DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO PARA LA DETECCIÓN DE DROGAS EN BEBIDAS

ESTADO DE LA TÉCNICA

La agresión y el abuso sexual se encuentran entre los delitos más comunes en el mundo de hoy. La agresión sexual facilitada por drogas (DFSA) ocurre cuando una persona es sometida mientras está incapacitada debido a los efectos del alcohol o las drogas, comúnmente conocidas como drogas de violación. Estas drogas han ganado mucha popularidad entre los abusadores, ya que no solo incapacitan físicamente a la víctima, sino que también dificultan su capacidad mental para que no puedan recordar nada.

Las drogas más comunes para la violación son los depresores del sistema nervioso central, que conducen a efectos farmacológicos como relajación, falta de inhibición, amnesia, alteración de la percepción, somnolencia e inconsciencia, entre otros. Estos medicamentos producen efectos de acción rápida y corta duración en dosis bajas y se pueden mezclar fácilmente en los alimentos y bebidas, ya que no presentan olor, sabor o color. Las sustancias más comúnmente utilizadas como drogas de violación incluyen hipnóticos y benzodiazepinas, analgésicos-anestésicos (por ejemplo, ketamina o fentanilo), escopolamina y ácido y-hidroxibutírico (GHB).

Por ejemplo, la ketamina es un medicamento anestésico utilizado con fines médicos, que causa pérdida de memoria, alucinaciones visuales y distorsión del tiempo y el espacio. Por otro lado, las benzodiazepinas comprenden una familia de depresores del sistema nervioso central que incluyen diazepam, midazolam, clonazepam y flunitrazepam, entre otros. Tienen propiedades ansiolíticas, sedantes e hipnóticas, que aumentan cuando el medicamento se toma en combinación con alcohol. Comúnmente, la detección de estas drogas en casos de agresión sexual se lleva a cabo utilizando técnicas instrumentales altamente sofisticadas como la cromatografía de líquidos o de gases acoplada a la espectrometría de masas. A pesar del alto nivel de sensibilidad, precisión y especificidad que presentan los métodos cromatográficos, no son adecuados para el análisis in situ debido a la complejidad de la instrumentación y al requisito de estrictas condiciones de laboratorio y personal capacitado.

Se han empleado varias estrategias, incluidos métodos electroquímicos y de detección basados en el color, para la generación de pruebas in situ para la detección de drogas de violación. En particular, las pruebas basadas en el color se han utilizado durante décadas en el análisis presuntivo in situ de muestras debido a su simplicidad, rapidez y portabilidad. Los avances en campos como el análisis digital de color, el desarrollo de sensores colorimétricos sólidos y los dispositivos microfluídicos han llevado a un creciente interés en el uso de este tipo de pruebas en el sitio de su uso.

Existen pruebas basadas en el color disponibles comercialmente para detectar drogas de violación en bebidas, como Drink Guard y Drink Detective. La prueba Drink Guard detecta ketamina y GHB, y el Drink Detective puede detectar muchas más drogas como ketamina, benzodiazepinas o GHB. Sin embargo, se demostró que estas pruebas dan falsos positivos y, además, muestran problemas para la detección de fármacos en diferentes matrices.

En los últimos años han surgido dispositivos analíticos microfluídicos basados en papel, ya que son pruebas colorimétricas simples in situ para el análisis múltiple de una amplia variedad de analitos. Estos sistemas se basan en reacciones químicas simples que producen resultados visibles que pueden interpretarse a simple vista. En los últimos años se han desarrollado varios dispositivos microfluídicos para la detección a simple vista de compuestos psicotrópicos, incluida la ketamina, utilizando reacciones colorimétricas. Por ejemplo, Musile et al. desarrollaron un dispositivo microfluídico basado en papel de seis canales para la detección a simple vista de ketamina, entre otras drogas psicotrópicas, incluyendo morfina, epinefrina y codeína. Más recientemente, Yehia et al. desarrollaron un sistema trimodal en un dispositivo microfluídico basado en papel que combina sensores potenciométricos, fluorométricos y colorimétricos para la detección sensible y específica de ketamina. Sin embargo, en ambos casos la reacción colorimétrica presentó un alto límite de detección, inhabilitando su uso en un escenario de caso real.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un dispositivo para la detección de compuestos. En particular, la presente invención se refiere a un dispositivo microfluídico para la detección de drogas de violación a partir de su análisis colorimétrico, así como el método para su uso.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 : Estructura del dispositivo microfluídico.

