混合物， 挥发油为留兰香油、 丁香油、 柠檬油、 薄荷油或它们的任意混合物， 合成油为三醋精、丁酸乙酯、辛酸油酸乙酯、 油酸乙酯、 肉 豆蔻酸异丙酯、 辛酸乙酯或它们的任意混合物。

对上述油相的优选主要是为了增加牛蒡苷元在 油相中的溶解度， 增大微乳形成区域。 上述所有的"优选"均表示在保证牛蒡苷元^ "较大溶解度的前提下，尽可能的选择具有更� � 微乳形成区域的油相。优选的组分具有更强的 溶解牛蒡苷元的能力和形成 ¾ ^大微乳区域的 能力。

乳化剂为牛蒡苷元微乳制剂必不可少的组分之 一。乳化剂一般为具有表面活性的物质 及它们的混合物，可以是离子的、非离子的或 两性离子的表面活性剂，其具有降低界面张 力形成界面膜， 促使微乳形成。 并不是所有的表面活性剂都适合作为本发明微 乳的组分。

本发明经过药剂学研究试验发现， 本发明所用到的乳化剂优选为壬基酚聚氧乙烯 醚、 聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙 烯氢化蓖麻油、脱水山梨醇衍生物、聚氧乙 烯 -聚氧丙烯共聚物、 聚氧乙烯垸基醚、 聚甘油脂肪酸酯和亚垸基多元醇酯中的一种或 多 种。 聚氧乙烯脂肪酸酯为聚氧乙烯硬脂酸酯、 PEG-40-硬脂酸酯或它们的混合物， 脱水山 梨醇衍生物为吐温 -20、吐温 -40、 吐温 -60、 吐温 -80,或它们的混合物， 聚氧乙烯-聚氧丙烯 共聚物为泊洛沙姆， 聚氧乙烯垸基醚为聚氧乙烯 -2-鲸蜡基醚、聚氧乙烯 -10-鲸蜡基醚、聚 氧乙烯 -20-鲸蜡基醚、 聚氧乙烯 -23-月桂基醚、 聚氧乙烯 -20-油基醚、 聚氧乙烯 -2-硬脂基 醚、 聚氧乙烯 -10-硬脂基醚、 聚氧乙烯 -20-硬脂基醚或它们的混合物， 聚甘油脂肪酸酯为 十甘油单硬脂酸酯、六甘油单硬脂酸酯、四甘 油单硬脂酸酯或它们的混合物，亚烷基多元 醇酯为硬脂酰基、 月桂酰基聚乙二醇 -32-甘油酯或它们的混合物。

优选地， 上述聚氧乙烯烷基醚为聚氧乙烯 -23-月桂基醚或聚氧乙烯 -20-油基醚。

自乳化药物传递系统 (SEDDS)要在胃肠道内自乳化并维持乳剂状态，� �方中需要有大 量的乳化剂，但乳化剂量大可能会刺激胃肠道 ，所以应充分考虑乳剂的安全性。因此对于 乳化剂的优选是结合药剂学和药物药理毒理研 究，选择毒性、刺激性和溶血反应小的乳化 剂，并且其具有更强的降低界面张力的能力。 上述乳化剂的 "优选 "均表示对乳化剂安全性 和乳化能力的筛选。 优选的组分具有更强的安全性和乳化能力。

在优选的实施方式中，本发明的牛蒡苷元微乳 制剂还包含助乳化剂。助乳化剂一般为 具有表面活性的物质。助乳化剂既可增加膜的 柔顺性，有利微乳乳滴界面膜的形成，又可 增大乳化剂的溶解 ，进一步降低界面张力，有利于微乳的稳定。 在本发明中使用的助乳 化剂为中等链长的醇类或 HLB值适宜的非离子型表面活性剂极性有机物。

本发明的助乳化剂为以下组分之一或它们的任 意混合物：短链醇、有机氨、垸基素酸、 单双垸基酸甘油酯和聚氧乙烯脂肪酸酯。 优选地， 助乳化剂为短链醇， 它选自聚乙二醇、 正丁醇、 正己醇、 乙醇、 乙二醇、 丙二醇和甘油中的一种或几种。进一步优选地 ， 助乳化 剂为乙醇、 甘油、 聚乙二醇 200、 聚乙二醇 300、 聚乙二醇 400或 1， 2-丙二醇。

对于助乳化剂的优选主要考虑助乳化剂的加入 对微乳稳定性和乳化效果的影响。助乳 化剂链的长短对助乳化效果有一定的影响，直 链的优于支链的，长链的优于短链的； 当助 表面活性剂链长达到表面活性剂碳链链长时， 其效果最佳。上述助乳化剂的"优选"均表示 对助乳化剂乳化能力和稳定性能的筛选。优选 的组分在保证微乳稳定性和对药物的乳化能 力方面更为强大。

当油相、乳化剂和助乳化剂确定之后，可以通 过三元相图找出微乳区域，从而确定它 们的用量。同时需要考虑乳化剂的安全性、助 乳化剂对微乳的稳定性以及它们对牛蒡苷元 的增溶效果。在保证能够制备成微乳的情况下 最大限度的降低乳化剂的用量以保证尽量低 的毒性。 因此， 本发明对微乳的油相、 乳化剂、助乳化剂的重量比进行了优选， 油相、乳 化剂、 助乳化剂的重量比为： 油相 5-85份、 乳化剂 20-60份、 助乳化剂 5-60份。 进一 步优选地， 油相、 乳化剂、 助乳化剂的重量比为： 油相 20-40份、 乳化剂 35-55份、 助 乳化剂 15-45份。'

上述制备的牛蒡苷元的微乳浓缩物大部分具有 液体的状态，为了使上述微乳浓缩物在 室温下是固体或半固体，在上述微乳浓缩物中 加入亲水组分。所述的亲水组分优选聚乙二 醇、聚环氧乙烷或它们的混合物。聚乙二醇为 聚乙二醇 200、聚乙二醇 300、聚乙二醇 400 或它们的混合物。

因此，在一个实施方案中，根据本发明形成的 微乳浓缩物包含如下重量比的组分：牛 蒡苷元 1-10份、油相 5-85份、乳化剂 20-60份、助乳化剂 5-60份、亲水组分 20-70份。 优选地， 所述微乳浓缩物包含如下重量比的组分： 牛蒡苷元 1-10份、 油相 20-40份、 乳 化剂 35-55份、 助乳化剂 15-45份、 亲水组分 30-50份。 对于亲水组分种类和重量的优 选表示优选的亲水组分的结晶结构不受影响或 所受的影响较小。

