La présente invention concerne une souche de microorganisme et de nouveaux composés manifestant des propriétés inhibitrices de farnésyl transférase.

Différents gènes, appelés proto-oncogènes et gènes suppresseurs, sont impliqués dans le contrôle de la division cellulaire. Parmi ceux-ci, les gènes ras et leurs produits généralement désignés protéines Ras, jouent un rôle clé dans le contrôle de la prolifération cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Notamment, il a été montré que certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogéniques. C'est ainsi qu'un grand nombre de tumeurs humaines (environ 10 à 30%) ont été associées à la présence de gènes ras modifiés.

L'élucidation du rôle exact de ces protéines Ras dans les cellules, de leur mode de fonctionnement et de leurs caractéristiques constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension et l'approche thérapeutique de la cancérogénèse.

La protéine correspondante est synthétisée in vivo sous la forme d'un précurseur cvtosoluble puis modifiée de façon post-traductionnelle de manière à lui conférer son activité biologique et lui permettre de transformer les cellules de mammifères. La première et obligatoire étape de ces modifications post- traductionnelles consiste en une farnésylation du groupe thiol d'un motif cystéine, localisé au niveau du groupement carbonyle terminal de Ras. Ce motif cystéine fait partie de la séquence d'identification de la prénylation, CAAX (SEQ ID N°l), où C représente la cystéine, A un résidu aliphatique et X un acide aminé quelconque. C'est la protéine farnésyl transférase qui catalyse le transfert d'un groupement famésyle du diphosphate farnésyle au composé CAAX Ras et donc qui confère, à l'issue de cette prénylation, l'activité biologique requise à la protéine pour transformer les cellules. La découverte de composés inhibant cette modification post-traductionnelle est vite apparue comme un des moyens possibles pour la mise au point de nouveaux traitements anti-cancéreux. L'inhibition de la farnésylation de Ras empêcherait la localisation de la protéine Ras au niveau membranaire et par conséquent bloquerait sa faculté à transformer les cellules normales en cellules cancéreuses.

La présente invention a pour objet principal de proposer de nouveaux inhibiteurs de farnésyl transférase.

Plus précisément, la présente invention résulte de l'isolement d'une souche de microorganisme apparentée au genre Chrysosporium plus préférentiellement à l'espèce lobatum possédant des propriétés particulièrement avantageuses pour la production de composés manifestant des propriétés inhibitrices à l'égard de la protéine farnésyl transférase.

Un aspect de l'invention concerne donc une souche Chrysosporium caractérisée en ce qu'il s'agit du microorganisme Chrysosporium CBS 123.95, d'un de ses dérivés ou de ses mutants.

Au sens de la présente invention, on entend par dérivé ou mutant, toute souche obtenue à partir de la souche Chrysosporium CBS 123.95 et susceptible d'être utilisée pour la production de composés selon l'invention et plus particulièrement manifestant des propriétés inhibitrices à l'égard de la protéine farnésyl transférase. En particulier, de tels dérivés ou mutants peuvent être obtenus par modifications génétiques (altération au niveau de l'ADN) ou biochimiques. A cet effet, différents outils de mutagénèse peuvent être utilisés, comme par exemple des outils non spécifiques:

- agents physiques (rayons X, rayons ultra-violet...) ou - agents chimiques (agents alkylants ou bialkylants, agents intercalants...), ou des outils spécifiques tels que les systèmes d'insertions mutationnelles dirigés sur l'ADN (transposons, rétrotransposons, plasmides intégratifs, etc).

La fermentation de cette souche sur un milieu de culture convenable et l'extraction subséquente du moût de fermentation correspondant permet d'isoler des composés qui, quoique possédant une structure originale comparativement aux inhibiteurs classiques de farnésyl transférase, se révèlent, de manière inattendue, intéressants à ce titre.

La présente invention concerne également des composés susceptibles d'être obtenus par fermentation de la souche Chrysosporium CBS 123.95 ou d'un de ses mutants via l'extraction du moût de fermentation correspondant.

Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de production de métabolites actifs selon lequel on cultive la souche Chrysosporium CBS 123.95 ou l'un de ses dérivés ou mutants et l'on récupère au moins un métabolite actif.

La fermentation de la souche est réalisée de manière classique à savoir sur un milieu de culture contenant les susbtrats nécessaires au développement dudit

microorganisme et dans des conditions de température et d'aération adéquate. Il est clair que la mise au point de ces conditions optimales pour le développement du microorganisme fait appel à de simples opérations de routine, familières à l'homme du métier.

A titre indicatif, le milieu de culture peut comprendre de l'extrait de malt et de la gélose. La fermentation est réalisée de préférence à une température supérieure à la température ambiante et plus particulièrement de l'ordre de 20°C à 30°C. Le pH est de l'ordre de 7 et le milieu est aéré et agité.

A l'issue de la fermentation, on récupère le moût de fermentation et on procède à son extraction. Cette extraction est effectuée à un pH acide, à l'aide d'un solvant organique adéquat. Il s'agit de préférence d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont recueillies, concentrées et réextraites avec une solution aqueuse alcalinisée à pH de l'ordre de 9. Les phases aqueuses correspondantes sont réunies, réacidifiées et extraites par un solvant organique. Le composé selon l'invention est récupéré par précipitation à l'issue de la concentration de la phase organique correspondante. L'exemple 1, présenté ci-après, rend compte de manière détaillée de ce processus d'isolement de composés selon l'invention à partir d'un moût de fermentation.

Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à des composés de formule générale I et leurs sels

dans laquelle:

- Rj représente un groupement alkoxy en Cj à C5, un groupement aldéhyde, carboxylique, un ester d'alkyle en C] à C5 ou un groupement alkyle-hydroxyle en C _j à C ₅ .

- R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle inférieur, linéaire ou ramifié, en Cj à C4 et

- R3 représente un groupement alkyle en C] à C4, un groupement hydroxyle ou un groupement alkoxy en C\ à C4.

Plus préférentiellement, il s'agit de composés de formule générale II:

dans laquelle R2 et R4 répondent à la définition présentée ci-dessus pour R2 et R5 représente un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en C] à C5, le cas échéant substitué par un groupement choisi parmi les groupements hydroxyle ou phényle, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements méthyle, méthoxy, hydroxyle ou halogène.

A titre de composés préférés selon l'invention, on peut plus particulièrement mentionner le composé suivant ainsi que ses sels:

De manière inattendue, il présente une activité significative in vitro dans le test d'inhibition de la farnésyl transférase.

Le principe de la technologie SPA ( Scintillation Proximity Assay) est appliqué au dosage de l'activité enzymatique de la farnésyl transférase. Selon cette méthode, l'activité inhibitrice farnésyl transférase est déterminée par la quantité de

(^H) famésyle transférée à partir du (^H) farnésyl pyrophosphate ^H FPP sur un substrat accepteur biotinylé.

La présente invention se rapporte également à l'utilisation des composés selon l'invention dans les traitements anticancéreux.

Elle concerne en outre les compositions pharmaceutiques contenant une quantité suffisante d'au moins un composé selon l'invention en mélange avec un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables, inertes ou physiologiquement actifs.

1 MATERIELS ET METHODES

Un échantillon de la souche Chrysosporium selon l'invention et mise en oeuvre dans l'exemple présenté ci-après, a été déposé et enregistré auprès du Centraalbureau voor Schimmel culturen (CBS) à Baarn aux Pays-Bas dans les conditions du Traité de Budapest, sous le numéro CBS 123.95.

Méthode employée pour détecter les métabolites actifs : test d'inhibition de la farnésyl transférase par scintillation proximity assay (SPA).

