SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico y estadificación del cáncer de vejiga en el que se miden los niveles de expresión de un grupo de microRNAs (miRNAs), valores que se utilizan posteriormente para saber la presencia de un tumor y la probabilidad de que pertenezca a las diferentes categorías clínicas establecidas. Por tanto, la invención se engloba dentro de los procedimientos de diagnóstico y estadificación de cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer de vejiga (CV) ocasiona el 3% de todos los tumores malignos en adultos en todo el mundo y es la neoplasia maligna urológica más letal. De hecho, según el estudio GLOBOCAN 2020, el CV representa, cada año, más de 570.000 nuevos casos de cáncer en todo el mundo y es responsable de más de 210.000 muertes anuales. Además, el CV aumenta considerablemente el gasto sanitario, ya que es el tumor con los mayores costes de seguimiento y el cáncer más costoso de tratar. El subtipo de cáncer músculo infiltrante se estima que representa un gasto de 150,000$ por paciente. Los principales factores de riesgo para el CV son el tabaquismo y la exposición ocupacional y ambiental a sustancias químicas. Actualmente, la ecografía vesical, la citología y la cistoscopia son las técnicas de referencia para el diagnóstico y seguimiento del CV a pesar de su baja sensibilidad o alta invasividad, respectivamente. Así, recientemente han surgido varios marcadores de CV en orina, como el test UroVysion, ImmunoCyt o el test de proteína de matriz nuclear (NMP-22); aunque, ninguno de ellos alcanza una elevada sensibilidad y especificidad. En consecuencia, se han propuesto nuevos marcadores no invasivos en biopsias líquidas, como los miRNAs o el ADN libre circulante (cell-free DNA).

Los miRNAs son moléculas cortas de RNA no codificantes de 20 a 22 nucleótidos que regulan la expresión génica. Los miRNAs están involucrados en diferentes procesos de tumorigénesis, como la iniciación, el crecimiento y la progresión tumoral y han surgido como nuevos candidatos a biomarcadores tumorales. Uno de los aspectos más prometedores de los miRNAs como biomarcadores es que están presentes en un amplio espectro de muestras biológicas (como plasma sanguíneo/suero, orina, saliva o heces) y son estables cuando se almacenan y manipulan adecuadamente. Estudios previos evidencian que los miRNAs están involucrados en el desarrollo y progresión del CV. Se han encontrado miRNAs desregulados en varios biof luidos como plasma/suero, orina y tejido. Sin embargo, estos estudios no se han realizado en todo el abanico de subtipos de CV, sino que solo han estudiado un subtipo de CV, el CV no músculo infiltrante (non muscle-invasive bladder cancer, NMIBC) (Ingelmo- Torres, M. et al. (2017) Oncotarget 8, 18238-47), CV músculo infiltrante (muscle-invasive bladder cancer, MIBC) (Feng Y., et al. (2019), Journal of Oncology 2019, 2654296) o de bajo grado (Dip N., et al. (2014), International Braz. J. Urol.: official journal of the Brazilian Society of Urology 40, 644-9)

En el documento US2021108275A1 se describe la cuantificación de un grupo de miRNAs en orina, sangre, suero o plasma de pacientes con cáncer vesical y administrar los miRNAs de dicho perfil que estén desregulados. En el documento EP3492607A2 se describe una serie de miRNAs que están desregulados en diferentes subtipos de cáncer vesical en orina. El documento describe un kit para diagnosticar cáncer vesical analizando la expresión de un grupo de miRNAs en exosomas urinarios que además pueden ser empleados como terapia para el cáncer vesical. En el documento de Medina et al. Biomedicines 2020, 8(1 1 ), 447 se describe un normalizador para estudios de miRNAs de cáncer vesical en orina.

Por tanto, existe una necesidad de disponer de técnicas de diagnóstico y estadificación del cáncer de vejiga que no resulten invasivas para el paciente.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han identificado y validado un perfil de orina de siete miRNAs (m¡R-221 -3p, m¡R-93-5p, m¡R-362-3p, m¡R-191 -5p, m¡R-200c-3p, m¡R-192-5p y m¡R- 21 -5p) con valor diagnóstico y de estratificación para CV, junto con otros seis miRNAs desregulados (m¡R-30a-5p, m¡R-425-5p, m¡R-99a-5p, m¡R-23a-3p, m¡R-215 -5p, m¡R-10b-5p), en una amplia cohorte de pacientes con CV y controles. También se han identificado los m¡R- 21 -5p, m¡R-425-5p y m¡R-99a-5p como posibles marcadores de seguimiento para la recidiva de CV y m¡R-21 -5p y m¡R-221 -3p como posibles marcadores de metástasis tumoral. Entre los miRNAs desregulados, m¡R-93-5p, m¡R-425-5p, m¡R-21 -5p y m¡R-200c-3p podrían ser marcadores del subtipo CV in situ. El análisis de muestras de tejido tumoral FFPE reveló que el contenido de miRNAs en la orina puede reflejar el del microambiente tumoral, mostrando su aplicación como biopsia líquida. El uso de estos nuevos biomarcadores de orina no invasivos puede mejorar el manejo del CV, reduciendo así el uso de las técnicas diagnósticas invasivas actuales.

