以下、好ましい実施形態について、図面� ��参照しながら説明する。図1は、本実施形態 に係る、主として顕微授精用に好適な顕微鏡 システムの概略断面図を示す。本実施形態に 係る顕微鏡システムは、IMSI(Intra-cytoplasmic Mor phologically Selected Sperm Injection:高倍率下で精� ��を選んで顕微授精を行う方法)およびICSI(Intr a-cytoplasmic Sperm Injection:卵細胞質内精子注入� ��)に好適であり、図1に示すように、光源11お よびコンデンサレンズ13とからなる透過照明� ��学系と、コレクタレンズ12と、試料14と、対 物レンズ15と、ターレット16と、照明側複屈� �光学部材BP1と、結像側複屈折光学部材BP2と� �偏光子Pと、検光子Aとを有する。

 図1において、光源11からの照明光はコレ� ��タレンズ12によって集光された後、偏光子P� ��入射して直線偏光に変換される。偏光子Pと 試料14との間の光路中には光源11側から順に� �照明側複屈折光学部材BP1と、試料14に照明光 を照射するコンデンサレンズ13とが配置され� ��おり、偏光子Pを射出された直線偏光は照明 側複屈折光学部材BP1に入射して複屈折作用に より振動方向が互いに直交する2つの直線偏� �成分に分離され、コンデンサレンズ13に入射 する。照明側複屈折光学部材BP1で分離された 2光線はわずかな分離角αを持って進行し、コ ンデンサレンズ13の集光作用によって互いに� ��ずかなシア量Sだけ離れた平行光線となって 試料14を照明する。試料14上のわずかに離れ� �位置を透過した2光線は、対物レンズ15を介� �て結像側複屈折光学部材BP2に入射し、結像� �複屈折光学部材BP2の複屈折作用により合成� �れて同一光路上を進行する。合成された光� �は検光子Aに入射し、検光子Aによって互いに 直交する直線偏光中の同一方向振動成分だけ が取り出されて干渉する。その結果、試料14� ��のわずかに異なる位置を透過する際に2光線 間に付与された位相差に応じた干渉縞が、像 面上で拡大像(干渉像)17を形成する。観察者� �図示しない接眼光学系を介して、この拡大� �17を観察することができる。

 試料14が平面で均質の場合には、(分離し� ��2光線の間には位相の差がないため、)拡大� �17は強度分布が一様なコントラストのない像 になる。一方、試料14が不均質で、かつ勾配� ��段差がある場合、(分離した2光線の間に位� �差が生じるため、)拡大像17には屈折率変化� �ある部分や勾配、段差に相当する部分にコ� �トラストが生じる。よって、屈折率の変化� �勾配、段差が可視化され、試料14を拡大観察 することが可能となる。

 なお、対物レンズ15は、20倍以上40倍以下� ��第1の対物レンズ(以下、乾燥系中倍対物レ� �ズや中倍対物レンズと称することもある)15a� ��、微分干渉観察法によるコントラスト観察� ��可能である60倍以上100倍以下の第2の対物レ� ��ズ(以下、乾燥系高倍対物レンズや高倍対物 レンズと称することもある)15bとからなり、� �れら中倍対物レンズ15aと高倍対物レンズ15b� �はターレット16等により切り替え使用可能に 構成されている。

 また、第1の対物レンズ15aは、上記の微分 干渉観察法、もしくは変調コントラスト観察 法の少なくともいずれか一方による観察が可 能であることが好ましい。ここで、変調コン トラスト観察法について、図2~図4を用いてそ の原理を簡単に説明する。図中、21はコンデ� ��サレンズ、Sは試料、22は対物レンズ、23は� �口板、24は円盤状の変調器である。なお、開 口板23は、コンデンサレンズ21の光源側焦点� �置で、中心部から離れた位置に矩形状開口23 aを有している。また、変調器24は、開口板23� ��略共役な位置に配置され、開口23aの像を含� ��得る透過率100%の領域24aと、例えば透過率15% の領域24bと、透過率0%の領域24cとが順に隣接� ��て配置形成されている。

 この光学系では、矩形状開口23aが光軸か� ��偏心した位置に配置されているので、コン� ��ンサレンズ21に入射した光は試料Sを斜め方� ��から照明するように射出する。このとき、� ��明な試料Sが図2(a)に示すように扁平である� �、試料Sを透過した光束は対物レンズ22によ� �変調器24の領域24b内に結像し、図3(a)に示す� �うに領域24b内に開口像23a´が形成される。ま た、試料Sの表面が図2(b)に示すように右肩上� ��りの斜面となっていると、試料Sを透過する とき光束は右方へ屈折して変調器24の領域24c� ��に結像し、図3(b)に示すように領域14c内に開 口像23a´が形成される。また、試料Sの表面が 図2(c)に示すように左肩上がりの斜面となっ� �いると、試料Sを透過するとき光束は左方へ� ��折して変調器24の領域24a内に結像し、図3(c)� ��示すように領域24a内に開口像23a´が形成さ� �る。

