Modifizierte Cytostatika

Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate aus Cytostatika und N-Thiocarbonyl- modifizierten Aminosäuren bzw. Peptiden, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere im Zusammenhang mit Krebser¬ krankungen.

Die Chemotherapie bei Tumorerkrankungen ist begleitet von meist schwer¬ wiegenden Nebenwirkungen, bedingt durch die Toxizität von Chemotherapeutika auf proliferierende Zellen anderer Gewebe. Seit vielen Jahren beschäftigen sich

Wissenschaftler mit dem Problem der Verbesserung der Selektivität von einge¬ setzten Wirkstoffen. Ein vielfach verfolgter Ansatz ist die Synthese von Prodrugs, die mehr oder weniger selektiv im Zielgewebe beispielsweise durch Veränderung des pH-Wertes (z.B. Tietze et al., DE 4 229 903), durch Enzyme (z.B. Glucu- ronidasen; Jacquesy et al., EP 511 917; Bosslet et al., EP 595 133) oder durch

Antikörper-Enzym-Konjugate (Bagshawe et al., WO 88/07378; Senter et al., US PS 4 975 278; Bosslet et al., EP 595 133) freigesetzt werden. Problematisch bei diesen Ansätzen ist u.a. die mangelnde Stabilität der Konjugate in anderen Ge¬ weben und Organen und insbesondere die ubiquitäre Wirkstoffverteilung, die sich an die extrazelluläre Wirkstofffreisetzung im Tumorgewebe anschließt.

Im folgenden werden beispielhaft drei cytostatisch aktive Grundkörper aus ver¬ schiedenen Substanzklassen, die mit schweren Nebenwirkungen behaftet sind, vor¬ g oestellt.

Das heterocyclische Amin Batracylin (1) zeigt in verschiedenen Darmkrebs- Modellen eine gute Antitumorwirkung (US PS 4 757 072).

(1)

Peptidkonjugate von (1) mit guter In-vitro-Wirkung und günstigeren Löslichkeits- eigenschaften (US 4 180 343) sind im Tierversuch schlechter verträglich als Batra¬ cylin selbst. So reichern sich z.B. die in EP 501 250 beschriebenen Fucose-

Kon)ugate sehr stark in der Leber an Glycokonjugate von Cytostatika, wie sie in unserer ebenfalls anhangigen Anmeldung PCT/96/01279 beschrieben sind, weisen zwar gunstigere Eigenschaften auf, sind aber synthetisch nur mit größerem Aufwand zuganglich

Das Chinolon-a (2) 7-[(3aRS, 4RS, 7aSR)-4- Amino- 1,3,3 a,4,7,7a-hexahy dro-i so- indol-2-yl]-8-chlor-l-cyclopropyl-6-fluor-l,4-dihydro-4-oxo- 3-chinolincarbonsaure zeigt neben einer hervorragenden anti bakteriellen Aktivität auch eine sehr gute Wi rksamkeit gegenüber verschiedenen Tumorzell inien (EP 520 240, JP 4 253 973) Dem stehen jedoch erhebliche toxikologische Probleme gegenüber (z B Genotoxizitat, Knochenmarks-Toxizitat, hohe akute Toxizität in vivo etc )

(2) (Chinolon-a)

20(S)-Camptothecιn (3) ist ein pentacyclisches Alkaloid, das 1966 von Wall et al isoliert wurde (J Amer Chem Soc 88 (1966) 3888) Es besitzt ein hohes Anti- tumor-Wirkpotential in zahlreichen In-vitro- und In-vivo-Tests Leider scheiterte jedoch die Realisierung des vielversprechenden Potentials in der Klinik an Toxizitats- und Loslichkeitsproblemen

Durch Öffnung des E-Ring-Lactons und Bildung des Natriumsalzes wurde eine wasserlösliche Verbindung erhalten, die in einem pH-abhangigen Gleichgewicht mit der ringgeschlossenen Form steht Klinische Studien führten auch hier bisher nicht zum Erfolg

NaOH

Etwa 20 Jahre spater wurde gefunden, daß die biologische Aktivität auf eine Enzyminhibition der Topoisomerase I zurückzuführen ist Seither wurden die Forschungsaküvitaten wieder verstärkt, um vertraglichere und in vivo wirksame Camptothecin-Deπvate zu finden

Zur Verbesserung der Wasserloshchkeit wurden z B Salze von A-Ring- und

B-Ring-modifizierten Camptothecin-Deπvaten sowie von 20-O-Acyl -Derivaten mit lonisierbaren Gruppen beschrieben (Vishnuvajjala et al , US 4 943 579) Das letztere Prodrug-Konzept wurde spater auch auf modifizierte Camptothecin- Deπvate übertragen (Wani et al , WO 96/02546) Die beschriebenen 20-O-Acyl- Prodrugs haben allerdings in vivo eine sehr kurze Halbwertszeit und werden sehr schnell zum Grundkorper gespalten

Wir fanden nun, daß die Modifizierung von Cytostatika wie z B Batracyhn, anti- tumoraktive Chinolone (wie z B Chinolon-a) oder Camptothecin bzw Campto- thecin-Deπvate mit N-thiocarbonyl-modifizierten Aminosäuren zu neuen Ver- bindungen mit überraschenden, hochinteressanten Eigenschaften fuhrt

Die so erhaltenen Konjugate sind synthetisch gut zugänglich und zeigen in vitro eine ähnlich hohe Aktivität gegenüber verschiedenen Tumor- zellinien und Tumorxenografts wie das zugrundeliegende Toxophor

In Abhängigkeit von der Zusammensetzung der N-thiocarbonyl-modifi- zierten Aminosäuren zeigen die erfindungsgemaßen Konjugate im Ver¬ gleich zu den zugrundeliegenden Cytostatika wesentlich verbesserte Los- hchkeitseigenschaften

Sie weisen gegenüber den zugrundeliegenden Toxophoren eine höhere Verträglichkeit und Tumorselektivitat auf

- In vivo zeigen sie eine gute bis sehr gute therapeutische Aktivität

Sie sind in extrazellularem Medium und in Blut wesentlich stabiler als die zuvor beschriebenen reinen Aminosaure-Prodrugs von Batracyhn, Chino- lonen oder von Camptothecin-Deπvaten

Im Fall von 20-O-Acylierungen von Camptothecin-Deπvaten wiid durch die esterartige Verknüpfung der Carrier-Reste mit der 20-Hydroxygruppe der für die Wirkung wichtige Lactonring stabilisiert

ie Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

S

II

(Ar-X-NH-C-) _n M-C

worin

^ ⁿ für 1 bis n' gleiche oder voneinander verschiedene Gruppierungen

S

II

Ar- ^λ -NH-C steht, wobei n eine Zahl 1 bis n' bedeutet und n' der maximalen

Zahl möglicher Anknüpfungsstellen von M entspricht,

worin

Ar für einen Arylrest mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen steht, der zusatzlich zu X gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein kann durch Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Carboxy, Carboxyalkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Isocyanato,

Isothiocyanato, Halogen, Sulfonyl und/oder Sulfonamid,

X für eine direkte Einfachbindung oder für Alkylen mit bis zu 6 Kohlenstoff¬ atomen steht,

M für ein Mono-, Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht, das über die α-Amino- gruppe und/oder über Amino- und/oder Hydroxygruppen der Seitenketten mit den n gleichen oder voneinander verschiedenen Gruppierungen

S

II

Ar-X-NH-C verknüpft ist, wobei weitere funktioneile Gruppen des

Peptids gegebenenfalls Schutzgruppen tragen können,

C für einen Rest eines Cytostatikums oder eines Cytostatikum-Derivats steht, das über eine Aminofunktion oder über ein Sauerstoffatom mit M verknüpft ist,

sowie deren Stereoisomere, Stereoisomerengemische und Salze.

C kann eine interkalierende Substanz, ein Topoisomerase-Inhibitor, ein Anti- metabolit, ein Alkylanz, ein Tubulinhemmer, ein Tyrosinphosphokinase- Inhibitor, ein Proteinkinase-C-Inhibitor oder ein Wirkstoff mit einem anderen oder unbekannten cytostati sehen oder cytotoxischen Wirkmecha¬ nismus sein. C kann beispielsweise ein Nucleosid, ein Endiin-Antibiotikum, eine Chinolon- oder Naphtyridoncarbonäure oder ein cytotoxisches Peptidantibiotikum z.B. aus der Klasse der Dolastatine sein. C kann Batracylin, Chinolon-a, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid, Methotrexat, Eto- posid, Camptothecin, ein Camptothecin-Derivat, Daunomycin, Doxorubicin,

Taxol, Vinblastin, Vincristin, Dynemicin, Calicheamycin, Esperamycin, Quercetin, Suramin, Erbstatin, Cyclophosphamid, Mitomycin C, Melphalan, Cisplatin, Bleomycin, Staurosporin oder ein anderer anti neoplastisch aktiver Wirkstoff sein.

Der Begriff "Alkylgruppen" soll hierin sofern nicht anders angegeben geradkettige, verzweigte, cyclische und Cycloalkylreste enthaltende Alkylreste umfassen. Diese Definition soll sinngemäß auch für alle anderen Alkylgruppen enthaltenden Reste gelten, wie beispielsweise Alkoxy etc.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin

Ar für einen Phenylrest steht, der para-ständig zu X noch Hydroxy, Carboxy,

Isothiocyanato oder Halogen tragen kann.

Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin

X für eine Einfachbindung oder für Methylen steht

Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I),

worin

M für ein Mono-, Di- oder Tπpeptid steht, das über die α-Aminogruppe und/oder über Amino- und/oder Hydroxygruppen der Seitenketten mit den n gleichen oder voneinander verschiedenen Gruppierungen S

II

Ar-X-Nπ-C verknüpft ist, wobei weitere funktionelle Gruppen des

Peptids gegebenenfalls Schutzgruppen tragen können

Bevorzugt bestehen die Peptide M aus Aminosaureresten, die sich ableiten von Alanin, Asparaginsaure, Glutaminsäure, Glycin, Leucin, Histidin, Lysin, Arginin,

Ornithin, Senn, Tyrosin, Valin, Diaminopropionsaure, , γ-Diaminobuttersaure oder Phenylalamin, wobei mehrere Aminosaurereste sowohl über die α-Amino- gruppe als auch gegebenenfalls über die Seitenketten-Aminofunktionen oder auch über beide Funktionen peptidisch verknüpft sein können

Falls M weitere funktionelle Gruppen tragt, so sind diese bevorzugt deblockiert

Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin C für einen Batra¬ cyhn-, Methotrexat-, Chinolon-a-, Etoposid-, Melphalan,- Taxol-, Camptothecin- Rest, ein im A-Ring oder B-Ring modifiziertes Camptothecin-Deπvat, einen Dau- nomycin- oder Doxorubicin-Rest steht, wobei C über eine Amino- oder Hydroxy- funktion mit M verknüpft ist Ganz besonders bevorzugte Beispiele für C sind

Reste des Batracyhn, Chinolon-a und Doxorubicin, Camptothecin, 7-Ethylcampto- thecin, 10,l l-(Methylendιoxy)camptothecιn, 7-Hydroxymethylcamptothecιn und 7-Ethyl- 10-hydroxy camptothecin

Die erfindungsgemaßen Verbindungen können in stereoisomeren Formen, bei- spielsweise als Enantiomere oder Diastereomere, oder als deren Gemische, bei¬ spielsweise als Racemat, vorliegen Die Erfindung betrifft sowohl die reinen Stereoisomere als auch deren Gemische

Die Stereoisomerengemische können, falls erforderlich, in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile getrennt werden, beispielsweise durch Chromatographie oder durch Kristallisationsverfahren

Die Aminosaurereste können jeweils in der D-Form oder in der L-Form vorliegen

Die Nomenklatur der Aminosäuren folgt den von der IUPAC aufgestellten Regeln

Bei fehlender Angabe der Stereochemie wurden Aminosäuren der L-Form einge¬ setzt

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bedingt durch eine Rotations¬ hinderung in rotationsisomeren Formen oder als deren Gemische auftreten Die Erfindung betrifft sowohl die reinen Rotationsisomere als auch deren Gemische

Rotationsisomerengemische können gegebenenfalls, falls erforderlich, mittels be¬ kannter Methoden in die einheitlichen Bestandteile gtrennt werden, beispielsweise durch Chromatographie (z B. HPLC) oder durch Kristallisationsverfahren Möglich ist dies nicht nur auf der Endstufe der Konjugate, sondern gegebenenfalls auch auf Zwischenstufen. Aus den rotamerenreinen Zwischenstufen können gegebenenfalls durch geeignete Synthesefuhrung die rotamerenreinen Endstufen hergestellt werden

Die erfmdungsgemaßen Verbindungen können auch in Form ihrer Salze vorliegen Im allgemeinen seien hier Salze mit organischen oder anorganischen Basen oder Sauren sowie innere Salze genannt.

Zu den Sauren, die addiert werden können, gehören vorzugsweise Halogen wasser¬ stoffsauren, wie z.B die Chlorwasserstoffsaure und die Bromwasserstoffsaure, ins¬ besondere die Chlorwasser stoff säure, ferner Phosphorsaure, Salpetersaure, Schwefelsaure, mono- und bifunktionelle Carbonsauren und Hydroxycarbonsauren, wie z B Essigsaure, Trifluoressigsaure, Maleinsäure, Malonsaure, Oxalsäure,

Gluconsaure, Bernsteinsaure, Fumarsaure, Weinsaure, Zitronensaure, Salizylsäure, Sorbinsaure und Milchsaure sowie Sulfonsauren, wie z B p-Toluolsulfonsaure, 1,5-Naphthahn-disulfonsaure oder Camphersulfonsaure

Physiologisch unbedenkliche Salze können ebenso Metall- oder Ammoniumsalze solcher erfmdungsgemaßen Verbindungen sein, die eine freie Carboxylgruppe

besitzen Besonders bevorzugt sind z B Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze, sowie Ammoniumsalze, die abgeleitet sind von Ammoniak oder organischen Aminen wie beispielsweise Ethylamin, Di- bzw Tπethylamin, Di- bzw Tπethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Ethylendiamin oder Phenethylamin

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der allgemeinen Formel (II)

M'-C (II),

worin C die oben angegebene Bedeutung hat und M' für einen Rest M steht, der an den gewünschten Verknupfungsstellen Wasserstoffatome tragt und dessen übrige potentielle Verknupfungsstellen durch Schutzgruppen blockiert sind,

mit Verbindungen der allgemeinen Formel (III)

Ar - X- N = C - S (III)

in geeigneten Losemitteln in Gegenwart einer Base zu Verbindungen der allge¬ meinen Formel (Ia)

S ιι (Ia)

Ar-X-NH-C- M"-C

umsetzt,

worin Ar, X und C die oben angegebenen Bedeutungen haben und M" für einen Rest M steht, dessen weitere potentielle Verknupfungsstellen durch Schutzgruppen blockiert sind,

S

II und im Fall der Einfuhrung weiterer Gruppen Ar-X-NH-C _^

die sich von der bzw den zunächst eingeführten unterscheiden, die entsprechenden Schutzgruppen gegebenenfalls selektiv von den Verbindungen der Formel (Ia)

abspaltet, diese in der oben angegebenen Weise mit weiteren Verbindungen der allgemeinen Formel (III), die sich von den zunächst eingeführten unterscheiden, umsetzt und gegebenenfalls diese Reaktionssequenz zu Einführung weiterer von

S

II den eingeführten Resten verschiedener Reste Ar-X-NH-C wiederholt,

und daß man verbleibende Schutzgruppen gegebenenfalls abspaltet.

Die erfindungsgemäßen Konjugate können beispielsweise hergestellt werden durch Verknüpfung von Hydroxy- oder Aminogruppen tragenden Cytostatika-Derivaten (z.B. Batracylin, Chinolone oder Camptothecine) mit aktivierten Carboxyl- komponenten, die ihrerseits Teile von geschützten Aminosäuren, Peptiden oder N-thiocarbonyl-modifizierten Peptiden darstellen können.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) sind zugänglich, indem man nach üblichen Methoden der Peptidchemie gegebenenfalls geschützte Aminosäurebau¬ steine an Amino- oder Hydroxyfunktionen von C anknüpft und gegebenenfalls durch schrittweise Einführung weiterer Aminosäurebausteine eine Peptidkette auf- baut. Alternativ können auch gegebenenfalls Schutzgruppen tragende Peptid-Bau- steine nach üblichen Methoden mit C verknüpft werden.

Die Reaktionen können bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhältnissen, beispielsweise 0,5 bis 2 bar, bzw. -30 bis +100°C, in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloro- form, niederen Alkoholen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der ge¬ nannten Lösungsmittel durchgeführt werden. In der Regel sind Reaktionen in DMF oder THF/Dichlormethan bei Normaldruck und bei einer Temperatur von 0 bis 60°C, insbesondere bei etwa Raumtemperatur, bevorzugt.

Für die Aktivierung der Carboxylgruppen kommen die in der Peptidchemie be- kannten Kupplungsreagenzien wie sie z.B. in Jakubke/Jeschkeit: Aminosäuren,

Peptide, Proteine; Verlag Chemie 1982 oder Tetrahedr. Lett. 34, 6705 (1993) be¬ schrieben sind, in Frage. Bevorzugt sind beispielsweise Säurechloride, N-Carbonsäureanhydride oder gemischte Anhydride.

Weiterhin bevorzugt zur Aktivierung der Carboxylgruppen ist die Bildung von Addukten mit Carbodiimiden z.B. N,N'-Diethyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclo-

hexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-Hydrochlorid, N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-tolu olsulfonat, oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1 ,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l ,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-Butyl-5-methyI-isoxa- zolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxycarbonyl-

1,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroform, oder BenzotriazoIyloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorop hosphat, 1-Hydroxybenzotriazol oder Hydroxysuccinimidester.

Als Basen können beispielsweise Triethylamin, Hünig-Base, Ethyl-diisopropyl- amin, Pyridin, N,N-Dimethylaminopyridin oder andere eingesetzt werden.

Als Schutzgruppen für eventuelle weitere reaktive Funktionen im Cytostatikum- Teil oder für Drittfunktionen der Aminosäuren können die in der Peptidchemie bekannten Schutzgruppen beispielsweise vom Urethan-, Alkyl-, Acyl-, Ester- oder Amid-Typ eingesetzt werden.

Aminoschutzgruppen im Rahmen der Erfindung sind die üblichen in der Peptid¬ chemie verwendeten Aminoschutzgruppen.

Hierzu gehören bevorzugt: Benzyloxycarbonyl, (Cbz) 3,4-Dimethoxybenzyl- oxycarbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxy- carbonyl, 2-Nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Ethoxy- carbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, (Boc) Allyloxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, 3,4,5- Trimethoxybenzyloxycarbonyl, Phthaloyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, 2,2,2-Tri- chlor-tert-butoxycarbonyl, Menthyloxycarbonyl, 4-Nitrophenoxycarbonyl, Fluor- enyl-9-methoxycarbonyl (Fmoc), Formyl, Acetyl, Propionyl, Pivaloyl, 2-Chlor- acetyl, 2-Bromacetyl, 2,2,2-Trifluoracetyl, 2,2,2-Trichloracetyl, Benzoyl, Benzyl,

4-Chlorbenzoyl, 4-Brombenzoyl, 4-Nitrobenzoyl, Phthalimido, Isovaleroyl oder Benzyloxymethylen, 4-Nitrobenzyl, 2,4-Dinitrobenzyl, 4-Nitrophenyl oder 2-Nitro- phenylsulfenyl. Besonders bevorzugte Schutzgruppen sind Fmoc, Boc und Cbz.

