модифицированные 5'-фocфoнaты азт - потенциальные противовирусные препараты.

область техники

изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно, к новым производным нуклеозидов, а именно, к замещенным 5'-фocфoнaтaм азт. эти соединения обладают противовирусным действием и могут быть применены для подавления репродукции вируса иммунодефицита человека.

предшествующий уровень техники

в настоящее время в медицинской практике используется целый ряд соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении вич. среди них различают нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы. среди производных нуклеозидов наиболее часто применяются з'-азидо-з'-дезокситимидин (азт, зидовудин®), 2',3'-дидeзoкcицитидин (ddс, зальцитабин®), 2',3'-дидeз- оксиинозин (ddl, диданозин®), 2',3'-дидeзoкcи-2',3'-дидeгидpoтимидин (d4T, ставудин®) и 2',3'-дидeзoкcи-3'-тиaцитидин (3TC, ламивудин®) [De сlеrсq, E., 2002. Nеw dеvеlорmепt iп апti-шV сhеmоthеrару. вiосhiт. вiорhуs. асtа, 1587 258-275].

механизм действия указанных соединений состоит в том, что после проникновения в инфицированные клетки они подвергаются трифосфорилиро- ванию и специфично блокируют синтез днк, катализируемый обратной транс- криптазой вич. высокая изменчивость вич приводит к быстрому возникновению резистентных штаммов вируса [Grоsсhеl, в., сiпаtl, J. H., and Cinatl J. Jr.,

1997. Virаl апd сеllulаr fасtоrs fоr rеsistапсе аgаiпst апtirеtrоvirаl аgепts. Iпtеrvirоlоgу, 40, 400-407; апtопеlli, G, тurriziапi, о., Vеrri, а., Nаrсisо, р., Fеrгi, F., D'оffizi, G., апd Diапziпi, F., 1996. Lопg-tеrm ехроsurе tо zidоvudiпе аffесts iп vitrо апd iп vivо thе еffiсiепсу оf thуmidiпе кiпаsе. AIDS Rеs нит Rеtrоvir., 12, 223-228], и, следовательно, к необходимости смены препарата. к тому же из-за низкой эффективности внутриклеточных превращений используемые препараты требуют высоких доз применения, что вызывает появление выраженных токсических эффектов.

следствиями токсичности азт являются подавление деятельности клеток спинного мозга, нарушения функции печени и миопатия [сhаriоt, р., Drоgоu, L, De Lасrоiх-Szmапiа, L, еliеzеr-Vапеrоt, M. с, сhаzаud, в., Lоmbеs, а., Sсhаеffеr, а., апd Zаfrапi, E.S., 1999. Zidоvudiпе-iпduсеd mitосhопdriаl disоrdеr with mаssivе livеr stеапоsis, mуораthу, lасtiс асidоsis, апd mitосhопdiаl DNA dе- рlеtiоп. J. нераtоl. 30, 156-160; кеllаm, р., воuсhеr, C.A., апd Lаrdеr, B.A., 1992. Fifth mutаtiопs iп шV rеvеrsе trапsсriрtаsе сопtributеs tо thе dеvеlорmепt оf high lеvеl rеsistапсе tо zidоvudiпе. рrос. Nаtl. асаd. Sсi. U.S.а, 89, 1934-1938; Rеп, J., еsпоuf, R.M., норkiпs, A.L., Jопеs, E. Y., кirbу, L, кееliпg, J., Rоss, C.K., Lаrdеr, в. а., Stuаrt, D. L, апd Stаmmеrs, D. к., 1998. з'-аzidо-з'-dеохуthуmidiпе drug rеsistапсе mutаtiопs iп FпV-1 rеvеrsе trапsсriрtаsе сап iпduсе lопg rапgе сопfоrmаtiопаl сhапgеs. рrос. Nаtl. асаd. ScL U.S.а, 95, 9518-9523]. быстрое выведение азт из организма требует частого приема препарата. кроме того, при длительном применении азт достаточно быстро вырабатываются резистентные штаммы вируса и лечение теряет эффективность. несмотря на все вышеперечисленные недостатки, азт по-прежнему остается наиболее широко применяемым анти-вич препаратом.