Aunque varios estudios han tenido como objetivo identificar los miRNAs en orina como nuevos biomarcadores no invasivos para mejorar el diagnóstico y el seguimiento de CV, ninguno ha incluido a pacientes con CV con todo el amplio espectro de grados y estadios. Además, ninguno ha tenido como objetivo identificar un perfil de miRNAs capaz de estratificar a los pacientes con CV. En la presente invención, se ha creado y validado un modelo que comprende siete miRNAs en orina como predictores (m¡R-221 -3p, m¡R-93-5p, m¡R-362-3p, m¡R-191 -5p, m¡R-200c-3p, m¡R-192-5p y m¡R-21 -5p) capaces de identificar y estratificar pacientes con CV en comparación con un grupo de controles sanos. Además, después del ajuste de FDR, se identificaron otros sesenta y tres miRNAs desregulados entre las categorías clínicas estudiadas. También se cuantificaron en la cohorte de validación la desregulación de los seis miRNAs desregulados más significativamente (m¡R-30a-5p, m¡R-425-5p, m¡R-99a-5p, m¡R-23a-3p, m¡R-215-5p y m¡R-10b-5p) identificados en la cohorte de cribado.

También se ha analizado la variación de los niveles de expresión de miRNAs a lo largo del tiempo según la recidiva de CV. Se encontró un aumento en los m¡R-21 -5p y m¡R-425-5p y una disminución en el m¡R-99a-5p a lo largo del tiempo en pacientes con CV con recidiva tumoral. De hecho, la expresión de estos tres miRNAs se normalizó a los niveles de los controles sólo en pacientes con remisión del tumor. Con todo, estos tres miRNAs pueden ser útiles como marcadores de seguimiento para identificar la recurrencia de CV.

También se observó un aumento de los m¡R-21 -5p y miR-221 -3p en la orina de pacientes con CV con metástasis en comparación con aquellos con patología no metastásica, por lo que estos miRNAs pueden ser biomarcadores no invasivos de metástasis tumoral en pacientes con CV. De hecho, se observó un aumento en la expresión de estos dos miRNAs con el grado de severidad de la CV en la cohorte de validación. Se analizó la variación de la expresión de miRNAs según el subtipo celular de CV y se observó un aumento significativo en los m¡R-93- 5p, m¡R-425-5p, m¡R-21 -5p, m¡R-200c-3p en pacientes con CV con histología in situ en comparación con histología papilar. Estos resultados sugieren que estos miRNAs pueden estar involucrados en el desarrollo de uno de estos subtipos específicos de tumores CV.

Finalmente, para descifrar el origen de la desregulación de estos trece miRNA, se analizó su expresión en muestras de tejido FFPE de la mayoría de los pacientes de la cohorte de cribado. La expresión de estos miRNAs según la gravedad de la CV en muestras de tejido tumoral sigue la tendencia observada en muestras de orina de los mismos pacientes. Estos resultados proponen el estudio de orina como biopsia líquida para CV, ya que este biof luido refleja lo que ocurre a nivel de miRNAs en el microambiente tumoral.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método para diagnosticar y/o estadificar cáncer de vejiga en un sujeto que comprende los siguientes pasos: a. determinar el nivel de expresión de cada uno de los siguientes miRNAs: m¡R-93-5p, m¡R-362-3p, m¡R-191 -5p, m¡R-200c-3p, m¡R-192-5p, m¡R-21 -5p y m¡R-221 -3p, en una muestra previamente extraída de dicho sujeto; b. usar los datos de niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) para predecir la probabilidad de que el sujeto padezca cáncer de vejiga y/o determinar el grado y estadio de dicho cáncer.

Preferiblemente, la etapa (a) se realiza mediante una retrotranscripción del RNA aislado de la muestra a cDNA, seguida de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) de los miRNAs de interés.

Preferiblemente, se normaliza la expresión de cada uno de los miRNAs descritos en la etapa (a) por la expresión del m¡R-29c-3p medida en la misma muestra del sujeto.

En este método para diagnosticar y/o estadificar cáncer de vejiga, la muestra se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva, preferiblemente es una muestra de orina.