Le principe de la technologie SPA ( H.E. Hart and E.B. Greenwald, J. Nucl Med, 20, 1062-1065, 1979 et Nelson N., Analytical Biochemistry, ___, 287-293,1987.) est appliqué au dosage de l'activité enzymatique de la farnésyl transférase (Ftase). Cette enzyme a été partiellement purifiée à partir de cellules THP1 humaines (Fromage N., Guitton J.D., Joyeux C, Desanlis F., Boniface O., Soria H. M., Boucher F., Clerc F.F., Crespo A., Duchesne M., Lavayre J., Tocque B;, Van Der Pyl D., Mayaux J.F., Becquart J., 5th European Meeting of GFBC on bio-chromatography and molecular biolog)', May 12-14, 1992, France). Le substrat accepteur , biotinylé, est un peptide de 11 acides aminés correspondant à la séquence terminale de la lamine-B (BLB). Le substrat donneur, le farnésyl pyrophosphate est marqué au tritrium ^H FPP. L'enzyme transfère le ^H FPP au substrat accepteur biotinylé et une fois la réaction arrêtée, le peptide famésyle est capturé par des billes encapsulant un scintillant fluorescent et couplées à la streptavidine (kit Amersham, TRKQ7010®). Le peptide radio-marqué,

excite les billes qui émettent alors de la lumière que l'on quantifie dans un compteur à scintillation solide-liquide (Topcount® , Packard).

La réaction SPA est démarrée en ajoutant 40μl de Ftase (2μg) dans une microplaque contenant 20 μl de BLB (0,1 μM), 20 μl de ³ H FPP (0,12 μM) et 20 μl de tampon d'essai 50 mM Hepes, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 20 mM KC1, 0.01 % triton X100 (témoin) ou 20 μl d'échantillon dilué dans le tampon d'essai (screening). La plaque est incubée 60 minutes à 37°C et la réaction est stoppée par l'ajout de 150 μl de réactif d'arrêt contenant les billes SPA. La plaque est scellée avec un film adhésif et laissée 30 minutes à température ambiante pour atteindre l'équilibre, puis comptée dans le compteur Topcount. Les résultats sont comptés en désintégration par minute, dpm, et exprimés en % d'inhibition par rapport au témoin enzyme (après soustraction du blanc). Les CI50 des composés sont calculées par régression non linéaire.

EXEMPLE 1

Préparation d'un métabolite actif selon l'invention à partir de la souche Chrysosporium CBS 123.95.

Trois erlenmeyers de 250 ml remplis avec 50 ml de milieu préalablement stérilisé (peptone 5g/l, extrait de viande 5g/l, glucose 10g/l, chlorure de sodium 5g/l, agar l /1, tween 85 lg/1, pH 7,2) sont ensemencés par une culture du Chiysosporium CBS 123.95 sous forme de culture liquide congelée. Ils sont agités à 240 trs/min dans un agitateur thermostaté à 28°C.

Après 5 jours, 100 ml de ces cultures sont transférés dans un ballon de 6 1 rempli par 21 du même milieu. Ce ballon, muni de 2 tubulures latérales (une pour l'ensemencement, l'autre pour l'inoculation du fermenteur) est mis en agitation à 22°C sur un tambour magnétique à 600 tours par minutes environ. Après 72 heures d'incubation, la totalité de cette culture est transférée stérilement dans un fermenteur de production de 100 litres rempli avec 60 litres de milieu préalablement stérilisé (extrait de malt 20g/l, agar lg/1, tween 85 lg/1). Pendant 142 heures la culture est maintenue à une température de 23°C, une pression de 0,5 bar, agitée à 200 trs/min et aérée à raison de 1 ,5 m3/hr.