上述的微乳制剂可以作为自乳化药物传递系统 ，含药的微乳浓缩物进入胃肠道后与胃 肠道内的水接触后自动形成微乳，供人体吸收 。也可以将微乳浓缩物加入赋形剂后制备成 为各种微乳制剂。以增加患者对该药物微乳制 剂的用药途径和剂型偏好的选择。所述的赋 形剂为防腐剂、 填充剂、 PH调节剂、 等渗调节剂、 酸化剂、 水或它们的混合物。 赋形剂 占微乳制剂重量的 0.05%-80%。

优选地， 上述防腐剂为抗坏血酸及其衍生物、 生育酚及其衍生物、 丁基羟基茴香醚、 丁基羟基甲苯或它们的任意混合物。 填充剂为微晶纤维素、 二氧化硅、 淀粉及其衍生物、 乳糖、憐酸二钙、 甘露醇或它们的任意混合物。酸化剂为柠檬酸 、琥珀酸、 富马酸、抗坏 血酸、 磷酸、 癸酸、 油酸、 醋酞纤维素、 乙酸 -1,2,4-苯三酸纤维素、 羟丙基甲基纤维素酞 酸酯、羧甲基乙基纤维素、卡波姆或它们的任 意混合物。 PH调节剂为磷酸盐的缓冲溶液、 氢氧化钠、盐酸或它们的任意混合物。等渗调 节剂为氯化钠溶液、氯化钾溶液或它们的混 合物。

上述牛蒡苷元的微乳浓缩物与赋形剂可以制备 成口服微乳制剂和静脉微乳制剂。口服 微乳制剂包括片剂、 颗粒剂和口服液。 由于自然形成，热力学稳定，牛蒡苷元的微乳 制剂制备过程简单。牛蒡苷元微乳制剂 可以制备成油包水型 (W/0型)或水包油型 (0/W型)两种， 本发明优选制备成 0/W型微乳 制剂。 牛蒡苷元微乳制剂的制备过程包括以下步骤：

(1)利用伪三元相图筛选处方， 确定牛蒡苷元微乳制剂的油相、 乳化剂、 助乳化剂的 种类及其它们之间的配比关系，确定能形成微 乳的区域，并最终确定牛蒡苷元微乳的油相、 乳化剂和助乳化剂的处方量；

(2) (a)将乳化剂溶于油相中， 然后加入助乳化剂和牛蒡苷元； 或

(b)可以直接将牛蒡苷元、 油相、 乳化剂和助乳化剂混合；

从而得到牛蒡苷元的微乳浓缩物； 和 /或

(3)将上述牛蒡苷元的微乳浓缩物加入上述赋形 剂中，制备成微乳口服制剂和微乳静 脉制剂。

. 在一个实施方案中，本发明提供本发明的牛蒡 苷元微乳制剂的制备方法，所述方法包 括如下步骤：

(1)将乳化剂溶于油相中， 然后加入助乳化剂， 混合均匀， 得到混合物；

(2)将牛蒡苷元加入上述混合物中， 得到牛蒡苷元的微乳浓缩物；

(3)将水以重量比 10-20: 1的比例加入到上述微乳浓缩物中， 得到微乳；

(4)将上述微乳加入赋形剂中， 制备成微乳制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供本发明的牛 蒡苷元微乳制剂的制备方法，所述方法 包括如下步骤：

(1)将乳化剂溶于油相中， 然后加入助乳化剂， 混合均匀， 得到混合物；

(2)将牛蒡苷元加入上述混合物中， 经超声波处理， 得到牛蒡苷元的微乳浓缩物；

(3)将水以重量比 10-20: 1的比例加入到上述微乳浓缩物中， 得到微乳；

(4)将上述微乳加入赋形剂中， 制备成微乳制剂。

在另一个实施方案中，本^：明提供本发明的� �蒡苷元微乳制剂的制备方法，所述方法 包括如下步骤：

(1)将乳化剂、 油枏、 助乳化剂和牛蒡苷元混合， 得到牛蒡苷元的微乳浓缩物；

(2)将水以重量比 10-20: 1的比例加入到上述微乳浓缩物中， 镥到微乳；

(3)将上述微乳加入赋形剂中， 制备成微乳制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供本发明的牛 蒡苷元微乳制剂的制备方法，所述方法 包括如下步骤：

(1) 将乳化剂、 油相、 助乳化剂和牛蒡苷元混合， 经超声波处理， 得到牛蒡苷元的微 乳浓缩物；

(2) 将水以重量比 10-20: 1的比例加入到上述微乳浓缩物中， -得到微乳；

(3)将上述微乳加入赋形剂中， 制备成微乳制剂。

牛蒡苷元的微乳制剂的制备过程还可以包含将 微乳浓缩物加入适量的水性介质中稀 释制备成自然可分散的微乳澄清浓缩液，从而 可以制备成为牛蒡苷元的微乳口服液。当用 水性介质稀释至 1 : 1-300， 优选为 1 : 10-70, 更优选为 1 : 10的稀释液， 自然可分散的 微乳预浓缩液形成 0/W微乳。

,本发明牛蒡苷元的微乳浓缩物还可以与上述� �赋形剂混合加热，搅拌直至熔解。可以 制备成为颗粒剂，或随后将所得到的颗粒进一 步细化后装入胶囊壳中，可以形成软胶囊或 硬胶囊。当颗粒或胶囊与水性介质包括胃液接 触后，牛蒡苷元的微乳浓缩物可以 稀释成 自然可分散的微乳。

另一方面， 本发明提供了用于治疗病毒性感染、细菌性感 染、肿瘤等病症或疾病的方 法，所述方法包括向有此需要的受试者施予有 效量的本发明的牛蒡苷元微乳制剂。所述病 毒性感染包括但不限于例如流感病毒， 副流感病毒， 疱疹病毒， 腮腺炎病毒等。所述细菌 性感染包括但不限于金黄色葡萄球菌、肺炎球 菌、 链球菌等。所述肿瘤包括肉瘤和癌， 例 如肺癌、 肝癌、 食道癌、 胃癌、 乳腺癌等。 此外， 本发明的牛蒡苷元微乳制剂还可以用于 治疗心血管疾病以及老年性痴呆等。

