1.1 HBV在世界范围内的流行

HBV 是一种非细胞病变的双链 DNA 病毒， 主要通过血液传播， 母婴传播或性传 播。 虽然 HBV有可用的疫苗和直接作用的高效抗病毒药， 但 HBV在全世界人群中仍 造成很大的疾病负担。 2015年全球携带 HBV的人数为 2.57亿， 因慢性 HBV感染并发 症导致的死亡人数超过 88.4万， 相当于每 36秒就有一个死亡发生。 流行病学研究估算 表明， 与美洲或欧洲比较， 亚洲和非洲国家的 HBV感染比例更高。

1.2亚洲人感染最常见的 HBV基因型

HBV 易突变产生不同的基因型， 据报道全球目前存在 10种不同 HBV基因型。 而 在亚洲国家中， HBV的基因型主要为 B和 C亚型。 HBV基因型与肝病的进展、 肝硬化 的风险、 肝细胞癌 (HCC)的发展等预后因素显著相关。 研究人员重点关注不同区域中 不同基因型的流行。 例如， 与其他基因型比较， 基因型 C和 D更容易发展为肝硬化和 HCC- 人类 白细胞抗原 (HLA), 是人类基因组中最具多态性的基因复合体基因 分型包括 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 , HLA-DQB1等。 研究发现， 与其它 HLA基因 相比， HLA-A等位基 因在中国汉族人群中发挥 更加重要的作用。 在亚洲最常见的 HLA-A*02亚型则是 *02： 01 , *02： 06和 *02： 07 □

1.3 HCC及其致癌通路 原发性肝癌 (HCC, Hepatocellular carcinoma ) 是慢性肝炎感染的一个致死性长期 并发症， 最常见于亚洲人。 2017年， HCC导致约 47万人死亡。 HCC发生的分子病理 是一个复杂过程， 涉及多种分子畸变以及基因突变， 最终导致恶性疾病和 HCC进展。

HBV-DNA 整合见于 80-90%的 HBV相关肝细胞癌。 HBV-DNA整合在 HBV相关 HCC 的发生发展过程中起着重要 的作用。 首先， HBV-DNA包含与肝癌发生相关的基 因， 如编码端粒酶逆转录酶、 赖氨酸甲基转移酶 2B和细胞周期蛋白 A2的基因。 其次, HBV 整合到人类基因组的时候， 通过对插入位点基因表达的影响， 增高基因组不稳定 性， 从而激活某些致癌途径， 如磷酸肌醇 -3 -激酶 /Akt、 myc、 Wnt/R-联蛋白、 c-Met和 hedgehog等。 研究认为 Akt信号传导的活化会抑制转化生长因子 (TGF) 书诱导的凋 HBV-DNA 整合所致的分子改变也会损伤 DNA检控点， 并导致硬化肝脏中肿瘤的形成。 这些分子改变包括 p53肿瘤抑制基因功能丧失、 p27细胞周期调节因子的失活、 胰岛素 样生长抑制 2受体位点杂合性缺失以及 pl6细胞周期抑制蛋白表达的缺失。 总之 ， HBV病毒会引发肝脏基因表达的变化， 从而赋予细胞肿瘤的特征。 这些变 化涉及 DNA 甲基化的改变、 mRNA表达谱的改变以及许多信号转导通路的组� �激活。 其中， 诱发肝癌的主要机制是由免疫反应介导的。 病毒利用免疫反应在肝脏中创造的 氧化环境， 结构性地激活信号通路， 阻断细胞凋亡， 促进细胞存活， 支持 HBV复制， 从而促进病毒的持续存在 ； 同时病毒也可能抑制或阻断先天免疫， 从而影响获得性免 疫反应的发展。 这种慢性、 持续性的免疫反应， 在病理层面上表现为肝炎和长期的纤 维化反应， 最终导致肝硬化和肝癌。 整合 的 HBV-DNA, 包含一个完整的开放阅读框（ORF） 的信封蛋白， 此蛋白可以 作为生产 HBs蛋白的模。 HCC细胞基因组中整合的 HBV-DNA的转录水平和 HBs蛋白 表达水平呈正相关。 而且 HBs蛋白在 HBV相关 HCC的转移灶中也有表达。 有研究显 示， 当 HBs蛋白的完整开放阅读框被嵌合到宿主的基因 组中， 血浆样本、 HCC肿瘤组 织可以检测到 HBs蛋白， 而临近的肝脏组织中并没有 HBs蛋白的表达。 这提示这些 HBs 蛋白并不是感染造成的， 而是来源于肝癌的发生发展过程中嵌入宿主细 胞基因组 的 HBV病毒基因。 即肝癌细胞无 HBV感染却持续表达 HBs蛋白。 抗病毒药物对于这 种整合的 HBV基因表达的蛋白是没有抑制和下调作用的。 所以 HCC患者， 即使在抗 病毒治疗下 HBs蛋白表达仍为阳性。