Die Abspaltung von Schutzgruppen in den entsprechenden Reaktionsschritten kann zum Beispiel durch Säure- oder Baseneinwirkung, hydrogenoly tisch oder auf andere Weise reduktiv erfolgen.

Biologische Testung

1. Wachstumsinhibitionstest zur Bestimmung der cytotoxischen Eigen¬ schaften

Die humanen Dickdarmtumorzellinien SW 480 und HT 29 (ATCC-Nr. CCL 228 und HBT-38) sowie die Maus-Melanom-Zellinie B16F10 wurden in Rouxschalen in RPMI 1640 Medium unter Zusatz von 10 % FCS gezogen. Anschließend wurde trypsiniert und in RPMI plus 10 % FCS zu einer Zellzahl von 50.000 Zellen/ml aufgenommen. 100 μl Zellsuspension/Well wurden in eine 96 Mi krowell platte gegeben und 1 Tag bei 37°C im C0 ₉ -Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden weitere 100 μl RPMI Medium und 1 μl DMSO mit den Prüfsubstanzen zugesetzt.

Das Wachstum wurde nach Tag 3 und Tag 6 überprüft. Dazu wurde zu jedem

Mikrowell 40 μl MTT-Lösung (3-(4,5-DimethyIthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolin- bromid) mit einer Ausgangskonzentration von 5 mg/ml H.,0 zugesetzt. Es wurde

5 Stunden im C0 ₂ -Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Medium abgesaugt und 100 μl i-Propanol/Well zugesetzt. Nach 30 min. Schütteln mit 100 μl H ₂ 0 wurde die Extinktion bei 540 nm mit einem Titertek Multiskan

MCC/340 (Flow) gemessen.

Die cytotoxische Wirkung ist in der Tabelle 1 als IC ₅₀ -Wert jeweils für die SW 480- und HT 29- und B16F10-Zellinie angegeben:

Tabelle 1:

IC ₅₀ / μM IC ₅₀ / μM IC ₅₀ / μM

Beispiel SW 480 HT 29 B16F10

1.2) 25 40 -

1.3) 45 70 -

1.4) 40 40 30

1.5) 250 400 -

1.6) 550 800

^"

eispi ιc ₅ o μM IC ₅₀ / μM

B el ιc ₅₀ / μM

SW 480 HT 29 B 16F10

2.1) 20 9 9

2.2) 15 6 4

2.3) 0,9 0,7 0,2

2.4) 0,8 0,9 1

2.5) 200 > 200 200

2.6) 0,2 0,3 0,06

2.8) 0,2 o,ι 0,1

2.9) 2 2 1

2.10) 2 2 0,4

2.11) 60 150 30

3) 3 2 1

4.1) 0,01 0,02 o,ι

4.2) 0,07 0,06 0,3

4.3) 0,02 0,02 o,ι

4.4) 0,3 0,2 0,6

4.5) 0,3 0,2 0,8

4.6) 0,2 0,15 0,5

4.7) 0,1 0,06 0,3

4.8) 0,3 0,15 0,8

4.9) 0,02 0,015 0,2

4.10) 0,02 0,01 0,2

4.1 1) 0,06 0,03 0,2

4.12) 0,04 0,03 0,2

4.13) 0,06 0,04 0,2

4.14) 0, 16 0,075 0,75

1

13 -

Beispiel ιc ₅₀ / μM ιc ₅₀ / μ ιc ₅₀ / μ

SW 480 HT 29 B16F10

4.15) 0,09 0,06 0,2

4.16) 0,15 0,12 0,6

4.17) 0,3 0,17 0,8

4.18) 0,3 0,12 0,4

4.19) 0,08 0,04 0,4

4.20) 0,07 0,06 0,3

4.21) 0,7 0,3 3

4.22) 0,04 0,04 0,1

4.23) 0,08 0,07 0,15

5.1) 0,025 0,02 0,05

5.2) 0,5 0,3 0,9

6) 0,005 0,003 0,015

7) 0,06 0,08 1

8) 0,15 0,2 3,0

2. Hämatopoetische Aktivität von Konjugaten im Vergleich zum zugrundeliegenden Wirkstoff

Material und Methoden:

Knochenmarkzellen wurden aus dem Femur der Maus gespült. 10 ⁵ -Zellen werden in McCoy 5A-Medium (0,3 % Agar) zusammen mit rekombinanten murinen GM-

CSF (Genzyme; Stammzellen-Kolonienbildung) und den Substanzen (10 ^"4 bis 100 μg/ml) bei 37 °C und 7 % CO ₂ inkubiert. 7 Tage später wurden die Kolonien (<50 Zellen) und Kluster (17-50 Zellen) ausgezählt.

Ergebnisse: Wie in Tabelle 2 dargestellt zeigen die untersuchten Konjugate eine gegenüber dem zugrundeliegenden Wirkstoff eine drastisch verminderte Hemmung der Knochenmarkstammzellproliferation.

Tabelle 2: Hemmung der CSF-induzierten Proliferation von Knochenmark¬ stammzellen der Maus

Beispiel IC ₅₀ [ng/ml]

Chinolon-a 0,2

2.4) 60,0

Camptothecin 0,4

4.4) 10

4.9) 22

In-vivo-Hemmung des Tumorwachstums im Nacktmaus-Modell

Material:

Für alle in-vivo-Experimente zur Untersuchung der Hemmung des Tumorwachs¬ tums wurden athymische Nacktmäuse (NMRI nu/nu-Stamm) verwendet. Das aus¬ gewählte großzellige Lungenkarzinom LXFL 529 wurde durch serielle Passage in

Nacktmäusen entwickelt. Der menschliche Ursprung des Tumors wurde durch iso- enzymatische und immunohistochemische Methoden belegt.

Experimenteller Aufbau:

Der Tumor wurde subcutan in beide Flanken von 6 bis 8 Wochen alten nu/nu- Nacktmäusen implantiert. Die Behandlung wurde, abhängig von der Verdopplungs¬ zeit, gestartet sobald die Tumoren einen Durchmesser von 5-7 mm erreicht hatten. Die Mäuse wurden der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe (5 Mäuse pro Gruppe mit 8-10 auswertbaren Tumoren) durch Randomisieren zugeteilt. Die einzelnen Tumoren der Kontrollgruppe wuchsen alle progressiv.

Die Größe der Tumoren wurde in zwei Dimensionen mittels Schieblehre vermessen. Das Tumorvolumen, das gut mit der Zellzahl korreliert, wurde anschließend für alle Auswertungen verwendet. Das Volumen wurde gemäß der Formel "Länge x Breite x Breite / 2" berechnet ([a x b ² ] / 2, a bzw. b stehen für zwei rechtwinklig angeordnete Durchmesser).

Die Werte des relativen Tumorvolumens (RTV) wurden für jeden einzelnen Tumor durch Dividieren der Tumorgröße am Tag X mit der Tumorgröße des Tages 0 (zum Zeitpunkt der Randomisierung) berechnet. Die mittleren Werte des RTV wurden dann für die weitere Auswertung verwendet.

Die Hemmung der Zunahme des Tumorvolumens (Tumorvolumen der Test- gruppe / Kontrollgruppe, T/C, in Prozent) war der abschließende Meßwert.

Behandlung:

Die Applikation der Verbindungen erfolgte an Tag 1, 2 und 3 nach Randomisie¬ rung intraperitoneal (i.p.).

Ergebnisse: Anhand der Verbindung aus Beispiel 4.4) ist die therapeutische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Konjugate gegenüber dem großzelligen humanen Lungen- tumorxenografts LXFL 529 dargestellt. Die Therapie führt bei der maximal tolerablen Dosis (MTD) und bei der Hälfte der MTD zu Tumorremissionen.

Tabelle 3:

Dosis Oberlebens¬ Zahl der relatives relatives

Therapie ht [mg/kg/Tag] zeit Tumore Tumorvolumen Köipergewic [Tage] [Tag 21] an Tag 21 an Tag 21 [% des Tags 0] [% des Tags 0]

>39 35

Kontroll¬ gruppe - 35 >18 16 1137 1 11,6 >35

7 >43

Beispiel 6,25 4.4) (MTD) >43 >43 9 0,2 1 13,0 >43

Beispiel >43 >43 4.4) 3,125 7 69,5 105,8 >43 >43

Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen sowohl in-vitro als auch in-vivo eine überraschen starke cytotoxische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen

Tumoren, insbesondere solchen der Lunge und des Dickdarms, verbunden mit einer großen Selektivität gegenüber nicht malignen Zellen auf.

Sie eignen sich daher zur Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere von solchen der Lunge und des Dickdarms.

Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nicht-toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder meh¬ rere erfindungsgemäße Verbindungen enthalten oder die aus einem oder mehreren erfindungsgemäßen Wirkstoffen bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.

Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls in einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.

Die therapeutisch wirksamen Verbindungen sollen in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise von etwa 0,5 bis 95 Gew.-%, der Gesamtmischung vor¬ handen sein.

Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfin¬ dungsgemäßen Verbindungen auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.

Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinär¬ medizin als vorteilhaft erwiesen, den oder die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in Gesamtmengen von etwa 0,5 bis etwa 500, vorzugsweise 5 bis 100 mg/kg Körper¬ gewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzie¬ lung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den oder die erfindungsgemäßen Wirkstoffe vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbesondere 3 bis 30mg/kg Körpergewicht.

Synthesebeispiele

Alle Thiocarbonyl-Aminosäure- bzw. Thiocarbonyl-Peptidkonjugate, die Gegen¬ stand dieser Erfindung sind, werden nach der folgenden allgemeinen Vorschrift synthetisiert:

Eine Lösung von 1 mmol des zugrundeliegenden Aminosäure- bzw. Peptid- konjugats in 50 ml absolutem Dimethylformamid wird mit je 1,1 mmol des entsprechenden Isothiocyanats pro freier Aminogruppe versetzt. Nach Zugabe von 1,74 ml (10 mmol) Ethyldiisopropylamin wird der Ansatz bei Raumtemperatur gerührt bis sich im Dünnschi chtchromatogramm kein Aminosäure- bzw. Peptid- konjugat mehr nachweisen läßt, längstens jedoch 16 h. Man engt i. Vak. ein und reinigt den Rückstand nach Trocknung i. Hochvak. durch Flash-Chromatographie an Kieselgel z.B. mit einem Ethylacetat / Petrolether- oder einem Dichlormethan / Methanol-System. Auch mehrmaliges Umfallen aus Dichlormethan / Methanol 1 : 1 (v/v) mit Diethylether ergibt vielfach reine Produkte.

Verbleibende Schutzgruppen werden anschließend in einer zweiten Stufe nach literaturbekannten Verfahren entfernt (eine Fluorenyl-9-methoxycarbonyl-Gruppe z.B. mit Piperidin in absolutem Dimethylformamid bei Raumtemperatur; eine tert- Butoxycarbonyl-Gruppe z.B. mit Trifluoressigsäure in absolutem Dichlormethan bei Raumtemperatur).

Die entsprechenden Isothiocyanate sind im Chemikalienfachhandel zu erwerben oder werden nach literaturbekannten Methoden synthetisiert.

SynthesebeispieleVorstufen: Aminosäure- bzw Peptidkonjugate

Beispiel 1.1

N-[N ^R -(FIuorenyl-9-methoxycarbonyI)-Iysyl]-batracylin, Trifluoracetat

1.1. a) N-[N ^α -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^ε -(fluorenyI-9-methoxycarbonyl)- lysyl]- batracylin:

N ^α -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^ε -(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysin (5,3 g,

1 1,3 mmol) und 2-Isobutoxy-l-isobutoxycarbonyl-l,2-dihydro-chinolin (4 ml,

14 mmol) werden in 40 ml Dichlormethan gelost Nach 20 min Ruhren bei Raum- temperatur setzt man eine Losung von Batracylin (2,5 g, 10 mmol) in Dimethyl¬ formamid (80 ml) zu und rührt den Ansatz für weitere 24 h bei Raumtemperatur Anschließend wird im Vakuum eingeengt bis Kristallisation einsetzt Die erhaltene Suspension wird mit Ethanol (500 ml) versetzt und für 1 h unter Rückfluß gekocht Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird das Produkt abfiltriert und mit Aceton und dann mit Diethylether gewaschen Man erhalt gelbe Kristalle

(5,9 g, 84 %) [DC (Ethylacetat) R _{ = 0,57, Schmp = 158 °C (Zers )]

1.1) N- [N ^ε -(FIuorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-batracyIin, Trifluoracetat:

Eine Suspension der obigen Verbindung (5,6 g, 8 mmol) in Dichlormethan (75 ml) wird mit wasserfreier Trifluoressigsaure (25 ml) versetzt und die resultierende

Losung für 90 min bei Raumtemperatur gerührt Nach Einengen im Vakuum wird der Ruckstand durch Zugabe von Diethylether (200 ml) kristallisiert Der Nieder¬ schlag wird abfiltriert und intensiv mit Diethylether gewaschen Nach mehr¬ maligem Umfallen aus Dichlormethan/Methanol 1.1 mit Diethylether erhält man gelb-orange Kristalle (5,13 g, 90 %) [DC (Ethylacetat) R _f = 0,05; Schmp. = 162 °C (Zers )].

Beispiel 1.2

N-[Seryl-D-alanyI]-batracylin, Trifluoracetat

I.2.a) N-[N-Benzyloxycarbonyl-D-alanyl]-batracylin:

N-Benzyloxycarbonyl-D-alanin (3,9 g, 17,5 mmol) wird in Analogie zu Beispiel I 1 a mit Batracylin (4,1 g, 16,4 mmol) umgesetzt Nach Einengen im Vakuum auf 50 ml wird mit Ethylacetat auf 300 ml aufgefüllt und sofort für 10 min zum Sieden erhitzt Anschließend läßt man auf Raumtemperatur abkühlen, filtriert ab und kocht das Filtergut erneut mit Ethylacetat (200 ml) aus Abkühlung unter Rühren auf 0 °C und Filtration ergibt gelbe Kristalle Die Kristalle (6,4 g, 80 %) werden durch Filtration abgetrennt und die vereinigten Filtrate nach Einengen im Vakuum durch Flashchromatographie [Petrolether/Ethylacetat 3 2 - 1 1] gereinigt Man erhält weitere 1,35 g (17 %) [DC (Ethylacetat)- Rf = 0,45, Schmp = 256 °C, [α] ²⁰ = +75,1° (c = 1,0 / CH ₂ C1 ₂ + 0,5 % CH ₃ OH)]

I.2.b) N-[D-AlanyI]-batracylin:

Verbindung 1.2 a (1 1,4 g, 25 mmol) wird in einer 33%-igen Losung von Brom¬ wasserstoff in Eisessig (100 ml) gelost Nach 30 min bei Raumtemperatur wird der Ansatz im Vakuum auf 30 ml eingeengt und anschließend unter kraftigem Ruhren in gesattigte Natriumhydrogencarbonat-Losung (1000 ml) gegossen Man

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rührt für 10 min. weiter, filtriert ab und wäscht mit Wasser, wenig Isopropanol und Diethylether. Das Produkt fällt in gelben Kristallen (7,87 g, 98 %) an [DC (Ethylacetat): R _f = 0,06; Schmp. = 267 °C (Zers.)].

I.2.c) N-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-seryl-D-alanyl]-batracylin:

Darstellung in Analogie zu Beispiel I.l.a aus N-(tert-Butoxycarbonyl)-serin und N-

[D-Alanyl]-batracylin (Beispiel I.2.b); Ausb.: 77 %.

1.2) N-[Seryl-D-alanyl]-batracylin, Trifluoracetat:

Darstellung in Analogie zu Beispiel 1.1 aus Verbindung I.2.c; Ausb.: 98 %.

Beispiel 1.3

N-[N ^ε -(FIuorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyI-D-aIanyl]-chinolo n-a,

Trifluoracetat

1.3.a) N-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-D-alanyl]-chinolon-a:

N-(tert-Butoxycarbonyl)-D-alanin (3,6 g, 19,2 mmol) und 2-Isobutoxy-l-isobutoxy- carbonyl-l,2-dihydro-chinolin (5,8 g, 19,2 mmol) werden in 200 ml Dimethylform¬ amid gelöst. Nach 8 h Rühren bei Raumtemperatur setzt man Chinolon-a (4 g, 9,6 mmol) und Ethyldiisopropylamin (3,3 ml) zu und behandelt den Ansatz 10 h mit Ultraschall. Man engt ein, nimmt den Rückstand in Dichlormethan auf und fällt mit Ether. Nach Filtration, Waschen mit Ether und Trocknen im Hochvakuum erhält man 4,58 g (81 %) vom Zielprodukt, welches ohne weitere Reinigung um¬ gesetzt wird.

I.3.b) N-[D-Alanyl]-chinoIon-a, Trifluoracetat:

4,56 g (7,75 mmol) der Verbindung aus obigem Beispiel werden in einer Mi¬ schung aus Dichlormethan (50 ml) und wasserfreier Trifluoressigsäure (50 ml) bei 0 °C gelöst und 1 h bei dieser Temperatur gerührt. Man engt ein, destilliert mit Dichlormethan nach und fällt den Rückstand aus Methanol mit Diethylether um. Man erhält 4,07 g (87 %) des kristallinen Zielproduktes [DC (Aceto- nitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): R _f = 0,34].

I.3.c) N-[N ^α -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^ε -(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)- lysyl-D-alanyl]-chinolon-a:

N ^α -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^ε -(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysin (1,57 g, 3,36 mmol) wird in Dimethylformamid (25 ml) gelöst und bei 0 °C mit N-

Hydroxysuccinimid (600 mg, 5,04 mmol) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (820 mg, 4,03 mmol) versetzt. Nach 3 h filtriert man den entstandenen Harnstoff ab, gibt zum Filtrat 1,5 g (2,86 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1.3.b) und rührt 16 h bei Raumtemperatur. Restlicher Harnstoff wird abfiltriert und das Filtrat durch Flash-Chromatographie [Dichlormethan/Methanol 97,5 :2,5 → 90: 10] gereinigt. Anschließend fällt man aus Dichlormethan/Methanol 1 : 1 mit Diethyl¬ ether um. Ausb.: 1,5 g (56 %) [DC (Dichlormethan/Methanol 9: 1): R _f = 0,47].

1.3) N-[N ^ε -(FluorenyI-9-methoxycarbonyI)-lysyI-D-aIanyl]- chinolon-a, Trifluoracetat

Abspaltung der tert-Butoxycarbonyl-Gruppe aus Verbindung I.3.c in Analogie zu Beispiel I.l und Umfällung des Rohproduktes aus Methanol mit Diethylether ergibt gelbe Kristalle. Ausb.: 80 % [DC (Dichlormethan/Methanol/Ammoniak (17 %ig) 15:4:0,5): R _f = 0,36].

