VIRUS EBOLA

Domaine technique

[0001] L’invention concerne une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant une combinaison d’épitopes T CD8 du virus Ebola qui est apte à être présentée par au moins quatre molécules HLA I prépondérantes différentes et à induire une réponse en lymphocytes T CD8 humains spécifiques chez des individus exprimant au moins l’une desdites molécules HLA I. L’invention concerne également l’utilisation de ladite composition comme vaccin préventif contre le virus Ebola et comme réactif pour l’immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola.

Technique antérieure

[0002] Le virus Ebola est un virus de la famille des Filoviridae hautement virulent, responsable d’épidémies de fièvres hémorragiques mortelles, chez l’Homme et le primate non-humain. Ce virus comprend une seule protéine d’enveloppe, la Glycoprotéine (GP), ainsi que des protéines internes dont la Nucléoprotéine (NP) qui est la protéine virale la plus exprimée avec environ 3200 molécules par virion et potentiellement la plus immunogène. Cinq espèces du virus Ebola ont été identifiées: Zaïre, Soudan, Reston, Forêt de Taï et Bundibugyo. Le virus Ebola Zaïre (EBOV) est responsable de la plupart des flambées épidémiques depuis la découverte du virus Ebola en 1976, avec un taux de létalité moyen d’environ 50 % (25 % à 90 % au cours des flambées récentes).

[0003] Aucun vaccin préventif n’a été approuvé pour le traitement des infections par Ebola mais plusieurs vaccins basés sur la glycoprotéine (GP) sont en développement. Il s’agit de vecteurs viraux réplicatifs tels que le virus de la stomatite vésiculaire (rVSV-Ebov), le cytomégalovirus (rCMV), ou le virus parainfluenza humain de type 3 (HPIV3), ainsi que d’adénovirus non-réplicatifs tels que Chad3-EBOV (Chimp adenovirus), EBOLA rAd-5 et Ad26.ZEBOV. On peut citer également, des plasmides (INO-4212 ou VRC-EBODNA023-00-VP) et des nanoparticules contenant la glycoprotéine (GP) recombinante combinées à un adjuvant à base de saponine (Matrix-M™). Les essais précliniques, chez le rongeur ou le primate non-humain se sont révélés concluants, apportant la preuve de concept d’une protection virale par vaccination dans ces modèles. Des essais chez l’homme sont également en cours.

[0004] Bien que prometteurs, ces vaccins présentent plusieurs limites. Initialement développés pour la lutte contre le bioterrorisme, ils ne sont pas adaptés à une vaccination à grande échelle en Afrique Sub-Saharienne. Une production massive est compliquée, et une dissémination dans les régions endémiques nécessite un stockage à -80°C pour assurer leur conservation. Par ailleurs, l’existence d’une immunité dirigée contre les vecteurs, comme les adénovirus, peut rendre le vaccin inefficace. En outre, ces vaccins ciblent uniquement la GP qui est la seule protéine du virus apte à être produite de manière recombinante pour la vaccination.

[0005] Peu d’études sont consacrées à l’immunité contre le virus Ebola et les corrélats de protection ne sont pas connus. Seule protéine de surface du virus, la GP est une cible-clé pour le développement d’une réponse humorale contre le virus. La présence d’anticorps neutralisants dirigés contre la GP confère d’ailleurs une protection et des titres élevés d’anticorps dirigés contre la GP du virus sont toujours détectables chez des patients ayant survécu à l’infection virale. La présence de lymphocytes T CD4 ⁺ (ou lymphocytes T CD4) et de lymphocytes T CD8 ⁺ (ou lymphocytes T CD8) dirigés contre les protéines virales, en particulier la NP et la GP a également été montrée chez des patients ayant survécu à l’infection virale (McElroy ét al., Proc. Natl Soi., 2015, 112, 4719-4724). Compte tenu du rôle majeur des lymphocytes T CD4+ dans l’initiation des réponses humorales et cytotoxiques, la réponse des lymphocytes T CD4 est nécessaire à l’établissement de l’immunité anti-EBOLA mais les caractéristiques de cette réponse sont peu connues. Les lymphocytes T CD8+ jouent un rôle majeur dans la réponse immunitaire contre le virus Ebola. Il a en effet été montré une corrélation entre survie à l’infection et taux de lymphocytes T CD8+ activés (Sanchez et al., J. Virol. , 2004, 78, 10370-10377). Il a également été montré que des souris vaccinées avec le Virus de l'encéphalite équine vénézuélienne codant pour la NP d’Ebola développaient une réponse CD8+ spécifique de la protéine, protégeant ainsi les animaux d’une infection létale (Wilson et Hart, J. Virol. , 2001 , 75, 2660-2664). En revanche, peu de données sont disponibles sur le rôle d’une réponse cellulaire contre la GP.

[0006] Les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL) sont capables de reconnaître les antigènes d’un virus pathogène, sous la forme de peptides d’une longueur de 9-10 acides aminés, dénommés épitopes T CD8+ (ou épitope T CD8), présentés par les molécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I (HLA I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) chez l’homme) à la surface des cellules infectées et de lyser les cellules infectées directement après reconnaissance des peptides. Compte-tenu du polymorphisme des molécules HLA I dans la population, la spécificité de liaison des molécules HLA I est très variable d’une molécule HLA de classe I à l’autre. De ce fait, la séquence des épitopes T CD8+ varient d’un individu à l’autre en fonction des molécules HLA-I codées par leurs allèles HLA I, dénommées ci-après allèles HLA I. L’ensemble des allèles HLA I d’un individu est dénommé typage HLA I. Par conséquent, pour élaborer un vaccin efficace, il est indispensable que celui-ci contiennent des épitopes T CD8+ pouvant être présentés par des molécules HLA I différentes afin d’avoir une couverture vaccinale la plus large possible.

Problème technique

[0007] Très peu d’épitopes T CD8 du virus Ebola immunogènes chez l’Homme ont été caractérisés jusqu’à présent et ces derniers sont tous issus de la NP et restreints uniquement à HLA-A2 (NP 150-158), HLA-A23 (NP 82-90) et HLA-B35 (NP 313-321 ) (Ruibal ét al., Nature, 2016, 533, 100-104). Pour mettre au point des vaccins efficaces contre le virus Ebola permettant d’avoir une couverture vaccinale la plus large possible, il existe donc un réel besoin de disposer d’un ensemble d’épitopes T CD8 de la NP et de la GP du virus Ebola capables d’être présentés par des molécules HLA I différentes représentatives de la population à vacciner et d’induire une réponse en lymphocytes T CD8 humains spécifiques chez les individus exprimant lesdites molécules HLA I. Résumé de l’invention

[0008] Les inventeurs ont identifié de nombreux épitopes T CD8 de la NP et de la GP du virus Ebola Zaïre capables de stimuler des lymphocytes T CD8 spécifiques chez un panel de donneurs sains représentatifs des populations caucasiennes et africaines ([Tableau 2], [Tableau 3] et [Tableau 4] ; Figure 1 ). Contrairement aux épitopes T CD8 de l’art antérieur immunogènes chez l’homme qui sont restreints à seulement 3 molécules HLA I prépondérantes (HLA-A2, HLA-A23, HLA-B35), ces épitopes T CD8 sont immunogènes chez des individus humains portant des molécules HLA I variées incluant la totalité des molécules HLA-A et HLA-B les plus fréquentes dans les populations caucasiennes et africaines (HLA-A1 , -A2, - A3, -A11 , -A24, -A29, -B7, -B8, -B15, -B18, -B35, -B40, -B44 et -B51 ) à l’exception de HLA-A23 ([Tableau 1 ]).. Cette ensemble d’allèles HLA-A et HLA-B permet d’obtenir une couverture vaccinale de potentiellement 95.2% des individus de la population mondiale ; 98,7% des individus d’Europe ; entre 67,9 et 80,9% des individus d’Afrique ; entre 78,8% et 92,2% des individus d’Asie et d’Océanie ; et entre 73,4% à 95,1 % des individus d’Amérique et des Caraïbes. La NP est plus immunogène que la GP, 54 épitopes ayant été obtenus pour la première et 28 pour la seconde, en accord avec les observations précédentes chez des patients ayant été infectés par le virus (McElroy 2015, précité). De plus la séquence de la NP est plus conservée et les épitopes T CD8 issus de la NP sont donc potentiellement efficaces contre les différentes souches d’Ebola. En combinant plusieurs épitopes T CD8 de l’invention, et éventuellement des épitopes T CD4, dans un ou plusieurs peptides/polypeptides issus de la NP ou de la GP du virus Ebola, polypeptides multiépitopiques ou protéines chimériques, et/ou polynucléotides, vecteurs recombinants, on obtient ainsi un vaccin contre le virus Ebola qui possède une couverture vaccinale potentielle optimale dans les différentes populations, en particulier africaines et caucasiennes. Onze épitopes de la NP et 10 épitopes de la GP permettent une couverture vaccinale maximale dans la population de référence (100% des individus répondeurs correspondant à 92% et 60% des individus de la population, respectivement pour les peptides de la

NP et les peptides de la GP). En combinant plusieurs épitopes T CD8 et T CD4 dans de longs fragments polypeptidiques (LSP), 6 LSP pour la NP comme pour la GP, on obtient une couverture vaccinale potentielle maximale de la population de référence, pour les réponses en lymphocytes T CD8 et T CD4 spécifiques du virus Ebola ([Tableau 12] et [Tableau 13]).

[0009] La présente invention a pour objet une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant au moins une combinaison d’épitopes T CD8 du virus Ebola qui est apte à être présentée par au moins quatre molécules HLA I prépondérantes différentes choisies parmi HLA-A1 , HLA-A2, HLA-A3, HLA- A11 , HLA-A24, HLA-A29, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B18, HLA-B35, HLA- B40, HLA-B44 et HLA-B51 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant au moins l’une desdites molécules HLA-I, et lesdits épitopes étant sélectionnés dans le groupe constitué par :

- les épitopes SEQ ID NO : 28 et 46 de la nucléoprotéine (NP), restreints à HLA- A1

- les épitopes SEQ ID NO : 2, 5, 7, 8, 11 , 13, 14, 17, 20, 23, 36, 38 et 45 de la NP et SEQ ID NO : 53, 57, 58, 63 , 64, 65, 72 et 73 de la glycoprotéine (GP), restreints à HLA-A2

- les épitopes SEQ ID NO : 9 et 44 de la NP et SEQ ID NO : 69 de la GP, restreints à HLA-A3

- les épitopes SEQ ID NO : 24 de la NP et SEQ ID NO : 71 de la GP, restreints à HLA-A11

- les épitopes SEQ ID NO : 16 de la NP et SEQ ID NO : 50 et 51 de la GP restreints à HLA-A24

- les épitopes SEQ ID NO : 10 et 41 de la NP, restreints à HLA-A29

- les épitopes SEQ ID NO : 33 de la NP, restreint à HLA-B7

- les épitopes SEQ ID NO : 26 de la NP, restreint à HLA-B8

- les épitopes SEQ ID NO : 12, 15, 22, 29 et 37 de la NP et SEQ ID NO : 52 de la

GP, restreints à HLA-B15

- G épitope SEQ ID NO : 25 de la NP, restreint à HLA-B18

- les épitopes SEQ ID NO : 19, 40, 43, 48 de la NP et SEQ ID NO : 56 de la GP, restreints à HLA-B35

- les épitopes SEQ ID NO : 3, 30, 39 et 47 de la NP et SEQ ID NO : 60 et 68 de la GP, restreints à HLA-B40

- les épitopes SEQ ID NO : 4 et 31 de la NP et SEQ ID NO : 59, 62, 66 et 67 de la GP, restreints à HLA-B44

- les épitopes SEQ ID NO : 18 et 32 de la NP et SEQ ID NO : 70 de la GP, restreints à HLA-B51

- l’épitope SEQ ID NO : 61 de la GP, restreint à HLA-A1 et HLA-A29

- G épitope SEQ ID NO : 21 de la NP, restreint à HLA-A2 et HLA-A24

- G épitope SEQ ID NO : 6 de la NP, restreint à HLA-A29 et HLA-B15

- l’épitope SEQ ID NO : 35 de la NP, restreint à HLA-B7 et HLA-B35

- l’épitope SEQ ID NO : 27 de la NP, restreint à HLA-B7 et HLA-B51

- l’épitope SEQ ID NO : 55 de la GP, restreint à HLA-B7, HLA-B18 et HLA-B51

- les épitopes SEQ ID NO : 34 et 42 de la NP, restreints à HLA-B18 et HLA-B40, et

- G épitope SEQ ID NO : 54 de la GP, restreint à HLA-B40 et HLA-B44. [0010] Dans des modes de réalisation particuliers, ladite composition immunogène ou vaccinale comprend une combinaison d’épitopes choisie de manière à ce qu’elle soit apte à être présentée par au moins 8 molécules HLA I prépondérantes différentes, de préférence au moins 12, 13 ou la totalité desdites molécules HLA I prépondérantes.