Figura 2: Dispositivo microfluídico cubierto y descubierto.

Figura 3. Cambios de color por benzodiazepinas y ketamina (Reactivo de Morris y Scott).

Figura 4. Curva de calibración para la detección de ketamina.

Figura 5. Curva de calibración para la detección de benzodiazepinas.

Figura 6: Método para detectar la presencia de drogas de violación en bebidas. DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención proporciona un dispositivo microfluídico para la detección de drogas de violación en bebidas a partir de su análisis colorimétrico.

En una modalidad preferida, la presente invención se refiere a dispositivos microfluídicos que comprenden varias capas superpuestas. Preferiblemente, los dispositivos microfluídicos comprenden una superposición de capas inferiores, medias, superiores y una capa intermedia de detección que comprende una estructura microfluídica. Preferiblemente, las capas superpuestas conforman un dispositivo rectangular.

Preferiblemente, la capa inferior comprende una capa hidrófila de un adhesivo sensible a la presión (PSA). Preferiblemente el adhesivo sensible a la presión (PSA) es un material hidrófilo con un ángulo de contacto de entre 6 ^o - 7 ^o . Preferiblemente, el PSA comprende un film de poliéster recubierto en ambas caras de adhesivo acrílico, por ejemplo, ARflow®93049.

Preferiblemente, la capa intermedia de detección comprende una estructura microfluídica, en donde la estructura microfluídica comprende una abertura, un canal, al menos dos áreas de detección y un canal de salida, dispuestos de manera secuencial, en donde la capa intermedia comprende un PSA de doble cara. Preferiblemente el adhesivo sensible a la presión (PSA) es un material hidrófilo con un ángulo de contacto de entre 6 ^o - 7 ^o . Preferiblemente, el PSA comprende un film de poliéster recubierto en ambas caras de adhesivo acrílico, por ejemplo, ARflow®93049. La capa intermedia de detección permite que un el volumen suficiente de muestra de la bebida fluya desde la bebida hasta el área de detección porcapilaridad. También proporciona la distancia necesaria para que el líquido fluya hacia arriba y cree el espacio para mantener el volumen necesario de la muestra. Preferiblemente, la estructura microfluídica comprende un canal de purga dispuesto antes de la cámara de detección.

Preferiblemente, la capa de detección comprende los reactivos necesarios para la reacción de identificación en un material de celulosa. Como se define aquí, el material de celulosa se selecciona de nitrocelulosa, carboximetilcelulosa, dietilaminoetilcelulosa, fosfocelulosa, celulosa sustituida con amonio cuaternario y sulfoxietilcelulosa. Preferiblemente, los reactivos se encuentran impregnados nitrocelulosa. Preferiblemente, los reactivos pueden encontrarse en ionogeles en los materiales de celulosa o cualquier material similar.

Preferiblemente, la capa de detección comprende dos secciones parcialmente cerradas que contienen las áreas de detección unidas por un canal ramificado que parte del canal de entrada formando dos canales simétricos con respecto al eje longitudinal que rodean la primera sección parcialmente cerrada para unirse al canal que une los dos tramos parcialmente cerrados, donde el canal que une las dos secciones parcialmente cerradas se bifurca formando dos canales simétricos con respecto al eje longitudinal de la misma de manera que rodean la segunda sección parcialmente cerrada y se unen para formar el canal de salida. La disposición de la capa de detección está descrita en la figura 1 .