对于这些应用，本发明的牛蒡苷元微乳制剂可 以与增强其药效的其他药物组合，所述 其他药物的实例包括，但不限于抗病毒药、抗 生素、抗肿瘤药、免疫增强剂等其它治疗剂。

根据本发明的另外的实施方案，本发明提供本 发明的牛蒡苷元微乳制剂在制备用于治 疗病毒性感染、 细菌性感染、 肿瘤等疾病的药物中的应用。

本发明通过实施例 1-30描述了本发明牛蒡苷元微乳制剂及其制备� �法， 本发明的所 有的微乳制剂或微乳浓缩物稀释后的微乳制剂 均符合微乳制剂的质量标准。离心试验后微 乳仍为澄清透明， 不出现分层、混浊现象。牛蒡苷元微乳浓缩液 及稀释液的粒径及粒度分 布测定结果表明， 平均粒径 10-90nm， 均未超过 lOOnm, 分布范围窄且均匀， 符合微乳的 关于粒径和粒度的分布要求。

本发明通过考察牛蒡苷元微乳制剂的口服生物 利用度，结果发现本发明提供的牛蒡苷 元微乳制剂 （含实施例 1-31 )将 CN101036643A公开的牛蒡苷元乳剂口服生物利用度 明 显提高了 1.39-4.73倍。本发明还通过牛蒡苷元对抗 S180肉瘤细胞小鼠移植瘤实验发现本 发明提供的牛蒡苷元的微乳制剂较 CN101036643A公开的牛蒡苷元乳剂对抗小鼠 S180瘤 的效果显著提高； 本发明牛蒡苷元的微乳制剂较 CN101036643A公开的牛蒡苷元乳剂抑 制 H22肝癌实体瘤和小鼠 Lewis肺癌实体瘤都有显著的优势； 在剂量相同的情况下， 与 牛蒡苷元乳剂和替加氟的联合用药相比，本发 明的牛蒡苷元微乳制剂和替加氟的联合用药 在抑制 H22肝癌实体瘤和小鼠 Lewis肺癌实体瘤方面 ¾^具有显著的优势， 且抑瘤率具有 显著的提高。

以上实验结果进一步说明了，本发明的牛蒡苷 元的微乳制剂较牛蒡苷元的乳化剂具有 更好的抑瘤作用， 这可能与牛蒡苷元的微乳制剂较牛蒡苷元的乳 化剂提高了口服利用度、 增加了药物吸收有关。 '

总之， 微乳改善了药物的传递， 与乳剂及常规制剂相比， 它们可以增加药物载量、增 强通透性、 降低粒径、改善粒径均匀度、增加药物溶出率 、增加生物利用度并且降低药物 动力学中的个体间和个体内差异。 当口服施用时， 本发明的微乳制剂显示出有利的性质， 例如在标准生物利用度试验中获得的高水平的 生物利用度。 具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明， 本发明不仅仅限于以下实施例。 第一部分 牛蒡苷元的微乳浓缩物及微乳制剂 实施例 1 牛蒡苷元微乳的制备及质量评价

1、 牛蒡苷元微乳浓缩物处方

组分 重量 /g

牛蒡苷元 5

辛癸酸甘油酯 15

壬基酚聚氧乙烯醚 50

1,2-丙二醇 12.5 无水乙醇 12.5

2、 牛蒡苷元微乳的制备工艺

称取处方量辛癸酸甘油酯、 壬基酚聚氧乙烯醚、 1，2-丙二醇、 无水乙醇， 混合后搅拌 均匀， 然后加入牛蒡苷元， 超声波处理以加速溶解， 得澄清浓缩液， 即为牛蒡苷元微乳浓 缩物。将上述所得的微乳浓缩物加水按照 1 : 10-20的重量比稀释至澄清溶液， 即得微乳。

3、 牛蒡苷元微乳理化性质的考察及其质量评价方 法

3.1 外观性状

观察牛蒡苷元微乳的外观性状

3.2微乳类型的鉴别

取少量的牛蒡苷元微乳浓缩液，分别加入亚甲 基兰和苏丹红溶液，观察 2种不同颜色 的溶液在微乳中的扩散速度的快慢。

3.3 离心实验

将牛蒡苷元微乳于 DT5-3离心机中离心 30miri， 观察现象， 考察其物理稳定性。 3.4粒径及粒度分布的研究

. 取牛蒡苷元微乳适量，用激光粒度测定仪测定 其粒径和粒度分布；取牛蒡苷元微乳适 量， 用水稀释 ₅₀ 倍； 用激光粒度测定仪测定其稀释液的粒径与粒度 分布。

3.5 牛蒡苷元含量测定方法的建立

3.5.1 色谱条件

色谱柱： Diamonsil C ₁₈ (size:5 n},-150mmx4.6mm) _; 流动相：甲醇-乙睛-水 (40:

20:40)； 流速: 0.8ml/min; 紫外检测波长 :280nm; 柱温:室温。

3.5.2标准曲线

精密称取牛蒡苷元对照^ 0.1562g (相当于牛蒡苷元 0.1381g)， 置于 25ml棕色量瓶 中， 加入甲醇溶解至刻度， 摇匀； 取 lml置于 25ml棕色量瓶中， 加甲醇稀释至刻度， 摇 匀； 分别取此稀释液 1、 2、 3、 4、 5、 6ml置于 10ml棕色瓶中， 加甲醇至刻度， 摇匀， 得到浓度为 22.1、 44.2、 66.3、 88.4、 110.5、 132.6 g/ml的系列标准溶液， 按照色谱条件 分别进样。

3.5.3 精密度与样品稳定性

取牛蒡苷元标准溶液 66.3 g/ml, 重复测定 6次， 计算峰面积 RSD; 分别在第 0、 2、 4、 6、 8、 12、 24h分别进样， 计算峰面积 RSD。

3.5.4含量测定

取牛蒡苷元微乳 lml， 置于 100ml量瓶中， 甲醇稀释至刻度， 测定牛蒡苷元的含量。 4、 牛蒡苷元微 ¾理化性质的考察及其质量评价结果

4.1 外观性状

4.2微乳类型

红色在微乳中的扩散速度比蓝色快， 说明该微乳为 0/W型微乳。

4.3 离心试验

微乳仍为澄清透明， 未产生沉淀， 不出现分层、 混浊现象。 说明其物理稳定性良好， 可间接说明自然静置较长时间后仍可保持较好 的稳定性。

4.4粒径及粒度分布

牛蒡苷元微乳浓缩液及稀释液的粒径及粒度分 布测定结果表明， 实验制备的牛蒡苷元 微乳平均粒径 25nm， 多分散系数为 0.105; 牛蒡苷元微乳稀释液的平均粒径 22nm， 多分 散系数为 0.078; 可见制备的牛蒡苷元微乳和微乳的稀释液的粒 径较小， 分布范围窄且均 匀。 符合微乳的关于粒径和粒度的分布要求。