 この説明で明らかなように、試料Sが図4(a )に示すような平坦面と斜面とを有する無色� �明体である場合、その観察像は図4(b)に示す� ��うに平坦面部分は灰色に、斜面部分は黒ま� ��は白く見える。このように、変調コントラ� ��ト観察法では、変調器24に設けた異なる透� �率領域と偏斜照明の効果とにより、無色透� �な試料でも陰影を持つ立体感のある像とし� �観察することが可能となる。

 なお、本顕微鏡システムにおいて、変調� ��ントラスト観察法によるコントラスト観察� ��可能な中倍対物レンズ15aを採用する場合は� ��上記した微分干渉観察法による観察のため� ��用いた部材である、照明側複屈折光学部材B P1、結像側複屈折光学部材BP2、偏光子Pおよび 検光子Aに換えて、光源11とコンデンサレンズ 13との間に(光源11側から順に)開口板23と変調� ��24を配置すればよい。

 本実施形態に係る顕微鏡システムにおい� ��、乾燥系の第2の対物レンズ(高倍対物レン� �)の開口数をNAとし、焦点距離をfとし、作動� ��離をWDとしたとき、次式(1)および(2)の条件� �を満足することが好ましい。

 0.78≦NA<1.0 …(1)
 f/3 ≦WD<2f  …(2)

 また、前記第2の対物レンズを用いて微分 干渉観察法による観察を行う場合に、物体面 におけるシア量をSとし、前記第2の対物レン� ��の開口数をNAとし、観察する光の波長をλと したとき、次式(3)の条件式を満足することが 好ましい。

 0.3≦S≦0.61λ/NA …(3)

 従来、生物顕微鏡の分野における、高倍( 60倍以上100倍以下)で高開口数の液浸対物レン ズによる微分干渉観察法による観察では、重 要視されるのは分解性能の良さについてであ り、ビデオエハンス等の画像処理手法を介在 することが前提となっていた。ところが、IMS I等の顕微授精を行う際には、精子を高倍観� �して広範囲の(多くの)精子からより良好なも のを選別した後に、この選別した精子を中倍 観察下で卵子に注入するという一連の作業を 迅速かつ的確に行うため、あくまで目視観察 が基本である。このため、目視において十分 なコントラストが得られることが望まれてい たが、これを満足するような微分干渉観察法 による観察可能な対物レンズの最適条件の提 示は今までなかった。そこで、本顕微鏡シス テムでは、微分干渉観察法による観察が可能 な第2の対物レンズ(高倍対物レンズ)の最適な 条件式(1)~(3)を導き出した。以下、これら条� �式(1)~(3)について順に説明する。

 まず、高倍対物レンズの適切な開口数NA� �範囲を規定する、条件式(1)について説明す� �。本顕微鏡システムにおいて、観察対象で� �る精子の頭部の大きさは4~5μm程度であり、� �つのピント面に頭部の空胞は1個乃至10個程� �の大小様々な大きさのものが散らばってい� �ことが確認されている。従って、0.4~0.5μm程� ��の大きさがコントラスト良く可視化・識別� ��きれば、IMSI用途として十分使えるレベルで あることが分かる。

 図5に、顕微鏡光学系で一般に用いられる インコヒーレント光学系のMTFカーブ(すなわ� �、縦軸に示すコントラストと横軸に示す光� �系の分解能との関係)を示す。なお、図5の横 軸f/f0は、空間周波数をfとし、対物レンズの� ��口数をNAとし、観察する光の波長をλとした とき、空間周波数fをf0=NA/λで規格化したもの である。顕微鏡光学系の横分解能をRESとする と、前記空間周波数fに対応する横分解能RES� �の関係は次式(4)で示される。

 RES=1/f={1/(f/f0)}×{λ/NA} …(4)

 ここで、図5に示す横軸f/f0の最大値=2.0が� ��顕微鏡光学系における限界分解能RES(max)と� �応している。そこで、上記の式(4)にf/f0=2.0を 代入することにより、顕微鏡光学系における 限界分解能RES(max)を示す、次式(5)が得られる� ��この条件式(5)で規定される限界分解能RES(max )に相当する開口数NAよりもさらに余裕を持た ないと、目視で像を視認することが難しい。

 RES(max)={1/2.0}×{λ/NA}=0.5λ/NA …(5)