1-3 Extraction et purification

58,2 kg de moût sont acidifiés à pH 3 puis agités pendant 1 heure avec 1 volume d'acétate d'éthyle. Après séparation de la phase organique par centrifugation l'ensemble des opérations précédentes est renouvelé 1 fois. Les 2 phases organiques sont réunies et concentrées sous pression réduite à 5 litres. L'extrait acétate d'éthyle obtenu est extrait à son tour par agitation pendant une heure avec 1 volume d'une solution aqueuse alcalinisée à pH 9. La phase organique est écartée par décantation et centrifugation. La phase aqueuse est acidifiée à pH 3 et extraite par 2 fois 1 volume d'acétate d'éthyle. Après décantation et centrifugation, la phase organique est concentrée sous pression réduite à 1,5 litre; à ce stade de concentration une précipitation apparaît. Après décantation, le surnageant est écarté et le précipité formé est séparé par filtration sur verre fritte N°4. Nous obtenons après séchage une nuit à l'étuve sous vide un extrait de 1 ,7 g présentant une CI50 inférieure à 3 μg/ l. L'étape suivante de purification consiste en une chromatographie de perméation sur support Sephadex LH20® (Pharmacia) effectuée sur des parties aliquotes de cet extrait sec . Par exemple, 500 mg sont dissous dans 10 ml d'un mélange MeOH/H2θ 1/1 v/v puis déposés au sommet d'une colonne cylindrique en verre de 30 mm de diamètre interne et de 100 cm de hauteur contenant le support préalablement gonflé dans le méthanol. L'élution s'effectue dans le méthanol à 0,5 ml/min. Des fractions de 2 ml sont collectées. A ce stade, les fractions obtenues peuvent être analysées par chromatographie sur couche mince sur plaque de silice Merck 60 F 254® avec l'éluant AcOEt/EtOH/H2θ 40:15:15, v:v:v. Dans ce système le métabolite recherché migre à un rapport frontal (Rf) compris entre 0,4 et 0,50, et se révèle de couleur bleu après pulvérisation du réactif de Dittmer ( bleu de molybdène Sigma®). Le métabolite actif est localisé dans les fractions 25 à 45 qui sont réunies, évaporées sous vide pour donner au total 1 ,1 g de poudre beige présentant une CI50 inférieure à 1 μg/ml. La purification peut être poursuivie par chromatographie liquide haute performance: le produit actif précédent (1,1g), remis en solution dans un mélange MeOH/H2θ 50:50 est injecté à raison de 0,5 ml pour chaque chromatographie dans un appareil HPLC équipé comme suit : colonne : BioSil HL90-10® (Biorad), C18 10μm , 250x10 mm débit de 3 ml/min élution isocratique A/B, 20:80, v:v

A : H2O avec 0,1 % TFA

B : CH3CN / H2θ, 95: 5, avec 0,1 % TFA détection UV à 210 nm.

Le métabolite actif est collecté au temps de rétention de 6,6 min. A l'issue de multiples injections et séparations par HPLC dans les conditions citées ci-dessus, les fractions renfermant le produit actif sont réunies. Après évaporation de l'acétonitrile sous pression réduite, l'extrait actif est percolé sur une colonne Mega Bond Elut ® C18 Varian qui est ensuite rincée par de l'eau distillée jusqu'à pH neutre de l'effluent ; l'élution s'effectue ensuite par environ 20 ml de méthanol. Après évaporation sous pression réduite de l'éluat methanolique, nous obtenons lg de poudre beige clair correspondant au métabolite actif suivant

Propriétés physico-chimiques

Formule moléculaire ₃₀ H ₄₉ O ₉ P S.M (m/z) 583 (M-H

Caractérisation par RMN de ce composé dans le DMSO-d6 (T=300K)

Position No Ôc (150 MHz) &. (600 MHz)

1 82 2.98 (lH,d,6Hz)

2 74 3.70 (lH,t,7Hz)

3 77.5 3.50 (lH,d,7Hz)

4 52.7

4a 47 2.05 (lH,m)

5 27 2.10 (lH,m) 1.77 (lH.m)

6 117 5.28 (IH.m)

6a 147

6b 42.6

7 31.3 1.35 UH. ) 1.50 (lH,m)

8 37 1.64 (IH.m) 1.40 (lH,m)