[0011] Dans des modes de réalisation particuliers, ladite composition comprend une combinaison d’épitopes sélectionnés dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 3 à 7, 9 à 22, 24 à 35 et 37 à 48 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 50 à 52, 54 à 56 et 59 à 64 et 66 à 71 de la GP. De préférence, la composition immunogène ou vaccinale comprend au moins un épitope sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 5, 6, 10, 15, 17, 24, 25, 34, 41 et 42 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 55, 61 et 71 de la GP.

[0012] Dans des modes de réalisation particuliers, ladite composition immunogène ou vaccinale comprend au moins un épitope T CD8 conservé dans différentes souches du virus Ebola, choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3 à 8, 10 à 39, 41 , 43, 47 et 48 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 51 à 60 et 67 à 71 de la GP; de préférence choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 5, 6, 12, 15 à 24, 27 à 38 et 41 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 51 , 54, 55, 57 à 60, 67 et 70 de la GP ; de manière encore plus préférée parmi les séquences SEQ ID NO : SEQ ID NO : 15 à 18, 20 à 24, 27, 30 à 33, 36 et 37 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 55, 57, 58, 60 et 67 de la GP.

[0013] Dans des modes de réalisation particuliers, ladite composition immunogène ou vaccinale comprend une combinaison d’épitopes T CD8 de la NP ou une combinaison d’épitopes T CD8 de la NP et de la GP.

[0014] Dans des modes de réalisation préférés, ladite composition immunogène ou vaccinale comprend une combinaison d’épitopes T CD8 de la NP comprenant au moins :

a) les épitopes SEQ ID NO : 5 restreint à HLA-A2 ; SEQ ID NO : 16 restreint à HLA-A24, SEQ ID NO : 26 restreint à HLA-B8, SEQ ID NO : 28 restreint à HLA-A1 et SEQ ID NO : 31 restreint à HLA-B44 ;

b) l’un des épitopes SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 ou SEQ ID NO : 17 restreint à HLA-A2 , de préférence l’épitope SEQ ID NO : 17;

c) l’un des épitopes SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 44 restreint à HLA-A3 ; de préférence l’épitope SEQ ID NO : 44 ;

d) l’épitope SEQ ID NO : 24 restreint à HLA-A11 ;

e) l’épitope SEQ ID NO : 6 restreint à HLA-A29 et HLA-B15 ou l’un des épitopes SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 41 restreint à HLA-A29 ; de préférence l’épitope SEQ ID NO : 6;

f) l’un des épitopes SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 39 ou SEQ ID NO : 47 restreint à HLA-B40 ou l’un des épitopes SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 42 restreints à HLA-B40 et HLA-B18, de préférence l’épitope SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 42, de manière plus préférée l’épitope SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 42 et ;

g) l’épitope SEQ ID NO : 27 restreint à HLA-B7 et HLA-B51 , l’épitope SEQ ID NO : 33 restreint à HLA-B7 ou l’épitope SEQ ID NO : 35 restreint à HLA-B7 et HLA- B35 , de préférence l’épitope SEQ ID NO : 27 ou SEQ ID NO : 35 ; de manière plus préférée l’épitope SEQ ID NO : 27 .

[0015] Dans des modes de réalisation préférés, ladite composition immunogène ou vaccinale, comprend une combinaison d’épitopes T CD8 de la GP comprenant au moins

- l’épitope SEQ ID NO : 61 restreint à HLA-A1 et HLA-A29,

- l’épitope SEQ ID NO : 63 ou SEQ ID NO : 64 restreint à HLA-A2

- l’épitope SEQ ID NO : 69 restreint à HLA-A3

- l’épitope SEQ ID NO : 71 restreint à HLA-A11

- l’épitope SEQ ID NO : 50 ou SEQ ID NO : 51 restreint à HLA-A24

- l’épitope SEQ ID NO : 55 restreint à HLA-B7 , HLA-B18 et HLA-B51 ,

- l’épitope SEQ ID NO : 52 restreint à HLA-B15

- l’épitope SEQ ID NO : 56 restreint à HLA-B35

- l’épitope SEQ ID NO : 54 (restreint à HLA-B40 et HLA-B44, et

- l’épitope SEQ ID NO : 59 ou SEQ ID NO : 66 restreint à HLA-B44.

[0016] Dans des modes de réalisation particuliers, ladite composition immunogène ou vaccinale comprend en outre au moins un épitope T CD4 de la NP ou de la GP du virus Ebola inclus dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 74 à 96 et 129 à 138 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 97 à 128 et 139 à 148 de la GP.

[0017] Dans des modes de réalisation particuliers de ladite composition immunogène ou vaccinale, ladite combinaison d’épitopes T CD8, et éventuellement les autres épitopes sont inclus dans un ou plusieurs peptides issus de la protéine NP de séquence SEQ ID NO : 1 ou GP de séquence SEQ ID NO : 49, polypeptides multi-épitopiques ou protéines chimériques, et/ou polynucléotides ou vecteurs recombinants codant le ou lesdits peptides, polypeptides et/ou protéines. De préférence, ladite composition immunogène ou vaccinale comprend les peptides NP de séquence SEQ ID NO : 80, 135, 149, 150, 151 et 152 ou les peptides GP de séquence SEQ ID NO : 107, 148, 153, 154, 155 et 156.

[0018] La présente invention a également pour objet ladite composition immunogène ou vaccinale selon la présente description pour son utilisation comme vaccin dans la prévention d’une infection par le virus Ebola.

[0019] La présente invention a également pour objet l’utilisation in vitro de ladite composition immunogène ou vaccinale selon la présente description pour le diagnostic d’une infection par le virus Ebola ou l’immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola. Exposé de l’invention

[0020] En conséquence, la présente invention a pour objet une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant au moins une combinaison d’épitopes T CD8 du virus Ebola qui est apte à être présentée par au moins quatre molécules HLA I prépondérantes différentes et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques du virus Ebola chez des individus exprimant au moins l’une desdites molécules HLA-I.

Conformément à la présente invention :

- Les séquences issues de la nucléoprotéine (NP) du virus Ebola sont définies en référence à la NP de séquence SEQ ID NO : 1 ou UniProt

AAD14590.1 , issue de la souche Zaïre du virus Ebola (ZEBOV).

- Les séquences issues de la glycoprotéine (GP) du virus Ebola sont définies en référence à la GP de séquence SEQ ID NO : 49 ou UniProt AKG65268.1 , issue de la souche Zaïre du virus Ebola (ZEBOV).

- Les acides aminés sont désignés à l’aide du code à une lettre. Les positions des peptides issus de la NP du virus Ebola sont indiquées en référence à la séquence SEQ ID NO : 1. Les positions des peptides issus de la GP du virus Ebola sont indiquées en référence à la séquence SEQ ID NO : 49.

- On entend par épitope T CD8, un peptide de 9 à 10 acides aminés qui lie au moins une molécule HLA I, de préférence une molécule HLA I prépondérante telle que présentée au [Tableau 1 ], et est ainsi présenté par ladite molécule HLA I et reconnu par des lymphocytes T CD8 humains spécifiques chez des individus portant cette molécule HLA I.

- On entend par épitope T CD8 restreint à une molécule HLA I, un épitope qui est reconnu par des lymphocytes T CD8 humains spécifiques lorsqu’il est présenté par ladite molécule HLA I.

- On entend par épitope T CD8 immunogène, un épitope T CD8 qui est apte à induire une réponse en lymphocytes T CD8 humains spécifiques chez des individus exprimant au moins ladite molécule HLA I.

- On entend par « molécule HLA I prépondérante », une molécule HLA I dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans une population de référence, par exemple l’une des populations caucasiennes ou africaines du [Tableau 1] - On entend par épitope T CD4, un peptide de 11 à 25 acides aminés qui lie au moins une molécule HLA II, en particulier au moins un allèle HLA-DR fréquent dans différentes populations tel que présenté au [Tableau 7], et est reconnu par des lymphocytes T CD4 humains spécifiques chez des individus portant cette molécule HLA II; le peptide comprend une séquence de 9 acides aminés incluant les résidus d’ancrage aux molécules HLA II, flanquée d’au moins 1 acide aminé, de préférence au moins 2 ou 3 acides aminés à chacune de ses extrémités.

- On entend par « lymphocytes T CD8 ou T CD4 spécifiques », des lymphocytes T CD8 ou T CD4 spécifiques des séquences de la NP ou de la GP du virus Ebola. Les expressions « lymphocytes T CD8 ou T CD4 spécifiques », « lymphocytes T CD8 spécifiques du virus Ebola », « lymphocytes T CD8 spécifiques de la NP ou de la GP du virus Ebola », « lymphocytes T CD8 dirigés contre le virus Ebola », « lymphocytes T CD8 dirigés contre la NP ou la GP virus Ebola » sont utilisées indifféremment pour désigner des lymphocytes T CD8 ou T CD4 spécifiques des séquences de la NP ou de la GP du virus Ebola.

- On entend par « induction d’une réponse en lymphocytes T CD8 ou T CD4 spécifiques », la stimulation de lymphocytes T CD8 ou T CD4 spécifiques in vitro ou in vivo.

On entend par fréquence ou taux de répondeurs in vitro à un épitope T CD4 ou T CD8 ou un peptide comprenant un épitope T CD4 ou T CD8 selon la présente invention, le pourcentage d’individus humains d’un groupe de référence pour lesquels des lignées de lymphocytes T CD4 ou T CD8 humains spécifiques dudit épitope ou peptide ont été obtenues.

- On entend par intensité de la réponse in vitro à un peptide comprenant un épitope T CD4 selon la présente invention, le pourcentage de lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques dudit peptide qui ont été obtenues dans un groupe d’individus humains de référence par rapport à la totalité des lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques obtenues avec les différents peptides de la même protéine (NP ou GP).

- On entend par groupe de référence, un ensemble d’individus humains exprimant des molécules HLA I ou HLA II variées, notamment des molécules HLA I variées incluant les allèles HLA-A et HLA-B les plus fréquents dans différentes populations ([Tableau 1] ou des molécules HLA-DR variées incluant les allèles HLA-DR les plus fréquents dans différentes populations ([Tableau 7]). Le groupe de référence inclus les groupes de référence des exemples (HLA I : Figure 1 , [Tableau 2], [Tableau 3] et [Tableau 4]) ; HLA II : [Tableau 8] et [Tableau 9]). Le groupe de référence est considéré comme représentatif d’une population ou d’un ensemble de populations, c’est-à-dire qu’il fournit des résultats extrapolables à cette ou ces population(s).

- On entend par virus Ebola, n’importe quel isolat du virus Ebola.

- Le pourcentage d’identité d’une séquence d’acide aminé est défini par le pourcentage de résidus d’acides aminés dans une séquence à comparer qui sont identiques à une séquence de référence après alignement des séquences, en introduisant des espaces si nécessaire, de façon à obtenir une identité de séquence maximale. L’alignement de séquences en vue de déterminer le pourcentage d’identité d’une séquence peut être réalisé de différentes façons connues de l’homme du métier, par exemple en utilisant des logiciels publics disponibles comme BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-). Ce logiciel est de préférence utilisé avec des paramètres par défaut.

- Sauf indication contraire, un, signifie au moins un, et ou signifie et/ou.