Beispiel 1.4

20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyι)-lysyl-aIanyl]-camptoth ecin, Trifluoracetat

CF ₃ COOH

I.4.a) 20-O-(Alanyl)-camptothecin, Trifluoracetat:

Camptothecin (500 mg, 1,44 mmol) werden in absolutem Dimethylformamid (20ml) gelöst und dann mit 4-Dimethylaminopyridin (50 mg) und N-tert-Butoxy- carbonyl-alanin-N-carboxy-anhydrid (775 mg, 3,6 mmol) versetzt. Nach 3 h werden weitere 775 mg (3,6 mmol) N-tert-Butoxycarbonyl-alanin-N-carboxy- anhydrid zugegeben und die Suspension 16 h mit Ultraschall behandelt. Man engt ein, nimmt das Rohmaterial in Dichlormethan (50 ml) auf und gibt bei 0 °C 5 ml Trifluoressigsäure zu. Nach 30 min. Rühren wird erneut eingeengt und das Produkt durch Flash-Chromatographie gereinigt (Acetonitril/Wasser 20: 1). Die entsprechen- den Fraktionen werden gesammelt, eingeengt und nach Lösen in Dioxan/Wasser

lyophilisiert. Man erhält 712 mg (93 %) der Ziel Verbindung [FAB-MS: m/z = 420 (M+H) ⁺ ],

1.4) 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-alanyl]- camptothecin, Trifluoracetat:

Das Konjugat aus Beispiel I.4.a wird nach Standard-Vorschrift (siehe Beispiel I. l.a) mit N ^α -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^ε -(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysin ver¬ knüpft und anschließend in Analogie zu Beispiel I.l an der α-Aminofunktion de¬ blockiert. Man erhält die Zielverbindung in einer Ausbeute von 24% [DC (Aceto- nitril/Wasser 20:1): R _f - 0,15].

Beispiel 1.5

7-Ethyl-20-O-(lysyl-alanyl)-camptothecin, Di-Trifluoracetat

I.5.a) 7-Ethyl-20-O-[N-(tert-butoxycarbonyl)-alanyl]-camptothecin:

Eine Lösung von 1,88 g (5,0 mmol) 20(S)-7-Ethyl-camptothecin (S. Sawada et al., Chem.Pharm.Bull. 39 (1991) 1446-1454) in 100 ml absolutem Dimethylformamid wird unter Rühren mit 2,15 g (10,0 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-alanin-N- carbonsäureanhydrid sowie 150 mg (1,2 mmol) 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin versetzt. Nach 3 h bei Raumtemperatur setzt man weitere 2,15 g (10,0 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-alanin-N-carbonsäureanhydrid und 150 mg (1,2 mmol) 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin zu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur.

Anschließend wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Flash¬ chromatographie [Petrolether/Ethylacetat 2:1 — > 1 : 1 — > Ethylacetat] gereinigt. Man

erhalt 2,02 g (73,8 %) an farblosen Kristallen [DC (Ethylacetat) R ₍ - 0,56, Schmp = 206-212°C, FAB-MS m/z = 548 (M+rf )]

1.5. b) 20-O-Alanyl-7-ethyl-camptothecin, Trifluoracetat:

Eine Losung von Verbindung 1 5 a (1,81 g, 3,3 mmol) in einer Mischung aus 70 ml Dichlormethan und 7 ml wasserfreier Trifluoressigsaure wird für 90 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen im Vakuum auf ein kleines Volumen wird das Produkt mit Diethylether ausgefallt und grundlich mit Diethylether gewaschen Man erhalt 1,34 g (72,3 %) an hellgelben Kristallen [DC (Ethylacetat) R _t = 0,05, Schmp = 242°C (Zers )]

I.5.c) 7-Ethyl-20-O- [N ^α ,N ^ε -di-(tert-butoxycarbonyl)-IysyI-aIanyl]- camptothecin:

1,57 g (4,55 mmol) N,N-Di-(tert-butoxycarbonyl)-lysin und 923 mg (6,83 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat werden in 35 ml Dimethylformamid gelost Nach Zugabe von 1,09 g (5,7 mmol) N-Ethyl-N'-(dimethylamιnopropyl)-carbodi- imid Hydrochlorid und 990 μl (5,7 mmol) Ethyl-diisopropylamin rührt man für

30 min bei Raumtemperatur Anschließend setzt man eine Losung aus Verbindung 1 5 b (1,3 g, 2,32 mmol) in 35 ml Dimethylformamid und 408 μl (2,32 mmol) Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raum¬ temperatur Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromato- graphie [Petrolether/Ethylacetat 2 1 — > 1 1 - Ethylacetat] erhalt man hellgelbe

Kristalle Ausb 1,38 g (75,3 %) [DC (Ethylacetat). R _f = 0,53, Schmp - 125°C (Zers )]

1.5) 7-EthyI-20-O-(lysyl-alanyι)-camptothecin, Di-Trifluoracetat:

Eine Suspension der obigen Verbindung (1,18 g, 1,5 mmol) in Dichlormethan (50 ml) wird mit wasserfreier Trifluoressigsaure (5 ml) versetzt und die resultie¬ rende Losung für 1 h bei Raumtemperatur gerührt Nach Einengen auf ein kleines Volumen im Vakuum wird das Produkt durch Zugabe von Diethylether ausgefallt Der Niederschlag wird abfiltriert und aus Ethylacetat umkristalhsiert Man erhalt 862 mg (71,5 %) an gelben Kristallen [DC (Ethylacetat) R _f = 0,05, Schmp = 137°C (Zers )]

Beispiel 1.6:

7-lN ^e -[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L-valyIoxymethy l)-camptothecin, Trifluoracetat

I.6.a) 7-Hydroxymethyl-camptothecin:

Diese Verbindung wird nach der Vorschrift von Miyasaka et al (Chem Pharm

Bull 39 (1991) 2574) hergestellt

I.6.b) 7-L-ValyIoxymethyl)-camptothecin, Trifluoracetat:

1 g (2,64 mmol) 7-Hydroxymethyl-camptothecin werden in 100 ml DMF gelost und dann mit 100 mg 4-N,N-Dimethylaminopyridin und einem Äquivalent N-tert- Butoxycarbonyl-L-valin-N-carboxy-anhydrid versetzt und die Suspension 16 h bei

Raumtemperatur gerührt Man engt ein und reinigt durch Flash-Chromatographie an Ethylacetat/Petrol ether 1 1 und spater 1,5 1 Das gereinigte Material wird in 30 ml Dichlormethan aufgenommen und bei 0°C mit 5 ml Trifluoressigsaure versetzt Nach 30 min Ruhren wird eingeengt und das aminodeblockierte Produkt aus Dichlormethan/Ether gefällt Man erhalt die Zielverbindung in einer

Gesamtausbeute von 55 % [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 1 0,2) R _f = 0,37]

1.6 7-lN ^ε -[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L-valyloxymethy lJ- camptothecin, Trifluoracetat

560 mg des Konjugats aus Beispiel I 6 b werden zu einer Losung aus 560 mg (1,5 Aq ) N ^α , N ^e -bis-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin, 239 mg N-Hydroxybenzo- triazol und 271 mg N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid in 50 ml Dimethylformamid gegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt Man engt ein, nimmt in Dichlormethan auf und extrahiert dreimal mit Wasser Nach Trocknen der organischen Phase wird eingeengt und durch Flashchromatographie (Petrolether/Essigester 1 1 > Essigester) gereinigt

Anschließend wird das erhaltene Produkt in 20 ml Dichlormethan aufgenommen, bei 0°C mit 3 ml Trifluoressigsaure versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt Nach Einengen und Fallen aus Dichlormethan/Ether erhalt man die

Zielverbindung in 62-%iger Ausbeute [DC Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 1 0,2 R, = 0,62]

1.7 10,l l-Methylendioxy-20-O-{N ^ε -[FluorenyI-9-methoxycarbonyl]-lysyl- leucylj-camptothecin, Trifluoracetat

I.7.a) 10,11-Methylendioxy-camptothecin:

Dieses Camptothecin-Derivat wird nach Wall et al (J Med Chem 29 (1986), 2358) aus dem S-konfigurierten, enantiomerenreinen Tricyclus, der z B durch Racematspaltung gewonnen werden kann, hergestellt

I.7.b) 10,1 l-(Methylendioxy)-20-O-leucyl-camptothecin, Trifluoracetat

150 mg (0,382 mmol) 10,11-Methylendioxy-camptothecin werden in 20 ml DMF gelost und dann mit 20 mg 4-N,N-Dimethylaminopyridin und 10 Äquivalenten N-tert -Butoxycarbonyl-L-leucin-N-carboxy-anhydrid versetzt und die Suspension 16 h bei 40°C gerührt. Man engt ein und reinigt durch Flash-Chromatographie an Ethylacetat/Petrol ether 2 1 Das gereinigte Material wird in 15 ml Dichlormethan aufgenommen und bei 0°C mit 2 ml Trifluoressigsaure versetzt Nach 30 min

Ruhren wird eingeengt und das aminodeblockierte Produkt aus Dichlorme¬ than/Methanol mit Ether gefallt Man erhalt die Zielverbindung in einer Gesamt¬ ausbeute von 35 %

I.7.c) 10,U-Methylendioxy-20-O-{N ^e -[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-IysyI- leucylj-camptothecin, Trifluoracetat

