Sekretionsoptimierter Mikroorganismus

Die Erfindung richtet sich auf Mikroorganismen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Nukleinsäuresequenz beinhalten, die nicht natürlicherweise in diesen vorhanden ist und die mindestens folgende Sequenzabschnitte umfasst: a) Nukleinsäuresequenz codierend für ein Protein, welches einen Cofaktor enthält, und b) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO.1 angegebenen Sequenz zu mindestens 20% identisch ist oder eine zu dieser Sequenz strukturhomologe Nukleinsäuresequenz, wobei die von der Nukleinsäuresequenz b) codierte Aminosäuresequenz mit der von der Nukleinsäuresequenz a) codierten Aminosäuresequenz derart funktionell zusammenwirkt, dass zumindest die von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Aminosäuresequenz von dem Mikroorganismus sezerniert wird, mit der Maßgabe, dass der Mikroorganismus zugehörig ist zur Gattung Corynebacterium. Solche Mikroorganismen können zur Verbesserung biotechnologischer Produktionsverfahren für Proteine, die einen Cofaktor enthalten, genutzt werden. Daher richtet sich die Erfindung ferner auf Verwendungen solcher Mikroorganismen sowie Verfahren, in denen solche Mikroorganismen kultiviert werden, insbesondere fermentative Verwendungen und Verfahren.

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere der Herstellung von Wertstoffen durch Fermentation von Mikroorganismen, die zur Bildung der interessierenden Wertstoffe in der Lage sind. Hierzu zählt beispielsweise die Herstellung niedermolekularer Verbindungen, etwa von Nahrungsmittelergänzungsstoffen oder pharmazeutisch relevanten Verbindungen, oder von Proteinen, für welche aufgrund ihrer Diversität wiederum ein großes technisches Einsatzgebiet besteht.

Zur Fermentation von Mikroorganismen besteht ein reichhaltiger Stand der Technik, insbesondere auch im großtechnischen Maßstab; er reicht von der Optimierung der betreffenden Stämme hinsichtlich der Bildungsrate und der Nährstoffausnutzung über die technische Gestaltung der Fermenter bis hin zur Gewinnung der Wertstoffe aus den betreffenden Zellen selbst und/oder dem Fermentationsmedium. Hierfür kommen sowohl genetische und mikrobiologische als auch verfahrenstechnische und biochemische Ansätze zu tragen.

Zur wirtschaftlichen Produktion von Proteinen, beispielsweise Enzymen, wird generell angestrebt, zum einen eine möglichst hohe Produktausbeute in der Fermentation zu erhalten, und zum anderen, dass diese vom Produktionsorganismus durch Sekretion aus der Zelle in das Produktionsmedium ausgeschleust werden. Auf diese Weise kann auf den aufwändigen Aufschluss der Zellen verzichtet werden und die weitere Aufreinigung bzw. Aufarbeitung (Downstream Processing) ist deutlich vereinfacht, da weniger unerwünschte Zellbestandteile abgetrennt werden müssen. Die meisten technischen Enzyme, die bisher in Wasch- und Reinigungsmittel eingesetzt werden, darunter insbesondere Proteasen und Amylasen, werden natürlicherweise sezerniert. Die Gene dieser Enzyme enthalten vor der Sequenz, die

für das Enzym (bzw. Proenzym im Falle von Proteasen) codiert, eine so genannte Signalsequenz, oftmals die so genannte Sec-Signalsequenz. Diese Sec-Signalsequenz codiert ein N-terminales Signalpeptid, das für die Translokation des ungefalteten Enzyms über die Cytoplasmamembran verantwortlich ist (See-abhängige Sekretion).

Ferner ist aus dem Stand der Technik die so genannte Tat („twin-arginine translocation")-abhängige Sekretion von Proteinen bekannt (vgl. hierzu unter anderem Schaerlaekens et al., (2004) J.Biotechnol., 112:279-88). Diese wird über sog. Tat-Signalpeptide vermittelt. Aus dem Stand der Technik sind unterschiedliche Tat-Signalpeptide aus unterschiedlichen Spezies bekannt, darunter aus E. coli, Bacillus subtilis sowie aus Vertretern der Gattungen Streptomyces und Corynebacterium.

Aus der internationalen Patentanmeldung WO2002022667 geht hervor, dass über den Tat- Sekretionsweg vollständig gefaltete Polypeptidketten ausgeschleust werden und dieser Sekretionsweg prinzipiell auch zur Sekretion von Proteinen geeignet ist, die einen Cofaktor enthalten. Daher wird vorgeschlagen, den Tat-Sekretionsweg für die heterologe Expression von Proteinen zu verwenden. Jedoch geht aus dieser Anmeldung ebenfalls hervor, dass eben nicht jedes Tat-Signalpeptid in jedem Mikroorganismus bzw. in jedem Bakterium auch eine entsprechende Sekretion bewirkt. Das PhoD- Signalpeptid von Bacillus subtilis wird von dem Tat-Sekretionssystem von E. coli per se nicht erkannt (Beispiel 4 der WO2002022667), sondern erst nach genetischer Modifikation desselben (hier durch rekombinante Expression zweier Komponenten des B. subtilis Tat-Sekretionssystems). Zum gleichen Ergebnis kommt auch die Veröffentlichung von Pop et al. (J. of Biological Chemistry 2002, VoI 277(5):3268-3273).

Damit kann aus dem Stand der Technik nicht auf ein heterologes Expressionssystem geschlossen werden, welches die Tat-vermittelte Sekretion eines Cofaktor-enthaltenden Proteins, insbesondere eines Enzyms, in unterschiedlichen Mikroorganismen erlaubt. Insbesondere nicht offenbart ist dieses für Bakterien der Gattung Corynebacterium. Ferner ist kein solches System für Corynebacterium bekannt, welches eine zufrieden stellende Produktausbeute in einer Fermentation ermöglicht.

Es stellte sich somit die Aufgabe, die biotechnologische Herstellung von Proteinen, insbesondere für solche, die einen Cofaktor enthalten, zu verbessern, insbesondere unter Nutzung von Bakterien der Gattung Corynebacterium. Hiermit verbunden ist als weitere Aufgabe, die Produktausbeute für Proteine, insbesondere für solche, die einen Cofaktor enthalten, in einer Fermentation zu erhöhen, wiederum insbesondere unter Nutzung von Bakterien der Gattung Corynebacterium. Insbesondere sollte ein Mikroorganismus zur Verfügung gestellt werden, insbesondere einer der Gattung Corynebacterium, der Proteine, die einen Cofaktor enthalten, verbessert sezerniert und unter Einsatz dessen sich weiter bevorzugt die Produktausbeute in einer Fermentation erhöht.