[0021] La capacité des épitopes T CD8 et peptides dérivés comprenant ces épitopes selon l’invention de lier des molécules HLA I est évaluée selon les techniques standards connues de l’Homme du métier telles que celles décrites en particulier dans les exemples. Il s’agit notamment de méthodes in silico Les méthodes in silico utilisent des outils de prédiction de liaison au CMH-I, tel que par exemple NetMHC v4.0. La capacité des épitopes T CD8 et peptides dérivés de l’invention de stimuler des lymphocytes T CD8 humains spécifiques, par exemple à partir de précurseurs présents chez des individus humains naïfs, de stimuler spécifiquement de telles cellules chez des individus humains ayant été infectés par le virus Ebola, la spécificité des lymphocytes T CD8 induits vis-à-vis des peptides ou de la protéine NP ou GP du virus Ebola, ainsi que la capacité des épitopes T CD8 et peptides dérivés selon l’invention d’être reconnus par des lymphocytes T CD8 spécifiques, est évaluée selon les techniques standards connues de l’Homme du métier telles que celles décrites dans les exemples. Il s’agit notamment d’un test de prolifération cellulaire, d’un test ELISPOT (dosage des cellules productrices de cytokines) ou d’un test de dosage de cytokines intracellulaires, spécifiques d’une cytokine produite par des lymphocytes T CD8 activés, en particulier une cytokine de type Th1 telle que par exemple IFN-g, IL-2 ou TNF-a. Les exemples montrent que les épitopes T CD8 et peptides dérivés selon l’invention sont capables d’induire une réponse en lymphocytes T CD8 humains spécifiques à partir de précurseurs présents chez des individus humains naïfs d’un groupe de référence.

[0022] Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites molécules HLA I prépondérantes sont choisies parmi HLA-A1 , HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 , HLA- A24, HLA-A29, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B18, HLA-B35, HLA-B40, HLA- B44 et HLA-B51 ; de préférence parmi HLA-A ^* 01 :01 , HLA-A ^* 02:01 , HLA-A ^* 03:01 , HLA-A*11 :01 , HLA-A*24:02, HLA-A*29:02, HLA-B*07:02, HLA-B*08:01 , HLA-

B*15:01 , HLA-B*15:02, HLA-B*15:03, HLA-B*18:01 , HLA-B*35:01 , HLA-B*35:02, HLA-B*35:03, HLA-B*40:01 , HLA-B*44:02, HLA-B*44:03 et HLA-B*51 :01 ; de manière préférée parmi HLA-A ^* 01 :01 , HLA-A ^* 02:01 , HLA-A ^* 03:01 , HLA-A ^* 11 :01 , HLA-A ^* 24:02, HLA-A ^* 29:02, HLA-B ^* 07:02, HLA-B ^* 08:01 , HLA-B ^* 15:01 , HLA-

B*18:01 , HLA-B*35:01 , HLA-B*35:03, HLA-B*40:01 , HLA-B*44:02, HLA-B*44:03 et HLA-B*51 :01 ; ces allèles HLA-I sont représentatifs des populations Caucasienne et Africaine. En particulier, cet ensemble d’allèles permet de couvrir 95,2 % des individus de la population mondiale ; 98,7 % des individus d’Europe ; 67,9 % des individus d’Afrique Centrale ; 71 ,9 des individus d’Afrique de l’Est ; 80,8 des individus d’Afrique Sub-Saharienne ; 80,7 des individus d’Afrique du Nord et 74,4% des individus d’Afrique de l’Ouest ; 87,9% des individus d’Asie du Nord-Est ; 78,8% des individus d’Asie du Sud ; 88,9% des individus d’Asie du Sud-Est ; 81 ,2% des individus d’Asie du Sud-Ouest ; 92,2% des individus d’Asie de l’Est ; 92,1 % des individus d’Océanie ; 95,1 % des individus d’Amérique du Nord ; 73,4% des individus d’Amérique du Sud et 93,4% des individus des Caraïbes

[0023] Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdits épitopes CD8 sont sélectionnés parmi les séquences suivantes de la nucléoprotéine (NP) et/ou de la glycoprotéine (GP) du virus Ebola : - SEQ ID NO : 28 et 46 de la NP, restreints à HLA-A1

- SEQ ID NO : 2, 5, 7, 8, 1 1 , 13, 14, 17, 20, 23, 36, 38 et 45 de la NP et SEQ ID

NO : 53, 57, 58, 63 , 64, 65, 72 et 73 de la GP, restreints à HLA-A2

- SEQ ID NO : 9 et 44 de la NP et SEQ ID NO : 69 de la GP, restreints à HLA-A3

- SEQ ID NO : 24 de la NP et SEQ ID NO : 71 de la GP, restreints à HLA-A1 1

- SEQ ID NO : 16 de la NP et SEQ ID NO : 50 et 51 de la GP restreints à HLA- A24

- SEQ ID NO : 10 et 41 de la NP, restreints à HLA-A29

- SEQ ID NO : 33 de la NP, restreint à HLA-B7

- SEQ ID NO : 26 de la NP, restreint à HLA-B8

- SEQ ID NO : 12, 15, 22, 29 et 37 de la NP et SEQ ID NO : 52 de la GP, restreints à HLA-B15

- SEQ ID NO : 25 de la NP, restreint à HLA-B18

- SEQ ID NO : 19, 40, 43, 48 de la NP et SEQ ID NO : 56 de la GP, restreints à

HLA-B35

- SEQ ID NO : 3, 30, 39 et 47 de la NP et SEQ ID NO : 60 et 68 de la GP, restreints à HLA-B40

- SEQ ID NO : 4 et 31 de la NP et SEQ ID NO : 59, 62, 66 et 67 de la GP, restreints à HLA-B44

- SEQ ID NO : 18 et 32 de la NP et SEQ ID NO : 70 de la GP, restreints à HLA- B51

- SEQ ID NO : 61 de la GP, restreint à HLA-A1 et HLA-A29

- SEQ ID NO : 21 de la NP, restreint à HLA-A2 et HLA-A24

- SEQ ID NO : 6 de la NP, restreint à HLA-A29 et HLA-B15

- SEQ ID NO : 35 de la NP, restreint à HLA-B7 et HLA-B35

- SEQ ID NO : 27 de la NP, restreint à HLA-B7 et HLA-B51

- SEQ ID NO : 55 de la GP, restreint à HLA-B7, HLA-B18 et HLA-B51

- SEQ ID NO : 34 et 42 de la NP, restreints à HLA-B18 et HLA-B40, et

- SEQ ID NO : 54 de la GP, restreint à HLA-B40 et HLA-B44.

[0024] Les séquences ci-dessus sont issues du virus Ebola Zaïre. Toutefois, l’invention englobe les épitopes variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d’un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de la nucléoprotéine de séquence SEQ ID NO : 1 ou de la glycoprotéine de séquence SEQ ID NO : 49, dès lors que ledit peptide conserve ses propriétés d’épitope T CD8 immunogène du virus Ebola telles que définies ci-dessus, c’est-à- dire qu’il est reconnu par des lymphocytes T CD8 humains spécifiques de la séquence sauvage ou d’un variant naturel du virus Ebola. Les épitopes variants comprennent avantageusement au plus 3 mutations dans l’une des séquences SEQ ID NO : 2 à 48 et 50 à 73, de préférence au plus 3 substitutions dans lesdites séquences.

[0025] Ladite combinaison d’épitopes comprend avantageusement 5 ou plus épitopes T CD8 selon l’invention, par exemple 5 à 15 (5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13,

14, 15), 5 à 25 (5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23,

24, 25), 10 à 25 (10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25) ou plus épitopes T CD8 selon l’invention. La combinaison d’épitopes de la composition est choisie de manière à ce qu’elle soit apte à être présentée par au moins 4 molécules HLA I prépondérantes différentes, de préférence au moins 8 (8, 9, 10, 11 , 12, 13 ou 14) molécules HLA I prépondérantes différentes, de manière préférée au moins 12 (12, 13 ou 14) molécules HLA I prépondérantes différentes, de manière encore plus préférée 13 ou la totalité desdites molécules HLA I prépondérantes.

[0026] Ladite composition comprenant une combinaison d’épitopes T CD8 de la NP et/ou de la GP du virus Ebola telle que définie précédemment permet d’améliorer la réponse immunitaire contre le virus Ebola en élargissant la couverture d’individus humains répondeurs.

[0027] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention ladite combinaison d’épitopes comprend au moins un épitope sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 6, 21 , 27, 34, 35, 42 de la NP et SEQ ID NO : 54, 55 et 61 de la GP ; ces épitopes sont restreints à plusieurs molécules HLA I permettant ainsi de limiter le nombre de séquences peptidiques dans la composition.

[0028] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, les épitopes de la combinaison sont sélectionnés dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 3 à 7, 9 à 22, 24 à 35 et 37 à 48 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 50 à 52, 54 à 56 et 59 à 64 et 66 à 71 de la GP. Ces épitopes induisent avantageusement une fréquence de répondeurs d’au moins 25 % chez les individus portant l’allèle ou l’un des allèles HLA I auquel l’épitope est restreint tels que définis ci-dessus ([Tableau 2], [Tableau 3] et [Tableau 4]).

[0029] De préférence, l’un au moins des épitopes de la combinaison est sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 5 à 7, 10 à 21 (HLA-A2), 22, 24 à 35, 37 à 45 et 48 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 52, 54 (HLA-B40), 55, 56, 59, 61 (HLA-A29), 63, 64, 66 et 68 à 71 de la GP. Ces épitopes induisent avantageusement une fréquence de répondeurs d’au moins 33,3 % chez les individus portant l’allèle ou l’un des allèles HLA I auquel l’épitope est restreint tels que définis ci-dessus ou l’allèle HLA I tel qu’indiqué entre parenthèses ([Tableau 2], [Tableau 3] et [Tableau 4]).

[0030] De manière préférée, l’un au moins des épitopes de la combinaison est sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 5, 6, 10, 12, 14 à 17, 20, 22, 24 à 27(HLA-B7), 28 à 31 , 33, 34, 35 (HLA-B35), 37, 39 à 42, 44, 45 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 52, 54 (HLA-B40), 55 (HLA-B18), 59, 61 (HLA-A29), 63, 64, 66, 68, 69 et 71 de la GP. Ces épitopes induisent avantageusement une fréquence de répondeurs d’au moins 50 % chez les individus portant l’allèle ou l’un des allèles HLA I tels que définis ci-dessus ou l’allèle HLA I tel qu’indiqué entre parenthèses ([Tableau 2], [Tableau 3] et [Tableau 4]) _·

[0031] De manière encore plus préférée, l’un au moins des épitopes de la combinaison est sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 5, 6, 10, 15, 17, 24, 25, 34, 41 et 42 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 55 (HLA-B18), 61 (HLA-A29) et 71 de la GP. Ces épitopes induisent avantageusement une fréquence de répondeurs de 75 % à 100 % chez les individus portant l’allèle ou l’un des allèles HLA I tels que définis ci-dessus ou l’allèle HLA I tel qu’indiqué entre parenthèses ([Tableau 2], [Tableau 3] et [Tableau 4]) _·

[0032] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, la dite combinaison comprend au moins un épitope T CD8 conservé, c’est-à-dire dont la séquence est conservée dans au moins une autre espèce du virus Ebola, de préférence Ebola Soudan ; de manière préférée une séquence conservée dans Ebola Zaïre Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest. De préférence, la séquence dudit peptide présente au moins 66%, de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90 %, 95 %, 98 %, 99% ou 100 % d’identité avec la séquence d’une autre espèce du virus Ebola, de préférence Ebola Soudan ; de manière préférée avec les séquences des virus Ebola Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest. La composition comprend avantageusement au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3 à 8, 10 à 39, 41 , 43, 47 et 48 qui présentent au moins 66% d’identité avec la séquence d’Ebola Soudan; de préférence choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 5, 6, 12, 15 à 24, 27 à 38 et 41 qui présentent au moins 85% d’identité avec la séquence d’Ebola Soudan ; de manière préférée choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 15 à 18, 20 à 24, 27, 30 à 33, 36 et 37 qui présentent au moins 90% d’identité avec les séquences d’Ebola Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest ou au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 51 à 60 et 67 à 71 qui présentent au moins 66% d’identité avec la séquence d’Ebola Soudan; de préférence choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 51 , 54, 55, 57 à 60, 67 et 70 qui présentent au moins 85% d’identité avec la séquence d’Ebola Soudan ; de manière préférée choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 55, 57, 58, 60 et 67 qui présentent au moins 90% d’identité avec les séquences d’Ebola Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest.