4.5 牛蒡苷元的含量测定

在 1.916xl(T ⁴ -4.79xl(r^g/ml范围内， 色谱峰面积与牛蒡苷元的进样量 ^g)呈良好线 性关系， 回归方程为: Y=1119986X+1508.8， r=0.9993。 实施例 2 微乳浓缩物

制备工艺： 称取处方量辛酸甘油酯、 聚氧乙烯蓖麻油 EL-40、 1， 2-丙二醇， 混合后 搅拌均匀， 然后加入牛蒡苷元溶解， 超声波处理以加速溶解， 得澄清浓缩液， 即为牛蒡苷 元微乳浓缩物 _ώ 将上述所得的微乳浓缩物加水按照 1 : 10-20的重量比稀释至澄清溶液， 即得微乳。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 15nm。 实施例 3 微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 35nm _£ 实施例 4微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 lOnmc 实施例 5微乳浓縮物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 19nm。 实施例 ό 微乳浓缩物

制备工艺： 称取处方量辛酸油酸乙酯、 吐温 -80、 1， 2-丙二醇、聚乙二醇 3350， 混合 后搅拌均匀， 然后加入牛蒡苷元溶解， 超声波处理以加速溶解， 得澄清浓缩液， 即为牛蒡 苷元微乳浓缩物。将上述所得的微乳浓缩物加 水按照 1 : 10-20的重量比稀释至澄清溶液, 即得微乳。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 40nm。

实施例 7 微乳浓缩物

制备工艺同实施例 6。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 35nm。

实施例 8微乳浓缩物

制备工艺同实施例 6。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 40nm。

实施例 9微乳浓缩物

制备工艺同实施例 6。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 48nn^ 实施例 10微乳浓缩物

制备工艺同实施例 6。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 44nm。 实施例 11 微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 46nmc 实施例 12微乳浓缩物

制备工艺同实施 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 45nm _t 实施例 13微)乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 36nm。 实施例 14微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 26nm。 实施例 15微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 16nm。 实施例 16微乳浓縮物

实施例 17微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 56nmc 实施例 18微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 27nm _t 实施例 19微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 82ηι^ 实施例 20微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 68nm。 实施例 21 微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 54nm。 实施例 22微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 63nmc 实施例 24微乳浓缩物

制备工艺同实施例 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 80nm _t 实施例 25 微乳浓缩物 组分 重量 /g

牛蒡苷元 5

辛癸酸甘油酯 30

氢化椰油甘油酯 50

1-丁醇 20

抗坏血酸 0.05

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 66nm。 实施例 26微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 86nmc 实施例 27微乳浓缩物

制备工艺同实施例 2。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 74nm。 实施例 28牛蒡苷元的微乳注射液 .

生理盐水 加至 100ml

制备工艺：

称取处方量月桂酰基聚乙二醇 -32-甘油酯、 氢化椰油甘油酯、 1 , 2-丙二醇， 混合后 搅拌均匀， 然后加入牛蒡苷元溶解， 超声波处理以加速溶解， 得澄清浓缩液， 搅拌下缓慢 加入适量的生理盐水。 同时加入磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液， 调节 PH值至 5.0-7.0。

0.2μιη滤膜过滤灭菌， 充氮 5ml灌封， 即得牛蒡苷元微.乳注射液。激光粒度测定仪� �定其 粒径， 平均粒径为 54nm。

实施例 29 牛蒡苷元的微乳口服液

制备工艺：

称取处方量薄荷油、 氢化椰油甘油酯、 1， 2-丙二醇， 混合后搅拌均匀， 然后加入牛 蒡苷元溶解， 超声波处理以加速溶解， 得澄清浓缩液， 搅拌下缓慢加入适量的蒸馏水、 处 方量的乳糖和 5%苯扎溴铵溶液， 即得牛蒡苷元的微乳口服液。 激光粒度测定仪测定其粒 径， 平均粒径为 57nm。

实施例 30 含牛蒡苷元微乳的胶囊

制备工艺：

称取处方量辛酸油酸乙酯、 氢化椰油甘油酯、 1， 2-丙二醇， 混合后搅拌均匀， 然后 加入牛蒡苷元溶解， 超声波处理以加速溶解， 得澄清浓缩液， 搅泮下缓慢加入处方量的 PEG3350 和二氧化硅， 充分混合后将混合物加入至胶囊壳中， 即得牛蒡苷元微乳胶囊。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 90nm。

实施例 31 微乳浓缩物

制备工艺： 称取处方量氢化椰油甘油酯、 聚氧乙烯蓖麻油 EL-40、 1， 2-丙二醇， 混 合后搅拌均匀， 然后加入牛蒡苷元溶解， 超声波处理以加速溶解， 得澄清浓缩液， 即为牛 蒡苷元微乳浓缩物。 将上述所得的微乳浓缩 i加水按照 1 : 10-20的重量比稀释至澄清溶 液， 即得微乳。 激光粒度测定仪测定其粒径， 平均粒径为 80nm。

将实施例 2-31制备的牛蒡苷元的微乳浓缩物或微乳制剂� �重复实施例 1中关于 "牛蒡 苷元微乳理化性质的考察及其质量评价"， 结果发现所有微乳制剂或微乳浓缩物稀释后的 微乳制剂均符合微乳制剂的质量标准。离心试 验后微乳仍为澄清透明， 不出现分层、混浊 现象。 牛蒡苷元微乳浓缩液及稀释液的粒径及粒度分 布测定结果表明， 实施例 2-31制备 的牛蒡苷元微乳平均粒径 10-90nm， 均未超过 lOOnm, 分布范围窄且均匀， 符合微乳的关 于粒径和粒度的分布要求。

将实施例 1-31制备的牛蒡苷元的微乳浓缩物或微乳制剂� � 置 40°C 75%RH条件下进 行加速试验， 并于第 1、 2、 3、 6月取样，用激光粒度测定仪进行粒径检测， 结果见表 1( 位 nm)。 由表 1 可以看出， 本发明制备的牛蒡苷元微乳具有很好的稳定性 ， 尤其实施例 1-18制备的牛蒡苷元微乳浓缩物或微乳制剂的� �定性更^, 同时粒径更小。