Preferiblemente, el material de celulosa comprende dos secciones parcialmente cerradas unidas por un canal ramificado, donde el canal ramificado parte del canal de entrada formando dos canales simétricos con respecto al eje longitudinal que rodean la primera sección parcialmente cerrada para unirse al canal que une los dos secciones parcialmente cerradas, donde el canal que une las dos secciones parcialmente cerradas se bifurca formando dos canales simétricos con respecto al eje longitudinal de la misma de manera que rodean la segunda sección parcialmente cerrada y se unen para formar el canal de salida. Preferiblemente, la segunda sección parcialmente cerrada está compuesta por dos círculos parcialmente superpuestos. La disposición del material de celulosa está descrita en la figura 1.

La configuración del material de celulosa permite el paso del líquido hacia la primera sección parcialmente cerrada donde se detecta la benzodiazepina y simultáneamente el paso del líquido hacia la segunda sección parcialmente cerrada donde se detectan la ketamina. La configuración en dos elipses de la segunda sección parcialmente cerrada permite la reacción de la ketamina con el compuesto colorimétrico en la primera elipse y la posterior acumulación del compuesto colorimétrico resultante en la segunda elipse por capilaridad.

La capa superior comprende una abertura o ventana superpuestas al área de detección de manera que el cambió de coloración se puede apreciar a simple vista. La capa superior puede ser una capa de material hidrofílico o hidrofóbico funcionalizado, como pueden ser polimetilmetacrilato (PMMA), polimetacrilato (PMA), tereftalato de polietileno (PET), polidimetilsiloxano (PDMS), elastómero termoplástico (TPE), poliestireno (PS), policarbonato (PC), diacrilato de polietilenglicol (PEGDA), poletilenglicol (PEG), poliuretano (PU), copolímero de defina cíclica (COC), polímero de defina cíclica (COP), teflones, hidrogeles e ionogeles. Preferiblemente, la capa superior es de polimetilmetacrilato (PMMA).

En una modalidad preferida, el área de detección comprende un círculo inferior, medio y superior unidos secuencialmente en un eje longitudinal por un canal. Preferiblemente, el área de detección comprende un círculo del que sobresale un canal.

En una modalidad preferida, la capa inferior comprende un espesor entre 100 y 500 pm, la capa media comprende un espesor entre 50 pm y 1 mm, y la capa superior comprende un espesor entre 100 y 500 pm. En una modalidad preferida, la longitud del material de celulosa comprende una longitud entre 1 y 10 cm, preferiblemente de 5 cm. La longitud del dispositivo permite acumular suficiente color para la observación.

La capa de detección cuenta con los reactivos necesarios para generar un cambio de color en presencia de marcadores químicos (moléculas inorgánicas, metales e iones, como por ejemplo Na ⁺ , K ⁺ , L¡ ⁺ , I; CI", nitratos, nitritos, iones de Cu, Co, y Fe, H ₂ O, O ₂ , CO ₂ ) y bioquímicos (moléculas orgánicas, derivados metabólicos, moléculas de gran tamaño, como por ejemplo etanol, compuestos organometálicos, glucosa, lactato, disacáridos, lípidos, proteínas, lipoproteínas, ácidos nucleicos, ADN, hormonas).

En una modalidad preferida, la capa intermedia de detección puede detectar la presencia de “drogas de violación” tras recibir la muestra a probar. La capa de detección cuenta con los reactivos necesarios para generar un cambio de color. Como se define aquí, “drogas de violación” comprenden preferiblemente benzodiazepinas y ketamina, pudiéndose incluir en este grupo por ejemplo escopolamina y ácido gamma hidroxibutírico (GHB) entre otras. Como se define aquí, benzodiazepinas comprende cualquiera de los compuestos diazepam, midazolam, clonazepam, flunitrazepam, temazepam, estalozolam, alprazolam, lormetazepam, lorazepam, bromazepam, nitrazepam, chlordiazepoxide, albandazole, meloxicam.