известен н-фосфонат азт (никавир®), одобренный в россии для терапии спид, менее токсичен, чем азт [Iпtrасеllulаr mеtаbоlism апd рhаrmа- соkiпеtiсs оf 5'-hydroheпphosphoпate оf 3'-azido-2',3'-dideoxythymidiпe, а рrоdrug оf з'-аzidо-г^з'-didеохуthутidiпе. апtivirаl Rеsеrсh 63 (2004), 107-113] . действие никавира основано на способности высвобождать азт, который после

внутриклеточного превращения в AзT-5'-тpифocфaт ингибирует репликацию вич. по данным фармакокинетических исследований клинические преимущества никавира объясняются более медленным и плавным нарастанием концентрации азт в крови, чем при приеме собственно азт; при этом C _мaкc азт из никавира < C _mкc азт из зидовудина, а T _ш азт из никавира > T _1/2 азт из зидо- вудина [Y. Skоblоv еt аl./апtivirаl Rеsеаrсh 63 (2004) 107-113]. тем не менее, токсичность никавира остается достаточно высокой. другим недостатком является возникновение резистентности к никавиру.

раскрытие изобретения

данным изобретением решена задача создания низко токсичных производных азт, обладающих способностью проникать внутрь клетки и постепенно высвобождать активный нуклеозид (азт). это позволит поддерживать внутриклеточную концентрацию препарата достаточную для проявления терапевтического действия в течение длительного времени и, таким образом, снизить разовую дозу препарата и/или частоту приема и уменьшить побочные эффекты.

задача решена созданием соединений, 5'-фocфoнил-3'-aзидo-3'-дeзoкcи- тимидин, общей формулы:

R = алкильные группы, в том числе содержащие атомы галогенов, кар- бокси-, гидрокси-, алкокси- и ацилокси- группы, а также замещенные амино- карбонильные группы.

новые соединения подавляют репродукцию вируса иммунодефицита человека 1-го типа в культуре перевиваемых лимфоцитов MT-4, обеспечивают защиту клеток от цитопатогенного действия вируса и не проявляют токсичности в отношении хозяйских клеток вплоть до крайне высоких концентраций (табл. 1). из полученных экспериментальных данных видно, что исследуемые соединения, не оказывая токсического действия на клетки в эффективных концентрациях (50%-е токсические дозы на 2-4 порядка превышают 50%-е ингибиру- ющие дозы) в высокой степени подавляют репродукцию вируса иммунодефицита 1 типа в культуре клеток MT-4. терапевтические индексы исследуемых соединений (IS), определяемые как отношение токсической дозы препарата к его эффективной дозе, сравнимы с таковыми для н-фосфоната азт. вирусологические тесты проведены в соотвествии с описанными ранее протоколами.

показано, что заявляемые фосфонаты азт в организме собак медленно высвобождают азт, таким образом, представляя собой, латентные формы азт (пример 7, табл. 2). исследования показывают, что для всех заявляемых фосфонатов единственным продуктом метаболизма, детектируемым в крови животных, является азт. фармакокинетические параметры, приведенные в тaбл.2, были определены по генерированному азт и зависели от структуры фосфоната.

лучшие варианты осуществления изобретения

целевые фосфонаты получали по следующей схеме:

где X = Cl или он Ia: R=ClCH ₂

Ib: R=ICH ₂

Ic: R=HOCH ₂

Id: R-CH ₃ OCH ₂

Ie: R=H ₂ NC(O)

ниже приведены конкретные примеры, раскрывающие сущность изобретения.

пример 1.

5'-Xлopмeтилфocфoнил-3'-aзидo-3'-дeзoкcи тимидин (Ia).

к раствору з'-азидо-з'-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в триэтилфос- фате (10 мл), охлажденному до O ⁰ C, добавляли хлорметилфосфонилдихлорид (0,92 мл, 9 ммоль). смесь перемешивали 18 часов при 18 ⁰ C, разбавляли охлажденной смесью пиридина (10 мл) и воды (10 мл), перемешивали 30 минут и выливали в воду (700 мл). раствор наносили на колонку с DEAE целлюлозой, элюировали в линейном градиенте NH ₄ HCO ₃ (о— я 5 мм, рн 7,5). целевые фракции упаривали, остаток разбавляли водой (3 мл) и дополнительно очищали на колонке с Liсhгорrер RP-18, элюируя водой. целевую фракцию лиофили-

зовали, получали 1 г (90%) фосфоната (Ia). ¹ H ямр (D ₂ O): 7,72 кв (IH, J=O, 5 гц, н-б), 6,27 т (IH, J=6 гц, H-I'), 4,55 м (IH, H-3'), 4,21 м (зн, H-4' и H-5'), 3,58 д (2H, J=8,5 гц, CH ₂ -P), 2,54 м (2H, H-2'), 1,95 д (зн, J=0,5 гц, CH ₃ ). ³¹ P ямр: 16,03 с.