[0033] Conformément à l’invention, ladite combinaison comprend des épitopes T CD8 de la NP, des épitopes T CD8 de la GP ou un mélange d’épitopes TCD8 de la NP et de la GP. Selon un mode de réalisation de l’invention, ladite combinaison comprend des épitopes T CD8 de la NP ou un mélange d’épitopes TCD8 de la NP et de la GP.

[0034] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend une combinaison d’épitopes T CD8 de la NP du virus Ebola qui est apte à être présentée par la totalité desdites molécules HLA I et à induire une fréquence maximale de répondeurs in vitro, c’est-à-dire chez tous les individus d’un groupe de référence qui sont répondeurs à la NP (correspondant à 92 % des individus dans le groupe de référence des exemples ; voir [Tableau 2] et [Tableau 3]), ladite combinaison comprenant

- au moins les épitopes suivants:

a) les épitopes SEQ ID NO : 5 restreint à HLA-A2 ; SEQ ID NO : 16 restreint à HLA-A24, SEQ ID NO : 26 restreint à HLA-B8, SEQ ID NO : 28 restreint à HLA-A1 et SEQ ID NO : 31 restreint à HLA-B44 ;

b) l’un des épitopes SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 ou SEQ ID NO : 17 restreint à HLA-A2 , de préférence l’épitope SEQ ID NO : 17;

c) l’un des épitopes SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 44 restreint à HLA- A3 ; de préférence l’épitope SEQ ID NO : 44 ;

d) l’épitope SEQ ID NO : 24 restreint à HLA-A1 1 ;

e) l’épitope SEQ ID NO : 6 restreint à HLA-A29 et HLA-B15 ou l’un des épitopes SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 41 restreint à HLA-A29 ; de préférence l’épitope SEQ ID NO : 6;

f) l’un des épitopes SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 39 ou SEQ ID NO : 47 restreint à HLA-B40 ou l’un des épitopes SEQ ID NO : 34 ou

SEQ ID NO : 42 restreints à HLA-B40 et HLA-B18, de préférence l’épitope SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 42, de manière plus préférée l’épitope SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 42 et ;

g) l’épitope SEQ ID NO : 27 restreint à HLA-B7 et HLA-B51 , l’épitope SEQ ID NO : 33 restreint à HLA-B7 ou l’épitope SEQ ID NO : 35 restreint à HLA-B7 et

HLA-B35 , de préférence l’épitope SEQ ID NO : 27 ou SEQ ID NO : 35 ; de manière plus préférée l’épitope SEQ ID NO : 27 ;

- et éventuellement

h) l’un des épitopes SEQ ID NO : 18 ou SEQ ID NO : 32 restreint à HLA- B51 ;

i) l’un des épitopes SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 48 restreint à HLA-B35 ;

j) l’un des épitopes SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 29 ou SEQ ID NO : 37 restreint à HLA-B15 , de préférence l’épitope SEQ ID NO : 15;

k) l’épitope SEQ ID NO : 25 restreint à HLA-B18 ;

L) l’épitope SEQ ID NO : 46 restreint à HLA-A1 ;

m) l’épitope SEQ ID NO : 21 restreint à HLA-A24 et HLA-A2 ; n) )l’épitope SEQ ID NO : 4 restreint à HLA-B44 ; et/ou o) l’un des épitopes SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 36 ou SEQ ID NO : 38 restreints à HLA-A2, de préférence l’épitope SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 20 ou SEQ ID NO : 38; de manière préférée, l’épitope SEQ ID NO : 38.

[0035] De préférence, ladite composition comprend au moins les épitopes SEQ ID NO : 5 restreint à HLA-A2 ; SEQ ID NO : 6 restreint à HLA-A29 et HLA-B15, SEQ ID NO : 16 restreint à HLA-A24, SEQ ID NO : 17 restreint à HLA-A2, SEQ ID NO : 24 restreint à HLA-A1 1 , SEQ ID NO : 26 restreint à HLA-B8, SEQ ID NO : 27 restreint à HLA-B7 et HLA-B51 , SEQ ID NO : 28 restreint à HLA-A1 , SEQ ID NO : 31 restreint à HLA-B44, SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 42 restreints à HLA-B40 et HLA-B18 et SEQ ID NO : 44 restreint à HLA-A3.

[0036] Par exemple, la dite composition comprend au moins les épitopes SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 restreint à HLA-A29 et HLA-B15, SEQ ID NO : 6 restreint à HLA-A29 et HLA-B15, SEQ ID NO : 9 restreint à HLA-A3, SEQ ID NO : 10 restreint à HLA-A29, SEQ ID NO : 15 restreint à HLA-B15, SEQ ID NO : 16 restreint à HLA-A24, SEQ ID NO : 17 restreint à HLA-A2, SEQ ID NO : 18 restreint à HLA-B51 , SEQ ID NO : 20 restreint à HLA-A2, SEQ ID NO : 21 restreint à HLA-A2 et HLA-A24, SEQ ID NO : 22 restreint à HLA-B15, SEQ ID NO : 24 restreint à HLA-A1 1 , SEQ ID NO : 25 restreint à HLA-B18, SEQ ID NO : 26 restreint à HLA-B8, SEQ ID NO : 27 restreint à HLA-B7 et HLA-B51 , SEQ ID NO : 28 restreint à HLA-A1 , SEQ ID NO : 29 restreint à HLA-B15, SEQ ID NO : 30 restreint à HLA-B40, SEQ ID NO : 31 restreint à HLA-B44, SEQ ID NO : 42 restreints à HLA-B40 et HLA-B18, SEQ ID NO : 43 restreints à HLA-B35, et SEQ ID NO : 44 restreint à HLA-A3. La composition comprenant ladite combinaison d’épitopes T CD8 de la NP du virus Ebola est apte à être présentée par la totalité desdites molécules HLA I et à induire une fréquence maximale de répondeurs in vitro, c’est-à-dire chez tous les individus d’un groupe de référence qui sont répondeurs à la NP (correspondant à 92 % des individus dans le groupe de référence des exemples ; voir [Tableau 12]). [0037] Selon un autre mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend une combinaison d’épitopes T CD8 de la GP du virus Ebola qui est apte à être présentée par 13 desdites molécules HLA I prépondérantes (toutes les molécules HLA I sélectionnées à l’exception de HLA- B8) et à induire une fréquence maximale de répondeurs in vitro, c’est-à-dire chez tous les individus d’un groupe de référence qui sont répondeurs à la GP (correspondant à 60 % des individus dans le groupe de référence des exemples ; voir [Tableau 4]), ladite combinaison comprenant au moins les épitopes suivants:

- l’épitope SEQ ID NO : 61 , restreint à HLA-A1 et HLA-A29 ;

- l’épitope SEQ ID NO : 63 ou SEQ ID NO : 64, restreint à HLA-A2 ;

- l’épitope SEQ ID NO : 69, restreint à HLA-A3 ;

- l’épitope SEQ ID NO : 71 , restreint à HLA-A11 ;

- l’épitope SEQ ID NO : 50 ou SEQ ID NO : 51 , restreint à HLA-A24 ;

-l’épitope SEQ ID NO : 55, restreint à HLA-B7 , HLA-B18 et HLA-B5 ; ,

- l’épitope SEQ ID NO : 52, restreint à HLA-B15 ;

- l’épitope SEQ ID NO : 56, restreint à HLA-B35 ;

- l’épitope SEQ ID NO : 54 restreint à HLA-B40 et HLA-B44 ; et

- l’épitope SEQ ID NO : 59 ou SEQ ID NO : 66, restreint à HLA-B44.

[0038] De préférence, ladite composition comprend au moins les épitopes SEQ ID NO : 51 restreint à HLA-A24 ; SEQ ID NO : 52 restreint à HLA-B15, SEQ ID NO : 53 restreint à HLA-A2, SEQ ID NO : 54 restreint à HLA-B40 et HLA-B44, SEQ ID NO : 55 restreint à HLA-B7, HLA-B18 et HLA-B51 , SEQ ID NO : 56 restreint à HLA-B35, SEQ ID NO : 59 restreint à HLA-B44, SEQ ID NO : 60 restreint à HLA-B44, SEQ ID NO : 61 , restreint à HLA-A1 et HLA-A29, SEQ ID NO : 62 restreint à HLA-B44, SEQ ID NO : 63 restreint à HLA-A2, SEQ ID NO : 64 restreint à HLA-A2, SEQ ID NO : 67 restreint à HLA-B44, SEQ ID NO : 68 restreint à HLA-B40 et SEQ ID NO : 69 restreint à HLA-A3. La composition comprenant ladite combinaison d’épitopes T CD8 de la GP du virus Ebola est apte à être présentée par 13 desdites molécules HLA I prépondérantes (toutes les molécules HLA I sélectionnées à l’exception de HLA-B8) et à induire une fréquence maximale de répondeurs in vitro, c’est-à-dire chez tous les individus d’un groupe de référence qui sont répondeurs à la GP (correspondant à 60 % des individus dans le groupe de référence des exemples ; voir [Tableau 13])

[0039] Ces exemples qui sont donnés uniquement à titre illustratif ne sont pas limitatifs et d’autres compositions induisant des fréquences maximales de réponse équivalentes peuvent être aisément obtenues avec d’autres combinaisons d’épitopes déterminées à partir des profils de réponse aux peptides NP et GP du groupe de référence des exemples présentées au [Tableau 2] et au [Tableau 3] pour la NP et au [Tableau 4] pour la GP.

[0040] Selon un mode de réalisation de l’invention, ladite composition comprend au moins un autre épitope, notamment un autre épitope T CD8, un épitope T CD4 ou un épitope B de la NP et/ou de la GP du virus Ebola, ou bien un épitope d’un antigène d’un autre pathogène, notamment un virus de fièvre hémorragique. Parmi les épitopes B de la NP du virus Ebola on peut citer les peptides 173-187, 361 -375, 365-379, 381 -395, 417-431 , 425-439, 485-499 et 505-515 d’EBOV, lesdites positions étant indiquées en référence à la séquence SEQ ID NO : 1. Parmi les épitopes B de la GP du virus Ebola on peut citer les peptides 41 -55, 52- 66, 93-107, 112-126, 201-215, 217-231 , 221 -235, 225-239, 236-250, 301-305, 309-323, 317-331 , 321 -335, 325-339, 329-343, 333-347, 337-351 , 341-355, 345- 359, 381 -395, 385-399, 389-403, 393-407, 397-411 et 469-483 d’EBOV, lesdites positions étant indiquée en référence à la séquence SEQ ID NO : 49.

[0041] De préférence, la dite composition comprend au moins un épitope T CD4 de la NP ou de la GP du virus Ebola inclus dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 74 à 96 et 129 à 138 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 97 à 128 et 139 à 148 de la GP. Ladite composition comprend avantageusement au moins un épitope T CD8 selon l’invention dont la séquence n’est pas incluse dans la séquence comprenant au moins un épitope T CD4 telle que définie ci-dessus, c’est-à-dire que tous les résidus de l’épitope T CD8 ne sont pas présents dans la séquence comprenant au moins un épitope T CD4. Ledit épitope T CD8 dont la séquence n’est pas incluse dans la séquence comprenant au moins un épitope T CD4 telle que définie ci-dessus est avantageusement sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 12-14, 28-31 , 38-41 et 46-48 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 54, 56, 63, 64, 66 et 70 de la GP. De préférence ladite composition comprend au moins un épitope T CD8 selon l’invention dont la séquence est disjointe (non-chevauchante) de celle comprenant au moins un épitope T CD4 ; cela signifie que la séquence de l’épitope T CD8 ne possède aucun résidu d’acide aminé en commun la séquence comprenant au moins un épitope T CD4 telle que définie ci-dessus. Ledit épitope T CD8 selon l’invention dont la séquence est disjointe (non-chevauchante) de celle comprenant au moins un épitope T CD4 telle que définie ci-dessus est avantageusement sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 40, 41 , 47 et 48 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 54, 63, 64, 66 et 70 de la GP.