Para la detección de benzodiazepinas se utilizan reacciones colorimétricas o luminiscentes, preferiblemente la reacción de Scott, pero no limitada, pudiéndose usar reacciones tipo valoración, inmunoensayos, inmunoensayo competitivo, inmunoensayo mediado por enzimas, enzimáticas, y aptámeros entre otras. La reacción de Scott consiste en la formación de un complejo de color entre la benzodiazepina y tiocianato de cobalto (II) en un medio ácido. De acuerdo con la reacción, se observa un cambio de color a rosa para el resultado negativo y a azul / morado para el resultado positivo. Para la detección de ketamina se utilizan reacciones colorimétricas o luminiscentes, preferiblemente, la reacción de Morris, pero no limitada, pudiéndose usar reacciones tipo valoración, inmunoensayos, inmunoensayo competitivo, inmunoensayo mediado por enzimas, enzimáticas, y aptámeros entre otras. La reacción de Morris consiste en la formación de un complejo de color entre la ketamina y tiocianato de cobalto (II) en un medio básico. De acuerdo con esta reacción, no se observó ningún cambio de color para el resultado negativo y un color azul para el resultado positivo.

Para la detección de otras drogas de violación como por ejemplo escopolamina y GHB, se utilizan reacciones colorimétricas o luminiscentes, como también reacciones tipo valoración, inmunoensayos, inmunoensayo competitivo, inmunoensayo mediado por enzimas, enzimáticas, y aptámeros entre otras.

En una modalidad preferida, el método para detectar la presencia de drogas de violación en bebidas comprende en insertar el dispositivo microfluídico en la bebida durante unos segundos comprendidos entre 1 y 10 segundos, preferiblemente 5 segundos, y llenar el depósito de muestra del dispositivo. Esperar al menos 1 minuto, preferiblemente 3 minutos, más preferiblemente 5 minutos y evaluar el color del dispositivo, preferiblemente a simple vista o por medios electrónicos.

La configuración multicapa garantiza la protección del sensor, evita fugas de reactivos a la bebida y actúa como un depósito para almacenar el volumen exacto de líquido necesario para humedecer todo el material de celulosa y asegurar el rendimiento autónomo del dispositivo.

En una modalidad preferida, el dispositivo se puede laminar para brindar protección contra el entorno externo sin comprometer la integridad de la prueba al permitir la permeabilidad de la muestra durante su uso. Preferiblemente, el aparato puede ser impermeable, o sustancialmente impermeable, hasta que el aparato se activa, por ejemplo, tras la eliminación de una capa extraíble u otros métodos.

EJEMPLOS

Detección de ketamina (Ejemplo 1)

Para el ensamblaje del área de detección, se colocaron 25 pL de la solución del sensor de ketamina en el círculo inferior del papel y se dejaron secar. El sensor de ketamina consistía en un precipitado en suspensión, por lo que cuando la solución se depositaba sobre el papel, se puede observar un precipitado verde en el círculo inferior, con un sobrenadante rosa claro que se puede ver en la mitad inferior del material de celulosa. Este precipitado reacciona para formar el complejo, volviéndose soluble.

Para la detección de ketamina en bebidas, el extremo del dispositivo, que comprende la entrada, se sumergió en la bebida durante 5 s para llenarla y posteriormente se retiró de la bebida. Luego, el líquido almacenado fluyó de forma autónoma a través del papel hasta el punto final del material de celulosa. Cuando la bebida adulterada pasaba por el área de detección se podía observar un cambio de color tanto en el círculo inferior, donde se depositaba la solución del sensor, como en la parte superior del material de celulosa de papel, incluidos los círculos medio y superior. El dispositivo introducidas en una solución de 5 mg de ketamina mL-1 mostraron dos cambios de color. Primero, el precipitado ubicado en el círculo inferior se convirtió en un color púrpura azulado con el tiempo. El sobrenadante, que fluyó desde el área de detección hasta el punto final del material de celulosa, se convirtió en un color azul brillante, apreciable en el círculo superior 5 minutos después de cargar el dispositivo, pero inmediatamente después de que la solución llegó al sensor. Al introducir el dispositivo en bebidas no adulteradas (por ejemplo, agua destilada), el color del precipitado formado en el primer círculo permaneció verde, y el sobrenadante que se puede observar en la parte superior del dispositivo se convierte en un color rosa claro.