Die Aufgabe wird gelöst durch einen Mikroorganismus, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Nukleinsäuresequenz beinhaltet, die nicht natürlicherweise in diesem vorhanden ist und die mindestens folgende Sequenzabschnitte umfasst: a) Nukleinsäuresequenz codierend für ein Protein, welches einen Cofaktor enthält, und b) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO.1 angegebenen Sequenz zu mindestens 20% identisch ist oder eine zu dieser Sequenz strukturhomologe Nukleinsäuresequenz, wobei die von der Nukleinsäuresequenz b) codierte Aminosäuresequenz mit der von der Nukleinsäuresequenz a) codierten Aminosäuresequenz derart funktionell zusammenwirkt, dass zumindest die von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Aminosäuresequenz von dem Mikroorganismus sezerniert wird, mit der Maßgabe, dass der Mikroorganismus zugehörig ist zur Gattung Corynebacterium.

überraschend wurde festgestellt, dass solche Nukleinsäuresequenzen in Bakterien der Gattung Corynebacterium die Sekretion von Proteinen, die einen Cofaktor enthalten, bewirken, insbesondere von einem von einer Nukleinsäuresequenz a) codierten Protein, das normalerweise im Cytosol der Zelle lokalisiert ist und daher nicht sezerniert würde. Ferner bewirken sie dieses in einem Maße, dass ein solcher Mikroorganismus für die biotechnologische Produktion des Cofaktor-enthaltenden Proteins geeignet ist, insbesondere in fermentativen Verfahren.

Unter einem Mikroorganismus, der zugehörig ist zur Gattung Corynebacterium werden neben Bakterien der Gattung Corynebacterium selbst auch weitere coryneforme Bakterien verstanden, insbesondere solche, die zugehörig sind zu den Gattungen Brevibacterium, Micrococcus, Microbacterium und Mycobacterium.

Coryneforme sind bakterielle Zellen mit einer charakteristischen, an einem Ende keulenartig verdickten Zellmorphologie. Corynebacterium selbst ist eine Gattung aerob bis fakultativ anaerob lebender, grampositiver Bakterien, deren Vertreter meist zwischen 3 bis 5 μm lang sind und deren Zellen eine meist charakteristische Keulenform aufweisen, wobei während des Wachstums die Form auch zwischen stäbchenförmig und kokkoid wechseln kann. Oftmals bilden sie keine Sporen und sind unbeweglich. In der Zellwand von Bakterien der Gattung Corynebacterium sind in der Regel charakteristischerweise meso-2,6-Diaminopimelinsäuren, die Zucker Galactose und Arabinose und Mykolsäuren enthalten. Nicht natürlicherweise vorhanden bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Nukleinsäuresequenz keine eigene Sequenz des Mikroorganismus ist, d.h. in der Wildtyp-Form des Mikroorganismus nicht in dieser Form vorhanden ist bzw. aus diesem isoliert werden kann. Eine natürliche Nukleinsäuresequenz wäre daher im Genom des betrachteten Mikroorganismus per se, also in dessen Wildtyp-Form, vorhanden. In erfindungsgemäße Mikroorganismen dagegen wurde eine solche Sequenz eingebracht, vorzugsweise gezielt eingebracht, bzw. in diesen erzeugt, beispielsweise und bevorzugterweise mit Hilfe gentechnologischer Verfahren. Diese Sequenz war daher nicht natürlicherweise in dem jeweiligen Mikroorganismus vorhanden, so dass der Mikroorganismus um diese Sequenz bereichert wurde. Bevorzugt wird diese Sequenz von dem Mikroorganismus exprimiert. Besonders bevorzugt umfasst die

Nukleinsäuresequenz in einem erfindungsgemäßen Mikroorganismus somit neben den nachfolgend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen a) und b) ferner mindestens eine oder mehrere Sequenzen, insbesondere Promotor-Sequenzen, zur Expression der Nukleinsäuresequenzen a) und b).

Die Nukleinsäuresequenz in einem erfindungsgemäßen Mikroorganismus umfasst somit mindestens zwei Sequenzabschnitte, nämlich die Nukleinsäuresequenzen a) und b), und besonders bevorzugt zusätzlich eine oder mehrere Sequenzen, insbesondere Promotor-Sequenzen, zur Expression der Nukleinsäuresequenzen a) und b). Die Nukleinsäuresequenz a) codiert hierbei für ein Protein, welches einen Cofaktor enthält, also dasjenige Protein, das von dem Mikroorganismus sezerniert und damit aus diesem ausgeschleust werden soll. Die Nukleinsäuresequenz b) codiert hierbei für eine Aminosäuresequenz, die mit einem von dem Mikroorganismus, im vorliegenden Fall also von einem Bakterium der Gattung Corynebacterium, verwendeten Translokationssystem derart in Wechselwirkung tritt, dass zumindest die von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Aminosäuresequenz von dem Mikroorganismus sezerniert wird. Die von dieser Nukleinsäuresequenz b) codierte Aminosäuresequenz bindet daher unmittelbar oder mittelbar an mindestens eine Komponente des Translokationssystems des erfindungsgemäßen Mikroorganismus. Unter unmittelbarer Bindung wird eine direkte Interaktion verstanden, die kovalent oder nicht kovalent sein kann; unter mittelbarer Bindung wird verstanden, dass die Interaktion über eine oder mehrere weitere Komponenten, insbesondere Proteine oder andere Moleküle, erfolgen kann, die als Adapter fungieren und dementsprechend eine Brückenfunktion haben zwischen der von der Nukleinsäuresequenz b) codierten Aminosäuresequenz und einer Komponente des bakteriellen Translokationssystems, wobei auch hier die Interaktionen jeweils kovalent oder nicht kovalent sein können. Bevorzugt handelt es sich bei dem verwendeten Tranlokationssystem um eine Tatabhängige Sekretion, d.h. unter Nutzung von mindestens einer Komponente des Tat-Sekretionssystems. Die Nukleinsäuresequenz b) codiert demnach für eine Tat-Signalsequenz (Tat-Signalpeptid), welches in Corynebacterium funktionell ist und eine Sekretion der von der Nukleinsäuresequenz a) codierten Aminosäuresequenz ermöglicht. Somit wird ein Cofaktor-enthaltendes Protein (codiert von der Nukleinsäuresequenz a)) auf Grund des Vorhandenseins der von der Nukleinsäuresequenz b) codierten Aminosäuresequenz von Bakterien der Gattung Corynebacterium sezerniert. Die von den Nukleinsäuresequenzen b) und a) codierten Aminosäuresequenzen können Bestandteil der gleichen Polypeptidkette sein, können aber auch auf miteinander nicht kovalent verknüpften Polypeptidketten vorliegen. Beispielsweise ist es möglich, dass nicht kovalent verknüpfte Polypeptidketten dennoch miteinander derart in Wechselwirkung stehen, insbesondere auf Grund nichtkovalenter Bindungen, dass das von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Cofaktor-enthaltende Protein ebenfalls auf Grund der Existenz der von der Nukleinsäuresequenz b) codierten Aminosäuresequenz aus der Zelle ausgeschleust wird. Unter einer funktionellen Kopplung/einem funktionellen Zusammenwirken von der von der Nukleinsäuresequenz b) codierten Aminosäuresequenz und dem von der Nukleinsäuresequenz a) codierten Cofaktor-enthaltenden Protein ist daher wie beschrieben der Sachverhalt zu verstehen, dass das von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Cofaktor-enthaltende Protein auf Grund der Existenz der von der Nukleinsäuresequenz b) codierten Aminosäuresequenz aus der Zelle ausgeschleust wird. Ohne