[0042] Selon un mode de réalisation de l’invention, ladite combinaison d’épitopes T CD8, et éventuellement les autres épitopes tels que définis ci-dessus sont inclus dans un ou plusieurs :

(a) peptides issus de la protéine NP de séquence SEQ ID NO : 1 ou GP de séquence SEQ ID NO : 49 ;

(b) polypeptides multi-épitopiques ou protéines chimériques ; lesdits peptides en (a), polypeptides et protéines en (b) pouvant être éventuellement modifiés ;

(c) polynucléotides ou vecteurs recombinants codant le ou lesdits peptides, polypeptides et/ou protéines ;

(d) un mélange dudit ou desdits peptide(s), polypeptide(s), protéine(s) de fusion, polynucléotide(s), vecteurs définis en (a) à (c).

[0043] Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, la composition immunogène ou vaccinale comprend au moins un peptide issu de la NP ou GP ou un mélange de peptides issus de la NP et/ou GP ; ledit mélange comprenant avantageusement au plus 25 peptides ; de préférence 5 à 15 peptides. De préférence, ledit peptide ou mélange de peptides est apte à être présenté par au moins 8 (8, 9, 10, 11 , 12, 13 ou 14) de préférence au moins 12 (12, 13 ou 14) molécules HLA I prépondérantes différentes telles que définies ci-dessus, de manière préférée la totalité desdites molécules HLA I prépondérantes.

[0044] Dans ce mode de réalisation avantageux, chacun desdits peptides de la composition est de préférence un peptide d’au plus 100 acides aminés issu de la NP de séquence SEQ ID NO : 1 comprenant au moins deux à quatre séquences comprenant au moins un épitope T CD8 de la NP choisies parmi les séquences SEQ ID NO : 2 à 48 ou un peptide d’au plus 100 acides aminés issu de la GP de séquence SEQ ID NO : 49 comprenant au moins deux à quatre séquences comprenant au moins un épitope T CD8 de la GP choisies parmi les séquences SEQ ID NO : 50 à 73. De préférence, ledit peptide comprend 3 à 10 (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) desdites séquences comprenant au moins un épitope T CD8 selon l’invention. De manière préférée, ladite composition comprend au moins un épitope T CD4 de la NP ou de la GP du virus Ebola inclus dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 74 à 96 et 129 à 138 de la NP et les séquences SEQ ID NO : 97 à 128 et 139 à 148 de la GP, le ou lesdits épitopes T CD4 et T CD8 étant dans les mêmes peptides ou dans des peptides séparés et ladite composition comprenant avantageusement au moins un épitope T CD8 dont la séquence n’est pas incluse dans la séquence comprenant au moins un épitope T CD4 de la NP ou de la GP telle que définie ci-dessus, de préférence un épitope T CD8 dont la séquence n’est pas chevauchante avec la séquence comprenant au moins un épitope T CD4 de la NP ou de la GP telle que définie ci-dessus.

[0045] Dans ce mode de réalisation avantageux, chacun desdits peptides de la composition consiste de préférence en une séquence de plus de 20 acides aminés à au plus 100 acides aminés (21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 acides aminés) consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 49, de manière préférée de 25 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 49 ou une séquence de plus de 20 acides aminés à au plus 100 acides aminés (21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 acides aminés), de manière préférée de 25 à 70 acides aminés possédant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 49.

[0046] Une composition préférée selon l’invention comprend au moins un peptide issu de ladite NP sélectionné dans le groupe constitué par :

a) les séquences SEQ ID NO : 149, 150, 151 et 152,

b) les séquences d’au plus 100 acides aminés (21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 acides aminés) consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 , de préférence de 25 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 comprenant au moins l’une desdites séquences en a), et

c) les séquences d’au plus 100 acides aminés (21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 acides aminés) consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 , de préférence de 25 à 70 acides aminés possédant au moins 70% d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec lesdites séquences en a).

[0047] De préférence, ladite composition comprend les peptides de séquence SEQ ID NO : 149, 150, 151 et 152 ou des peptides dérivés desdites séquences tels que définis en b) ou c). Les peptides de séquence SEQ ID NO : 149, 150 ,151 et 152 induisent des fréquences de répondeurs in vitro en T CD8+ spécifiques de la NP du virus Ebola, de respectivement 36%, 16%, 44% et 58%. Les peptides de séquence SEQ ID NO : 149, 150 et 151 induisent également des fréquences de répondeurs in vitro en T CD4+ spécifiques de la NP du virus Ebola, de respectivement 56,3%, 37,5% et 68,75% ([Tableau 12]).

[0048] De préférence, la dite composition comprend également les peptides de séquence SEQ ID NO : 80 et 135 ; le peptide de séquence SEQ ID NO : 80 induit des fréquences de répondeurs in vitro en T CD8+ spécifiques et en T CD4+ de la NP du virus Ebola de respectivement 36% et 75%. Le peptide de séquence SEQ ID NO : 135 induit une fréquence de répondeurs in vitro en T CD4+ spécifiques de la NP du virus Ebola de 62,5% ([Tableau 12]).

[0049] A titre d’exemple illustratif de cette composition préférée selon l’invention, on peut citer la composition comprenant les peptides NP de séquence SEQ ID NO : 80, 135, 149, 150, 151 et 152 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro en T CD4+ spécifiques de 100 % et une fréquence maximale de répondeurs in vitro en T CD8+ spécifiques (92 % des individus du groupe de référence). Une telle composition permet d’obtenir une couverture vaccinale potentielle maximale de la population mondiale et en particulier des populations caucasiennes et africaines, en ce qui concerne l’immunité cellulaire contre le virus Ebola. [0050] Cet exemple qui est donné uniquement à titre illustratif n’est pas limitatif et d’autres compositions induisant des fréquences de réponse équivalentes peuvent être aisément obtenues avec d’autres combinaisons de peptides NP, déterminées à partir des profils de réponse en T CD8+ et en T CD4+ induits par respectivement les différents épitopes T CD8 [Tableau 2] et [Tableau 3] et les différents peptides comprenant des épitopes T CD4+ [Tableau 8], ainsi que les séquences des peptides NP présentés au [Tableau 12]

[0051] Une autre composition préférée selon l’invention comprend au moins un peptide issu de ladite GP sélectionné dans le groupe constitué par :

a) les séquences SEQ ID NO : 153, 154, 155 et 156,

b) les séquences d’au plus 100 acides aminés (21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 acides aminés) consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 , de préférence de 25 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 comprenant au moins l’une desdites séquences en a), et

c) les séquences d’au plus 100 acides aminés (21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 acides aminés) consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 , de préférence de 25 à 70 acides aminés possédant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec lesdites séquences en a).

[0052] De préférence, ladite composition comprend les peptides de séquence SEQ ID NO : 153, 154, 155 et 156 ou des peptides dérivés desdites séquences tels que définis en b) ou c). Les peptides de séquence SEQ ID NO : 153, 154, 155 et 156 induisent des fréquences de répondeurs in vitro en T CD8+ spécifiques de la GP du virus Ebola, de respectivement 12%, 24%, 24% et 20%. Les peptides de séquence SEQ ID NO : 153, 154, 155 et 156 induisent également des fréquences de répondeurs in vitro en T CD4+ spécifiques de la GP du virus Ebola, de respectivement 56,3%, 50%, 62,5% et 62,5% ([Tableau 13]).

[0053] De préférence, la dite composition comprend également les peptides de séquence SEQ ID NO : 107 et 148 ; ces peptides induisent une fréquence de répondeurs in vitro en T CD4+ spécifiques de la GP du virus Ebola de respectivement 50% et 62,5% pour les peptides de séquence SEQ ID NO : 107 et 148.

[0054] A titre d’exemple illustratif de cette composition préférée selon l’invention, on peut citer la composition comprenant les peptides GP de séquence SEQ ID NO : 107, 148, 153, 154, 155 et 156 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro en T CD4+ spécifiques de 100 % et une fréquence de répondeurs in vitro en T CD8+ spécifiques de 56%, proche de la fréquence maximale (60 % des individus du groupe de référence). Une telle composition permet d’obtenir une couverture vaccinale potentielle maximale de la population mondiale, et en particulier des populations caucasiennes et africaines, en ce qui concerne l’immunité cellulaire contre le virus Ebola. .

[0055] Cet exemple qui est donné uniquement à titre illustratif n’est pas limitatif et d’autres compositions induisant des fréquences équivalentes peuvent être aisément obtenues avec d’autres combinaisons de peptides GP, déterminées à partir des profils de réponse en T CD8+ et en T CD4+ induits par respectivement les différents épitopes T CD8 [Tableau 4] et les différents peptides comprenant des épitopes T CD4+ [Tableau 9], ainsi que les séquences des peptides GP présentés au [Tableau 13]

[0056] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la composition immunogène ou vaccinale comprend un polypeptide multiépitopique chimérique comprenant au moins une combinaison d’épitopes tels que définis ci-dessus. On définit ici un polypeptide chimérique comme une succession d’acides aminés qui n’est pas présente dans la nature. Un polypeptide multiépitopique chimérique selon l’invention comprend au moins deux à quatre épitopes T CD8 de la NP et/ou de la GP du virus Ebola tels que définis ci-dessus, les séquences desdits épitopes étant dans ledit polypeptide, adjacentes, liées par un élément de liaison ou séparées par une séquence comprenant un autre épitope tel que défini ci-dessus. L’autre épitope est notamment un autre épitope T CD8, un épitope T CD4 ou un épitope B de la NP et/ou de la GP du virus Ebola, ou bien un épitope d’un antigène d’un autre pathogène, notamment un virus de fièvre hémorrhagique. Le polypeptide multiépitopique peut également comprendre plusieurs copies d’une même séquence de peptide/épitope. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide multiépitopique comprend moins de 100 acides aminés consécutifs de la NP de séquence SEQ ID NO : 1 et/ou de la GP de séquence SEQ ID NO : 49, de préférence moins de 50, de manière préférée moins de 30. Le polypeptide multiépitopique présente une longueur de 20 à 200 acides aminés, de préférence de 30 à 100 acides aminés, de manière préférée d’environ 50 acides aminés.

[0057] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, ledit peptide ou polypeptide tel que défini ci-dessus est un peptide ou un polypeptide modifié comprenant une modification au niveau de résidu(s) d’acide aminé, de la liaison peptidique ou de ses extrémités et ledit peptide ou polypeptide modifié conservant ses propriétés d’épitope T CD8 immunogène de la NP ou de la GP du virus Ebola telles que définies ci-dessus, c’est-à-dire qu’il est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD8 humains spécifiques chez des individus humains exprimant au moins une des molécules HLA I prépondérantes telles que définie ci- dessus. Cette ou ces modification(s), de préférence une ou des modification(s) chimique(s), qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l’homme du métier, incluent de façon non-limitative l’une au moins des modifications chimiques suivantes : l’acétylation du résidu d’acide aminé N- terminal et/ou l’amidation du résidu d’acide aminé C-terminal (Maillère et al., Molecular Immunology, 1195, 32, 1377-1385), la substitution d’un acide aminé par un acide aminé non-protéinogénique (acide aminé D ou analogue d’acide aminé); l’addition de groupement chimique (lipide, oligo ou polysaccharide) au niveau d’une fonction réactive, notamment de la chaîne latérale R ; la modification de la liaison peptidique (-CO-NH-), notamment par une liaison du type rétro ou rétro- inverso (-NH-CO-) ou une liaison différente de la liaison peptidique ; la cyclisation ; la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d’un peptide (épitope d’intérêt pour la vaccination); la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d’une protéine, notamment une chaîne a d’une molécule HLA I ou le domaine extracellulaire de ladite chaîne, et le couplage à une molécule appropriée. Ces modifications sont destinées en particulier à augmenter la stabilité et plus particulièrement la résistance à la protéolyse, ainsi que la solubilité ou l’immunogénicité du peptide ou polypeptide selon l’invention. [0058] Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ou polypeptide modifié, il comprend une ou plusieurs N6-acétyl-lysine(s), phosphosérine(s) et/ou phosphothréonine(s).