пример 2.

5'-иoдмeтилфocфoнил-3'-aзидo-3'-дeзoкcи тимидин (Ib).

5'-иoдмeтилфocфoнил-3'-aзидo-3'-дeзoкcит� �мидин (Ib) синтезировали из з'-азидо-з'-дезокситимидина и иодметилфосфоновой кислоты по методу, описанному для соединения Ia. выход 54%. ¹ H ямр (D ₂ O): 7,55 с (IH, H-6), 6,07 т (IH, J=6 гц, H-I'), 4,37 м (IH, H-3'), 4,00 м (зн, H-4' и H-5'), 2,89 (2H, J=9 гц, CH ₂ -P), 2,34 м (2H, H-2'), 1,75 с (зн, CH ₃ ). ³¹ P ямр: 17,00 с.

пример 3.

5'-гидpoкcимeтилфocфoнил-3' -азидо-з'-дезокситимидин (Ic).

раствор пиридиниевой соли ацетоксиметилфосфоновой кислоты (1,2 ммоль) в пиридине (3 мл) прибавляли к раствору з'-азидо-з'-дезокситимидина (267 мг, 1 ммоль) в пиридине (2 мл), прибавляли при перемешивании дицикло- гексилкарбодиимид (520 мг, 2,5 ммоль), реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 10 часов и разбавляли водой (5 мл). после 30 минут дополнительного перемешивания отделяли осадок, раствор упаривали, остаток растворяли в IM KOH (5 мл) и перемешивали при комнатной температуре 5 часов. раствор упаривали, остаток растворяли в воде (100 мл). раствор наносили на колонку с DEAE целлюлозой в HCO ₃ "-фopмe, элюировали в линейном градиенте NH ₄ HCO ₃ (0— »-15 мм, рн 7,5). целевые фракции упаривали и переупаривали с водой (3 раза по 5 мл), остаток разбавляли водой (3 мл) и хроматографиро- вали на колонке с Liсhrорrер RP- 18, элюируя водой. целевую фракцию лиофи- лизовали, получали 238 мг (66%) фосфоната (Ic).

¹ H ямр (D ₂ O): 7,68 кв (IH, J=0,5 гц, н-б), 6,22 т (IH, J=6 гц, H-I '), 4,48 м (IH, H-3'), 4,16 м (зн, H-4' и H-5'), 3,77 д (2H, J=7 гц, CH ₂ -P), 2,51 т (2H, J=б гц H- 2'), 1,93 д (зн, J=0,5 гц, CH ₃ ). ³¹ P ямр: 16.03 с.

пример 4.

δ'-метоксиметилфосфонил-з'-азидо- з'-дезокситимидин (Id) синтезировали из з'-азидо-з'-дезокситимидина и метоксиметилфосфоновой кислоты по методу, описанному для соединения Ic. ¹ H ямр (D ₂ O): 7,66 кв (IH, J=0,5 гц, H- 6), 6,21 т (IH, J=6 гц, H-I'), 4,48 м (IH, H-3'), 4,15 м (зн, H-4' и H-5'), 3,68 кв (2H, J=8 гц, CH ₂ -P), 2,52 т (2H, J=6 гц H-2'), 1,94 д (зн, J=0.5 гц, CH ₃ ). ³¹ P ямр: 16,03 с.

пример 5.

5'-Aминoкapбoнилфocфoнил-3'-aзидo-3'-дe� �oкcитимидин (Ie).