Sensibilidad para la ketamina (Ejemplo 2)

Para probar la sensibilidad del dispositivo, se llevó a cabo una curva de calibración para el dispositivo microfluídico de ketamina. Para este propósito, se prepararon 6 soluciones de ketamina, incluidas cinco concentraciones diferentes del medicamento: 0, 1 , 2, 3, 4, 5 mg ml-1, (n = 3). Las imágenes se obtuvieron en los dispositivos 10 minutos después de la carga de las soluciones. Se puede observar que el color azul es observable desde el medio hasta el punto final del material de celulosa, mostrando resultados positivos. Los hotógrafos P del dispositivo microfluídico de ketamina fueron analizados y procedidos por ImageJ. Todas las imágenes se transformaron en imágenes RGB. Se eligieron valores rojos para la curva de calibración. La ecuación de la curva de calibración fue y = 6,86x + 32,75 (R2: 0,9740), obteniendo un límite de detección (LoD) de 0,71 mg mL-1.

Teniendo en cuenta la dosis oral efectiva de ketamina en su uso anestésico (6-10 mg kg- 1), y el posible volumen de los diferentes vasos (30 - 500 mL), la concentración de ketamina que se puede encontrar en bebidas adulteradas varía de 0.72 mg mL-1 a 20 mg mL-1. En su forma actual, el dispositivo microfluídico de ketamina permite la detección adecuada de ketamina para todas las concentraciones posibles encontradas en escenarios reales.

Para probar el dispositivo en diferentes matrices, se eligieron una variedad de bebidas convencionales que incluyen Coca-cola, Orange Kas, Lemon Kas, Schweppes Tonic y Gin (Steward) + Schweppes Tonic (3: 7). Se preparó una solución de ketamina de 5 mg mL-1 con cada matriz. Se preparó una solución de ketamina de 5 mg mL-1 con cada matriz. Una bebida adulterada con ketamina produjo un color cambiado a azul en la sección media superior del material de celulosa. Sin embargo, los resultados negativos mostraron coloraciones inesperadas dependiendo del tipo de matriz. Para las matrices Lemon Kas y Gin-Tonic, los dispositivos tenían un cambio de color distintivo a rosa claro, mientras que, con otras bebidas, como Coca-Cola, Orange Kas y Tonic, los dispositivos negativos tenían una coloración ligeramente azul cerca del punto final. Sin embargo, todavía se observó una gran diferencia entre las coloraciones de los dispositivos negativos y positivos. Estos resultados indican que el dispositivo microfluídico de ketamina es capaz de detectar la adulteración de una amplia gama de bebidas comunes. Curiosamente, la coloración del área de detección de la franja donde se depositó el precipitado (círculo inferior) tendía a desaparecer con el flujo de las bebidas. Esto indica que el pH y la composición de la bebida afectan no solo la reacción de detección, sino también la capacidad de disolver el precipitado. Además, esto confirma la necesidad de colocar la ventana entre el círculo medio y el superior para evitar resultados falsos positivos.

Detección de benzodiazepinas (Ejemplo 3)

Para el ensamblaje del área de detección, se colocaron 9,5 pL de la solución del sensor de benzodiazepinas en el único círculo del papel y se dejaron secar. En el caso de las benzodiazepinas, el sensor era una solución homogénea sin precipitado apreciable, dando como resultado un color homogéneo en toda el área de detección papel. Su principio de funcionamiento es similar al de la ketamina y consistía en insertar el extremo del dispositivo, donde se coloca la entrada d, en la bebida durante 3 s para llenar el depósito del canal con el líquido de muestra. Una vez lleno, el dispositivo microfluídico se retiró de la bebida. Inmediatamente después, el líquido almacenado fluyó hacia el punto final del material de celulosa absorbiendo la muestra y humedeciendo el material en el camino. Tras la evaporación de la solución del sensor, se encontró que el color del material de celulosa era azul. Cuando se introduce en bebidas no adulteradas (por ejemplo, agua destilada), el color cambia de azul a rosa claro. Por otro lado, en el caso de un resultado positivo, cuando el dispositivo microfluídico de benzodiazepinas se introduce en una solución de diazepam 2,5 mg mL-1 , se observó un cambio de color de azul a púrpura ya durante el primer minuto de operación.