[0059] Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide ou polypeptide modifié comprend l’acétylation de son résidu d’acide aminé N-terminal et/ou l’amidation de son résidu d’acide aminé C-terminal.

[0060] Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide ou polypeptide modifié est un lipopeptide ou un lipopolypeptide. Ledit lipopeptide ou un lipopolypeptide peut être obtenu, notamment par addition d’un lipide sur une fonction a-aminée ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d’un acide aminé dudit peptide ou polypeptide; il peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d’acides gras en C4-20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d’un stéroïde. La partie lipidique préférée est notamment représentée par un groupe N ^a -acétyl-lysine N ^E (palmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam).

[0061] Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, la combinaison d’épitopes est incluse dans une protéine de fusion (protéine chimérique) comprenant ledit ou lesdits peptides fusionnés avec une protéine hétérologue (différente de la NP ou de la GP) ou un fragment polypeptidique hétérologue (fragment d’une protéine différente de NP ou de la GP dont la séquence n’est pas directement adjacente à la séquence dudit peptide dans la séquence de ladite NP ou GP). Ledit ou lesdits peptides peuvent être fusionnés avec l’extrémité NH2 ou COOH de ladite protéine ou dudit fragment polypeptidique hétérologue ou insérés dans la séquence de ladite protéine ou dudit fragment.

[0062] Selon une disposition avantageuse, ladite protéine chimérique est constituée par un ou plusieurs peptides ou polypeptides tels que défini ci-dessus, fusionnés avec l’une des chaînes d’une molécule HLA, de préférence la chaîne alpha d’une molécule HLA I, ou bien avec un fragment de celle-ci correspondant à une molécule HLA soluble, notamment un fragment correspondant au domaine extracellulaire précédé du peptide signal homologue ou d’un peptide signal hétérologue. Ledit peptide est avantageusement inséré entre le peptide signal et l’extrémité NH2 du domaine extracellulaire de la chaîne a, comme décrit pour la molécule HLA-A2 (Oved K et al. Cancer Immunol Immunother (2005) 54: 867- 879).

[0063] La présente invention a également pour objet une composition immunogène ou vaccinale comprenant au moins un polynucléotide codant pour au moins un peptide, polypeptide, et/ou ou protéine chimérique tels que définis ci- dessus. Ledit polynucléotide, est un ADN, un ARN ou un mélange d’ADN et d’ARN, recombinant ou synthétique. La séquence de l’ADN peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l’usage des codons soit optimal chez l’hôte dans lequel elle est exprimée.

[0064] Ces polynucléotides peuvent être insérés dans un vecteur d’expression, sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur approprié, pour permettre l’expression du ou desdits peptide(s) ou polypeptide(s) conforme à l'invention dans une cellule de l’hôte.

[0065] De nombreux vecteurs sont connus en eux-mêmes ; le choix d’un vecteur approprié dépend de l’utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d’intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l’hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des acides nucléiques nus (ADN ou ARN) ou des vecteurs viraux ou bactériens. Les vecteurs viraux sont notamment les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d’intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu’un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l’introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l’électroporation ou la microinjection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l’électroporation associée à des liposomes. [0066] De préférence, ledit vecteur est un vecteur d’expression comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression du peptide, polypeptide, protéine de fusion tels que définis ci-dessus. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d’expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d’épissage).

[0067] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, ladite composition comprend au moins un polynucléotide codant ledit ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), et/ou protéine(s) de fusion tels que définis ci-dessus, inséré dans un acide nucléique nu, de préférence un ADN nu.

[0068] D’autres compositions conformes à l'invention peuvent également comprendre une cellule présentatrice d’antigène modifiée, comprenant au moins un peptide, polypeptide, protéine chimérique, polynucléotide et/ou un vecteur tels que définis ci-dessus, la cellule pouvant être modifiée de façon stable ou transitoire. La cellule est notamment une cellule présentatrice d’antigène naturelle telle qu’une cellule dendritique ou une cellule présentatrice de l’antigène artificielle, telle que des exosomes dérivés de cellules dendritiques ou des vésicules dérivées de cellules exprimant la NP ou la GP du virus Ebola ou des fragments immunogènes desdites protéines. La composition selon l’invention peut comprendre une cellule dendritique chargée avec au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique selon l’invention, ou transformée avec au moins un polynucléotide ou un vecteur selon l’invention.

[0069] La composition immunogène ou vaccinale selon l’invention comprend avantageusement un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une substance porteuse et/ou un adjuvant.

[0070] Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés.

[0071] Les adjuvants sont avantageusement choisis parmi: les émulsions huileuses, les substances minérales, les extraits bactériens, les oligonucléotides contenant des CpG, la saponine, l’hydroxyde d’alumine, le monophosphoryl - lipide A et le squalène.

[0072] Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nano-particules.

[0073] La composition conforme à l’invention peut comprendre en outre des adjuvants habituellement utilisés dans les vaccins, et permettant par exemple de favoriser l’administration du principe actif, de le stabiliser, d’augmenter son immunogénicité.

[0074] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, la composition comprend en outre un antigène du virus Ebola, notamment la GP, sous forme d’une protéine recombinante, d’un polynucléotide ou d’un vecteur recombinant codant ledit antigène, ledit antigène d’Ebola étant éventuellement combiné à un adjuvant. La composition selon l’invention comprend avantageusement une combinaison d’épitopes T CD8 et T CD4 de la NP du virus Ebola et une protéine GP recombinante du virus Ebola, un polynucléotide, et/ou un vecteur codant ledit antigène, éventuellement combiné à un adjuvant.

[0075] La composition immunogène ou vaccinale comprend une dose efficace d’un ou plusieurs peptide(s), polypeptide(s), protéine(s), polynucléotide(s), et/ou vecteur(s), permettant d'obtenir un effet préventif sur une infection par un virus Ebola. Cette dose est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l’âge, le sexe et le poids du sujet. La composition est généralement administrée selon les protocoles usuels de vaccination, à des doses et pendant une durée suffisante pour induire une réponse cellulaire en lymphocytes T CD8+, et éventuellement T CD4+ dirigés contre la protéine NP et/ou GP du virus Ebola. L'administration peut être orale, parentérale ou locale, de préférence par injection, notamment sous- cutanée ou intramusculaire, La composition se présente sous une forme galénique adaptée à une administration choisie. [0076] La composition selon la présente invention est avantageusement utilisée comme vaccin pour la prévention des infections par le virus Ebola, notamment Ebola Zaïre, Soudan, Reston, Bundibuygo et Tai Forest ; de préférence Ebola Zaïre.

[0077] La présente invention a également pour objet une méthode de vaccination contre le virus Ebola, caractérisée en ce qu’elle comprend l’administration d’une composition vaccinale telle que définie ci-dessus, à un individu, par tout moyen approprié tel que défini ci-dessus.

[0078] L’administration de la composition selon l’invention à un individu, induit une réponse une réponse cellulaire en lymphocytes T CD8, et éventuellement en lymphocytes T CD4, dirigés contre la protéine NP et/ou GP du virus Ebola.

[0079] Selon un mode de réalisation, ladite composition immunogène ou vaccinale est utilisée en combinaison avec une autre composition vaccinale contre le virus Ebola, notamment une composition comprenant une protéine recombinante GP ou un polynucléotide ou vecteur codant ladite protéine. Lesdites compositions vaccinales sont utilisées simultanément, séparément ou de façon séquentielle.

[0080] La présente invention a également pour objet l’utilisation de la composition immunogène ou vaccinale selon la présente description pour la préparation d’un médicament (vaccin) destiné à la prévention des infections par le virus Ebola.

[0081] La présente invention a également pour objet l’utilisation in vitro de la composition telle que définie ci-dessus comme réactif pour le diagnostic d’une infection par le virus Ebola.

[0082] La présente invention a également pour objet l’utilisation in vitro de la composition elle que définie ci-dessus comme réactif pour l’immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola chez un individu ayant été exposé au virus Ebola ou ayant été vacciné contre le virus Ebola.

[0083] La présente invention a également pour objet une méthode in vitro, d'immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola chez un individu ayant été exposé au virus Ebola ou ayant été vacciné contre le virus Ebola, caractérisée en ce qu’elle comprend : - la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu comprenant des lymphocytes T CD8+ ou un mélange de lymphocytes T CD8+ et T CD4+, avec une composition selon l’invention telle que définie ci-dessus, et

- la détection de lymphocytes T CD8+, et éventuellement de lymphocytes T CD4+, spécifiques du virus Ebola, par tout moyen approprié.

[0084] L’individu est de préférence un individu humain. L’échantillon biologique est notamment du sang total, des cellules mononuclées du sang périphériques (PBMC) isolés, des lymphocytes, des lymphocytes T CD8+ ou un mélange de lymphocytes T CD8+ et T CD4+ isolés, notamment à partir de PBMC.

[0085] La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic ou d’immunomonitorage comprenant la composition telle que définie ci-dessus. De préférence, ledit réactif comprend au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique tels que définis ci-dessus, par exemple marqué et/ou complexé à une molécule HLA, notamment complexé à des molécules HLA marquées, par exemple biotinylées, sous la forme de complexes multimériques HLA/peptide tels que des tétramères de complexes HLA/peptide, marqués. Les dites molécules HLA marquées sont notamment des molécules HLA I marquées, un mélange de molécules HLA I marquées ou un mélange de molécules HLA I et HLA II marquées. De préférence, ledit réactif est inclus dans un coffret (kit).

[0086] La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé d’analyse de lymphocytes T CD8+ ou d’un mélange de lymphocytes T CD8+ et T CD4+, spécifiques du virus Ebola, caractérisé en ce qu’il comprend au moins les étapes suivantes :

- la mise en contact, in vitro, d'un échantillon cellulaire comprenant des lymphocytes T CD8+ ou un mélange de lymphocytes T CD8+ et T CD4+ avec des complexes multimériques HLA /peptide, marqués, notamment par un fluorochrome, lesdits complexes étant formés par la liaison de molécules HLA solubles avec au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique issu de la NP ou GP du virus Ebola Zaïre selon l’invention, et

- l’analyse des cellules liées auxdits complexes HLA l/peptide, notamment en cytométrie de flux. [0087] Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l’analyse des cellules (lymphocytes T CD8+ ou TCD8+ et T CD4+) comprend le tri desdites cellules.

[0088] La présente invention a également pour objet un peptide constitué d’un épitope T CD8 immunogène de la NP ou GP du virus Ebola de séquence SEQ ID NO : 3, 4, 6, 9-13, 15-16, 18, 20, 22-28, 30-34, 37, 39-42, 44, 46, 47, 50 à 73 et 150 à 156 tel que définis ci-dessus.

[0089] Les peptides et leurs dérivés tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'homme du métier. Par exemple, les peptides et leurs dérivés peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) ou en phase liquide, et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse. Les lipopeptides peuvent être notamment préparés selon le procédé décrit dans les Demandes Internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. Les peptides et t leurs dérivés tels que définis ci- dessus peuvent également être produits à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l’homme du métier ; l’ADNc est cloné dans un vecteur d’expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d’affinité.

[0090] Les polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes. Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.

Brève description des dessins

[0091] La présente invention sera mieux comprise à l’aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l’identification et la caractérisation des épitopes T CD8 et T CD4 immunogènes issus de la nucléoprotéine (NP) et de la glycoprotéine (GP) du virus Ebola Zaïre selon la présente invention, ainsi qu’aux figures annexées, sur lesquels :

Fig.1

[0092] [Fig. 1 ] montre les fréquences alléliques (%) des molécules HLA I sélectionnées dans différentes populations Caucasiennes (France) et Africaines (Cameroun, Soudan, Afrique du Sud) et dans le groupe de référence testé (panel).