8a 43.5

9 60 0.94 (IH.m)

10 29 1.15 (IH.m) 1.74 (IH.m)

11 20.7 1.20 (IH.m) 1.35 (IH.m) lia 55 1.35 (IH.m)

11b 36.3

12 33.7 1.29(2H,t,3Hz)

13 20.7 2.19 (IH.m) 1.75 (IH.m)

13a 50.5 2.63 (lH,m)

13b 45.7

14 180

15 11.8 1.17 (3H,s)

16 25 0.99 (3H,s)

17 15 0.67 (3H,s)

18 31.4 1.40 (3H,m)

19 23 0.83 (3H,d,6Hz)

20 24 0.79 (3H,d,6Hz)

21 22 0.81 (3H,s)

22 60.5 3.60 (lH,d,6Hz) 4.02 (lH,t,6Hz)

EXEMPLE 2

Détermination de l'activité inhibitrice de la protéine farnésyl-transférase.

Cette activité est appréciée pour le métabolite de l'exemple 1 selon la méthode décrite dans le chapitre précédent intitulé matériels et méthodes.

* Peptide ( Cystéine-Valine-Phénylalanine-Méthionine) utilisé à titre de témoin dans les mesures d'activité farnésyl transférase.

LISTE DE SEQUENCES

(1 ) INFORMATIONS GENERALES:

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.

(B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron (C) VILLE: ANTONY

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 92165

(G) TELEPHONE: 40.91.69.22 (H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.96

(ii) TITRE DE L' INVENTION: NOUVEAUX COMPOSES MANIFESTANT DES PROPRIETES INHIBITRICES DE FARNESYL TRANSFERASE ET MICROORGANISME DU GENRE CHRYSOSPORIUM SUSCEPTIBLE D'ETRE UTILISE POUR LES PREPARER

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (IV) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:

(A) TYPE DE SUPPORT: Tape

(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 4 acides aminés

(B) TYPE:acide aminés

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE:protéine (ix) CARACTERISTIQUE:

(D) AUTRE INFORMATION: Les deux premiers Xaa représentent un aliphatique quelconque et le troisième aa un acide aminé quelconque.

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 : Cys Xaa Xaa Xaa

INDICATIONS RELATIVES A UN MICRO-ORGANISME DEPOSE

(règle I3bts du PCT)

A. Les indications ont trait au micro-organisme visé dans la description page 2 , ligne 9

B. IDENTIFICATION DU DEPOT D'autres dépôts font l'objet d'une feuille supplémentaire

Nom de l'institution de dépôt

Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)

Adresse de l'institution de dépôt (y compris le code postal et le pays)

Oosterstraat 1 , P . O . Box 273

3740 AG BAARN

Pays-Bas

Date du dépôt n" d'ordre

30 îanvier 1995 CBS 123 95

Une feuille supplémentaire est jointe

C. INDICATIONS SUPPLEMENTAIRES (le cas échéant) pour la suite de ces renseignements

En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet européen est demandé, un échantillon du microorganisme déposé ne sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet européen ou jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejeté, retirée ou réputée retirée, que par la mxsB remise d'un échantillon à un expert désigné par le requérant (règle 28(4) de la CBE).

D. ETATSDESIGNESPOURLESQUELSLESINDICATIONSSONTDONNEES

(si les indications ne sont pas données pour tous les Etats désignés)

E. INDICATIONS FOURNIES SEPAREMENT (le cas échéant)

Les indications énumerées ci-après seront fournies ultérieurement au Bureau international (spécifier la nature générale des indicat p «x , "n* d'ordre du dépôt")

Réservé à l'office récepteur Réservé au Bureau international

D Cette feuille a été reçue en même temps que la | | Cette feuille est parvenue au Bureau international le demande internationale

Fonctionnaire autorisé Fonctionnaire autorisé

J. LE PICAUD

Formulaire PCT/RO/134 (ju-Net 1992)