Para la clasificación y estadificación de los tumores se aplican las siguientes categorías:

Categoría de tumor:

Tx No se puede evaluar

TO no hay evidencia

Tis Carcinoma in situ

Ta Carcinoma papilar no invasivo

T1 Tumor que invade el tejido conjuntivo subepitelial

T2 Tumor que invade la capa muscular

T2a Tumor que invade la capa muscular superficial (mitad interna)

T2b Tumor que invade la capa muscular profunda (mitad externa)

T3 Tumor que invade la grasa perivesical

T3a Microscópicamente

T3b Macroscópicamente (masa extravesical)

T4 Tumor que invade cualquiera de las siguientes estructuras: próstata, útero, vagina, pared pélvica o pared abdominal

Grado histológico:

GX: No se puede evaluar el grado de diferenciación G1 : Bien diferenciado

G2: Moderadamente diferenciado

G3-G4: Pobremente diferenciado/indiferenciado

Preferiblemente para calcular la probabilidad de pertenecer a una determinada categoría clínica, se puede emplear la siguiente fórmula: logit = -4.061045 + intercept + 0.15 * m¡R-221 -3p - 0.055 * m¡R93-5p + 0.1086

* m¡R362-3p - 0.181 * m¡R_191 -5p - 0.11 * m¡R_200c-3p + 0.2154

* m¡R_192-5p - 0.7692 * m¡R_21 -5p

En la fórmula, hay que sustituir el nombre de cada uno de los miRNAs por el valor del nivel de expresión obtenido para cada uno de ellos.

El valor de intercerpt varía en función de la categoría clínica a la que pueda pertenecer el tumor, por ejemplo, tal y como se indica a continuación:

Para calcular la probabilidad de ser por ejemplo T>2GX, usar el Intercepts: -0,28:

Prob

Para calcular la probabilidad de ser por ejemplo TaT1 G3, usar el Intercepts: 0,7839:

Prob(

Para calcular la probabilidad de ser por ejemplo TaG1 , usar el Intercepta 1 ,9428: Prob(

Para calcular la probabilidad de ser control:

Prob(Control) = 1 - (Prob(T>2GX) + Prob(TaT1 G3) + Prob(TaGI ))

Para una muestra, se calcula la probabilidad de pertenecer a cada una de las categorías y el valor más alto indicará la clasificación correcta para determinar el grado y estadio del tumor.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para diagnosticar y/o estadificar el cáncer de vejiga en un sujeto que comprende a) medios para extraer el RNA de una muestra extraída de dicho sujeto que se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva; preferiblemente, la muestra es orina y b) medios para determinar el nivel de expresión de los siguientes miRNAs: m¡R-93-5p, m¡R-362-3p, m¡R-191 -5p, m¡R-200c-3p, m¡R-192-5p y m¡R-21 -5p y m¡R-221 -3p.

Preferiblemente, en el kit para diagnosticar y/o estadificar el cáncer de vejiga se utiliza el m¡R- 29c-3p como normalizador de la expresión de cada uno de los miRNAs de (b).

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para diagnosticar recidivas de cáncer de vejiga en un sujeto que comprende los siguientes pasos: a. determinar el nivel de expresión de cada uno de los siguientes miRNAs: m¡R-21 -5p, m¡R-425-5p y m¡R-99-5p, en una muestra previamente extraída de dicho sujeto; b. determinar una desviación o no desviación de los valores obtenidos en la etapa (a) con valores de referencia de pacientes sin recidivas; c. atribuir la desviación o no desviación de la etapa (b) a un diagnóstico de recidiva de cáncer de vejiga en el sujeto.

Preferiblemente en este método para diagnosticar recidivas de CV, un nivel de expresión diferente de todos los miRNAs en la muestra según la etapa (a) indica la presencia de una recidiva de cáncer de vejiga en el sujeto.

Preferiblemente, la etapa (a) se realiza mediante una retrotranscripción del RNA aislado de la muestra a cDNA, seguida de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) de los miRNAs de interés.

Preferiblemente, se normaliza la expresión de cada uno de los miRNAs descritos en la etapa (a) por la expresión del m¡R-29c-3p medida en la misma muestra del sujeto.

En este método para determinar recidivas en cáncer de vejiga, la muestra se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva, preferiblemente es una muestra de orina.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para para diagnosticar recidivas de cáncer de vejiga que comprende: a. medios para extraer el RNA de una muestra extraída de dicho sujeto que se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva, preferiblemente es orina; b. medios para determinar el nivel de expresión de los siguientes miRNAs: m¡R-21 -5p, m¡R-425-5p y m¡R-99-5p.

Preferiblemente, en este kit se utiliza el m¡R-29c-3p como normalizador de la expresión de cada uno de los miRNAs incluidos.

Preferiblemente, este kit comprende un perfil de expresión de los miRNAs de (b) en al menos una muestra de un sujeto que ha sufrido recidiva de cáncer de vejiga.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para determinar la presencia de metástasis de cáncer de vejiga en un sujeto que comprende los siguientes pasos: a. medir la cantidad de cada uno de los siguientes miRNAs: m¡R-21 -5p y m¡R-221 -3p, en una muestra previamente extraída de dicho sujeto; b. determinar una desviación o no desviación de los valores obtenidos en la etapa (a) con valores de referencia de pacientes sin metástasis; c. atribuir la desviación o no desviación de la etapa (b) a un diagnóstico de presencia de metástasis del cáncer de vejiga en el sujeto.