die Anwesenheit der von der Nukleinsäuresequenz b) codierten Aminosäuresequenz in der Zelle wäre die Sekretion des von der Nukleinsäuresequenz a) codierten Cofaktor-enthaltenden Proteins daher vermindert oder überhaupt nicht vorhanden. Beispielsweise und besonders bevorzugt wird ein solches funktionelles Zusammenwirken dadurch erreicht, dass die von der Nukleinsäuresequenz b) codierte Aminosäuresequenz und die von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Aminosäuresequenz Bestandteile der gleichen Polypeptidkette sind, zumindest innerhalb der Zelle. Prinzipiell können die von den jeweiligen Nukleinsäuresequenzen a) und b) codierten Aminosäuresequenzen aber auch auf getrennten Polypeptidketten vorliegen, so lange das funktionelle Zusammenwirken beider Sequenzen - also die Vorteilhaftigkeit und/oder Notwendigkeit des Vorhandenseins der von der Nukleinsäuresequenz b) codierten Aminosäuresequenz für die Sekretion des von der Nukleinsäuresequenz a) codierten Cofaktor- enthaltenden Proteins - zumindest innerhalb der Zelle gegeben ist, beispielsweise durch unmittelbare oder mittelbare Bindung beider Aminosäuresequenzen aneinander, wobei alle Bindungen kovalent oder nicht kovalent sein können.

In Vergleichsversuchen wird ein solches funktionelles Zusammenwirken ermittelt, indem ein erster Mikroorganismus, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, umfassend zumindest eine Nukleinsäuresequenz b) und eine Nukleinsäuresequenz a), beinhaltet und diese exprimiert, mit einem zweiten Mikroorganismus, der sich von dem ersten Mikroorganismus möglichst nur dadurch unterscheidet, dass er die Nukleinsäuresequenz b) nicht beinhaltet, verglichen wird. Beide Mikroorganismen werden unter gleichen Bedingungen kultiviert, wobei die Bedingungen so gewählt sind, dass zumindest der erste Mikroorganismus das von der Nukleinsäuresequenz a) codierten Cofaktor- enthaltende Protein exprimiert und sezerniert. Das Vorliegen eines funktionellen Zusammenwirkens ergibt sich durch die verstärkte Sekretion des von der Nukleinsäuresequenz a) codierten Cofaktor- enthaltenden Proteins bei dem ersten Mikroorganismus im Vergleich mit dem zweiten Mikroorganismus.

Die Nukleinsäuresequenz b) ist diesbezüglich zu mindestens 20% identisch zu der in SEQ ID NO.1 angegeben Nukleinsäuresequenz oder zu mindestens 20% identisch zu der von ihr codierten Aminosäuresequenz (angegeben in SEQ ID NO.2), jeweils bezogen auf die Gesamtlänge der angegebenen Sequenzen. Zunehmend bevorzugt ist die Nukleinsäuresequenz b) zu mindestens 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch zu der in SEQ ID NO.1 angegebenen Nukleinsäuresequenz oder zu mindestens 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch zu der von ihr codierten Aminosäuresequenz (angegeben in SEQ ID NO.2). Denn unerwarteterweise ermöglichen diese Sequenzen eine effiziente Tat-abhängige Sekretion eines Cofaktor- enthaltenden Proteins in Bakterien der Gattung Corynebacterium.

Ferner ist es möglich, anstelle der genannten Sequenzen, die eine Sekretion des Cofaktor-enthaltenden Proteins ermöglichen, zu diesen Sequenzen strukturhomologe Sequenzen zu verwenden. Unter einer strukturhomologen Nukleinsäuresequenz wird eine Sequenz verstanden, die eine Aminosäuresequenz codiert, deren Aminosäureabfolge eine solche räumliche Faltung dieser Sequenz bewirkt, dass sie mit dem von Corynebacterium verwendeten Translokationssystem derart wechselwirkt, dass das Cofaktor- enthaltende Protein von dem Translokationssystem aus der Corynebacterium-Zelle ausgeschleust wird. Die von dieser Nukleinsäuresequenz codierte Aminosäuresequenz bindet daher unmittelbar oder mittelbar an mindestens eine Komponente des Translokationssystems des erfindungsgemäßen Mikroorganismus. Unter unmittelbarer Bindung wird eine direkte Interaktion verstanden, unter mittelbarer Bindung wird verstanden, dass die Interaktion über eine oder mehrere weitere Komponenten, insbesondere Proteine oder andere Moleküle, erfolgen kann, die als Adapter fungieren und dementsprechend eine Brückenfunktion haben zwischen der von der strukturhomologen Nukleinsäuresequenz codierten Aminosäuresequenz und einer Komponente des bakteriellen Translokationssystems. Eine bevorzugte erfindungsgemäße strukturhomologe Nukleinsäuresequenz codiert für ein Tat-Signalpeptid, das drei Motive umfasst: ein positiv geladenes N-terminales Motiv, eine hydrophobe Region und eine C-terminale Region, die ein kurzes Consensus-Motiv (A-x-A) enthält und vorzugsweise mit diesem Motiv endet, welches die Spaltstelle durch eine Signalpeptidase spezifiziert. Ebenfalls bevorzugt umfasst ein Tat-Signalpeptid, das von einer erfindungsgemäßen strukturhomologen Nukleinsäuresequenz codiert wird, eine Consensus-Sequenz [ST]-R-R-X-F-L-K. Angegeben sind die Aminosäuren in dem für den Fachmann geläufigen Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren in Proteinsequenzen, wobei x für eine beliebige Aminosäure in der Proteinsequenz steht und ST bedeutet, dass es sich um Serin oder um Threonin handeln kann. Wichtig ist, dass es sich bei der von der strukturhomologen Nukleinsäuresequenz codierten Aminosäuresequenz nicht um irgendein beliebiges Tat-Signalpeptid aus dem Stand der Technik handelt, sondern um eine Aminosäuresequenz, die von dem von Corynebacterium verwendeten Translokationssystem erkannt wird bzw. mit diesem wie beschrieben in Wechselwirkung tritt und demnach eine Sekretion Cofaktor-enthaltender Proteine bei Bakterien der Gattung Corynebacterium bewirkt.