1.4 HCC的治疗现状 当前， 外科手术切除和肝移植是治疗 HCC最有效的方法， 但符合这些手术标准的 HCC 患者不足 30%, 且符合条件的患者 5年内术后复发率高达 80% o 此外， 供体肝脏 的等待时间很长， 等待移植的人数持续增加， 导致将近 25%的患者最终因肿瘤进展而 无法接受移植。 最 常用的保守治疗是经导管的肝动脉化疗栓塞 （TACE）, 但这种疗法禁用于晚期 肝硬化和肝脏功能代偿不全 的患者； 另外， 与栓塞相关的缺血性损伤会导致患者腹水 增加， 并可能导致死亡。 目前 FDA批准用于治疗 HCC的靶向药为索拉非尼和瑞格非尼， 均为酪氨酸激酶 抑制剂。 索拉菲尼在未接受治疗的晚期肝癌的中位总生 存期 （mOS） 为 10.7个月， 中 位至疾病进展时间为 5.5个月。 其中索拉菲尼一线治疗失败的二线晚期 HCC使用瑞戈 非尼的临床研究中 mOS为 10.6个月， 中位无进展生存期 （mPFS） 为 3.1个月， 客观缓 解率 （ORR） 为 11%。 而且晚期 HCC患者的临床试验数据提示， 索拉非尼和瑞格非尼 与出血风险增高以及动静脉血栓有关， 且其在适应症人群中生存期优势只有 2-3个月， 随着时间延长， 患者容易发生疾病进展。 另外阿帕替尼在既往接受过至少一线系统性 治疗后失败或不可耐受的晚期 HCC的 III期临床试验显示， 阿帕替尼组的 mOS为 8.7 个月， mPFS为 4.5个月， ORR为 10.7%。 以上生存数据可见目前靶向药物疗效有限。 近年来 ， HCC的免疫治疗研究取得了重大突破。 免疫治疗在 HCC一线治疗中的地 位有相关临床研究可以验证， 免疫联合疗法一线治疗 III期研究 （IMbravel50） 的结果 显示： 与标准疗法索拉非尼单药治疗相比， 采用阿替利珠单抗和贝伐珠单抗（T+A） 联合用药能够大幅降低患者死亡风险和疾病进 展风险， 但 ORR （RECISTvl.l） 仅达到 27.3%, 其 mPFS仅为 6.8个月。 在晚期 HCC预后更差的中国患者中， 其 mPFS仅为 5.7 个月。 另外， PD-1在 HCC二线治疗的依据在 CheckMate-040中可以证实， 未伴 HCV 或 HBV 感染的晚期 HCC患者的 PD-1单药治疗， ORR为 15-20%, 未接受过索拉菲尼 治疗的受试者 mOS为 28.6个月， 接受过索拉菲尼治疗的 mOS为 15.6个月。 以上数据 表明 HCC的免疫治疗与以往相比有了很大进步， 但其疗效仍差强人意， 有待进一步研 究。 化疗一般对 HCC患者不产生显著的生存优势。 虽然目前正在开发几种化疗药物的 联合疗法， 例如， PIAF （顺钳、 干扰素、 多柔比星和 5 -氟尿嚅嚏）、 GEMOX（吉西他 滨和奥沙利钳） 和 FOLFOX4 （氟尿嚅嚏、 亚叶酸钙和奥沙利钳输液）， 但与之相关的 临床试验尚未成功， 结果也不完整。

HBV 相关 HCC患者需要抗病毒治疗以抑制病毒复制、 降低病毒负荷以及改善肝硬 化的预后。 同时由于抗肿瘤治疗有可能再次激活 HBV, 因此 CSCO原发性肝癌诊疗指 南 2020指出必须高度重视基础肝病， 建议在 HCC进行诊断、 治疗和临床研究时全程 使用抗病毒治疗。 抗病毒疗法推荐用恩替卡韦和替诺福韦行预防 性抗病毒治疗。 根据 CSC02020指南晚期 HCC二线治疗 I级专家推荐 IA类证据的瑞戈非尼和阿帕替尼及 2A类证据 PD-1单抗在现有临床试验中表现优势不明显。 综上 ， 由于当前可用治疗方式与药物的局限性和风险 ， 需要新的治疗策略为 HBV 相关 HCC患者提供更多治疗选择。