表 1 牛蒡苷元的微乳粒径变化结果

第二部分牛蒡苷元微乳制剂主要药动学和药 效学考察

试验例 1 牛蒡苷元微乳制剂的口服生物利用度研究

1、 实验材料

1.1药品与试剂

牛蒡苷元乳剂：处方和制备工艺同 CN101036643A说明书第 4页实施例 3，牛蒡苷元 乳剂的处方： 牛蒡子苷元 1.0g+蛋黄磷脂 3.0g+中链油 15g+油酸 0.08g+甘油 3.0g。 牛蒡苷元微乳剂： 本发明实施例 1制备的微乳剂；

牛蒡苷元对照品 (纯度 99.5%); 肝素钠， 生理盐水， 甲醇， 乙睛 (均为色谱纯试剂)， 其他均为分析纯试剂。

1.2实验仪器

LC-10A 高效液相色谱仪; SPD-10AV 紫外检测器: ShimazuClass-vp Version 5.03 working station; KQ-100型超声波清洗器； 台式离心机 TGL-16C; 手动匀浆器。

1.3 实验动物

新西兰家兔， 体重 1400-1500g， 雌雄均有， 山东新时代药业动物中心提供。

2、 实验方法

2.1血浆中药物浓度的测定方法

2.1.1对照品溶液的配制

精密称取牛蒡苷元对照品 9.58mg， 置于 10ml容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度， 得 0.958mg/ml的对照品溶液。

2.1.2血浆样品预处理

取样品 0.5ml置于分液漏斗中， 加入 5ml二氯甲烷， 摇匀， 提取两次。 分取二氯甲垸 层并合并， 40Ό水浴蒸干二氯甲垸液， 残渣加乙睛 0.5ml溶解， 作为供试品溶液， 置于冰 箱中 （-20°C )待测， 进样 10μ1。

2.1.3 生物样品中药物含量测定方法的建立

2.1.3.1 色谱条件

色谱柱： Diamonsil C ₁₈ (size: 5μηι, 150mmx4.6mm); 流动相： 乙睛 -τΚ(35:

65)； 流速: 0.8ml/min; 紫外检测波长 :280nm; 柱温： 室温。

2.1.3.2方法专属性考察

将实验动物的血浆按上述方法处理后， 取 ΙΟμΙ注入高效液相色谱仪。 同法处理空白 血浆样品。结果， 在上述色谱条件下， 牛蒡苷元色谱峰与其它峰有良好的分离度， 与邻近 峰分离度 R:2.5， 理论塔板数为 3566块 /米， 空白血浆对其分析测定没有干扰。

2.1.3.3 最低检测浓度的测定

按峰高为基线噪音 3倍计算， 血浆中牛蒡苷元 低检测量为 9.58xl0 g/ml。

2.1.3.4线性范围

取空白生物样品， 加入不同浓度牛蒡苷元标准溶液， 使样品浓度为 :1.9ΐ6χ1(Τ ² 、 4.79x l 0 ^-2 、 9.58x l(T ² 、 4.79><10人 9.58x 10"^ 2.874、 4.79 g/ml，各进样 10μ1， 以进样量 ^g) 为横坐标， 以色谱峰面积为纵坐标， 绘制标准曲线。 结果： 在 1.916><10 ⁴ -4.79><10 _§ 范 围内， 色谱峰面积与牛蒡苷元的进样量 ^g)呈良好线性关系， 回归方程 为: Y=11'19986X+1508.8， r=0.9993。

2.1.3.5回收率和精密度

回收率： 取空白生物样^， 配制 4.79x 1 (T g/ml、 4.79x lO"Vg mK 4.79 g/ml 三个浓度生物样品及同样浓度的牛蒡苷元标准 溶液， 分别在前述 HPLC色谱条件下各测 定 5次， 并将测定结果进行比较， 计算绝对回收率。 结果表明:本方法在低、 中、 高三种 浓度水平上的回收率最低为 :75.6%， 能满足生物样品的测试要求。

精密度： 取 4.79x l0 g/ml、 4.79 lO"Vg/mK 4.79 g/ml三个浓度血浆在同一天内分 别进行五次测定， 计算其日内相对标准差， 精密度 RSD分别为 2.22%、 1.67%、 0.98%。 经测定其他生物样品的日内、 日间相对标准差均小于 5%， 符合生物样品的测试要求。

2.1.4血桨等生物样品预处理方法选择

血浆样品在注入色谱柱测定前需去除蛋白质等 杂质，以防止堵塞色谱柱，造成柱效降 低， 一般采用加入水溶性有机溶媒如甲醇、 乙腈等， 或加入 10%三氯醋酸等强酸除蛋白， ,或用有机溶媒提取。本实验中采用对牛蒡苷� �有较好溶解度的二氯甲垸提取生物样品，考 虑到二氯甲垸的挥发性较大， 故将二氯甲烷液挥干后加较为稳定的乙腈来溶 解， 进样。

2.2分组与给药

2.2.1牛蒡苷元微乳剂组

将禁食 12小时， 自由饮水的家兔 10只，取 1ml空白血后分别给 30mg/kg牛蒡苷元微 乳灌胃剂灌胃， 分别于给药后 0.5小时、 1小时、 1.5小时、 2.0小时、 2.5小时、 3.0小时、 4.0'小时、 5.0 小时、 6.0 小时耳缘静脉取血 lml， 置涂有肝素的离心管中， 离心 (3O00rpm)10min，取血浆 0.5ml，保存于 -20°(冰箱中，按前述生物样品制备方法进行处 理， 并制备， 保 于 -20Γ冰箱中， 测定血药浓度时取 ΙΟμΙ进样分析。

2.2.2牛蒡苷元乳剂组

将禁食 12小时， 自由饮水的家兔 10只，取 1ml窆白血后分别给 30mg/kg牛蒡苷元乳 剂灌胃， 分别于给药后 0.5小时、 1小时、 1.5小时、 2.0小时、 2.5小时、 3.0小时、 4.0 小时、 5.0小时、 6.0小吋耳缘静脉取血 lml，置涂有肝素的离心管中，离心 (3000rpm) lOmin, 取血浆 0.5ml， 保存于 -20°C冰箱中， 按前述生物样品制备方法进行处理， 并制备， 保存于 -20°C冰箱中， 测定血药浓度时取 ΙΟμΙ进样分析。