Somit wird erfindungsgemäß ein Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium zur Verfügung gestellt, welcher eine Tat-vermittelte Sekretion eines Cofaktor-enthaltenden Proteins, insbesondere eines Enzyms, ermöglicht, und welcher insbesondere eine zufriedenstellende Produktausbeute in einer Fermentation ermöglicht. Unter Tat-vermittelter Sekretion wird verstanden, dass mindestens eine Komponente des Tat-Sekretionssystems des betreffenden Mikroorganismus an der Ausschleusung des Cofaktor-enthaltenden Proteins beteiligt ist.

In einer gesonderten Ausführungsform ist der Mikroorganismus dadurch gekennzeichnet, dass die Faltung der von der Nukleinsäuresequenz a) codierten Aminosäuresequenz im Cytoplasma des Mikroorganismus erfolgt. Dies ist von wesentlicher Bedeutung, da viele Proteine, die einen Cofaktor enthalten, bereits im Cytoplasma teilweise oder vollständig gefaltet werden, insbesondere deshalb, damit

sie zur Aufnahme des Cofaktors befähigt sind, die im Regelfall im Cytoplasma der Zelle vorhanden sind. Um einen Cofaktor aufnehmen zu können, muss daher die Tertiärstruktur des Proteins zumindest anteilig oder vollständig ausgebildet sein. Die Sekretion eines solchen Proteins, welches bereits seine tertiäre Struktur zumindest anteilig angenommen hat, ist in der Regel ungleich komplizierter im Vergleich zur Ausschleusung einer Aminosäuresequenz in ihrer Primärstruktur oder allenfalls Sekundärstruktur. Im erstgenannten Fall ist es erforderlich, die Tertiärstruktur, d.h. die räumliche Gestalt zumindest weitestgehend zu erhalten - beispielsweise auch deshalb, um einen nicht kovalent gebundenen Cofaktor nicht wieder zu verlieren -, während im zweiten Fall ein noch nicht gefaltetes Protein sezerniert wird, welches erst nach dem Sekretionsschritt seine spätere Tertiärstruktur annimmt. Daher stellt das Ausschleusen von solchen Cofaktor-enthaltenden Proteinen, deren Tertiärstruktur bereits im Cytoplasma ausgebildet wurde, insbesondere von solchen, die heterolog in dem Bakterium exprimiert wurden, eine besondere Herausforderung dar, die mit der vorliegenden Erfindung ermöglicht wird, vor allem im Hinblick auf biotechnologische Fermentationsverfahren zur rekombinanten Herstellung solcher Cofaktor- enthaltenden Proteine. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Mikroorganismus daher dadurch gekennzeichnet, dass er zumindest die von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Aminosäuresequenz gemeinsam mit mindestens einem Cofaktor sezerniert.

Die Cofaktoren werden eingeteilt in unterschiedliche Gruppen. Zwei große Gruppen sind die Coenzyme und die prosthetischen Gruppen. Coenzyme sind in der Regel keine Proteine, sondern organische Moleküle, die oftmals chemische Gruppen tragen bzw. zur Weitergabe von chemischen Gruppen zwischen verschiedenen Proteinen oder Untereinheiten eines Proteinkomplexes dienen. In der Regel sind sie nicht kovalent mit dem sie tragenden Protein, insbesondere Enzym, verbunden. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Coenzyme als Cofaktoren sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nikotinamind-Dinucleotid (NAD ⁺ ), Nikotinamind-Dinucleotidphosphat (NADP ⁺ ), Coenzym A, Tetrahydrofolsäure, Chinone, insbesondere Menaquinon, Ubiquinon, Plastoquinone, Vitamin K, Ascorbinsäure (Vitamin C), Coenzym F420, Riboflavin (Vitamin B2), Adenosin-Triphosphat S- Adenosylmethionin, 3'-Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat, Coenzym Q, Tetrahydrobiopterin, Cytidintriphosphat, Nucleotid-Zucker, Glutathion, Coenzym M, Coenzym B, Methanofuran, Tetrahydromethanopterin, Methoxatin. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die genannten Coenzyme als Cofaktoren beschränkt, vielmehr stellen auch alle weiteren Coenzyme Cofaktoren im Sinne der Erfindung dar.

Prosthetische Gruppen bilden einen dauerhaften Teil der Proteinstruktur und sind in der Regel kovalent an das Protein, insbesondere Enzym, gebunden.

Besonders bevorzugt ist die prosthetische Gruppe als Cofaktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Flavin-Mononucleotid, Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD), Pyrroloquinolinquinon, Pyridoxalphosphat, Biotin, Methylcobalamin, Thiamin- Pyrophosphat, Häm, Molybdopterin und Disulfinde bzw. Thiole, insbesondere Liponsäure. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die genannten prosthetischen Gruppen als

Cofaktoren beschränkt, vielmehr stellen auch alle weiteren prosthetischen Gruppen Cofaktoren im Sinne der Erfindung dar.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Mikroorganismus somit dadurch gekennzeichnet, dass der Cofaktor des Proteins, für das die Nukleinsäuresequenz a) codiert, ein Coenzym oder eine prosthetische Gruppe ist. Insbesondere können solche Coenzyme oder prosthetischen Gruppen in verschiedenen Oxidationsstufen vorliegen. Ferner kann es sich bei dem Cofaktor um ein Coenzym oder eine prosthetische Gruppe handeln. Es ist jedoch auch möglich dass der Cofaktor mehrere Coenzyme oder mehrere prostehtische Gruppen, insbesondere zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder acht Coenzyme oder zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder acht prosthetische Gruppen oder Kombinationen hiervon umfasst. Da Cofaktoren oftmals bei Elektronenübertragungsvorgängen von Bedeutung sind und beispielsweise häufig Bestandteil von Enzymen sind, welche Redox- Reaktionen katalysieren, können sie in verschiedenen Oxidationsstufen vorliegen. So sind NAD ⁺ , NADP ⁺ oder FAD die oxidierten Verbindungen, während NADH, NADPH sowie FADH ₂ die reduzierten Entsprechungen sind. Analog können Cofaktoren protoniert oder deprotoniert als Säure bzw. als Base vorliegen oder allgemein - sofern sie zwischen mehreren Erscheinungsformen wechseln - in allen möglichen Erscheinungsformen vorliegen, beispielsweise mit oder ohne der von dem jeweiligen Cofaktor übertragenen chemischen Gruppe wie beispielsweise einer Methylgruppe oder einer Phospatgruppe, als Quinon- oder Hydroquinon oder als Disulfid bzw. Dithiol.