1.5 T细胞在 HBV相关 HCC免疫治疗中的作用及使用 TCR T细胞的基本原理

T 细胞是来源于骨髓、 淋巴， 并在胸腺（Thymus） 中分化成熟的免疫细胞， 其表 面表达有 T细胞抗原受体（TCR）, 在细胞介导的免疫中起到清除感染和癌细胞的 重要 作用。 TCR能够识别由主要组织相容性复合物 （MHC） 分子呈递的靶抗原表位并与之 特异性结合。 一旦 T细胞识别其靶点， 即可通过大量增殖、 释放细胞因子和细胞毒性 等作用杀伤靶细胞。 人们 尝试使用 T细胞过继免疫疗法， 治疗人类恶性肿瘤 （例如白血病） 和病毒类 疾病 （例如巨细胞病毒 （CMV） 和爱泼斯坦-巴尔病毒 （EB病毒， EBV）o 然而， 从患 者的血液中分离和扩增病毒或肿瘤特异性的 T细胞非常困难且耗时。 因此， 研究人员 采用了新的治疗策略， 通过导入靶向特定抗原的 T细胞受体（TCR） 或 TCRa/p异二聚 体， 使得这些基因编辑过的 T淋巴细胞作用于特定的病毒或肿瘤抗原， 赋予 T细胞明 确的抗原特异性。 对于 TCR-T应用于实体瘤， 特别是 HBV感染相关的 HCC有较高的 临床应用价值和意义。 然而必先了解 HBV病毒的 HBs蛋白表达过程和机理才能明确 TCR-T作用的关键。

TCR-T 细胞治疗则是依赖于 （组织相容性复合体） MHC分子的呈现来识别靶点并 激活 T细胞功能， 可以识别 MHC 分子呈现的细胞内抗原片段， 这样的特点决定了 TCR-T 细胞治疗的靶标范围更广， 包括细胞内抗原、 细胞表面抗原， 以及肿瘤细胞突 变后产生的新抗原， 能够克服肿瘤异质性对于恶性肿瘤细胞抗原表 达所带来的差异， 体现了更高的治疗价值。 除此之外临床证据表明， HBV特异性 T细胞的过继免疫疗法对于 HBV 复制或肿 瘤生长能起到控制作用。 接受了对 HBV有特异性免疫 （来自接种 HBV疫苗或依靠自 身免疫达到 HBV感染痊愈） 的供者的骨髓， 白血病患者甚至可以在骨髓移植后获得对 HBV 的免疫能力。 同样， 给对 HBV有特异性免疫的受试者移植 HBV阳性的肝脏， 也 能够清除移植肝脏的 HBV感染 。 有研 究表明， 通过基因编辑表达 HBV特异性 T细胞受体（TCR） 的 T细胞， 可以 在体内识别 HBV相关 HCC细胞， 并被激活扩增， 在降低 HBs蛋白水平同时并未观察 到肝脏炎症的加重或其他毒性。 因此， HBs蛋白是一个 HBV相关 HCC的一个有探索 前景的潜在治疗靶点。 此外 ， T细胞耗竭导致细胞治疗在实体瘤中疗效较差� �原因之一。 T细胞耗竭常见 于恶性肿瘤中， 是长期暴露于持续性抗原刺激下所致的 T细胞功能障碍， 即 T细胞持 续发挥作用后最终失去效应功 能， 其中表现为 （肿瘤坏死因子） TNF和 （干扰素 -丫） IFN-y产生缺陷。 这也是恶性肿瘤细胞免疫逃避的机制之一。 此外， 在 HBV相关的 HCC 患者中， HBV 的特异性 T细胞免疫往往受到严重抑制。 在这些患者中 HBV特异 性 T细胞存在功能缺陷， 数量稀少且易衰竭 （exhaustion）。 由于这些功能缺陷， 患者 血液的离体分析几乎检测不到 HBV特异性 的 T细胞。 因此， 利用基因工程等生物学手段开发靶向乙肝表面 抗原的特异性 TCR, 转染体 外分离病人 T细胞， 构建高亲和力的 TCR-T细胞进行回输治疗成为一种新的选择。 然 而目前， 并没有一种验证安全有效的 TCR-T细胞用于治疗 HBV 相关疾病， 尤其是 HBV 诱发的肝癌； 且 TCR-T细胞在治疗实体瘤试验中极易因肿瘤微环� ��下的免疫抑制, 造成 TCR-T细胞衰竭， 导致抗肿瘤效果不佳。 发明内容 鉴于目前存在的技术问题， 本申请提供了一种经修饰的免疫细胞， 特异的靶向乙 肝表面抗原， 且能够克服肿瘤微环境免疫抑制导致的免疫细 胞耗竭。 其能够特异性杀 灭由 HBV感染所诱发的肝癌细胞， 从而治疗 HBV感染诱发的肝癌。 