EXEMPLES

EXEMPLE 1 : Identification d’épitopes T CD8+ du virus Ebola Matériels et méthodes

1. Design et production des peptides

[0093] Les séquences de la NP (UniProt - AAD14590.1 ; SEQ ID NO : 1 ) et de la GP (UniProt - AKG65268.1 ; SEQ ID NO : 49) du virus Ebola proviennent du Centre américain pour les informations biotechnologiques (NCBI). La souche Zaïre de 1976 a été utilisée (ZEBOV). Les peptides ont été sélectionnés à l’aide de l’outil de prédiction de liaison au CMH-I, NetMHC v4.0. Pour l’allèle HLA-A*02, les peptides présentant un rang inférieur ou égal à 1 % ont été sélectionnés. Pour les autres allèles, seuls les dix meilleurs peptides (NP et GP confondus) ont été sélectionnés. Les peptides de 9-mers et 10-mers ont été synthétisés par Pepscan (Pays-Bas), avec une pureté minimale de 80%.

2. Préparation des cellules

[0094] Les prélèvements sanguins (Couche leuco plaquettaire) proviennent de l’Établissement Français du Sang (Centre de Rungis). Les PBMC ont été isolés par gradient de ficoll. Les cellules dendritiques (DC) immatures ont été obtenues à partir des PBMC par différenciation des cellules adhérentes après 5 jours de culture en milieu AIM-V contenant 1000 U/ml d’IL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF (R&D Systems). Les DC matures ont été obtenues à partir des DC immatures après avoir été cultivées pendant deux jours en présence de LPS. Les lymphocytes T CD8 ⁺ ont été purifiés à partir des PBMC à l’aide de microbilles magnétiques ciblant toutes les populations non CD3+/CD8+ (Miltenyi Biotec). Le génotypage des donneurs a été réalisé par NGS par la société DKMS Life Science (Dreseden, Allemagne).

3. Obtention de lignées de lymphocytes T CD8 ⁺ spécifiques des peptides

[0095] Les lymphocytes T CD8 ⁺ (1 à 3x10 ⁵ ) ont été mis en culture en plaque 96 puits à fond rond avec des DC matures autologues préalablement chargées avec des pools de peptides (10 mg/ml). La culture est faite dans du milieu IMDM supplémenté par du Sérum AB (milieu IMDM complet) contenant 30 ng/mL d’IL-21 (Bio-techne). 20 lignées lymphocytaires ont été ensemencées pour chaque pool de peptides. La culture est stimulée au bout d’une semaine par ajout de 10000 à 30000 DC chargées avec les pools de peptides, 5 ng/mL IL-15 et 5 ng/mL IL-7 (Bio-techne). Entre 5 et 7 jours après la restimulation, un test de spécificité est réalisé par ELISpot. Chaque puits de culture constitue une lignée de lymphocytes T CD8 ⁺ .

4. Evaluation de la spécificité de lymphocytes T CD8 cultivés avec les peptides par ELISpot

[0096] L’anticorps anti-IFN-g humain 1 -D1 K est adsorbé à 2,5mg/ml en PBS 1X (Mabtech) sur des plaques 96 puits Multiscreen HA (Millipore) par une incubation d’une nuit à 4°C. Les plaques sont ensuite saturées par une incubation de 2 heures à 37°C avec du milieu l’IMDM complet, Les lymphocytes T CD8 ⁺ sont incubés pendant 16 heures à 37°C dans ces plaques après avoir été lavés dans du milieu AIM-V/IL-7 (0,5ng/ml d’IL-7). Des PBMC (50 000 cellules/puits) incubés en présence de 10mg/ml de peptides sont utilisées comme cellules présentatrices. Après l’incubation, les plaques sont lavées avec de l’eau distillée, du PBS /Tween 0,05% et du PBS. 10OmI/puits d’Ac anti-IFN-g humain 7-B6-1 biotinylé (Mabtech) à 0,25mg/ml en PBS 1X/BSA 1 % est ajouté dans les plaques qui sont incubées 1 h30 à 37°C. Après plusieurs lavages en PBS ou PBS/tween 0,05%, la sécrétion d’IFN- Y est mise en évidence par l’ajout de l’Extravidine-Phosphatase Alcaline (Sigma) et de NBT/BCIP. Après 5 à 10 minutes d’incubation, la réaction est stoppée par lavage à l’eau courante. Après séchage, les spots sont comptés sur un lecteur ELISpot (AID). Une lignée de lymphocytes T CD8 ⁺ est considérée comme spécifiques de l’antigène si le nombre de spots dans les puits contenant l’antigène est au moins deux fois plus élevé que le puits ne contenant pas l’antigène, la différence entre les 2 types de puits étant au moins supérieure à 25. Résultats

1. Sélection des peptides par prédiction in silico

[0097] Les peptides issus de la NP et de la GP d’Ebola Zaïre ont été sélectionnés à l’aide de l’outil de prédiction de liaison au CMH-I, NetMHC v4.0. Les allèles HLA- A et HLA-B présents chez au moins 5% des individus dans différentes populations ont été recherchés. Les allèles HLA-C n’ont pas été retenus en raison de la faible expression de ces derniers en comparaison des allèles HLA-A et HLA-B (Neefjes et Ploegh, Eur. J. Immunol., 1988, 18, 801-810). Les allèles HLA I sélectionnés sont : HLA-A*01 :01 , HLA-A*02:01 , HLA-A*03:01 , HLA-A*11 :01 , HLA-A*23 :01 , HLA-A*24:02, HLA-A*29:02, HLA-B*07:02, HLA-B*08:01 , HLA-B*15:01 , HLA- B*15:02, HLA-B*15:03, HLA-B*18:01 , HLA-B*35:01 , HLA-B*35:02, HLA-B*35:03,

HLA-B*40:01 , HLA-B*44:02, HLA-B*44:03, HLA-B*51 :01 ([Tableau 1 ]).

[0098] [Tableau 1]

[0099] 92 peptides pour la NP et 46 peptides pour la GP ont été sélectionnés par des méthodes de prédiction in silico pour être testés in vitro. La NP semble plus immunogène que la GP, le nombre de peptides candidats étant deux fois plus élevé, ce qui est concordant avec les données publiées par Mc Elroy et collaborateurs (McElroy et al., 2015, précité).

2. Obtention de lignées de lymphocytes T CD8 ⁺ spécifiques de la NP et de la GP de ZEBOV

[0100] 25 donneurs sains comportant des molécules HLA variées et représentatives des populations caucasiennes et africaines ont été sélectionnés [Fig. 1] Il s’agit des allèles HLA-A ^* 01 :01 , HLA-A ^* 02:01 , HLA-A ^* 03:01 , HLA- A ^* 11 :01 , HLA-A ^* 24:02, HLA-A ^* 29:02, HLA-B ^* 07:02, HLA-B ^* 08:01 , HLA-B ^* 15:01 , HLA-B*18:01 , HLA-B*35:01 , HLA-B*35:03, HLA-B*40:01 , HLA-B*44:02, HLA- B*44:03 et HLA-B*51 :01.

[0101] Des lignées de lymphocytes T CD8 ⁺ ont été obtenues par co-culture des lymphocytes T CD8 ⁺ avec des cellules dendritiques autologues préalablement chargées avec des pools de peptides. Après amplification des lymphocytes T, chaque lignée a été testée par ELISpot pour sa capacité à reconnaître des pools de peptides puis dans un second test, les peptides individuels contenus dans le pool reconnu par les lignées.

[0102] Le [Tableau 2] et le [Tableau 3] présentent les réponses individuelles en lymphocytes T CD8+ spécifiques contre les différents peptides de la NP et de la GP d’Ebola, respectivement. Les peptides (épitopes T CD8) reconnus pas les lymphocytes T CD8 ⁺ spécifiques de la NP et de la GP d’Ebola sont indiqués. Le typage HLA (Restriction) pour lequel le donneur a été testé, le nombre de donneurs testés, le nombre de donneurs positifs et le pourcentage de donneur répondeur par allèle sont également indiqués. [0103] [Tableau 2]

[0104] [Tableau 3]

[0105] [Tableau 4]

[0106] Les tests d’amplification des lymphocytes T CD8 ⁺ sont effectués à partir d’un panel de donneurs sains possédant des molécules HLA de classe I variées. Les cellules T spécifiques étant présentes dans le sang avec une fréquence faible, les lymphocytes T sont amplifiés par des cycles de stimulation antigénique. La spécificité des cellules pour les peptides d’intérêt est évaluée par ELISpot. Ces tests permettent d’évaluer la réponse des lymphocytes vis-à-vis des peptides et d’ainsi sélectionner la combinaison de peptides ayant une fréquence de répondeurs élevée.

[0107] Un total de 54 et 28 épitopes ont été mis en évidence pour la N P et la GP respectivement, ce qui correspond à environ 60% des peptides testés pour chacune des protéines. Sur les 25 donneurs testés, des réponses lymphocytaires T CD8+ contre les peptides issus de la NP et de la GP ont été obtenues pour 23 et 15 donneurs, respectivement. Par ailleurs, il est à noter qu’aucun épitope restreint à l’allèle HLA-A*23 n’a été obtenu, que ce soit pour les peptides issus de la NP ou de la GP. Par ailleurs, il n’a pas été possible de mettre en évidence d’épitopes issu de la GP restreint à l’allèle HLA-B*08.

5. Conservations des épitopes

[0108] Comme, les peptides identifiés et étudiés sont issus de la souche Zaïre du virus Ebola, la conservation des séquences de ces peptides entre les différentes souches du virus Ebola a été étudiée. Les résultats sont représentés en pourcentage d’identité de séquence par rapport à la souche Zaïre. Le pourcentage d’identité des peptides entre les différentes souches est plus élevé pour les peptides de la NP que de la GP [Tableau 5] et [Tableau 6] Ces peptides, en particulier les peptides NP, devraient ainsi pouvoir être utilisés dans une composition vaccinale pour l’ensemble des souches du virus Ebola. [0109] [Tableau 5]

[Tableau 6]

EXEMPLE 2 : Identification d’épitopes T CD4+ du virus Ebola Matériels et méthodes

1. Design et production des peptides

[0110] Les séquences de la NP (UniProt AAD14590.1 ; SEQ ID NO : 1 ) et de la GP (UniProt AKG65268.1 ; SEQ ID NO : 49) du virus Ebola proviennent du Centre américain pour les informations biotechnologiques (NCBI). La souche Zaïre de 1976 a été utilisée (ZEBOV). Les peptides ont été sélectionnés à l’aide de l’outil de prédiction de liaison au CMH-II, issu de la base de données IEDB (http://www.iedb.org/). Les algorithmes NetMHCIIpan et Sturniolo ont été utilisés pour prédire la capacité de liaison d’un peptide donné aux molécules HLA de classe II sélectionnées. Des peptides de 20-mers contenant les cœurs proches ont ensuite été définis, de manière à ce que les cœurs ne soient pas en position 1 ou en position 20 du peptide. Les peptides de 20-mers ont été synthétisés par Pepscan (Pays-Bas), avec une pureté minimale de 80%.

2. Préparation des cellules

[0111] Les prélèvements sanguins (Couche leuco plaquettaire) proviennent de l’Établissement Français du Sang (Centre de Rungis). Les cellules mononuclées de sang périphérique (PBMC) ont été isolées par gradient de ficoll. Les cellules dendritiques (DC) immatures ont été obtenues à partir des PBMC par différenciation des cellules adhérentes après 5 jours de culture en milieu AIM-V contenant 1000 U/ml d’IL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF (R&D Systems). Les DC matures ont été obtenues à partir des DC immatures après avoir été cultivées pendant deux jours en présence de LPS. Les lymphocytes T CD4 ⁺ ont été purifiés à partir des PBMC à l’aide de microbilles magnétiques couplées à des anticorps anti-CD4 (Miltenyi Biotec). Le génotypage des donneurs a été réalisé par NGS par la société DKMS Life Science (Dresden, Allemagne). 3. Obtention de lignées de lymphocytes T CD4 ⁺ spécifiques des peptides

[0112] Les lymphocytes T CD4 ⁺ (1 à 3x10 ⁵ ) ont été mis en culture en plaque 96 puits à fond rond avec des DC matures autologues préalablement chargées avec des pools de peptides (10 mg/ml). La culture est faite dans du milieu IMDM supplémenté par du Sérum AB (milieu IMDM complet) contenant 1000U/ml d’IL-6 (R&D Systems) et 10ng/ml d’IL-12 (R&D Systems). 25 lignées lymphocytaires ont été ensemencées pour chaque pool de peptides. La culture est stimulée au bout d’une semaine par ajout de 10000 à 30000 DC chargées avec les pools de peptides, de 20U/ml d’IL-2 (R&D Systems) et de 10ng/ml d’IL-7 (R&D Systems). Une autre stimulation est faite après 14 et 21 jours de culture. Entre 5 et 7 jours après la dernière stimulation, un test de spécificité est réalisé par ELISpot. Chaque puits de culture constitue une lignée de lymphocytes T CD4 ⁺ .