Preferiblemente, en el método para determinar la presencia de metástasis en CV, la disminución del nivel de expresión de todos los miRNAs en la muestra según la etapa (a) indica la presencia de una metástasis del cáncer de vejiga en el sujeto.

Preferiblemente, en el método para determinar la presencia de metástasis en CV, la etapa (a) se realiza mediante una retrotranscripción del RNA aislado de la muestra a cDNA, seguida de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) de los miRNAs de interés.

Preferiblemente, en el método para determinar la presencia de metástasis en CV, se normaliza la expresión de cada uno de los miRNAs descritos en la etapa (a) por la expresión del m¡R-29c-3p medida en la misma muestra del sujeto.

En el método para determinar la presencia de metástasis, la muestra se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva, preferiblemente es una muestra de orina. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para para determinar la presencia de metástasis de cáncer de vejiga que comprende: a) medios para extraer el RNA de una muestra extraída de dicho sujeto que se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva, preferiblemente orina y b) medios para determinar el nivel de expresión de los siguientes miRNAs: m¡R-21 -5p y m¡R-221 -3p.

Preferiblemente en este kit para determinar la presencia de metástasis se utiliza el m¡R-29c- 3p como normalizador de la expresión de cada uno de los miRNAs incluidos.

Preferiblemente este kit para determinar la presencia de metástasis además comprende un perfil de expresión de los miRNAs de (b) en al menos una muestra de un sujeto que ha sufrido metástasis de cáncer de vejiga.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para identificar el subtipo celular (papilar o in situ) del cáncer de vejiga en un sujeto que comprende los siguientes pasos: a) medir la cantidad de cada uno de los siguientes miRNAs: m¡R-93-5p, m¡R-425-5p, m¡R- 21 -5p y m¡R-200c-3p, en una muestra previamente obtenida de dicho sujeto; b) determinar una desviación o no desviación de los valores obtenidos en la etapa (a) con valores de referencia de pacientes con cáncer de vejiga papilar o cáncer de vejiga in situ; c) atribuir la desviación o no desviación de la etapa (b) a un diagnóstico de subtipo de cáncer de vejiga en el sujeto.

Preferiblemente, en el método para identificar el subtipo celular del CV una disminución del nivel de expresión de todos los miRNAs en la muestra según la etapa (b) indica la presencia de un subtipo celular in situ del cáncer de vejiga en el sujeto.

En este método de identificar el subtipo de cáncer de vejiga, la muestra se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva, preferiblemente es una muestra de orina.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para para identificar el subtipo celular (papilar o in situ) de cáncer de vejiga que comprende: a) medios para extraer el RNA de una muestra extraída de dicho sujeto que se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva; preferiblemente la muestra es orina; b) medios para determinar el nivel de expresión de los siguientes miRNAs: m¡R-93-5p, m¡R-425-5p, m¡R-21 -5p y m¡R-200c-3p.

Preferiblemente, en este kit se utiliza el m¡R-29c-3p como normalizador de la expresión de cada uno de los miRNAs incluidos.

Preferiblemente, este kit además comprende un perfil de expresión de los miRNAs de (b) en al menos una muestra de un sujeto que ha sufrido cáncer de vejiga papilar o in situ.

Otro aspecto de la invención se refiere a un aparato para diagnosticar y/o estadificar cáncer de vejiga en un sujeto que comprende: a. al menos un dispositivo para determinar los niveles de expresión de los siguientes miRNAs: m¡R-93-5p, m¡R-362-3p, m¡R-191 -5p, m¡R-200c-3p, m¡R-192-5p, m¡R-21 -5p y m¡R-221 -3p, en una muestra previamente extraída de dicho sujeto que se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva; b. medios de procesamiento configurados para: i. acceder a los valores de niveles de expresión de miRNA determinados por el dispositivo en (a);

¡i. estimar una probabilidad en base a los niveles de expresión determinados, siendo la probabilidad una probabilidad de que el sujeto padezca cáncer de vejiga y/o de que el tumor que provoca el cáncer pertenezca a una determinada categoría clínica y iii. generar una señal de salida indicativa de la probabilidad estimada.

Otro aspecto de la invención se refiere a un aparato para diagnosticar recidivas cáncer de vejiga en un sujeto que comprende: a. al menos un dispositivo para determinar los niveles de expresión de los siguientes miRNAs: m¡R-21 -5p, m¡R-425-5p y m¡R-99-5p, en una muestra previamente extraída de dicho sujeto que se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva; b. medios de procesamiento configurados para: i. acceder a los valores de niveles de expresión de miRNA determinados por el dispositivo en (a); ¡i. comparar de los valores obtenidos en la etapa (a) y determinar una desviación o no desviación respecto a valores de referencia de pacientes sin recidivas; iii. generar una señal de salida indicativa de si la desviación calculada en (¡i) corresponde con una recidiva de cáncer de vejiga.