本申请的第一方面提供 了一种经修饰的免疫细胞， 其包含靶向乙肝表面抗原的 T 细胞受体 （HBV TCR） 和嵌合转换受体； 所述嵌合转换受体包含免疫抑制受体的细胞 外结构域 但 CD）和介导免疫细胞激活信号的共刺激分子的� ��胞内结构域（ICD）； 所述 ECD 与其配体结合在所述经修饰的免疫细胞中产生 免疫细胞激活信号而非免疫细胞失 活信号。 在 一些实施方案中， 所述 TCR包含 TCRa链可变区和 TCRR链可变区； 其中， 所述 TCRa链可变区的 aCDR3的氨基酸序列如 SEQ ID NO:3所示， 或其变体， 其中一个或两 个氨基酸被其它氨基酸 替换； 且所述 TCRR链可变区的 RCDR3的氨基酸序列如 SEQ ID NO:6所示， 或其变体， 其中一个或两个氨基酸被其它氨基酸替换。 在 一些实施方案中， 所述 TCRa链可变 区包含互补决定区 aCDRl、 aCDR2和 aCDR3, 且所述 TCRp链可变区包含互补决定区 pCDRK RCDR2和 pCDR3, 其中： aCDRl、 aCDR2和 aCDR3分别如 SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO:2和 SEQ ID NO:3所示； pCDRK RCDR2和 pCDR3分别如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6所示； 或 CDR变体， 其中一个或多个 CDR中的一个或两个氨基酸被其它氨基酸替换。 在 一些实施方案中， 所述 TCRa链可变区包含与 SEQ ID ?<0:7具有至少90%序列 相同性的氨基酸序列； 在一些实施方案中， 所述 TCRp链可变区包含与 SEQ ID NO： 8 具有至少 90 %序列相同性的氨基酸序列。 在 一些实施方案中， 所述免疫抑制受体选自包括 PD1、 CTLA4, BTLA, TIM3, TIGIT, TGFp受体以及其他任意具有免疫抑制功能或与� �疫抑制信号通路相关的蛋白 的任一种及其组合， 所述免疫抑制受体的 ECD可存在至少一个氨基酸突变。 在 一些实施方案中， 本申请的 ECD为 PD1 ECD； 在一些实施方案中， PD1 ECD 序列可存在至少一个氨基酸突变； 在一些实施方案中， PD1 ECD存在一个氨基酸突变, 132位的丙氨酸突变为亮氨酸， 增加了 PD1 ECD与 PDL1的亲和力， ECD氨基酸序列 如 SEQ ID NO:9所示。 在 一些实施方 案中， 共刺激分子包含： CD28、 4-1BB、 ICOS、 CD27、 IL-12R, CD3, 0X40及其组合， 上述免共刺激分子的 ICD可存在至少一个氨基酸突变。 在一些实施方案 中， 本申请的 ICD为 CD28 ICD； 在一些实施方案中， 本申请的 ICD为 4-1BB ICD； 在一些实施方案中， CD28 ICD序列可存在至少一个氨基酸突变； 在一些实施方案中， 4-1BB ICD序列可存在至少一个氨基酸突变； 在一些实施方案中, CD28 ICD氨基酸序列如 SEQ ID N0:12所示； 在一些实施方案中， 4-1BB ICD氨基酸 序列如 SEQ ID N0:13所示。 在一些实施方案 中， 所述 ECD和所述 ICD通过跨膜区 (TM) 序列连接； 在一些 实施方案中， 跨膜区包含选自以下的蛋白的跨膜结构域： T细胞受体的 a, R或 (链， CD28, CD3s, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137和 CD 154及其组合， 上述蛋白的跨膜结构域可存在至 少一个氨基酸突变。 在一些实施方案 中， 所述跨膜区序列为 CD8跨膜区序列或 CD28跨膜区序列； 在 一些实施方案中， 所述 CD8跨膜区序列如 SEQ ID NO:10所示； 在一些实施方案中， 所述 CD28跨膜区序列如 SEQ ID NO:11所示。 