2.3数据处理

将血药浓度-时间曲线用中国药学会数学药理� �业委员会编写的 3ρ87实用药代动力 学程序进行处理， 经计算机进行曲线拟合， 求得主要药动力学参。

2.4实验结果

结果见表 1。 由此可见， 将牛蒡苷元制备成微乳制剂后， 口服生物利用度 （F)较乳 剂提高了 2倍多。

牛蒡苷元乳剂和微乳剂灌胃给药的相对生物利 用度

组别 给药剂量 ： (mg/kg) AUC g'mr ¹ '!!) AUC/D F (%) 乳剂组 30 1.4978 0.0499 14.56

微乳剂组 30 4.6520 0.1550 45.21

将实施例 2〜31制备的牛蒡苷元的微乳浓缩物或微乳制剂 替代试验例 1中使用的实施 例 1的牛蒡苷元的微乳制剂， CN101036643A说明书公开实施例 1〜7替换试验例 1中的 乳剂重复试验例 1， 结果发现 CN101036643A说明书公开实施例 1〜7牛蒡苷元的乳剂口 服生物利用度为 9.60%〜16.23%， 本发明的牛蒡苷元的微乳制剂的口服生物利用 度为 38.80%〜55.02%， 较牛蒡苷元的乳剂口服生物利用度明显提高了 1.39〜4.73倍。 试验例 2 牛蒡苷元对抗 S180肉瘤细胞小鼠移植瘤实验

1、 受试药物和实验动物

昆明种小鼠 18〜22 g, 雌雄各半， 共 50只。 小鼠肉瘤 S180细胞， 替加氟、 牛蒡苷 元乳剂 (牛蒡苷元乳剂： 处方和制备工艺同 CN101036643A说明书第 4页实施例 3， 即牛 蒡苷元乳剂的处方： 牛蒡子苷元 1.0g+蛋黄磷脂 3.0g+中链油 15g+油酸 0.08g+甘油 3.0g)， 牛蒡苷元微乳剂 （本发明实施例 1制备的牛蒡苷元微乳剂）。

2、 S180肉瘤细胞小鼠移植瘤模型的建立

S180细胞培养于 1640培养液中， n。C， 5%C0 ₂ 下常规培养， 平均每 2天传代一次， 至对数生长期时用生理盐水制备成密度为 3.0xl0 ⁷ /mL单细胞悬液， 于无菌条件下接种于 小鼠腹腔内 （约 5只小鼠， 雌雄均有）， 接种后 10天左右见小鼠腹腔明显肿大， 此时脱 颈处死小鼠， 放入盛有 75%乙醇的烧杯中浸泡 2〜3 min, 将消毒过的小鼠放于超净工作 台中，用镊子夹起腹中部皮肤，于下腹部用手 术剪剪开皮肤暴露腹部，用无菌注射器穿过 腹部肌肉抽取腹水， 放入无菌试剂瓶内备用。

将上述抽取的腹水用台盼蓝计数，采用肿瘤细 胞 >95%的移植液用生理盐水稀释， 调 整细胞数至 2χ10 ⁷ 〜6χ 10 ⁷ 个 /ml， 得肿瘤细胞悬液。

一人固定小鼠， 另一人左手捏起小鼠右前腋窝部皮肤， 顺皱褶将 l mL注射器针头插 入皮下， 每只小鼠接种 0.2mL肿瘤细胞悬液。

3、 分组与给药

接种后次日称重， 选体重相近且健康小鼠随机分为 4组， 每组 1Q只， 雌雄各半， 每 只称重记录。 于接种肿瘤细胞 24 h后灌服给药。 每只 0.2 mL， 每日 1次， 连续 14 d。

表 3各组给药方案

4、 测定指标

末次给药后空腹 24 h， 脱颈处死小鼠， 称重， 剥取瘤块并称重。 计算抑瘤率 （％) = (阴性对照组平均瘤重 -实验组平均瘤重） /阴性对照组平均瘤重 χΐοο%， 取瘤进行病理学 检查。

. 5、 结果

经病理切片实验观察，所切除的组织为肿瘤组 织，组织^ ^型性较小。牛蒡苷元乳剂组 的抑瘤率仅仅为 17.0%, 而牛蒡苷元微乳剂组的抑瘤率为 46.4%。 这表明， 牛蒡苷元微乳 制剂相对于乳剂组对抗小鼠 S180瘤的效果显著提高。

表 4给药前后体质量对照与抑瘤率

牛蒡苷元乳剂组 27.3 37.6 3.4 17.0 将实施例 2〜31制备 6ί牛蒡苷元的微乳浓缩物或微乳制剂替代试验 例 2中使用的实施 例 1的牛蒡苷元的微乳制剂， 用 CN101036643A说明书公开实施例 2〜7替换实施例 33 中的乳剂， 重复试验例 2， 结果发现本发明的牛蒡苷元的微乳制剂的抑瘤 率为 35.60%〜 53.82%, 而 CN101036643A说明书公开实施例 2〜7乳剂的抑瘤率为 10.5%〜18.3%， 这 表明本 ^发明提供的牛蒡苷元微乳制剂较 CN101036643A公开的乳剂对抗小鼠 S180瘤的效 果显著提高。 试验例 3牛蒡苷元对 KM小鼠 H22肝癌的抑制试验

1研究目的

研究牛蒡苷元对腋下种植 H22肝癌的 KM小鼠的实体瘤抑制作用。

2供试品及对照品

2.1 供试品

牛蒡苷元微乳， 冷藏， 密闭保存

2.2对照品

替加氟， 白色颗粒， 室温， 密闭避光保存

2.3供试品及对照品配制

2.3.1供试品配制：

牛蒡苷元 5mg

辛癸酸甘油酯 30mg

壬基酚聚氧乙烯醚 50mg

丙二醇 20mg

牛蒡苷元微乳剂分别按处方量称取辛癸酸甘油 酯、壬基酚聚氧乙烯醚和丙二醇，混合 均匀， 加入处方量牛蒡苷元超声， 使溶解， 即得牛蒡苷元微乳浓缩液。使用前需高压灭菌 处理。牛蒡苷元微乳测定：取牛蒡苷元微乳 lg加至 100g水中，搅拌至乳化完全后测粒径， 平均为 25nm， 符合微乳要求 （小于 100nm)。

2.3.2对照品：牛蒡苷元乳剂 (处方和制备工艺同 CN101036643A说明书第 4页实施例

1) 3 实验动物分组及识别方法

SPF级 KM小鼠 60只， 合格证号： 0008062， 雌 ¾各半， 4周龄， 20

3.1 分组方法： 根据完全随机分组方法进行分组； 雌雄分别分组。

3.2识别方法： 采用 3%苦味酸染色法， 组别间标记如表 4所示。

小鼠组间标记

, 小鼠组别 1 2 3 4 5 6 染色部位' 白 头 背 尾 左前 左中

3.3 动物词养环境条件

普通环境， 20〜25 °C， 日温差≤3 °C ; 湿度为 40%〜70%； 动物照度： 15〜20 1x _; 工 作照度： 150 k以上； 试验开展前及试验结束后对房间进行彻底清洁 消毒。每天全部作业 结束后清扫、 消毒。