Ferner ist es möglich, dass die von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Aminosäuresequenz einen Cofaktor enthält, der keiner der beiden vorstehend erläuterten Gruppen von Cofaktoren zuzuordnen ist. Wesentlich ist, dass die von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Aminosäuresequenz überhaupt mindestens einen Cofaktor enthält, wobei es in der Regel notwendig für die Präsenz des Cofaktors ist, dass die Aminosäuresequenz eine Tertiärstruktur aufweist, d.h. einen höheren Faltungsgrad erreicht hat im Vergleich mit der Aminosäuresequenz in ihrer Primär- oder Sekundärstruktur, wobei unter Primärstruktur die lineare Abfolge der einzelnen Aminosäuren und unter Sekundärstruktur das Vorhandensein der grundlegenden Strukturelemente alpha-Helix und ß-Faltblatt in der sonst noch weitgehend linearen Aminosäuresequenz verstanden wird. Das Ausbilden einer räumlichen Anordnung von Sekundärstrukturelementen zueinander ist Teil der Ausbildung der Tertiärstruktur im Sinne der vorliegenden Patentanmeldung. Weitere Cofaktoren können beispielsweise auch Metallionen (Spurenelemente) sein. Bevorzugt handelt es bei solchen Cofaktoren um zwei- oder dreiwertige Metallkationen wie zum Beispiel Cu ²⁺ , Fe ³⁺ , Co ²⁺ oder Zn ²⁺ . Metallionen, können beispielsweise die Anlagerung des Substrats oder des Coenzyms begünstigen oder andererseits als Bestandteil des aktiven Zentrums oder der prosthetischen Gruppe am Katalysevorgang direkt teilnehmen. Weiterhin bewirken diese Metallionen die Stabilisierung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen, insbesondere Enzymen, und schützen sie so vor Denaturierung.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Mikroorganismus dadurch gekennzeichnet, dass die von der Nukleinsäuresequenz b) codierte Aminosäuresequenz eine Signalsequenz für den Tat-Sekretionsweg ist. Wie vorstehend erläutert ermöglicht die Tat-abhängige Sekretion das Ausschleusen von vollständig gefalteten Polypeptidketten. Daher ist dieser Sekretionsweg besonders geeignet zur Sekretion von Proteinen, die einen Cofaktor enthalten. Erfindungsgemäß bevozugt ist es somit, in Bakterien der Gattung Corynebacterium den Tat-Sekretionsweg für die Sekretion von heterolog exprimierten Proteinen, die einen Cofaktor enthalten, zu nutzen.

Die Expression eines Gens ist dessen übersetzung in das bzw. die von diesem Gen codierte(n) Genprodukt(e), also in ein Protein bzw. in mehrere Proteine. In der Regel umfasst die Genexpression die Transkription, also die Synthese einer Ribonukleinsäure (mRNA) anhand der DNA (Desoxyribonukleinsäure )-Sequenz des Gens und deren Translation in die entsprechende Polypeptidkette. Die Expression eines Gens führt zur Bildung des entsprechenden Genproduktes, welches eine physiologische Aktivität aufweist und/oder bewirkt und/oder einen Beitrag zu einer übergeordneten physiologischen Aktivität leistet, an der mehrere verschiedene Genprodukte beteiligt sind. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird das Genprodukt, also das entsprechende Protein, noch um einen Cofaktor ergänzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Mikroorganismus dadurch gekennzeichnet, dass die von der Nukleinsäuresequenz b) codierte Aminosäuresequenz und die von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Aminosäuresequenz Bestandteile der gleichen Polypeptidkette sind. Damit wird eine Tat-vermittelte Sekretion eines Cofaktor-enthaltenden Proteins, insbesondere eines Enzyms, bewirkt, indem der Tat-Signalsequenzanteil der Polypeptidkette mit dem von Corynebacterium verwendeten Tat-abhängigen Translokationssystem derart wechselwirkt, dass das Cofaktor-enthaltende Protein von dem Translokationssystem aus der Corynebacterium-Zelle ausgeschleust wird. Der Tat- Signalsequenzanteil der Polypeptidkette dirigiert daher die gesamte Polypeptidkette zu einer Komponente des Tat-abhängigen Translokationssystems, indem es an diese Komponente unmittelbar oder mittelbar bindet, wobei die Bindung voraussichtlich nichtkovalent ist.

Derartige Nukleinsäuren, die für solche Polypeptidketten codieren, können über an sich bekannte Verfahren zur Veränderung von Nukleinsäuren erzeugt werden. Solche sind beispielsweise in einschlägigen Handbüchern wie dem von Fritsch, Sambrook und Maniatis, „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, dargestellt. Das Prinzip besteht darin, eine Nukleinsäure zu erzeugen, die die Nukleinsäuresequenzen a) - die für das Cofaktor- enthaltende Protein codierende Sequenz - und b) - die für die Tat-Signalsequenz codierende Sequenz - im gleichen Leseraster umfasst, wobei sich bevorzugt die Nukleinsäuresequenz b) stromaufwärts, d.h. am 5 ^' -Ende der Nukleinsäuresequenz a) befindet. Im resultierenden Polypeptid befindet sich daher die Tat-Signalsequenz bevorzugt am N-Terminus des Polypeptids. Optional kann sich zwischen den Nukleinsäuresequenzen b) und a), d.h. zwischen Tat-Signalsequenz (Tat-Signalpeptid) und dem zu

sezernierenden Cofaktor-enthaltenden Protein, ein Spacer befinden. Der Spacer kann 1 bis 50, 1 bis 40, 1 bis 30, 1 bis 20, 1 bis 10, 1 bis 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, oder 1 Aminosäure lang sein. Auf Nukleinsäureebene bedeutet das, dass sich zwischen den Nukleinsäuresequenzen b) und a) eine Spacersequenz befindet, die auf Grund des genetischen Codes dreimal so viele Nukleotide lang ist, wie der Spacer Aminosäuren enthält.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Mikroorganismus dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe von Corynebacterium ammoniagenes (Brevibacterium ammoniagenes), Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium taipei, Micrococcus glutamicus, Brevibacterium roseum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium herculis, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium acetoacidophilum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilium, Microbacterium ammoniaphilum, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae, Brevibacterium thiogenitalis, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium auris, Corynebacterium atypicum, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae, Corynebacterium casei, Corynebacterium confusum, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium equi, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium hanseni, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium nigricans, Corynebacterium pseudodiptheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium resistens, Corynebacterium striatum, Corynebacterium tuscaniae, Corynebacterium tuscaniense, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium xerosis.