Das Konjugat aus Beispiel I 7 b wird nach Standardvorschrift (siehe Beispiel I 1 a mit N ^α -(tert -Butoxycarbonyl)-N ^E -(fluorenyl-9-methoxycarbonyl-)-lysιn verknüpft und anschließend an der α-Aminofunktion durch Einwirkung von Trifluoressig¬ saure deblockiert Ausb 69 % über 2 Stufen [DC Acetomtril/Wasser 10 1 R _f = 0,4]

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Beispiel 1.8

20-O-(Lysyl-aspartyI)-camptothecin, Di-Hydrobromid

I.8.a) 20-O-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-aspartyl-(γ-benzylester)]-cam ptothecin:

Eine Suspension von 5,23 g (15,0 mmol) 20(S)-Camptothecin in 400 ml absolutem Dimethylformamid wird unter Rühren mit 10,45 g (30,0 mmol) N-(tert-Butoxy- carbonyl)-asparaginsäure-(γ-benzylester)-N-carbonsäureanh ydrid sowie 367 mg (3,0 mmol) 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin versetzt. Nach 8 h Rühren bei 60 °C setzt man weitere 5,23 g (15,0 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-asparaginsäure-(γ- benzylester)-N-carbonsäureanhydrid und 183,5 mg (1,5 mmol) 4-(N,N-Dimethyl- amino)-pyridin zu und rührt für drei Tage bei Raumtemperatur. Anschließend wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Flashchromatographie [Petrol- ether/Ethylacetat 1 :2] gereinigt. Man erhält 2,3 g (23,4 %) an orange-gelben Kri¬ stallen [DC (Ethylacetat): R _f - 0,59; Schmp. = 130°C (Zers.)].

I.8.b) 20-O-Aspartyl-(γ-benzylester)-camptothecin, Trifluoracetat:

Eine Lösung von Verbindung I.8.a (2,22 g, 3,4 mmol) in einer Mischung aus 70 ml Dichlormethan und 7 ml wasserfreier Trifluoressigsaure wird für 90 min. bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen im Vakuum auf ein kleines Volumen wird das Produkt mit Diethylether ausgefällt und gründlich mit Diethylether gewaschen. Man erhält 1,08 g (72,3 %) an beigen Kristallen [DC (Ethylacetat): R _f = 0,14, Schmp. = 216°C (Zers.)].

1.8.c) 20-O-[N ,N ^ε -di-(tert-Butoxycarbonyl)-lysyl-aspartyl-(γ-benzylest er)]- camptothecin:

433 mg (1,25 mmol) N,N-Di-(tert-butoxycarbonyl)-lysin und 338 mg (2,50 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von 360 mg (1,88 mmol) N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodi- imid Hydrochlorid und 500 μl (3,0 mmol) Ethyl-diisopropylamin rührt man für 15 min. bei Raumtemperatur. Anschließend setzt man eine Lösung aus Verbindung I.8.b (500,7 mg, 0,75 mmol) in 15 ml Dimethylformamid und 200 μl (1,13 mmol) Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raum- temperatur. Nach Einengen im Vakuum wird der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und die Lösung einmal mit Wasser gewaschen. Man trocknet über MgSO4 und reinigt den nach Einengen im Vakuum verbleibenden Rückstand durch Flashchromatographie [Petrolether/Ethylacetat 1:2] zu beigen Kristallen. Ausb.: 473,8 mg (70,5 %) [DC (Ethylacetat): R _f = 0,42; Schmp. = 99°C (Zers.)].

1.8) 20-O-(Lysyl-aspartyl)-camptothecin, Di-Hydrobromid:

Eine Lösung der obigen Verbindung (462 mg, 0,52 mmol) in Dichlormethan (25 ml) wird mit einer 33%-igen Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure (5 ml) versetzt und die nach wenigen Minuten resultierende Suspension für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Man dekantiert von dem ausgefallenen Produkt ab und wäscht den Rückstand gründlich mit Diethylether. Zur Reinigung wird nach

Lösung in warmem Ethanol durch Zugabe von Diethylether umgefällt. Man erhält 391 mg (100 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril/Wasser 5: 1): R _f = 0,05; Schmp. = 225°C (Zers.)].

Beispiel 1.9

20-O-(Lysyl-seryl)-camptothecin, Di-Hydrobromid

I.9.a) 20-O-[O-BenzyI-N-(tert-butoxycarbonyl)-seryl]-camptothecin:

Eine Suspension von 5,23 g (15,0 mmol) 20(S)-Camptothecin in 400 ml absolutem

Dimethylformamid wird unter Rühren mit 9,64 g (30,0 mmol) O-Benzyl-N-(tert- butoxycarbonyl)-serin-N-carbonsäureanhydrid sowie 367 mg (3,0 mmol) 4-(N,N- Dimethylamino)-pyridin versetzt. Nach 8 h Rühren bei 60 °C setzt man weitere 4,82 g (15,0 mmol) O-Benzyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-serin-N-carbonsäureanhydri d und 183,5 mg (1,5 mmol) 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin zu und rührt für drei

Tage bei Raumtemperatur. Anschließend wird der Ansatz filtriert, das Filtrat im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Flashchromatographie [Petrol- ether/Ethylacetat 2: 1 → 1 : 1 → 1 :2] gereinigt. Man erhält 6,66 g (70,9 %) eines gelben Schaums [DC (Acetonitril Ethylacetat 1 : 1): R = 0,66; FAB-MS: m/z = 626 (M+H ⁺ )].

I.9.b) 20-O-[O-Benzyl-seryl]-camptothecin, Trifluoracetat:

Eine Lösung von Verbindung I.9.a (2,5 g, 4,0 mmol) in einer Mischung aus 20 ml Dichlormethan und 4 ml wasserfreier Trifluoressigsaure wird für 1 h bei Raum¬ temperatur gerührt. Nach Einengen im Vakuum auf ein kleines Volumen wird das Produkt mit Diethylether ausgefällt und gründlich mit Diethylether gewaschen. Man erhält 2,51 g (98,1 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 : 1): R _f = 0,17; Schmp. = 198°C (Zers.)].

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1.9.c) 20-O-[N ^α ,N ^F -di-(tert-Butoxycarbonyl)-Iysyl-(O-benzyI)-seryl]- camptothecin:

1,73 g (5,0 mmol) N,N-Di-(tert-butoxycarbonyl)-lysin und 1,35 g (10 mmol) 1- Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von 1,44 g (7,5 mmol) N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid

Hydrochlorid und 2,0 ml (12 mmol) Ethyl-diisopropylamin rührt man für 15 min. bei Raumtemperatur. Anschließend setzt man eine Lösung aus Verbindung I.9.b (1,92 g, 3,0 mmol) in 50 ml Dimethylformamid und 790 μl (4,5 mmol) Ethyl¬ diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raumtemperatur. Nach Einengen im Vakuum wird der Rückstand durch Flashchromatographie

[Petrolether/Ethylacetat 3: 1 — » 1 : 1 -> 1 :3] zu gelben Kristallen gereinigt. Ausb.: 2,32 g (89,1 %) [DC (Ethylacetat): R _f = 0,45; Schmp. = 130°C (Zers.)].

1.9) 20-O-(Lysyl-seryl)-camptothecin, Di-Hydrobromid:

Eine Lösung der obigen Verbindung (2,13 g, 2,46 mmol) in Dichlormethan (120 ml) wird mit einer 33%-igen Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure

(25 ml) versetzt und die nach wenigen Minuten resultierende Suspension für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Man dekantiert von dem ausgefallenen Produkt ab und wäscht den Rückstand gründlich mit Diethylether. Zur Reinigung wird nach Lösung in Dichlormethan/Methanol 1 : 1 durch Zugabe von Diethylether umgefällt. Man erhält 1,78 g (100 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril/Wasser 5: 1):

R _f - = 0,05].

Beispiel 1.10

7-Ethyl-20-O-[N ^ε -(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in, Trifluoracetat

1.10.a) 20-O-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-vaIyl]-7-ethyI-camptothecin:

Die Verbindung wird unter Verwendung des in I.5.a beschriebenen Verfahrens aus 1,88 g (5,0 mmol) 20(S)-7-Ethyl-camptothecin (S. Sawada et al., Chem. Pharm. Bull. 39 (1991) 1446-1454) und 2,43 g (10,0 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)- valin-N-carbonsäureanhydrid hergestellt. Man erhält 1,46 g (51 %) an beigen Kristallen [DC (Acetonitril): R _f = 0,86; Schmp. = 224-227°C (Zers.); FAB-MS: m/z = 576 (M+FT)].

I.lO.b) 7-Ethyl-20-O-valyl-camptothecin, Trifluoracetat:

Aus Verbindung I.lO.a (1,44 g, 2,5 mmol) wird wie unter I.5.b beschrieben die N-

(tert-Butoxycarbonyl)-Gruppe abgespalten. Man erhält 626 mg (43 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril): R _f = 0,45; Schmp. = 160°C (Zers.)].

I.lO.c) 20 -O - [ N ^α - (tert-Bu to xy ca rb o nyI)- N ^ε - (fI u o r e n yl - 9 - methoxycarbonyl)-lysyl-valyI]-7-ethyl-camptothecin:

In Analogie zu 1.5. c werden 797 mg (1,7 mmol) N ^α -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^ε -

(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysin mit Verbindung I.lO.b (590 mg, 1,0 mmol) umgesetzt. Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromato¬ graphie [Petrolether/Ethylacetat 1 :2] erhält man beige Kristalle. Ausb.: 287 mg (31 %) [DC (Ethylacetat): R _f = 0,50; Schmp. = 172°C (Zers.)].