3.4词养条件

笼具名称及规格： 笼具名称及规格： 鼠笼架（LxWxH 1450 mmx400 mmx l500 mm) 鼠盒（LxWxH 300 mmx lOOmmx 150mm)

词养密度： 5只 /笼

更换频率： 鼠盒隔两天更换一次。

清洁消毒： 笼架每天湿擦消毒， 消毒剂为 0.1%的新洁尔灭和 75%的乙醇溶液， 消毒 剂每周交替使用。

3.5 词料、 垫料及饮水

SPF鼠料， 辐照饲料 （批号： 10063011 )， 常规词养， 自由采食， 自由饮水；

4试验方法

4.1剂量设计： 给药组剂量设计见表 5。

将接种后的小鼠随机分为 6组， 每组 10只， 雌雄各半。

表 6小鼠给药剂量及方式

组别 组名 给药剂量 给药方式

. 1 模型组 一 灌胃

2 乳剂低剂量组 15 mg/kg 灌胃

3 乳剂高剂量组 45 mg/kg 灌胃 4 微乳低剂量组 15 mg/kg 灌胃

5 微乳高剂量组 45 mg/kg 灌胃

6 替加氟组 10 mg/m ² 維

濯冃

7 乳剂高剂量 +替加氟组 45 mg/kg +10 mg/m ² 維

濯冃

8 微乳高剂量 +替加氟组 45 mg/kg +10 mg/m ² 灌胃

4.2试验方法:

小鼠 H22细胞培养于 1640培养液中， 37°C 5 %C0 ₂ 下常规培养， 平均每两天传代 一次， 至对数生长期时用生理盐水制备成密度为 3.0χ10 ⁷ 个 /ml单细胞悬液， 在无菌条件 下注射于小鼠腹腔内， 接种后 7天见小鼠腹腔明显肿大， 此时， 脱颈处死， 放入盛有 75 %乙醇的烧杯中浸泡 2 3分钟， 将消毒后的小鼠放入超净工作台中， 暴露腹部， 用无菌 注射器抽取腹水放入无菌试剂瓶内备用。将上 述腹水用台盼蓝计数，用生理盐水稀释，调 整细胞数至 Ι.ΟχΙΟ ⁷ 个 /ml, 接种于小鼠右腋下， 每只 0.2ml

动物接种肿瘤后第四天开始给药， 每天按表 6灌胃给药 1次 （每天上午给药）， 给药 容积为 lO ml'kg— ¹ ; 模型组灌胃等量的生理盐水。 连续给药 10天。

5指标检测

5.1 体重

检测频率： 分组前及解剖前称量动物空腹体重。

仪器设备： ACS-3A-a型计价电子秤， 上海大华电子秤厂

5.2肿瘤质量

检测频率： 给药 10天后结束试验， 放血处死， 剖检。

称量重量的组织器官:.腋下肿瘤 .

剖检方法： 腹腔注射 2%戊巴比妥钠（0.3 ml.kg )麻醉， 腹主静脉取血完毕后， 剪断 腹主动脉放血处死， 然后进行常规腋下取瘤。

仪器设备： BS224S型电子天平， 北京赛多利斯仪器系统有限公司

ACS-6A型电子计价秤， 上海大华电子秤厂

6数据统计处理方法

试验数据以 ± s表示， 采用 SPSS 11.5统计软件进行数据处理。

7实验结果

实验结果显示 （实验结果见表 6): ( 1 ) 与乳剂高剂量组、 乳剂低剂量组比较， 微乳高剂量组和微乳低剂量组的抑瘤率 明显提高， 并具有显著性差异；

(2 )本发明还同时考察了牛蒡苷元与替加氟联合� �药的情形， 结果发现， 在剂量相 同的情况下，与牛蒡苷元乳剂和替加氟的联合 用药相比，牛蒡苷元微^ ^制剂和替加氟的联 合用药在抑制 H22肝癌实体瘤方面具有显著的优势， 且抑瘤率具有显著的提高。

以上实验结果进一步说明了，牛蒡苷元的微乳 制剂较牛 '蒡苷元的乳化剂具有很好的抑 瘤作用，这可能与牛蒡苷元的微乳制剂较牛蒡 苷元的乳化剂提高了口服利用度、增加了药 物吸收有关。

表 7牛蒡苷元对 KM小鼠瘤重和抑瘤率的影响 （ 士 s) 组别 剂量 瘤重 抑瘤率 模型组 - 2.05±0.89 - 乳剂低剂量组 15 mg/kg 1.92±1.55 6.3 乳剂高剂量组 45 mg/kg 1.85±0.96 9.8 微乳低剂量组 15 mg/kg 1.69±1.55 ^{A A} 17.6 微乳高剂量组 45 mg/kg 1.56±0.96 ^AA 23.9

替加氟组 10 mg/m ² 1.54±0.52 ^{Δ Α} 24.9 乳剂高剂量 +替加氟组 45mg/kg +10 mg/m ² 1.48士0.67 27.8 微乳高剂量 +替加氟组 45mg/kg +10 mg/m ² 1.23±0.51" ^ΔΑ 40.0 注意： 与乳剂低剂量组比较， ρ<0.05 ; 与乳剂高剂量组比较， ρ<0.05 ;

■与乳剂高剂量 +替加氟组比较， ρ<0.05。 试验例 4牛蒡苷元对移植性小鼠 Lewis肺癌抑瘤率影响

1 研究目的

研究牛蒡苷元对腋下种植肺癌 Lewis瘤株的小鼠的实体瘤抑制作用。

2供试品及对照品

2.1 供试品

牛蒡苷元微乳， 冷藏， 密闭保存

2.2对照品

替加氟， 白色颗粒， 室温， 密闭避光保存 2.3供试品及对照品配制

2.3.1供试品配制：

牛蒡苷元 5mg

辛癸酸甘油酯 30mg

壬基酚聚氧乙烯醚 50mg

丙二醇 20mg

分别按处方量称取辛癸酸甘油酯、壬基酚聚氧 乙烯醚和丙二醇，混合均勾，加入处方 量牛蒡苷元超声， 使溶解， 即得牛蒡苷元微乳浓缩液。使用前需高压灭菌 处理。牛蒡苷元 微乳测定：取牛蒡苷元微乳 lg加至 100g水中，搅拌至乳化完全后测粒径，平均为 25nm， 符合微乳要求 （小于 100nm)。