4. Evaluation de la spécificité de Lymphocytes T CD4 cultivés avec les peptides par ELISpot

[0113] Des anticorps anti-IFN-g humain (clone 1 -D1 K, Mabtech, Suède) ont été adsorbés à 2,5mg/ml en PBS 1X (Mabtech) sur des plaques 96 puits Multiscreen HA (Millipore). Après une nuit d’incubation à 4°C, les plaques ont été saturées en les incubant 2 heures à 37°C avec du milieu l’IMDM complet. Les lymphocytes T CD4 ⁺ ont été incubés pendant 16 heures à 37°C dans ces plaques après avoir été lavés dans du milieu AIM-V contenant 0,5ng/ml d’IL-7, en présence de cellules présentatrices (50000 PBMC/puits) incubés en présence de 10mg/ml de peptides. Après l’incubation, les plaques ont été lavées avec de l’eau distillée, du PBS /Tween 0,05% et enfin du PBS. L’anticorps anti-IFN-y humain 7-B6-1 biotinylé (Mabtech) à 0,25mg/ml en PBS 1X/BSA 1 % a été ajouté dans les plaques (100mL/puits) puis incubé 1 h30 à 37°C. Après plusieurs lavages en PBS ou PBS/tween 0,05%, la sécrétion d’IFN-y a été mise en évidence par l’ajout de l’Extravidine-Phosphatase Alcaline et du substrat NBT/BCIP (Sigma-Aldrich, France). Après 5 à 10 minutes d’incubation, la réaction a été stoppée par lavage à l’eau courante. Après séchage, les spots, reflétant la sécrétion d’IFN- y par chaque lymphocyte T CD4 ⁺ activé, ont été comptés sur un lecteur ELISpot (AID). Une lignée de lymphocytes T CD4 ⁺ est considérée comme spécifique de l’antigène si le nombre de spots dans les puits contenant l’antigène est au moins deux fois plus élevé que le puits ne contenant pas l’antigène, la différence entre les deux types de puits étant au moins supérieure à 25.

Résultats

1. Sélection des peptides par prédiction in silico

[0114] Les peptides ont été sélectionnés à l’aide de l’outil de prédiction de liaison au CMH-II, issu de la base de données IEDB (http://www.iedb.org/). Seules les molécules HLA-DR les plus abondamment exprimées à la surface des Cellules Présentatrices d’Antigène (CPA) ont été étudiées. Les allèles DRB1 parmi les plus fréquents dans différentes populations [Tableau 7] ont été sélectionnés.

[0115] Les allèles HLA-DRB3*01 :01 , HLA-DRB3*02:02, HLA-DRB4*01 :01 et HLA-DRB5*01 :01 ont été ajoutées. Ainsi, 15 allèles HLA-DR, représentatifs des populations Caucasienne et Africaine, cités ci-après ont été sélectionnés : HLA- DRB1*01 :01 , HLA-DRB1 *03:01 , HLA-DRB1 *04:01 , HLA-DRB1 *04:05, HLA- DRB1 *07:01 , HLA-DRB1 *08:02, HLA-DRB1 *09:01 , HLA-DRB1*11 :01 , HLA- DRB1*12:01 , HLA-DRB1*13:01 , HLA- DRB1 *15:01 , HLA-DRB3*01 :01 , HLA- DRB3*02:02, HLA-DRB4*01 :01 et HLA-DRB5*01 :01.

[0116] Les algorithmes NetMHCIIpan et Sturniolo ont permis de prédire la capacité de liaison d’un peptide donné aux molécules HLA de classe II sélectionnées. Pour chaque peptide, un rang est déterminé, son affinité prédite étant comparée à celle de 200000 peptides naturels. Dans le cas présent, les peptides de 9-mers (coeur) avec un rang inférieur à 10% pour au moins 4 allèles HLA-DR, ou les peptides ayant un rang inférieur à 5% pour au moins 1 allèle ont été sélectionnés. Des peptides de 20-mers contenant les coeurs proches ont ensuite été définis, de manière à ce que les coeurs ne soient pas en position 1 ou en position 20 du peptide. 23 peptides 20-mer pour la NP et 33 peptides 20-mer pour la GP ont été sélectionnés pour être testés in vitro. [0117] [Tableau 7]

[Tableau 71: Fréquence allélique (%) des principales molécules HLA-DRB1 (données issues de www.allefrequencies.net)

Les allèles sélectionnés sont indiqués en gras. 2. Obtention de lignées de lymphocytes T CD4 ⁺ spécifiques de la NP et de la GP de ZEBOV

[0118] 16 donneurs sains comportant des molécules HLA variées et représentatives des populations caucasiennes et africaines ont été sélectionnés. Des lignées de lymphocytes T CD4 ⁺ ont été obtenues par co-culture des lymphocytes T CD4 ⁺ avec des cellules dendritiques autologues préalablement chargées avec des pools de peptides. Après amplification des lymphocytes T, chaque lignée a été testée par ELISpot pour sa capacité à reconnaître des pools de peptides puis dans un second test, les peptides individuels contenus dans le pool reconnu par les lignées. Afin de s’assurer de la capacité de chaque donneur à pouvoir répondre, des lignées lymphocytaires CD4 ⁺ spécifiques d’un pool de peptides spécifiques du Cytomégalovirus, Epstein-barr et de la grippe ont également été produites.

[0119] Le [Tableau 8] et le [Tableau 9] présentent les réponses individuelles en lymphocytes T CD4+ spécifiques contre les différents peptides de la NP et de la GP d’Ebola respectivement. Les lignées de lymphocytes T CD4 ont été obtenues par stimulation in vitro par des cellules dendritiques préalablement chargées avec les peptides de la NP ou de la GP. La spécificité pour ces peptides a été évaluée par Elispot IFNy. Le [Tableau 8] et le [Tableau 9] indiquent le taux de répondeurs (en %) et l’intensité de réponse (pourcentage de lignées positives) pour chacun des peptides.

[0120] [Tableau 8]

ITableau 81: Réponse individuelle des lymphocytes T CD4 contre les peptides N P [0121] [Tableau 9]

ITableau 91: Réponse individuelle des lymphocytes T CD4+ contre les peptides GP [0122] Il est à noter que seul un peptide (GP18-37) n’induit de réponse chez aucun des donneurs. Pour chaque peptide, l’intensité de réponse est variable en fonction des donneurs, de 1 à 14 lignées positives. Par ailleurs, le nombre de lignées positives totales par donneur est également extrêmement variable, de 1 à 83 et de 1 à 105 pour la NP et la GP respectivement.

[0123] Les résultats obtenus sont très hétérogènes en fonction des peptides étudiés. Dans le cadre de la vaccination contre le virus Ebola, il est nécessaire de sélectionner les peptides qui permettent d’induire une réponse cellulaire importante chez un maximum d’individus. Les données peuvent donc être analysées selon deux paramètres : le taux (nombre de donneurs répondeurs) et l’intensité (nombre de lignées totales positives) de réponse pour chaque peptide pour les peptides issus de la NP et la GP respectivement. Dix peptides pour la NP et 8 pour la GP induisent des réponses chez 50% des donneurs ou plus. On peut noter une bonne corrélation entre taux et intensité de réponse, en particulier pour la NP. En effet, les peptides répondant chez le plus grand nombre de donneurs sont également ceux pour lesquels le nombre de lignées positives est le plus élevé. Ces peptides peuvent donc permettre une bonne couverture de la population, tout en induisant une réponse efficace.

[0124] Les peptides identifiés et étudiés sont issus de la souche Zaïre du virus

Ebola. La conservation de la séquence peptidique entre les différentes souches du virus Ebola a été étudiée pour les peptides présentant un fort taux de réponse. Les résultats sont représentés en pourcentage d’identité de séquence par rapport à la souche Zaïre. Le pourcentage d’identité des peptides entre les différentes souches est plus élevé pour les peptides de la NP que de la GP [Tableau 10] et [Tableau 11] Ces peptides, en particulier les peptides NP, devraient ainsi pouvoir être utilisés dans une composition vaccinale pour l’ensemble des souches du virus Ebola. [0125] [Tableau 10]

[Tableau 10]: Conservation des séquences des peptides issus de la NP entre les différentes souches du virus Ebola

[0126] [Tableau 11]

[Tableau 11] : Conservation des séquences des peptides issus de la GP entre les différentes souches du virus Ebola

3. Combinaison de peptides en longs fragments d’intérêt

[0127] La couverture de différentes populations est un des enjeux majeurs dans le développement d’un vaccin contre le virus Ebola. Compte tenu du rôle majeur des lymphocytes T CD4+ dans l’initiation des réponses humorales et cytotoxiques, il est avantageux de combiner les épitopes T CD8 d’Ebola (exemple 1 ) avec les épitopes T CD4 d’Ebola identifiés ci-dessus pour augmenter l’efficacité d’un vaccin contre le virus Ebola. En outre, il est nécessaire de déterminer un cocktail minimal d’épitopes T CD4 et d’épitopes T CD8 permettant d’obtenir une couverture maximale de la population à vacciner

Dans ce cas, 6 LSP pour la NP peuvent ainsi être établis ([Tableau 12]).

[0128] [Tableau 12]

[Tableau 12] : LSP issus de la NP contenant des épitopes T CD4 et T CD8 [0129] L’objectif est de déterminer un jeu de peptides permettant une couverture maximale des donneurs testés, aussi bien en réponse T CD4 qu’en réponse T CD8. Avec cette combinaison, la couverture maximale est obtenue aussi bien pour les T CD4 comme pour les T CD8.

[0130] Pour la GP, 6 LSP peuvent également être combinés ([Tableau 13]).

[0131] [Tableau 13]

[Tableau 13] : LSP issus de la GP contenant des épitopes T CD4 et T CD8 [0132] Les 6 LSP de la GP sélectionnés ne permettent pas de couvrir l’allèle HLA-B*08, aucun épitope n’ayant été obtenu pour cet allèle. Les allèles HLA-A*11 et HLA-B*35 ne sont également pas couverts par les LSP, les épitopes obtenus étant trop éloignés. Afin d’obtenir la couverture optimale, il faut alors ajouter le peptide GP664-673 (épitope HLA-A*11 ). Seuls 14 des 15 donneurs sont couverts par cette combinaison, tandis que la couverture est maximale pour les donneurs CD4+.

Conclusion

[0133] Cette étude a permis de mettre en évidence des épitopes T CD8 immunogènes issus de la NP et de la GP du virus Ebola, capables de stimuler les lymphocytes T CD8, dans une cohorte de donneurs sains représentative des populations caucasiennes et africaines (groupe de référence).

[0134] La NP est plus immunogène que la GP, 54 épitopes ayant été obtenus pour la première, et 28 pour la seconde. Ces résultats sont cohérents avec les observations faites par Mc Elroy et al., (Mc Elroy et al., 2015, précité) chez des patients ayant été infectés par le virus. Il a en effet observé qu’il existait une réponse lymphocytaire T CD4 ⁺ et CD8 ⁺ contre les différentes protéines virales, et en particulier contre la NP.

[0135] Aucun épitope restreint à l’allèle HLA-A*23 (prépondérant dans les populations africaines) n’a été obtenu. Néanmoins, la combinaison des différents épitopes permet d’obtenir une couverture vaccinale potentielle des populations africaines et caucasiennes entre 68 et 98%.

[0136] Ces épitopes T CD8 d’Ebola sont avantageusement combinés avec les épitopes T CD4 d’Ebola (exemple 2) de façon à obtenir une combinaison de peptides permettant une couverture maximale des donneurs testés, aussi bien en réponse T CD4 qu’en réponse T CD8 dirigée contre le virus Ebola. La combinaison des épitopes T CD4 et T CD8 d’Ebola permet ainsi d’augmenter l’efficacité d’un vaccin contre le virus Ebola.