Otro aspecto de la invención se refiere a un aparato para determinar la presencia de metástasis de cáncer de vejiga en un sujeto que comprende: a. al menos un dispositivo para determinar los niveles de expresión de los siguientes miRNAs: m¡R-21 -5p y miR-221 -3p, en una muestra previamente extraída de dicho sujeto que se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva; b. medios de procesamiento configurados para: i. acceder a los valores de niveles de expresión de miRNA determinados por el dispositivo en (a);

¡i. comparar de los valores obtenidos en la etapa (a) y determinar una desviación o no desviación respecto a valores de referencia de pacientes con metástasis;

Iii. generar una señal de salida indicativa de si la desviación calculada en (¡i) corresponde con la presencia de metástasis.

Otro aspecto de la invención se refiere a un aparato para identificar el subtipo celular (papilar o in situ) de cáncer de vejiga en un sujeto que comprende: a. al menos un dispositivo para determinar los niveles de expresión de los siguientes miRNAs: m¡R-93-5p, m¡R-425-5p, m¡R-21 -5p y m¡R-200c-3p, en una muestra previamente extraída de dicho sujeto que se selecciona de entre sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina o saliva; b. medios de procesamiento configurados para: i. acceder a los valores de niveles de expresión de miRNA determinados por el dispositivo en (a);

¡i. comparar de los valores obtenidos en la etapa (a) y determinar una desviación o no desviación respecto a valores de referencia de pacientes con cada uno del subtipo celular; iii. generar una señal de salida indicativa de si la desviación calculada en (¡i) corresponde con la uno u otro subtipo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Expresión de los 7 miRNAs incluidos en el modelo de regresión logística Elastic Net para el diagnóstico y estratificación del CV. A. Heatmap, el verde representa la sobreexpresión de los diferentes miRNAs y el rojo representa la infraexpresión. B. Expresión relativa en los diferentes subtipos de CV y controles sanos.

Figura 2. Expresión de los 13 miRNAs desregulados en la cohorte de validación. A. Heatmap, el verde representa la sobreexpresión de miRNAs y el rojo representa la infraexpresión. B. Expresión relativa en los diferentes subtipos de CV y controles sanos.

Figura 3. Gráfico de concordancia de Bangdiwala que representa la concordancia entre los valores predichos y observados obtenidos en la cohorte de validación con nuestro modelo de regresión ordinal. Las coincidencias perfectas entre los valores predichos y observados se muestran como cuadrados negros, las categorías adyacentes se representan como cuadrados grises y la falta de coincidencia se representa como cuadrados blancos.

Figura 4. Expresión relativa de los miRNAs desregulados según la presencia de recidiva tumoral, metástasis y subtipo celular en pacientes con CV de la cohorte de validación. A. Expresión relativa de m¡R-21 -5p, m¡R-425-5p y m¡R-99a-5p según la recidiva tumoral. B. Expresión relativa de m¡R-21 -5p, m¡R-425-5p y m¡R-99a-5p a lo largo del tiempo según la recidiva tumoral. C. Expresión relativa de m¡R-21 -5p, m¡R-425-5p y m¡R-99a-5p en las muestras recogidas durante el seguimiento según la recidiva tumoral. D. Expresión relativa de m¡R-21 -5p y m¡R-221 -3p según la presencia de metástasis. E. Expresión relativa de m¡R-93- 5p, m¡R-425-5p, m¡R-21 -5p y m¡R-200c-3p según el subtipo celular CV.

Figura 5. Expresión relativa en tejido tumoral parafinado de los miRNAs desregulados encontrados en la orina de los mismos pacientes con CV.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Cuantificación de la expresión de los niveles de miRNAs

El nivel de expresión de los miRNAs se cuantificó mediante PCR de retrotranscripción seguida de qPCR (RT-qPCR) en dos etapas diferentes:

Etapa de cribado

En función de la calidad del RNA aislado, se seleccionaron 35 pacientes con CV y 15 controles y se estudió el nivel de expresión de los miRNAs. Para la retrotranscripción se utilizó el Universal cDNA Synthesis Kit II (Qiagen) y se cuantificó el nivel de expresión de 179 miRNAs con el Serum/Plasma Focus microRNA PCR Panel V5 (Qiagen) con el ExiLENT SYBR Green Master Mix (Qiagen) en un LightCycler 480 II (Roche, Mannheim, Alemania) como se informó anteriormente (29). Además, cada panel incluye los siguientes controles internos: 5 RNA sintéticos del RNA Spike-in-kit destinados a monitorizar el rendimiento durante el aislamiento de RNA y la síntesis de cDNA, y un calibrador interplaca por triplicado y un control negativo. Para normalizar el nivel de expresión de cada miRNA estudiado, empleamos la expresión de m¡R-29c-3p, propuesto recientemente como un normalizador robusto para los estudios de miRNAs en orina en CV. A continuación, se realizó una regresión ordinal para diagnosticar y estratificar a los pacientes con CV según los niveles de miRNAs antes de la cirugía.