2.3.2对照品：牛蒡苷元乳剂 (处方和制备工艺同 CN101036643A说明书第 4页实施例

1)

3 实验动物分组及识别方法

SPF级 KM小鼠 60只， 合格证号： 0008062， 雌雄各半， 4周龄， 20

3.1 分组方法： 根据完全随机分组方法进行分组； 雌雄分别分组。

3.2识别方法： 采用 3%苦味酸染色法， 组别间标记如表 4所示。

表 8小鼠组间标记

小鼠组别 1 2 3 4 5 6 染色部位 白 头 背 尾 左前 左中

3.3 动物饲养环境条件

普通环境， 20〜25 °C， 日温差≤3 °C ; 湿度为 40%〜70%； 动物照度： 15〜20 1x _; 工 作照度： 150 1x以上； 试验开展前及试验结束后对房间进行彻底清洁 消毒。每天全部作业 结束后清扫、 消毒。

3.4饲养条件

笼具名称及规格： 笼具名称及规格： 鼠笼架（LxWxH 1450 mmx400 mmxl500 mm) 鼠盒 （LxWxH 300 mmx lOOmmx 150mm)

饲养密度： 5只 /笼

更换频率： 鼠盒隔两天更换一次。 清洁消毒： 笼架每天湿擦消毒， 消毒剂为 0.1%的新洁尔灭和 75%的乙醇溶液， 消毒 剂每周交替使用。

3.5词料、 垫料及饮水

SPF鼠料， 辐照饲料（批号： 10063011 )， 常规词养， 自由采食， 自由饮水； 试验方法

4.1剂量设计： 给药组剂量设计见表 5

将接种后的小鼠随机分为 6组， 每组 10只， 雌雄各半。

表 9小鼠给药剂量及方式

组名 给药剂 j 给药方式

1 模型组 ¾

一 mg

冃

2 乳剂低剂量组 15 mg/kg Mg

濯冃

3 乳剂高剂量组 45 mg/kg 灌胃

4 微乳低剂量组 15 mg/kg 灌胃

5 微乳高剂量组 45 mg/kg 灌胃

6 替加氟组 10 mg/m ² 維

濯冃

7 乳剂高剂量 +替加氟组 45 mg/kg +10 mg/m ² 維

濯冃

8 微乳高剂量 +替加氟组 45 mg/kg +10 mg/m ² 維

濯冃

4.2试验方法:

小鼠肺癌 Lewis瘤株细胞培养于 1640培养液中， 37°C 5 %C0 ₂ 下常规培养， 平均每 两天传代一次， 至对数生长期时用生理盐水制备成密度为 3.0χ10 ⁷ 个 /ml单细胞悬液， 在 无菌条件下注射于小鼠腹腔内， 接种后 7天见小鼠腹腔明显肿大， 此时， 脱颈处死， 放入 盛有 75 %乙醇的烧杯中浸泡 2 3分钟， 将消毒后的小鼠放入超净工作台中， 暴露腹部， 用无菌注射器抽取腹水放入无菌试剂瓶内备用 。将上述腹水用台盼蓝计数，用生理盐水稀 释， 调整细胞数至 1.0x 10 ⁷ 个 /ml， 接种于小鼠右腋下， 每只 0.2ml

动物接种肿瘤后第四天开始给药， 每天按表 6灌胃给药 1次（每天上午给药）， 给药 容积为 lO ml'kg— 模型组灌胃等量的生理盐水。 连续给药 10天。

5指标检测

5.1 体重

检测频率： 分组前及解剖前称量动物空腹体重。 仪器设备： ACS-3A-a型计价电子秤， 上海大华电子秤厂

. 5.2肿瘤质量

检测频率： 给药 10天后结束试验， 放血处死， 剖检。

称量重量的组织器官： 腋下肿瘤

剖检方法： 腹腔注射 2%戊巴比妥钠（0.3 ml*kg )麻醉， 腹主静脉取血完毕后， 剪断 腹主动脉放血处死， 然后进行常规腋下取瘤。

仪器设备： BS224S型电子天平， 北京赛多利斯仪器系统有限公司

ACS-6A型电子计价秤， 上海大华电子秤厂

6数据统计处理方法

试验数据以 ^士 s表示， 采用 SPSS 11.5统计软件进行数据处理。

7实验结果

实验结果显示 （实验结果见表 '7):

( 1 ) 与乳剂高剂量组、 乳剂低剂量组比较， 微乳高剂量组和微乳低剂量组的抑瘤率 明显提高， 并具有显著性差异；

(2)本发明还同时考察了牛蒡苷元与替加氟联合 用药的情形， 结果发现， 在剂量相 同的情况下，与牛蒡苷元乳剂和替加氟的联合 用药相比，牛蒡苷元微乳制剂和替加氟的联 合用药在抑制肺癌 Lewis实体瘤方面具有显著的优势， 且抑瘤率具有显著的提高。

以上实验结果进一步说明了，牛蒡苷元的微乳 制剂较牛蒡苷元的乳化剂具有很好的抑 瘤作用，这可能与牛蒡苷元的微乳制剂较牛蒡 苷元的乳化剂提高了口服利用度、增加了药 物吸收有关。

表 10牛蒡苷元对小鼠肺癌瘤重和抑瘤率的影响 （ ±s) 组别— 剂量 瘤重 抑瘤率 模型组 - 3.86±1.12 -

-乳剂低剂量组 15 mg/kg 3.52±1.55 8.8 乳剂高剂量组 45 mg/kg 3.35±1.01 13.2 徼乳低剂量组 15 mg/kg 2.89±1.44 ^{A A} 25.1 微乳高剂量组 45 mg/kg 2.60±0.89 ^{Δ Α} 32.6

加氟组 10 mg/m ² 2.29±0.77 ^{Δ Α} 40.6 乳剂高剂量 +替加氟组 45mg/kg+10mg/m ² 2.18±0.50 43.5 微乳高剂量 +替加氟组 45mg/kg+10mg/m ² 1.82±0.5Γ ^ΔΑ 52.8 注意： 与乳剂低剂量组比较， ρ<0.05; 与乳剂高剂量组比较， ρ<0.05;

"与乳剂高剂量 +替加氟组比较， ρ<0.05。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描 述，但是本领域技术人员应认识到，在不 偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发 明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲 涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的 所有这些改变与修饰。