Sensibilidad para las benzodiazepinas (Ejemplo 4)

Se prepararon y probaron con el dispositivo 5 soluciones de diazepam, incluyendo 0, 0.5, 1 , 2 y 3 mg mL-1 de diazepam en agua destilada. Las fotografías del dispositivo microfluídico de benzodiazepinas fueron analizadas y procesadas por ImageJ utilizando el mismo protocolo que el utilizado para la ketamina. La ecuación de la curva de calibración fue: y = 21 ,47x + 58,37 (R2: 0,9947), con 0,55 mg mL-1 como límite de la detección.

Teniendo en cuenta la dosis oral efectiva para diazepam cuando se usa como hipnótico (10-20 mg), y el posible volumen de los diferentes vasos (30 - 500 mi), la concentración de benzodiazepinas que se pueden encontrar en bebidas adulteradas varía de 0.02 mg mL-1 a 0.66 mg mL-1. En su forma actual, el límite de la detección del dispositivo microfluídico de benzodiazepinas se encuentra dentro del rango de concentraciones de diazepam que se pueden encontrar en escenarios reales.

Para probar diferentes matrices, se utilizaron las mismas bebidas convencionales que para el dispositivo microfluídico de ketamina. Las matrices fueron adulteradas con 2,5 mg mL-1 diazepam.

Cuando se introdujo en bebidas no adulteradas, el color cambió de azul a rosa claro. En todos los casos, cuando el dispositivo se introdujo en una bebida adulterada, el color cambió a púrpura. Dispositivo microfluídico combinado de ketamina y benzodiazepinas (Ejemplo 5)

El método de ensamblaje fue el mismo que en secciones anteriores donde se colocaron 6,5 pL de la solución del sensor de benzodiazepinas en el círculo inferior, mientras que 7,5 pL de la solución del sensor de ketamina se colocaron en el círculo medio y se dejaron secar. El dispositivo microfluídico se alineó manualmente y se ensambló desde las capas inferiores hasta las capas superiores.

Este dispositivo microfluídico utilizó el mismo principio de funcionamiento que sus partes individuales anteriores, donde el canal de entrada se sumergió en la bebida durante 5 s para llenar el canal del depósito. En este caso, el líquido pasó a través de ambos sensores mientras humedecía el material de celulosa, primero a través del sensor de benzodiazepinas y luego a través del sensor de ketamina. El sensor de benzodiazepinas es una solución homogénea que no requiere una vía fluídica. Contrariamente a eso, el sensor de ketamina, forma un precipitado que se disuelve después de la reacción con el medicamento, por lo que se necesita una ruta de papel para acumular el color azul. Esta acumulación ocurre al final del círculo central, por lo que la ventana de visualization se colocó sobre un círculo superior. El círculo superior también fue necesario para mover la muestra sobre el área de detección durante el tiempo requerido y, por lo tanto, para observar ambos fármacos a través de la colorimetría.

Los colores antes de que el dispositivo se introdujera en la bebida eran: azul para el sensor de benzodiazepinas y verde para el precipitado del sensor de ketamina. Cuando la entrada del dispositivo microfluídico se sumergió en el agua destilada como un control negativo, el sensor de benzodiazepinas cambió de color a rosa, el precipitado de ketamina cambió a verde claro y el sobrenadante de ketamina observado en la parte superior-media del dispositivo de papel de ketamina se convirtió en un rosa claro, como se mostró anteriormente. Para la detección de benzodiazepinas, el dispositivo microfluídico combinado se introdujo en una solución de 2,5 mg de diazepam mL-1 (n = 3). Como era de esperar, el sensor de benzodiazepinas cambió de color de azul a púrpura en los primeros 5 minutos. En este caso, la interacción entre el diazepam y el área de canto de ketamina no produjo un cambio en el color, apareciendo similar a los controles negativos con bebidas no adulteradas.