1.10) 7-Ethyl-20-O-[N ^f -(fIuorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-vaIyl]- camptothecin, Trifluoracetat:

Obige Verbindung (277,8 mg, 0,3 mmol) wird wie beschrieben mit Trifluoressig¬ saure in Dichlormethan entschutzt Man erhalt 209 mg (74 %) an gelben Kristallen [DC (Ethylacetat). R _f = 0,06, Schmp = 199°C (Zers.)]

Beispiel 1.11

7-Ethyl-20-O-[N ^ε -(fluorenyI-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-10-hydroxy - camptothecin, Trifluoracetat

I.ll.a) 20-O-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-valyI]-7-ethyI-10-hydroxy- camptothecin:

Die Verbindung wird unter Verwendung des in I 5 a beschriebenen Verfahrens aus 392,4 mg (1,0 mmol) 20(S)-7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin (S Sawada et al , Chem Pharm Bull 39 (1991) 3183-3188) und insgesamt 2,43 g (10,0 mmol) N- (tert-Butoxycarbonyl)-valin-N-carbonsaureanhydrid innerhalb von 6 Tagen her¬ gestellt Man erhalt nach Flash-Chromatographie [Petrolether/Ethylacetat 5 1 -> 2 1 -> 1 1] 353 mg (45 %) an hellgelben Kristallen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 1) R _f = 0,63, Schmp = 95-97°C]

1.1 l.b) 7-Ethyl-10-hydroxy-20-O-valyl-camptothecin, Trifluoracetat:

Aus Verbindung l i l a (340 mg, 0,43 mmol) wird wie unter I 5 b beschrieben die

N-(tert-Butoxycarbonyl)-Gruppe abgespalten Man erhalt 255 mg (98 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 1) R _t = 0,04, Schmp = 189°C (Zers )]

I.ll.c) 20-O-[N ^α -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^ε -(fluorenyl-9- methoxycarbonyl)-lysyl-valyI]-7-ethyl-10-hydroxy-camptotheci n:

In Analogie zu I.5.C werden 562,3 mg (1,2 mmol) N -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^ε - (fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysin mit Verbindung 1.11.b (242,2 mg, 0,4 mmol) umgesetzt. Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromato¬ graphie [Petrolether/Ethylacetat 5:1 -> 3:1 -> 1:1] erhält man gelbe Kristalle. Ausb.: 251 mg (67%) [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1:1): R _f = 0,68; Schmp. = 163°C (Zers.)].

1.11) 7-Ethyl-20-O-[N ^ε -(fIuorenyI-9-methoxycarbonyl)-Iysyl-valyl]-10- hydroxy-camptothecin, Trifluoracetat:

Obige Verbindung (244,9 mg, 0,26 mmol) wird wie beschrieben mit Trifluoressig¬ saure in Dichlormethan entschützt. Man erhält 115 mg (46 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1:1): R _f = 0,05; Schmp. = 196°C (Zers.)].

Beispiele 1.1 - 1.3

Konjugate des Batracylins mit einer Aminosäure; allgemeine Formel:

1.1) N-[N-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-D-alanyl]- batracylin

Edukt: N-(D-alanyl)-batracylin Ausb.: 76 % [DC (Ethylacetat/Eisessig 100:1): R _f = 0,53; Schmp.: 185 °C]

1.2) N-[N ^α -(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-Iysyl]-batracyli n

Edukt: N-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-batracylin, Trifluor¬ acetat

Ausb.: 68 % über 2 Stufen [DC (Dichlormethan/Methanol 5:1): R _f = 0,31; Schmp.: 162 °C (Zers.)]

1.3) N-[N ^ε -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl]-batracyIi n

Edukt: N-[N ^α -(tert-Butoxycarbonyl)-lysyl]-batracylin

Ausb.: 71% über 2 Stufen [DC (Dichlormethan/Methanol 5:1): R, = 0,30;

Schmp.: 162 °C (Zers.)]

Beispiele 1.4 - 1.8

Konjugate des Batracylins mit zwei Aminosäuren; allgemeine Formel:

1.4) N-[N ^α -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-D-alanyl]- batracylin Edukt: N-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-D-alanyl]-batracy lin,

Trifluoracetat,

Ausb.: 70 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): R _f =

0,36]

1.5) N-[N-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-seryI-D-alanyl]- batracylin

Edukt: N-(Seryl-D-alanyl)-batracylin, Trifluoracetat

Ausb.: 45 % [DC (Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 17 %-ig 15:2:0,2):

R _f - 0,32]

1.6) N-[N-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyI)-glutamyl-D-alanyl] - batracylin

Edukt: N-(Glutamyl-D-alanyl)-batracylin Ausb.: 70 % [DC (Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 17 %-ig 15:8:0,8):

R _f - 0,68]

98/15571 35

1.7) N-[N ^α ,N ^ε -bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl- seryl]-batracylin

Edukt N-(Lysyl-seryl)-batracyhn, Di -Trifluoracetat Ausb 46 % [DC (Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 17 %-ig 15 3 0,2)

R _f = 0,24, Schmp 155-157 °C (Zers )]

1.8) N-{N ^α -[N ^α ,N ^ε -bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyI]- α,ß-diaminopropionyl}-batracylin

Edukt N-[N ^α -Lysyl-Nß-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-α,ß-diamιn o- propionyl]-batracylin, Di-Trifluoracetat Ausb 39 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 1 0,2) R _f =

0,54]

Beispiele 2.1 - 2.10

Konjugate des Chinolons-a mit einer Aminosäure; allgemeine Formel:

2.1) N-[N-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyι)-alanyl]- chinolon-a

Edukt N-(Alanyl)-chinolon-a, Trifluoracetat

Ausb 48 % [DC (Acetonitril/Wasser 10 1) R _f = 0,55]

2.2) N-[N-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-D-alanyl]- chinolon-a

Edukt N-(D-Alanyl)-chinolon-a, Trifluoracetat Ausb 61 % [DC (Dichlormethan/Methanol/Eisessig 90 10 1) R _f = 0,38]

2.3) N-[N ^α -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-α,γ-diamino- butyryl]-chinolon-a, Hydrochlorid

Edukt: N-[N ^γ -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)- ,γ-diaminobutyryl]- chinolon-a, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 60 % über 2 Stufen [DC

(Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 17 %-ig 10: 10:3): R _f - 0,51; Schmp.: 221 °C (Zers.)]

Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Wasser suspendiert und der pH-

Wert mit 0,1 N Salzsäure auf 2-3 eingestellt. Nach Filtration wird das Filtrat lyophilisiert.

2.4) N-[N ^α -(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-lysyl]-chinolon- a, Hydrochlorid

Edukt: N-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-chinolon-a,

Trifluoracetat Ausb.: 74 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): R _f =

0,33]

2.5) N-[N ^α ,N ^ε -bis-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-D-lysyl]- chinolon-a

Edukt: N-(D-Lysyl)-chinolon-a, Di-Trifluoracetat Ausb.: 59 % [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): R _f = 0,33; Schmp.

186 °C]

2.6) N-[N ^α -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-ornithyl]- chinolon-a, Hydrochlorid

Edukt: N-[N -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-ornithyl]-chinolon-a, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 47 % über 2 Stufen [DC (Dichlormethan/Methanol/Ammo- niak 17 %-ig 10: 10:3): R _f = 0,36; Schmp.: 211 °C (Zers.)] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Wasser suspendiert und der pH-

Wert mit 0, 1 N Salzsäure auf 2-3 eingestellt. Nach Filtration wird das Filtrat lyophilisiert.

2.7) N-[N ^α -(Phenylamino-thiocarbonγI)-lysyl]-chinolon-a Edukt: N-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-chinolon-a, Trifluoracetat

98/15571 37 -

Ausb. 58 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): R _f = 0,48]

2.8) N-[N ^α -(4-Isothiocyanato-phenylamino-thiocarbonyI)-Iysyl]- chinolon-a Edukt: N-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-chinolon-a,

Trifluoracetat

Ausb.: 73 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): R _f =

0,38]

2.9) N-[N -(4-Carboxy-phenylamino-thiocarbonyI)-lysyl]-chinolon-a Edukt: N-[N*-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-chinolon-a,

Trifluoracetat Ausb.: 62 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 10:3: 1,5):

R _f = 0,6]

2.10) N-[N ^α -(Phenyl-methyl-amino-thiocarbonyI)-lysγl]-chinoIon-a

Edukt: N-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-chinolon-a,

Trifluoracetat

Ausb.: 59 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): R _f ^■

0,44]

Beispiel 2.11

Konjugate des Chinolons-a mit zwei Aminosäuren; allgemeine Formel:

COOH

2.11) N-[N ^α -(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-lysyl-D-aIanyl]- chinolon-a

Edukt: N-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-D-alanyl]-chinolo n-a

Trifluoracetat Ausb.: 53 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2) R _f =

0,33]

Beispiel 3

Konjugate des Doxorubicins; allgemeine Formel:

3) N-[N ^α -(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyI)-lysyI-aIanyI]- doxorubicin

Edukt: N-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-alanyl]-doxorubic in,

Trifluoracetat,

Ausb.: 46 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): R _f =

0,2; FAB-MS: m/z = 894 (M+H) ⁺ ]

98/15571 39 -

Beispiele 4.1 - 4.11

Konjugate des 20(S)-Camptothecins; allgemeine Formel:

4.1) 20-O-[N ^α -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-alanyl]- camptothecin

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-alanyl]-camptothe cin,

Trifluoracetat Ausb.: 80 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2): R _f =

0,32]

4.2) 20-O-[N ^α -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyI-Ieucyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 20-O-[ ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-leucyl]-camptothe cin,

Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 71 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): R _f = 0,48]

Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.