Weiter bevorzugt ist der Mikroorganismus ausgewählt aus der Gruppe von Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium taipei ATCC13744, Micrococcus glutamicus ATCC 13761 , Brevibacterium roseum ATCC13825, Brevibacterium flavum ATCC13826, Corynebacterium herculis ATCC13868, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Brevibacterium divaricatum ATCC14020, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium immariophilium ATCC14068, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Corynebacterium lilium ATCC15990, Corynebacterium callunae ATCC15991 , Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240 und ganz besonders bevorzugt ist der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum.

Solche Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren etabliert werden. Zudem verfügt man bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., unterschiedliche Bakterienstämme geeignet sein.

Grampositive Bakterien der Gattung Corynebacterium weisen gegenüber gram negativen Bakterien den grundsätzlichen Unterschied auf, sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abzugeben, aus welchem sich, sofern dies gewünscht ist, die exprimierten Proteine direkt gewinnen bzw. aufreinigen lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Bevorzugt erfolgt daher eine Sekretion in das umgebende Medium. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon- Usage verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist.

Unter Codon-Usage wird die übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren verstanden, d.h. welche Nukleotidfolge (Triplett oder Basentriplett) für welche Aminosäure bzw. für welche Funktion, beispielsweise Beginn und Ende des zu translatierenden Bereichs, Bindungsstellen für verschiedene Proteine, usw., codiert. So besitzt jeder Organismus, insbesondere jeder Produktionsstamm eine bestimmte Codon-Usage. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der transgenen Nukleinsäure liegenden Codons in der Wirtszelle einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNAs gegenüberstehen. Synonyme Codons codieren dagegen für dieselben Aminosäuren und können in Abhängigkeit vom jeweiligen Wirt besser translatiert werden. Dieses gegebenenfalls notwendige Umschreiben hängt somit von der Wahl des Expressionssystems ab. Insbesondere bei zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen aus unbekannten, eventuell nicht kultivierbaren Organismen kann eine entsprechende Anpassung der Codon-Usage an den sie exprimierenden Mikroorganismus notwendig sein.

Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen dieser Gattung, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen als Produktionsorganismen eine erhöhte Produktausbeute in einer Fermentation verwirklichen lässt. Als Produkte, die während der Fermentation gebildet werden, werden Proteine, die einen Cofaktor enthalten, insbesondere Enzyme, darunter insbesondere Enzyme, welche Redox-Reaktionen katalysieren, betrachtet. Beispielhaft genannt seien Oxidasen, Peroxidasen, Hydrogenasen, Dehydrogenasen, Reduktasen, Biotin-abhängige Redox- Enzyme, CO ₂ -fixierende Enzyme, u.a.

Die in-vivo-Synthese eines solchen Produktes, also durch lebende Zellen, erfordert den Transfer des zugehörigen Gens in einen erfindungsgemäßen Mikroorganismus, dessen so genannte Transformation. Bevorzugt sind solche Mikroorganismen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor und dessen stabile Etablierung angeht. Zudem zeichnen sich die bevorzugten Mikroorganismen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Häufig müssen aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der

Technik zur Verfügung stehenden Systemen die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermittelt werden. Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Mikroorganismen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Produkte.

Die Mikroorganismen können ferner hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere um solche Mikroorganismen handeln, die mehrere Produkte, insbesondere mehrere Cofaktor-enthaltende Proteine, insbesondere Enzyme, exprimieren und sie in das die Mikroorganismen umgebende Medium sezernieren.

Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Mikroorganismen (Wirtszellen) beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig Produkt aus dem Medium entnommen werden kann.

Die vorliegende Erfindung eignet sich daher für die Herstellung rekombinanter Proteine, insbesondere Enzyme. Hierunter sind erfindungsgemäß alle gentechnischen oder mikrobiologischen Verfahren zu verstehen, die darauf beruhen, dass die Gene für die interessierenden Produkte in einen erfindungsgemäßen Mikroorganismus eingebracht werden. Ein solches Gen im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst die vorstehend ausführlich erläuterten Nukleinsäuresequenzen b) und a), um eine Sekretion des von der Nukleinsäuresequenz a) codierten Cofaktor-enthaltenden Proteins zu bewirken, in der Regel zusammen mit der von der Nukleinsäuresequenz b) codierten Tat-Signalsequenz (Tat- Signalpeptid), und es umfasst besonders bevorzugt zusätzlich eine oder mehrere Sequenzen, insbesondere Promotor-Sequenzen, zur Expression der Nukleinsäuresequenzen a) und b). Diesbezüglich erfolgt die Einschleusung der betreffenden Gene über Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, aber auch über solche, die bewirken, dass das interessierende Gen in der Wirtszelle in ein bereits vorhandenes genetisches Element wie das Chromosom oder andere Vektoren eingefügt werden kann. Die funktionelle Einheit aus Gen und Promotor und eventuellen weiteren genetischen Elementen wird erfindungsgemäß als Expressionskassette bezeichnet. Sie muss dafür jedoch nicht notwendigerweise auch als physische Einheit vorliegen.

Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die ein Gen im Sinne der vorliegenden Erfindung enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erfüllen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Proteins zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure (das Gen) geeigneterweise in einen Vektor kloniert. Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist somit ein Vektor, der ein Gen im Sinne der vorliegenden Erfindung enthält. Hierzu können beispielsweise solche Vektoren gehören, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Viren oder von Bacteriophagen ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie sich extrachomosomal als eigene Einheiten etablieren oder in ein Chromosom bzw. in chromosomale DNA integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein.

Expressionsvektoren umfassen Teilsequenzen, die sie dazu befähigen, in den für die Produktion von Proteinen optimierten erfindungsgemäßen Mikroorganismen zu replizieren und dort das enthaltene Gen zur Expression zu bringen. Bevorzugte Ausführungsformen sind Expressionsvektoren, die selbst die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen. Die Expression wird beispielsweise von Promotoren beeinflusst, welche die Transkription des Gens regulieren. So kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor einem Gen lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch nach gentechnischer Fusion sowohl durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle als auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Expressionsvektoren können über änderungen der Kulturbedingungen oder Zugabe von bestimmten Verbindungen, wie beispielsweise die Zelldichte oder spezielle Faktoren, regulierbar sein. Expressionsvektoren ermöglichen, dass das zugehörige Protein heterolog, also in einer anderen Zelle bzw. Wirtszelle als derjenigen, aus der es natürlicherweise gewonnen werden kann, produziert wird. Die Zellen können dabei durchaus zu verschiedenen Organismen zugehörig sein oder von verschiedenen Organismen stammen. Auch eine homologe Proteingewinnung aus einer das Gen natürlicherweise exprimierenden Wirtszelle über einen passenden Vektor liegt innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung, sofern die Wirtszelle ein erfindungsgemäß gestalteter Mikroorganismus ist. Dies

kann den Vorteil aufweisen, dass natürliche, mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationsreaktionen an dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie sie auch natürlicherweise ablaufen würden.