在一些实施方案 中， 嵌合转换受体为 PD1但 CD)-CD8(TM)-4-lBB(ICD)(PDl-BB)； 在一些实施方案中， PD1-BB氨基酸序列如 SEQ ID NO: 15所示； 在一些实施方案中， 嵌合转换受体为 PD 1 (ECD)-CD28(TM)-CD28(ICD)(PD 1-28);在一些实施方案中， PD1- 28氨基酸序列如 SEQ ID NO:16所示。 在一 些实施方案中， 所述免疫细胞选自淋巴细胞、 树突状细胞、 单核、 巨噬细胞、 粒细胞、 肥大细胞； 在一些实施方案中， 所述细胞为 T细胞。 本 申请的第二方面提供了一种核酸分子， 所述核酸分子包含编码本申请第一方面 所述的 TCR分子的核酸序列； 和 /或包含编码本申请第一方面所述的嵌合转换� �体的核 酸序列。 本 申请的第三方面提供了一种载体， 其中所述的载体包含本申请的第二方面所述 的核酸分子。 本 申请的第四方面提供了一种药物组合物， 所述组合物含有药学上可接受的载体 以及权利要求本申请第一方面所述的经修饰的 免疫细胞、 本申请的第二方面所述的核 酸分子、 本申请的第三方面所述的载体。 本 申请第四方面提供了本申请第一方面所述的经 修饰的免疫细胞、 本申请第二方 面所述的核酸分子、 本申请第三方面所述载体或本申请第四方面所 述的药物组合物在 制备用于预防或治疗由 HBV感染所 引发的相关疾病的药物中的用途； 所述 HBV感染 相关疾病包含肝炎、 肝纤维化、 肝硬化、 肝癌所组成的一种或多种。 本申请的有益效果： 一方面， 本申请从依靠自身免疫清除了 HBV感染的捐赠者体内分离出针对 HBV的 T淋巴细胞 ， 并基于这些 T淋巴细胞进一步建立起一个乙肝表面抗原特� �性 TCR库。 HBV TCR T细胞的构建就是基于这个库中的 TCR分子筛选的结果。 我们构建的经修饰 的免疫细胞可 以特异性识别和裂解 HBsAg阳性的 HCC细胞。 另一方面， 本申请的经修 饰的免疫细胞在表达靶向 HBsAg的 TCR-T的同时， 表达嵌合转换受体，高度竞争性结合 肿瘤细胞中的 PD-L1分子， 转换 PD-1/PD-L1抑制性信号为免疫细胞激活信号， 能有效 阻断 T细胞表面天然 PD-1分子诱导的细胞耗竭， 减少 TCR-T细胞在免疫抑制性微环境 中的失能， 并增加细胞因子的释放、 提升细胞增殖能力、 肿瘤杀伤能力。 同时有望克 服目前肝癌过继 T细胞免疫治疗所面临的肿瘤异质性、 肿瘤屏障难以渗透、 作用时间 短暂、 局部免疫抑制性微环境等一系列难以解决的难 题， 在实体瘤的细胞免疫治疗领 域具有巨大的应用前景 。 再一方面， 体内外试验表明本申请的经修饰的免疫细胞， 增 强 TCR-T细胞治疗效用的同时不会对抗原阴性而 PD-L1阳性的细胞产生非特异功能， 副反应方面和安全性方面优于 PD1/PD-L1抗体和 TCR-T细胞联用。 附图说明 为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案 ， 下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍 ， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例 , 对于本领域技术人员来讲 ， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得 其他的附图。 图 1为同时表达 HBV TCR和嵌合转换受体作用原理示意图； 图 2为同时表达 HBV TCR和嵌合转换受体结构序列； 图 3为 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB、 HBV TCR-PD1-28慢病毒滴度和 T细胞 MOI； 图 4为 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB、 HBV TCR-PD1-28 T细胞表达； 图 5为 