4.3) 20-O-[N ^α -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-Iysyl- phenylalanylj-camptothecin

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-phenylalanyl]- camptothecin, Trifluoracetat

98/15571 40 -

Ausb.: 75 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1 :0,2): R _f =

0,33]

4.4) 20-O-[N ^α -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-IysyI-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 68 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig

5: 1 :0,2): R _f = 0,35; FAB-MS: m/z - 727 (M+H) ⁺ ] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.

4.5) 20-O-[N ^α -(4-Carboxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 79 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig

5:1 :0,2): R _f = 0,46] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.

4.6) 20-O-[N -(4-ChIor-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-valyl]- ca ptothecin, Hydrochlorid Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 86 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig

10:1 :0,1): R _f = 0,24] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyo¬ philisiert.

98/15571 41

4.7) 20~O-[N ^α -(Phenylamino-thiocarbonyl)-Iysyl-valyI]-camptothecin,

Hydrochlorid

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 67 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig

5:1:0,2): R _f = 0,5] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.

4.8) 20-O-[N ^α -(Phenyl-methyl-amino-thiocarbonyI)-lysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 55 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig

5: 1:0,2): R _f = 0,5] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyo- philisiert.

4.9) 20-O-[N ^α ,N ^ε -bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyI)-IysyI- alanyl]-camptothecin

Edukt: 20-O-(Lysyl-alanyl)-camptothecin, Di-Trifluoracetat

Ausb.: 64% [DC (Acetonitril/Wasser 10:1): R _f = 0,72]

4.10) 20-O-[N ^α ,N ^ε -bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyI)-lysyI-D- alanylj-camptothecin

Edukt: 20-O-(Lysyl-D-alanyl)-camptothecin, Di-Trifluoracetat

Ausb.: 77% [DC (Acetonitril/Wasser 20:1): R _f = 0,40; FAB-MS: m/z =

850 (M+H) ⁺ ]

4.11) 20-O-[N ^α ,N ^ε -bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-iysyl- phenylalanyl]-camptothecin

Edukt: 20-O-(Lysyl-phenylalanyl)-camptothecin, Di-Trifluoracetat

Ausb.: 84% [DC (Acetonitril/Wasser 20: 1): R _f = 0,6]

4.12) 20-O-[N ^α -(3-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyI-valyI]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 58 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1:1): R _f =

0,03; Schmp. = 195 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 727 (M+H) ⁺ ] Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspension mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultierende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.

4.13) 20-O-[N ^α -(2-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-Iysyl-vaIyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 36 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 : 1): R _f =

0,03; Schmp. = 192 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 727 (M+H) ⁺ ] Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspension mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultierende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.

4.14) 20-O-[N ^α -(4-Methoxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 54 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 :1): R _f =

0,06; Schmp. = 195 °C (Zers.); FAB-MS : m/z = 741 (M+H) ⁺ ] Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspension mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultierende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.

4.15) 20-O-[N -(3-Methoxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-valyI]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat

98/15571

- 43

salzfreie Vorstufe: 65 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 : 1): R _f =

0,08; Schmp. = 197 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 741 (M+H) ⁺ ] Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspension mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultierende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.

4.16) 20-O-[N ^α -(4-Nitro-phenyIamino-thiocarbonyI)-Iysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 86 % über 2 Stufen [DC: (Acetonitril/Wasser/Eisessig

5:1:0,2): R _f = 0,5]. Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.

4.17) 20-O-[N ^α -(3-Nitro-phenylamino-thiocarbonyI)-lysyl-valyI]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 46 % über 2 Stufen. Die Reinigung auf der Fmoc-geschütz- ten Zwischenstufe erfolgt durch Flash-Chromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol 50: 1). Anschließend erfolgt die Deblockierung mit Piperidin. [DC: (Aceto- nitril/Wasser Eisessig 5: 1:0,2): R _f = 0,45;

Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert. [FAB-MS: m/z = 756 (M+H) ⁺ ].

4.18) 20-O-[N -(4-Amino-phenyIamino-thiocarbonyI)-lysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat mono-Fmoc-geschütztes p-Phenylen-diamin:

8/15571

44

Dieses wird aus Phenylendiamin mit 0,5 Aq Fmoc-Cl ohne weiteren Basenzusatz hergestellt Anslchließend wird es nach Standardbedingungen in das Senfol überfuhrt salzfreie Vorstufe 46 % über 2 Stufen Die Reinigung auf der Fmoc- geschutzten Zwi schenstufe erfolgt durch Fl ash- Chromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol 50 1). Anschließend erfolgt die Deblockierung mit Piperidin Di e Rei nigung erfolgt dann erneut durch Fl ash- Chromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Metha- nol/Ammoniak 1 7 %ig 1 5 : 1 .0, 1 ) [DC (Acetoni¬ tril/Wasser/Eisessig 5 1 :0,2) R _f = 0,45]

Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelost und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überfuhrt Die resultierende Losung wird anschließend lyophilisiert [FAB-MS" m/z = 726 (M+H) ⁺ ]

4.19) 20-O-[N ^α -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyI)-histidyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt 20-O-[Histidyl-valyl]-camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe 81 % [DC. (Acetonitril/Wasser 10 1 R _f = 0,4] Hydrochlorid Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelost und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsaure ins Hydrochlorid überfuhrt Die resultierende Losung wird anschließend lyophilisiert

4.20) 20-O-[N ^α -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-leucyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt 20-O-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothec in,

Trifluoracetat salzfreie Vorstufe 71 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig

5 1 0,2) R _f = 0,45] Hydrochlorid Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelost und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsaure ind Hydrochlorid überfuhrt Die resultierende Losung wird anschließend lyophilisiert

98/15571 45

4.21) 20-O-i[N ^α -N ^e -bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyI)]-lysyl- valylJ-camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 20-O- ιLysyI-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-valylJ- camptothecin, Bis-Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 79 % über 2 Stufen.

[DC: (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2) R _f = 0,46]; [FAB-MS: m/z = 1006 = (M+H) ⁺ ]. Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.

4.22) 20-O-[N ^α ,N ^ε -bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl- aspartyI]-camptothecin, Natriumsalz

Edukt: 20-O-(Lysyl-aspartyl)-camptothecin, Di-Hydrobromid salzfreie Vorstufe: 50 % - die Reinigung erfolgt durch mehrmaliges Umfallen aus Dichlormethan/Methanol 1 :1 mit Diethylether [DC (Acetonitril/Wasser 5: 1): R _f = 0,58; Schmp. = 192 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 894 (M+H) ⁺ ]. Natriumsalz: Die Verbindung wird in Wasser suspendiert und mit einem Äquivalent einer 0,1 N-Natronlauge versetzt. Die resultie¬ rende Lösung wird anschließend lyophilisiert.

4.23) 20-O-[N ^α ,N ^ε -bis-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyI)-lysyl- seryl]-camptothecin

Edukt: 20-O-(Lysyl-seryl)-camptothecin, Di-Hydrobromid

Ausb.: 36 % - die Reinigung erfolgt durch Flashchromatographie [Petrol- ether / Ethylacetat 2:1 -> 1 :2 → Ethylacetat] [DC (Acetonitril): R _f = 0,70; Schmp. = 183 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 866 (M+H) ⁺ ].

98/15571 - 46

Beispiel 5

Konjugate des 20(S)-7-Ethyl-camptothecins; allgemeine Formel:

5.1) 7-EthyI-20-O-[N ^α ,N ^ε -bis-(4-hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)- Iysyl-alanyl]-camptothecin

Edukt: 7-Ethyl-20-O-(lysyl-alanyl)-camptothecin, Di-Trifluoracetat

Ausb.: 27 % [DC (Acetonitril): R _f = 0,68; Schmp. - 122 °C (Zers.);

FAB-MS: m/z = 879 (M+H) ⁺ ].

5.2) 7-EthyI-20-O-[N -(4-hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-vaIyI]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 7-Ethyl-20-O-[N ^ε -(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]- camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 61% über 2 Stufen [beige Kristalle; DC (Acetonitril/Ethyl¬ acetat 1 : 1): R _f = 0,02; Schmp. = 220 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 755 (M+H) ⁺ ].

Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspen¬ sion mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultie¬ rende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyo¬ philisiert.

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Beispiel 6

Konjugate des 10,ll-(Methylcndioxy)-camptothecins; allgemeine Formel:

6) 10,1 l-(MethyIendioxy)-20-O-[N ^α -(4-Hydroxy-phenylaminothio- carbonyI)-lysyl-leucyI]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 10,l l-(Methylendioxy)-20-O-[N ^e -(Fluorenyl-9-methoxy-carbonyl)- lysyl-leucyl]-camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 90 % über 2 Stufen [DC: (Acetonitril/Wasser/Eisessig

5: 1 :0,2) R _f = 0,43] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.

Beispiel 7

Konjugate des 7-Hydroxymethyl-camptothecins; allgemeine Formel

7) 7-[N -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-valyloxymethyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 7-[N ^ε -(Fluorenyl-9-methoxy-carbonyl)-lysyl-valyloxymethyl]- camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 60 % über 2 Stufen. Die Reinigung auf der Fmoc- geschützten Zwi schenstufe erfolgt durch Fl ash- Chromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol 20: 1). Anschließend erfolgt die Deblockierung mit Piperidin. [DC: (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2) R _f = 0,54]

Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.

Beispiel 8

Konjugate des 20(S)-7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecins; allgemeine Formel:

8) 7-Ethyl-10-hydroxy-20-O-[N ^α -(4-hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-

Iysyl-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukt: 7-Ethyl-20-O-[N ^ε -(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-10- hydroxy-camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 69% über 2 Stufen [beige Kristalle; DC (Acetonitril/Ethyl¬ acetat 1 : 1): R _f - 0,03; Schmp. = 225 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 771 (M+H) ⁺ ] Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspen¬ sion mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultie- rende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.