 また、一般に、人間の眼は、コントラス� ��の値が0.1以下であれば見分けることが困難� ��あることと、コントラストの値が0.2以上で� ��れば視感度が良いことが知られている。図5 において、コントラストの値が0.1となる空間 周波数f/f0は1.6付近であることから、横分解� �RESが0.4μm(観察対象である精子頭部の空胞の� ��きさ)となるためには、式(4)にこれらの値を 代入して、次式(6)を満足する必要がある。

 RES={1/1.6}×{λ/NA}=0.4 …(6)

 なお、本顕微鏡システムの使用目的であ� ��IMSIやICSIでは目視観察が前提となるため、� �の視感度を考えると、観察時の中心波長λは 500nm~550nm近傍であることが望ましい。これは� ��500nmは暗所、550nmは明所における眼の視感度 のピークだからである。よって、観察の中心 波長λ=500nm=0.5μmとして式(6)に代入すると、高 倍対物レンズに必要な開口数NAの最下限値と� ��て、次式(7)が得られる。

 NA={1/1.6}×0.5[μm]/0.4[μm]=0.78 …(7)

 また、視感度が良いとされるコントラス� ��の値が0.2となる空間周波数f/f0は図5より1.4� �近であることから、上記と同様に式(6)に代� �すると、より好ましい開口数NAの最下限値と して、次式(8)が得られる。

 NA={1/1.4}×0.5[μm]/0.4[μm]=0.89 …(8)

 また、開口数NAは、対物レンズと試料間� �媒質の屈折率nと対物レンズの開口角φを用� �るとNA=n・sin(φ/2)で表され、本実施形態にお� ��ては媒質が空気(屈折率n=1)である。ゆえに� �開口数NAの上限値は1となる。

 以上まとめると、本実施形態の顕微鏡シ� ��テムにおいて、コントラスト良く目視観察� ��能に構成するための好ましい高倍対物レン� ��の開口数NAの範囲は、条件式(1)すなわち0.78� ��NA<1.0となる。さらに、より好ましくは、� ��件式(8)より、高倍対物レンズの開口数NAの� �囲は、0.89≦NA<1.0となる。

 次に、高倍対物レンズにおける作動距離W Dの適切な範囲を規定する、上記条件式(2)に� �いて説明する。従来の顕微鏡システムにお� �て、高倍対物レンズとして用いられていた� �開口数の液浸系対物レンズは、一般に作動� �離が大きく取ることが難しかった。このた� �、操作時のサンプルを保温装置等により37℃ に保温することが絶対条件であるICSI観察やIM SI観察で用いようとすると、高倍から中倍へ� ��対物レンズ切り替え時に対物レンズの先端� ��と保温装置が干渉しやすいという問題があ� ��た。また、作動距離が大きく取れないこと� ��ら、高開口数の液浸系対物レンズではカバ� ��ガラス直下近傍しか観察することができず� ��カバーガラスから離れた位置にある精子を� ��別対象にすることができないという問題が� ��った。そこで、本顕微鏡システムは、高倍� ��対物レンズを乾燥系レンズで構成すること� ��、条件式(1)で示される開口数NAの条件に加� �て、条件式(2)で示される作動距離WDが大きい という条件も兼ね備える。

 作動距離を決定する一つの要素として、� ��物レンズの倍率がある。対物レンズの倍率� ��、無限遠補正光学系の場合、結像レンズと� ��物レンズの焦点距離との比によって決定さ� ��るものであり(本実施形態のように60倍以上1 00倍以下の高倍対物レンズでは、例えば、結� ��レンズの焦点距離を200mmとすると、対物レ� �ズの焦点距離は2.00~3.33mとなる)、高倍になる ほど焦点距離は短くなる。一般に、作動距離 は対物レンズの焦点距離に比例するため、対 物レンズの倍率が高倍になるほど作動距離は 減少する。また、作動距離を決定する他の要 素として、開口数がある。開口数の大きさが 同じであれば、作動距離が長くなるほど、対 物レンズの第1レンズ面(物体側レンズ面)にお ける光線高さが高くなり、収差補正をより困 難にする。

 つまり、対物レンズの長作動距離化と高� ��率化・高開口数化とは相反する関係にある� ��め、従来の顕微鏡システムにおける高倍対� ��レンズでは、作動距離を重視したものと、� ��率・開口数を重視したものとに二極化して� ��た。具体的には、前者では倍率60倍/開口数0 .7/作動距離2mm前後が、後者では倍率100倍/開� �数1.4/作動距離0.1mm前後が、代表的なスペッ� �である。しかしながら、IMSIの観察を用途と� ��るならば、上記条件式(1)に示すように必ず� ��も開口数NAが1を超える必要はなく、その分� ��動距離を長くするほうが作業効率の向上に� ��ながる。