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB、 HBV TCR-PD1-28对靶细胞杀伤和细胞因 子； 图 6为 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB、 HBV TCR-PD1-28多轮肿瘤刺激杀伤实验; 图 7为 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB、 HBV TCR-PD1-28多轮肿瘤刺激细胞因子; 图 8为 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR对各种靶细胞杀伤和细胞因子功能； 图 9为 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR靶细胞多轮刺激增殖能力检测； 图 10为免疫缺陷小鼠 HBsAg+PDLl+移植瘤模型 HBV TCR-PD1-BB体内药效、 体 重和体内分布； 图 11为免疫缺陷小鼠 HBsAg+PDLl+移植瘤模型 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-T 体内长期药效比较。 具体实施方式 为 了更容易理解本发明， 描述实施例之前， 先对本发明某些技术和科学术语做说 明。 除显而易见在本发明申请文件中的它处另有明 确定义， 本发明使用的所有其它技 术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技 术人员通常理解的含义。 术语“乙肝表面抗原 T细胞受体 (TCR)”在本文中被定义为这样的 TCR, 其在主要组 织相容性复合体 (MHC)分子环境下与乙肝表面抗原结合从而在表� ��重组 TCR的细胞 中诱导产生辅助子或细胞毒性应答。 本申请的 TCR或其片段， 其能够结合由 HLA-A*02 呈递的乙肝表面抗原多肽。 具体而言， 所述乙肝表面抗原可为 HBS20-28, 其可在本申 请中以 HBs20、 HBs20-28、 S20-28和 S20互换使用， 如无特殊说明则指基因型 A和 D的 S20-28抗原即 FLLTRILTI多肽。 在一些实施例中所述乙肝表面抗原为 HBV基因型 A和 D； 在一些实施例中， 所述乙肝表面抗原为 HBV基因型 B和 C。 在一些实施例中， 所述乙肝 表面抗原包含 FLLTRILTI ( SEQ ID NO: 19) 氨基酸序列； 在一些实施例中， 所述乙肝 表面抗原包含 FLLTKILTI ( SEQ ID NO:20) 氨基酸序列。 在一些实施例中， 所述乙肝 表面抗原为 FLLTRILTI ( SEQ ID NO： 19) 氨基酸序列； 在一些实施例中， 所述乙肝表 面抗原为 FLLTKILTI ( SEQ ID NO:20) 氨基酸序列。 术语 “MHC分子 ”是免疫球蛋白超家族的蛋白质， 可以是 I类或 II类 MHC分子。 因此, 其对于抗原的呈递具有特异性， 不同的个体有不同的 MHC, 能呈递一种蛋白抗原中不 同的短肽到各自的 APC细胞表面。 人类的 MHC通常称为 HLA基因或 HLA复合体。

TCR 是由 a链小链或者丫链岱链以异质二聚体形式存在� �细胞膜表面的糖蛋白。 在 95 %的 T细胞中 TCR异质二聚体由 a和侪连组成， 而 5 %的 T细胞具有由丫和 b链组成的 TCR。 天然邱异质二聚 TCR具有 a链和侪连， a链和侪连构成邱异源二聚 TCR的亚单位。 a和 R各 链包含可 变区和恒定区， 各可变区包含嵌合在框架 结构 (framework regions)中的 3个 CDR (互补决定区)， CDR1、 CDR2和 CDR3, 本申请 TCR的 a链和 R链的 CDR区划定采用 IMGT编号规则 。 CDR区决定了 TCR与 pMHC复合物的结合。 TCR恒定域的序列可以在 国际免疫遗传学信 息系统 (IMGT)的公开数据库中找到， 如 TCR分子 a链的恒定域序列 为 “TRAC*01”， TCR分子 R链的恒定域序列为 “TRBCl*01”或“ TRBC2*01”。 在本 申请中， 术语 “T细胞受体 ”、 “TCR”、 “TCR分子”可互换使用。