Zu einem einsetzbaren Expressionssystem können ferner zusätzliche Gene zählen, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, und die die erfindungsgemäße Produktion des Proteins, das einen Cofaktor enthält und von der Nukleinsäuresequenz a) codiert wird, beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Genprodukte handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäß sezernierten Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen enzymatische Funktion zu beeinflussen. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beeinflussen.

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt ein Verfahren dar zur Herstellung eines Proteins, welches einen Cofaktor enthält, durch einen Mikroorganismus, der zugehörig ist zur Gattung Corynebacterium, umfassend folgende Verfahrensschritte: a) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz, die nicht natürlicherweise in diesem vorhanden ist und die mindestens folgende Sequenzabschnitte umfasst: i. Nukleinsäuresequenz codierend für ein Protein, welches einen Cofaktor enthält, und ii. Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO.1 angegebenen Sequenz zu mindestens 20% identisch ist oder eine zu dieser Sequenz strukturhomologe Nukleinsäuresequenz, in einen Mikroorganismus, wobei die Sequenzabschnitte i) und ii) funktionell gekoppelt sind, b) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz gemäß a) in dem Mikroorganismus

Mit einem solchen Verfahren ist es daher möglich, Cofaktor-enthaltende Proteine mit Bakterien der Gattung Corynebacterium herzustellen, insbesondere in einer biotechnologischen Fermentation. Auf Grund einer Tat-vermittelten Sekretion eines Cofaktor-enthaltenden Proteins, insbesondere eines Enzyms, wird dessen Aufreinigung bzw. weitere Prozessierung in einem solchen Verfahren erheblich erleichtert. Ferner ermöglicht ein solches Verfahren insbesondere eine zufriedenstellende Produktausbeute in einer Fermentation. Alle zuvor für die erfindungsgemäßen Mikroorganismen und Vektoren erläuterten Aspekte treffen auch auf die erfindungsgemäßen Verfahren zu, so dass sie an dieser Stelle nicht nochmals wiederholt werden, sondern auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren daher dadurch gekennzeichnet, dass zumindest die von der Nukleinsäuresequenz a) codierte Aminosäuresequenz gemeinsam mit mindestens einem Cofaktor von dem Mikroorganismus sezerniert wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren ferner dadurch gekennzeichnet, dass der Cofaktor des Proteins, für das die Nukleinsäuresequenz a) codiert, ein Coenzym oder eine prosthetische Gruppe ist.

Besonders bevorzugt kommt in erfindungsgemäßen Verfahren ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus zum Einsatz. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen demnach Verfahren dar zur Herstellung eines Proteins, welches einen Cofaktor enthält, die dadurch gekennzeichnet sind, dass diese Verfahren als einen Verfahrensschritt die Kultivierung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus umfassen, wie er vorstehend beschrieben ist, der das Protein in das ihn umgebende Medium sezerniert.

Cofaktor-enthaltende Proteine, insbesondere Enzyme, die mit derartigen Verfahren hergestellt werden, finden mannigfaltig Verwendung. Darunter inbesondere zu nennen sind Oxidasen, Peroxidasen, Hydrogenasen, Dehydrogenasen, Reduktasen, Biotin-abhängige Enzyme, insbesondere CO ₂ -fixierende Enzyme, bzw. Redox-Enzyme im allgemeinen. Redox-Enzyme werden beispielsweise für die enzymatische Bleiche in Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt. Auch in der Textil- und Lederindustrie dienen sie der Aufarbeitung der natürlichen Rohstoffe. Ferner können alle gemäß mit erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Enzyme wiederum im Sinne der Biotransformation als Katalysatoren für chemische Reaktionen eingesetzt werden.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren demnach dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Enzym ist, insbesondere eines, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Redox-Enzym, Oxidase, Peroxidase, Hydrogenase, Dehydrogenase, Reduktase, Biotin-abhängiges Enzym, CO ₂ -fixierendes Enzym, Protease, Amylase, Cellulase, Lipase, Hemicellulase, Pectinase, Mannanase oder Kombinationen hiervon.

Proteine und insbesondere Enzyme werden für ihren vorgesehenen Einsatzzweck optimiert und insbesondere genetisch modifiziert, um ihnen für ihren jeweiligen Verwendungszweck verbesserte Eigenschaften zu verleihen. Die in erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Enzyme können daher die jeweiligen Wildtypenzyme oder weiterentwickelte Varianten sein. Unter Wildtypenzym ist zu verstehen, dass das Enzym in einem natürlich vorkommenden Organismus bzw. in einem natürlichen Habitat vorhanden ist aus diesem isoliert werden kann. Unter einer Enzym-Variante werden Enzyme verstanden, die aus einem Vorläufer-Enzym, beispielsweise einem Wildtyp-Enzym, durch Veränderung der Aminosäuresequenz erzeugt wurden. Die Veränderung der Aminosäuresequenz erfolgt vorzugsweise durch Mutationen, wobei Aminosäure-Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Kombinationen hiervon vorgenommen sein können. Das Einbringen solcher Mutationen in Proteine ist Stand der Technik und dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie hinlänglich bekannt.

Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode

des hergestellten Produktes, beispielsweise des rekombinanten Proteins. Alle Fermentationsverfahren, die zur Herstellung der rekombinanten Proteine geeignet sind, stellen daher bevorzugte Ausführungs- formen dieses Erfindungsgegenstandes dar. Als geeignet ist ein solches Verfahren dann zu betrachten, wenn ein entsprechendes Produkt gebildet wird. Als Produkte, die während der Fermentation gebildet werden, werden Proteine, die einen Cofaktor enthalten, darunter insbesondere Enzyme, darunter insbesondere Enzyme, welche Redox-Reaktionen katalysieren, betrachtet. Beispiele für Redox-Enzyme sind Oxidasen, Peroxidasen, Hydrogenasen, Dehydrogenasen, Reduktasen, Biotin-abhängige Redox- Enzyme, CO ₂ -fixierende Enzyme, u.a.

Hierbei müssen die für die eingesetzten Herstellungsverfahren, für die Mikroorganismen und/oder die herzustellenden Produkte jeweils optimalen Bedingungen anhand der zuvor optimierten Kulturbedingungen der betreffenden Stämme nach dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise hinsichtlich Fermentationsvolumen, Medienzusammensetzung, Sauerstoffversorgung oder Rührergeschwindigkeit, experimentell ermittelt werden.

Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen ebenfalls in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert; man spricht auch von einer Zufütterungsstrategie. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Biotrockenmasse und/oder vor allem der Aktivität des interessierenden Produktes erreicht werden.

Analog dazu kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechsel produkte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.