 そこで、高倍対物レンズ(第2の対物レン� �)の開口数をNAとし、焦点距離をfとし、作動� ��離をWDとしたとき、本実施形態では条件式(2 )すなわちf/3≦WD<2fを満足することが好まし い。この条件式(2)が下限値を下回ると、対物 レンズの切り替え時に対物レンズの先端部が 保温装置と干渉する等の不具合を引き起こす 可能性が高くなる。一方、条件式(2)が上限値 を上回ると、対物レンズの第1レンズ面にお� �る光線高さが高くなり過ぎて、条件式(1)で� �定された開口数NAを確保するのが困難となる 。

 続いて、微分干渉観察法におけるシア量S の最適な範囲を規定する、上記条件式(3)につ いて説明する。図6に、シア量Sを1.5λ/NAから0. 15λ/NAまで変化させたときの位相コントラス� �MTFカーブを示す(なお、微分干渉観察法にお� ��る位相コントラストMTFの算出方法について� ��、特許文献3に詳しい)。図6において、横軸f /f0は空間周波数fを対物レンズの開口数NAで規 定される基準周波数f0=NA/λで規格化したもの� ��、縦軸は各周波数における位相物体のコン� ��ラストMTFを示す。

 図6から、微分干渉観察法における位相コ ントラストMTFは、インコヒーレントMTFカーブ よりも大きなコントラストの値を取らないこ とが分かる。また、図6から、(例えば1.5λ/NA� �ように)シア量Sが大きいと位相コントラスト MTFが負値を取ることが分かるが、これは偽解 像と呼ばれる白黒が反転した状態である。一 般に、微分干渉観察法による観察では、上記 のような偽解像が起こらない、すなわち位相 コントラストMTFが負値を取らない状態が好ま しいとされている。

 そこで、位相コントラストMTFが負値を取� ��ない条件を満たす、低空間周波数帯域(横軸 f/f0の値が小さい領域)の限界についてまず考� ��る。図6より、低空間周波数帯域の最大のシ ア量Sは、約0.61λ/NA乃至0.5λ/NAであることが分 かり、これらの値はちょうど顕微鏡光学系の 点分解能や線分解能に相当している。図6に� �いてシア量Sが0.61λ/NAのカーブを見ると、低� ��間周波数帯域のコントラストの値は高いが� ��高空間周波数帯域の横軸f/f0=1.4付近でのコ� �トラストの値が0.1程度となり、ちょうど視� �度の限界に当たることが分かる。よって、� �実施形態における対物レンズのシア量Sの上� ��値は、点分解能を維持できる0.61λ/NAとなる� ��また、より好ましいシア量Sの上限値は、(� �記0.61λ/NAのカーブよりインコヒーレントMTF� �ーブにより近くであり、)線分解能を維持で� ��る0.5λ/NAとなる。

 次に、位相コントラストMTFが負値を取ら� ��い条件を満たす、高空間周波数帯域(横軸f/f 0の値が大きい領域)の限界を考える。図6より 、高空間周波数帯域の最大のシア量Sは、横� �f/f0=1.6付近で最大コントラストを取るカーブ 、すなわち0.3λ/NAのカーブであることが分か� ��。このとき、低空間周波数帯域のコントラ� ��トをある程度犠牲にする代わりに、高空間� ��波数帯域での視認度を、インコヒーレントM TFのコントラストの値とほぼ同等の0.1に保つ� ��とができる。また、これによりもシア量Sを 小さくすると、低空間周波数帯域でも高空間 周波数帯域でもそれぞれコントラストが低下 するため、本実施形態の使途には好ましくな い。よって、本実施形態における対物レンズ のシア量Sの下限値は0.3λ/NAとなる。

 以上まとめると、上記条件式(3)すなわち0 .3λ/NA≦S≦0.61λ/NAを満足する、より好ましく� ��0.3λ/NA≦S≦0.5λ/NAを満足するシア量Sを設定� ��ることにより、微分干渉観察法において対� ��レンズの分解能を殆ど損なわず、且つ目視� ��て精子頭部内の空胞を高いコントラストで� ��察することが可能となる。

 なお、本実施形態に係る第2の対物レンズ (高倍対物レンズ)は、カバーガラスの厚さや� ��度等の変化による収差変動を補正する補正� ��を有することが好ましい。これは、補正環� ��用いることによって、カバーガラスの厚み� ��差や温度等により発生した収差を打ち消し� ��対物レンズの解像度およびコントラストを� ��に最良となるところで調整をすることがで� ��るからである。