5'-Aминoкapбoнилфocфoнил-3 '-aзидo-3 '-дезокситимидин (Ie) синтезировали из з'-азидо-з'-дезокситимидина и аминокарбонилфосфоновой кислоты по методу, описанному для соединения Ic получили 70 мг (94%) соединения Ie. ¹ H ямр (DMSO-d _б ): 7,82 с (IH, H6), 7,17 с и 7,13 с (2H, NH ₂ ), 6,12 т (IH, J 6,9, Hl'), 4,5 м (IH, нз'), 3,95 м (зн, H4' и H5'), 2,30 м (2H, H2'), 1,81 с (зн, CH ₃ ). ³¹ P ямр (DMSO-d ₆ ): -1,56 с. масс-спектр: m/е 374,3 [M ⁺ ].

пример 6.

исследование ингибирования репродукции вич включает культивирование первично инфицированных лимфоидных клеток линии MT-4 в присутствии исследуемых соединений, конечные концентрации которых в культу- ральной среде составляют 0,001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток.

ингибирование репродукции вич в культуре чувствительных клеток определяют по снижению накопления вирусспецифического белка p24 (по дан-

ным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования при окрашивании бромидом 3-(4,5-димeтилтиaзoл- 2-ил)-2,5-дифeнилтeтpaзoлия (MTT).

оценка цитотоксичности соединений.

цитотоксичность препарата оценивают путем добавления его разведений в бессывороточной среде RPMI- 1640 к клеточной суспензии MT-4, помещенной в лунки 96-лyнoчнoгo планшета ("сеl-сult", епglапd), до конечных концентраций 0,001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37 ⁰ C в течение 4 суток. посевная концентрация составляет 0,5x10 ⁶ клеточных частиц в миллилитре. контролем служат клетки без добавления препарата, вместо которого вносят такое же количество бессывороточной среды. жизнеспособность клеток подсчитывают на 4 сутки культивирования, пользуясь формазановым методом (прижизненным окрашиванием клеток MTT). токсичность различных доз препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам строят дозо- зависимую кривую и определяют концентрацию, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD ₅₀ ). исследуемые соединения не оказывают токсического действия на клетки MT-4 в эффективных концентрациях. следует также отметить, что 50% токсичные дозы на 5-6 порядков превышают эффективные в отношении Bич-1 дозы (таблица 1).

влияние исследуемых соединений на репродукцию Bич-1 в культуре клеток MT-4 исследовано по известной методике.

терапевтический индекс, или индекс селективности (IS) считают как отношение 50%-нoй токсической концентрации соединения к его 50%-нoй эффективной дозе (результаты представлены в таблице 1). на основании этих количественных показателей ингибирования можно судить об эффективности противовирусного действия заявляемых соединений, заключающейся в высокой степени подавления репликации Bич-1 в культуре клеток MT-4, сравнимой с эффективностью никавира.

пример 7.

собаке весом 12 кг вводили 250 мг исследуемого вещества орально (в смеси с творогом). через определенные промежутки времени отбирали пробы крови (1 мл) из бедренной вены. пробы центрифугировали (10 минут, 2000 об/мин), супернатант отделяли. из супернатанта отбирали аликвоты (0,25 мл), добавляли оксетан (0,25 мкг, как внутренний стандарт) и метанол (0,75 мл). полученную смесь центрифугировали 3 минуты при 5000 об/мин. супернатант отделяли и упаривали в токе воздуха при 40 ⁰ C, к остатку добавляли воду (1 мл). аликвоты (20 мкл) анализировали методом вэжх на жидкостном хроматографе Gупkоtес, германия; аналитическая колонка Ultrаsрhеrе ODC "весkmап" USA. элюент: 6% ацетонитрил в 0,1% H ₃ PO ₄ (рн 2,1) в присутствии 0,15% триэтиламина. детекция при λ _max 265 нм, температура 30 ⁰ C. фар- макокинетические параметры, полученные в результате анализа данных, приведены в таблице 2.

таблицаl . противовирусная активность фосфонатов азт против Bич-1 гKB-4046:

таблица 2. фармакокинетические параметры азидотимидина после введения собаке внутрь 250 мг субстанций азт, никавира, Ia и Ie в эквиваленте 250 мг азт

таким образом, показано, что заявленные соединения обладают низкой токсичностью, способны эффективно ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита 1 типа в культуре клеток MT -4 и генерировать азт в организме млекопитающих, обеспечивая плавное нарастание его концентрации в крови.