Etapa de validación

Una vez identificado un perfil de miRNAs con capacidad de diagnosticar y estratificar pacientes con CV, su nivel de expresión se cuantificó en una cohorte independiente y más grande de 172 pacientes con CV y 94 controles por duplicado. Para ello, se utilizaron ensayos específicos de miRNA miRCURY LNA miRNA PCR (Exiqon). Cada miRNA se midió por duplicado y se consideró satisfactoria una desviación estándar (DE) <0,5. También analizamos la variación de la expresión de miRNAs en orina a lo largo del tiempo dependiendo de la recidiva de CV en 51 muestras seriadas de 17 pacientes con CV, de los cuales 6 pacientes tuvieron recurrencia de BC. Además, analizamos la expresión de los miRNAs desregulados según la presencia de metástasis y subtipo celular. Además, se cuantificó la expresión de los miRNAs desregulados en tejido tumoral parafinado de 30 pacientes con CV. Además, de dos de estos pacientes, se disponía de urotelio vesical sano adyacente por lo que se cuantificó la expresión de los miRNAs desregulados también es estas dos muestras de tejido. Los niveles de expresión de miRNAs se cuantificaron como se mencionó anteriormente. La selección del normalizador más estable entre todas las muestras se realizó con la herramienta RefFinder que integra diferentes programas: geNorm, Normfinder, BestKeeper y el método delta-Ct comparativo. Los normalizadores candidatos evaluados fueron los propuestos por el fabricante para muestras de tejido (m¡R-103a-3p, m¡R-423-5p y m¡R-423- 3p) y el m¡R-29c-3p, el normalizador utilizado en muestras de orina.

Identificación de las dianas de los miRNAs

Una vez que seleccionamos un perfil de miRNAs con potencial de diagnóstico y estadificación, identificamos sus proteínas diana validadas y predichas relacionadas con el CV utilizando la base de datos miRWalk 2.0 (http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/) que comprende 12 programas de predicción de dianas de miRNAs. Luego, estas dianas se integraron dentro de la vía del cáncer de vejiga de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) (htps://www.qenome.jp/kegg/).

Análisis estadístico

Las diferentes variables analizadas representaron utilizando la media (DS) y la mediana (1 ^e , 3 ^e cuartil) en el caso de las variables continuas y frecuencias relativas y absolutas en el caso de las variables categóricas. Los valores de miRNAs se normalizaron restando de los valores de Ct crudas el valor correspondiente de Ct del miRNA normalizador: m¡R-29c-3p para muestras de orina y m¡R-103a-3p en el caso de tejido parafinado. Se ajustó un modelo de regresión ordinal penalizado Elastic Net utilizando los valores de los miRNAs en la cohorte de cribado, con el objetivo de identificar aquel conjunto de miRNAs que nos permite discriminar entre pacientes y los pacientes con diferentes estadios y grados. Además, se ajustaron modelos de regresión ordinal univariante para cada miRNA. Los valores de P se corrigieron para comparaciones múltiples utilizando false discovery rate (FDR). Las predicciones se realizaron utilizando el modelo de regresión ordinal ajustado en la cohorte de cribado y el poder discriminative del modelo se evaluó estimando el coeficiente de correlación de rango (rho) entre los valores previstos y observados. Además, la bondad de ajuste se determinó mediante una gráfica de concordancia de Bangdiwala (30). En la estimación estadística de Bangdidawala, las coincidencias perfectas se ponderaron como 1 y las categorías adyacentes se ponderaron como 0. Las diferencias entre pacientes metastásicos y no metastásicos y entre tipos de tumores (papilar vs. in situ) se evaluaron mediante la prueba de Wilcoxon-Mann- Whitney. Los valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los análisis estadísticos se realizaron con los paquetes R (versión 4.0.2) y R clickR (versión 0.4.47), glmnetcr (versión 1 .06), ordinal (versión 2019.12-10) y ved (versión 1 .4-7).

RESULTADOS

Características clínicas de los sujetos de estudio

Se reclutaron prospectivamente un total de 207 pacientes con CV junto con 109 voluntarios sanos (grupo control) de edad y sexo similares. Las características clínicas de los sujetos del estudio se muestran en la Tabla 1 . Los pacientes con CV estudiados en la etapa de cribado (n = 35) fueron: 10 pacientes con TaG1 (28,6 %), 8 pacientes con TaG3 (22,9 %), 5 pacientes con T1 G3 (14,3%) y 12 pacientes con T2G3 (34,3%). Los pacientes con CV estudiados en la etapa de validación (n = 172) fueron: 33 pacientes con TaG1 (19,3%), 14 pacientes con TaG3 (8,1%), 30 pacientes con T1 G3 (17,4%), 70 pacientes con TaG2 (40,7%), 8 pacientes con T 1 G2 (8,7%) y 17 pacientes con T2G2/T2G3/T3G3 (9,9%). Los pacientes con CV con tumores de grado 2 (TaG2 y T1 G2) se incluyeron en la cohorte de validación para validar los miRNAs propuestos en todo el espectro de pacientes con CV. En cuanto a los grupos control, en la etapa de cribado se analizaron 15 controles (mediana de edad 64 años, 80% hombres) y 94 en la etapa de validación (mediana de edad 64 años, 85% hombres).