Das hergestellte Produkt kann nachträglich aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Bevorzugt wurde es erfindungsgemäß in das Medium sezerniert. Dieses Fermentationsverfahren ist entsprechend gegenüber der Produktaufbereitung aus der Trockenmasse bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung geeigneter Sekretionsmarker und Transportsysteme.

Für jedes Produkt, das mit erfindungsgemäßen Mikroorganismen bzw. Verfahren herzustellen ist bzw. hergestellt wird, sind eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar. Das optimale Verfahren muss für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden.

Erfindungsgemäße Mikroorganismen werden daher vorteilhaft in den beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt und werden in diesen Verfahren verwendet, um ein Produkt herzustellen, insbesondere ein Protein, welches einen Cofaktor enthält. Konsequenterweise ist demnach ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines vorstehend beschriebenen Mikroorganismus zur Herstellung eines Proteins, welches einen Cofaktor enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Enzym ist. Vorteilhafterweise ist das Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Redox-Enzym, Oxidase, Peroxidase, Hydrogenase, Dehydrogenase, Reduktase, Biotin-abhängiges Enzym, CO ₂ - fixierendes Enzym, Protease, Amylase, Cellulase, Lipase, Hemicellulase, Pectinase, Mannanase oder Kombinationen hiervon.

Das nachfolgende Beispiel erläutert die vorliegende Erfindung weiter, ohne sie darauf einzuschränken.

Beispiel 1 :

Produktion des cytosolischen, FAD-haltigen Enzyms Sorbitol-Xylitol-Oxidase aus Streptomyces coelicolor durch Tat-abhängige Sekretion in Corynebacterium glutamicum

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme, Baukästen (Kits) und Geräte wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.

a) Konstruktion des Sorbitol-Xylitol-Oxidase (SoXy)-Expressionsvektors:

Da es sich bei der Sorbitol-Xylitol-Oxidase SoXy um ein normalerweise im Cytosol vorkommendes Cofaktor-haltiges Protein handelt, wurde ein Tat-spezifisches Signalpeptid vorgeschaltet, um den Export des Proteins zusammen mit seinem Cofaktor über den Tat-Weg von Corynebacterium glutamicum zu ermöglichen. Dabei handelt es sich um das heterologe Signalpeptid TorA, welches in E. coli einen strikt Tat-abhängigen Membrantransport vermittelt. Das Gen der SoXy wurde mittels Polymerase- Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, wobei am 3'-Ende eine EcoRI Schnittstelle zur Ligation in den Corynebacterium glutamicum Expressionsvektor pEKEx2 (Eikmanns et al. (1991 ) Gene 102:93-98) eingefügt wurde (vgl. Figur 1 ).

Das DNA-Fragment des TorA-Signalpeptids und daran angehängt die ersten hundert Basenpaare des SoXy-Gens wurde synthetisch hergestellt und unter Ausnutzung der sich im Anfangsbereich der SoXy befindlichen Notl-Schnittstelle in den Expressionsvektor pEKEx2 kloniert (vgl. Figur 1 ).

b) Expression und Sekretion der Sorbitol-Xylitol-Oxidase

Zur Analyse der Expression und Sekretion der SoXy wurde Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Abe et al., (1967) J Gen Appl Microbiol, 13:279-301 ) mit dem SoXy-Expressionsvektor transformiert.

Die Kultivierung erfolgte in CGXII Medium (Keilhauer et al. (1993) J Bacteriol 175:5595-603) und die Induktion der Expression durch Zugabe von 100 μM IPTG. Anschließend wurden die Proteine der Zellfraktion und des überstands aufgearbeitet und über Polyacrylamidgele aufgetrennt. In einem mit Coomassie gefärbten Gel war die Sorbitol-Xylitol-Oxidase mit einer Größe von 44 kDa in der Zellfraktion nicht sichtbar. Nach der Induktion mit IPTG zeigte sich in den Proben des überstandes für die SoXy- Transformanten (S1 , S2 und S3) jeweils eine Proteinbande mit einer Größe von 44 kDa, die im überstand der Negativkontrolle nicht auftrat (vgl. Figur 2). Die entsprechenden Banden wurden aus dem Proteingel isoliert, und mittels Maldi-TOF Analyse konnte bestätigt werden, dass es sich bei dem isolierten Protein um die Sorbitol-Xylitol-Oxidase aus Streptomyces coelicolor handelt

c) Aktivitätsnachweis

Die Aktivität der SoXy wurde mit Hilfe des qualitativen Aktivitätstests für Wasserstoffperoxid-bildende Enzyme in Kolonien auf Agarplatte mittels 4-Chloronaphthol untersucht (S. Delagrave et al. (2001 ) Application of a very high-throughput digital imaging screen to evolve the enzyme galactose oxidase, Prot. Eng., 14: 261-267). Bei dieser Methode gilt, je mehr Wasserstoffperoxid gebildet wird, desto eher tritt eine Blaufärbung des Mediums ein. Mittels dieses Aktivitätstests konnte eine beginnende Blaufärbung bei Vorhandensein des SoXy-Expressionsvektors innerhalb von 4 h nach Zugabe von 30 μl des Kulturüberstands detektiert werden (vgl. Figur 3). Die Kontrolle mit Leervektor zeigte hingegen keine Blaufärbung.

Damit wird deutlich, dass erfindungsgemäße Mikroorganismen befähigt sind, funktionelle Cofaktor- enthaltende Proteine effizient zu sezernieren, vor allem auch solche, die normalerweise im Cytosol lokalisiert sind.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 : Klonierungsschema für die Sorbitol-Xylitol-Oxidase. Dargestellt ist der Expressionsvektor pEKEx2, in den über die Pstl- und die Notl-Schnittstelle die DNA-Sequenz des E. coli-TorA-Signalpeptids und daran angehängt das 5'-Ende des SoXy-Gens eingebracht wurde. In einem zweiten Klonierungsschritt wurde dann das 3'-Ende des SoXy-Gens über die Notl- und die EcoRI-Schnittstelle eingefügt.

Figur 2: Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel zur Lokalisation der Sorbitol-Xylitol-Oxidase SoXy in Proben des überstands. Vergleich Leervektor (c) in Corynebacterium glutamicum mit den drei SoXy- Transformanten S1 , S2 und S3. Die Anzucht erfolgte in CGXII-Medium, die Induktion der SoXy erfolgte mit 100μM IPTG über einen Zeitraum von 18 Stunden.

Figur 3: Qualitativer Aktivitätstest für Wasserstoffperoxid-bildende Enzyme in Kolonien auf Agarplatte mittels 4-Chloronaphthol. Vergleich Leervektor (K) in Corynebacterium glutamicum mit zwei Transformanten (1 und 2), welche den SoXy-Expressionsvektor enthalten.