Tabla 1. Características clínicas de los pacientes con CV y controles sanos estudiados.

Las variables continuas se representan como mediana y rango intercuartílico. Las variables categóricas se representan como recuento y porcentaje. CV, cáncer vesical; TURBT, resección transuretral de un tumor de vejiga. Identificación de los miRNAs desregulados en las diferentes categorías de pacientes con CV y controles.

En la etapa de cribado, pudimos cuantificar de forma óptima 157 miRNAs en orina (Ct<36 en al menos un grupo clínico) de los 35 pacientes con CV y 15 controles estudiados. Realizamos una regresión ordinal univariante para cada miRNA para identificar los miRNAs desregulados entre los diferentes subgrupos de pacientes con CV y los controles. Después del ajuste de FDR, se seleccionaron los 70 miRNAs con PcO.05. A continuación, ajustamos un modelo de regresión logística ordinal de Elastic Net para el diagnóstico y la estratificación de CV utilizando el nivel de expresión de los 179 miRNAs incluidos en el panel prediseñado en orina de pacientes y controles. El modelo incluyó 7 miRNAs como variables predictoras: m¡R-93-5p, m¡R-362-3p, m¡R-191 -5p, m¡R-200c-3p, m¡R-192-5p, m¡R-21 -5p y m¡R-221 -3p (Figura 1 ).

La fórmula para calcular la probabilidad de pertenecer a una determinada categoría es la siguiente: log iti = -4.061045 + intercept! + 0.15 * miR-221 -3p - 0.055 * m¡R93-5p + 0.1086

* m¡R362-3p - 0.181 * m¡R_191 -5p- 0.il * m¡R_200c-3p + 0.2154

* m¡R_192-5p - 0.7692 * m¡R_21 -5p

Intercepta 1.9428

Intercepts: 0.7839

Intercepts: -0.28

Prob(Control) = 1 - (Prob(T>2GX) + Prob(TaT1 G3) + Prob(TaGI ))

A continuación, validamos en una cohorte independiente de pacientes con CV y controles aquellos miRNAs incluidos en el modelo de regresión logística Elastic Net (m¡R-93-5p, m¡R- 362-3p, m¡R-191 -5p, m¡R-200c-3p, m¡R- 192-5p, m¡R-21 -5p y miR-221 -3p) y los miRNAs que presentaron mayores diferencias identificados en el la etapa de cribado: m¡R-30a-5p, m¡R- 425-5p, m¡R-99a-5p, m¡R-23a-3p, m¡R-215-5p y m¡R-10b-5p.

Validación de los miRNAs desregulados en las diferentes categorías de pacientes con CV y controles

Todos los miRNAs propuestos para la validación tuvieron un valor de expresión óptimo (Ct <36) en una cohorte independiente de 172 pacientes con CV y 94 controles sanos. A diferencia de la etapa de cribado, aquí incluimos pacientes con CV con tumores de grado 2 para analizar todo el espectro de pacientes con CV. Las diferencias en los niveles de expresión se validaron utilizando modelos de regresión ordinal univariante (Figura 2). También pudimos validar la capacidad predictiva de nuestro modelo Elastic Net en la cohorte independiente de 172 pacientes con CV y 94 controles sanos. El poder discriminative del modelo se evaluó estimando los valores de rho entre los valores predichos y observados. El valor de rho del modelo validado fue 0,61. La bondad de ajuste se determinó mediante un diagrama de concordancia de Bangdiwala (Figura 3). Las coincidencias perfectas se ponderaron como 1 (representadas como cuadrados negros) y las categorías adyacentes se ponderaron como 0,5 (representadas como cuadrados grises) en la estimación de la estadística de Bangdiwala. La falta de coincidencia entre los valores predichos y observados se representó como cuadrados blancos. El valor ponderado de Bangdiwala fue 0,62 y el no ponderado fue 0,41 , lo que refleja una alta coincidencia entre los valores previstos y observados para cada individuo estudiado.

Desregulación de los miRNAs atendiendo a la recidiva, metástasis y subtipo celular

Analizamos la variación de los miRNAs validados a lo largo del tiempo dependiendo de la recidiva de CV en 51 muestras seriadas de orina de 17 pacientes con CV. 6 pacientes tuvieron recurrencia de CV mientras que 11 pacientes tuvieron remisión del tumor. Realizamos modelos lineales mixtos con pendiente aleatoria e intercepto de todos los miRNAs cualificados en la etapa de validación. Observamos un aumento en m¡R-21 -5p y m¡R-425-5p y una disminución en m¡R-99-5p en pacientes con recidiva tumoral en comparación con aquellos pacientes con remisión tumoral y controles (Figura 4A). Analizamos la variación de su expresión a lo largo del tiempo y observamos que m¡R-21 -5p y m¡R-425-5p aumentaban con el tiempo en aquellos pacientes con recidiva tumoral, mientras que su expresión se normalizaba (presentaba una tendencia hacia los niveles de los controles) en pacientes con remisión tumoral. (P=0,013 y P=0,044, respectivamente). Finalmente, m¡R-99a-5p disminuyó con el tiempo en aquellos pacientes con recidiva tumoral, mientras que se normalizó en pacientes con remisión tumoral (P=0,036) (Figura 4B). Para evaluar si la expresión de estos 3 miRNAs se normalizaba a los niveles de los controles en aquellos pacientes con remisión tumoral pero no en aquellos con recidiva tumoral, comparamos dos muestras recogidas de cada paciente durante el seguimiento. A diferencia de lo que les ocurre a los pacientes con recidiva tumoral, la expresión de m¡R-21 -5p, m¡R-425-5p y m¡R-99a-5p en pacientes con remisión tumoral alcanza el nivel de los controles en la muestra 2 (Figura 4C). En la cohorte de validación, también estudiamos la variación de los miRNAs validados en función de la presencia de metástasis tumorales. 15 pacientes con CV presentaban metástasis. En línea con los resultados obtenidos en la cohorte de validación, la expresión de m¡R-21 -5p (P=0,0008) y m¡R-221 -3p (P=0,0016) fue mayor en pacientes con CV con metástasis (Figura 4D) (menor expresión relativa implica un menor valor de Ct normalizados y una mayor expresión de miRNAs). Finalmente, analizamos la variación de los miRNAs validados en función del subtipo celular de CV, comparando los niveles de expresión de 155 pacientes con CV papilar y 14 pacientes con CV in situ. Observamos un aumento significativo en m¡R-93-5p (P=0,01 ), m¡R-425-5p (P=0,007), m¡R-21 -5p (P=0,006) y m¡R-200c-3p (P=0,031 ) en aquellos pacientes con CV con CV in situ (Figura 4E).

Análisis de los miRNAs desregulados en muestras de tejido FFPE de CV

A continuación, analizamos el nivel de expresión de los 13 miRNAs desregulados en muestras de tejido de 30 pacientes con CV estudiados en la etapa de cribado junto con dos muestras de urotelio de vejiga sana adyacentes. El análisis de la estabilidad llevado a cabo con RefFinder seleccionó al m¡R-103a-3p como el miRNA con mayor estabilidad entre todas las muestras. Por lo tanto, normalizamos el nivel de expresión de cada miRNA estudiado en tejido parafinado por el de m¡R-103a-3p, tal como se mencionó anteriormente. Los 13 miRNAs tenían un valor de expresión óptimo en secciones de tejido (Ct <36). Las diferencias y la tendencia en los niveles de expresión en el tejido se analizaron mediante modelos de regresión ordinal univariados. Los resultados obtenidos en tejido presentan la misma tendencia que los obtenidos en orina. Los siguientes miRNAs significativamente desregulados en tejido: m¡R-93-5p (Odds ratio, OR =0,1 14; Intervalo de confianza del 95%, IC [0,026, 0,400]; P=0,002), m¡R-21 -5p (OR =0,474; IC 95% [0,225, 0,929]; P=0,036), m¡R-30a-5p (OR =1 ,922; IC 95% [1 ,124, 3,443]; P= 0,019) y m¡R-10b-5p (OR = 2,546; IC 95% [1 ,356, 5,231]; P= 0,006) (Figura 5). Estos resultados sugieren que la orina podría reflejar la expresión de miRNAs presentes en el microambiente tumoral, por lo que es una buena opción como biofluido de estudio para la biopsia líquida de CV.

Análisis in silico de las dianas biológicas de los miRNAs

Una vez validadas las diferencias de expresión en los miRNAs seleccionados, identificamos sus proteínas diana validadas y predichas relacionadas con el CV utilizando las bases de datos miRWalk 2.0 y KEGG. Las dianas encontradas con miRWalk 2.0 se integraron dentro de la ruta del cáncer de vejiga de KEGG. Todos los miRNAs estudiados tienen dianas validadas relacionados con CV. Además, 10 de los 13 miRNAs estudiados tienen dianas predichas a lo largo de dicha ruta biológica (Tabla 2). Curiosamente, se observó una correlación significativa entre varios de estos miRNAs (datos no mostrados), lo que reforzaría la importancia de estos miRNAs en la regulación de la ruta del cáncer de vejiga.

Tabla 2. Dianas validadas y predichas de los 13 miRNAs desregulados en la ruta del cáncer de vejiga. proteínas diana se identificaron mediante miRWalk 2.0 y se integraron en la ruta biológica del desarrollo del cáncer de vejiga. Las dianas validadas son aquellas que se ha demostrado experimentalmente que están regulados por un miRNA. Las dianas predichas se definen como aquellas que teóricamente podrían unirse a su miRNAs en función de la energía de unión libre entre las secuencias míRNA-mRNA.