TCR 分子 本 申请的 TCR或其片段识别 HLA-A2限制性的乙肝表面抗原。 大约总人口的 50%表 达 MHC I类分子 HLA-A*02, 因此， HLA-A*02限制性 TCR可具有普遍的治疗用途。 具体而言， 本申请的 TCR可以识别许多 HLA-A*02等位基因的产物， 包括 HLA-A*0201、 *0202、 *0203、 *0206和 *0207等。 尽管， 白种人和亚洲人的 HLA基因亚型可存在明显 的差异； 然而， 超过 95 %的 HLA-A2阳性的白种人是 HLA-A0201； 而 HLA-A2阳性的中 国人 由如下 HLA-A2亚型组成 :23 %HLA-A0201； 45 %HLA-A0207； 8%HLA-A0206； 23 %HLA-A0203。 在 一些实施例中， 所述 TCR包含 TCRa链可变区和 TCRp链可变区， 并且 TCRa和 R 链各具有 3个互补决定区 (CDR)o 在 一些实施例中， 所述 TCRa链可变区的 aCDR3的氨基酸序列如 SEQ ID NO:3所示, 或其变体 ， 其中一个或两个氨基酸被其它氨基酸替换； 和 /或所述 TCRR链可变区的 RCDR3的氨基酸序列如 SEQ IDNO:6所示， 或其变体， 其中一个或两个氨基酸被其它氨 基酸替换。 在 一些实施例中 ， 所述 aCDRl、 aCDR2和 aCDR3分别如 SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO:2和 SEQ ID NO:3所示； 和 /或所述 pCDRK RCDR2和 RCDR3分别如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6所示。 可以将上述本申请的 CDR区氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中 来制备嵌合 TCRo 只要框架结构与本申请的 TCR的 CDR区兼容， 本领域技术人员根据本申请公开 的 CDR区就能够设计或合成出具有相应功能的 TCR分子。 因此， 本申请 TCR分子是指 包含上述 a和 /或侪连 CDR区序列及任何适合的框架结构的 TCR分子。 本申请 TCRa链可 变区为与 SEQ ID NO:7具有至少 90% , 优选地 95 % , 更优选地 98%序列相同性的氨基酸 序列； 和 /或本申请 TCRR链可变区为与 SEQ ID NO:8具有至少 90% , 优选地 95 % , 更优 选地 98 %序列相同性的氨基酸序列。 在一些实施例中， 所述 TCR为邱异质二聚体， 其包含 TCRa链恒定域和 TCRR链恒 定域。 在一些实施例中， 本申请的 TCR分子的恒定域是人的恒定域。 本领域技术人员 知晓或可以通过查阅相关书籍或 IMGT (国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库来获� �� 人的恒定域氨基酸序列。 例如， 本发明 TCR分子 a链的恒定区序列可以为，TRAC*01”， TCR分子 R链的恒定区序列可以为 “TRBCl*01”或“ TRBC2*01 ^,, o 在一些实施例中， 恒定 区引入一个额外 的二硫键提高稳定性并减少外源转入的 TCR分子与内源的 TCR分子错 配。 本申请的 TCR分子的恒定区也可以是小鼠的恒定区。 将 TRAC和 TRBC同时换成小 鼠来源的恒定 区可以避免外源转入的 TCR分子与内源的 TCR分子错配， 造成 TCR靶向 错误。 此效用与外源导入人工二硫键目的类似。 嵌合转换受体 本 申请的嵌合转换受体包含： 免疫抑制受体的细胞外结构域 (ECD), 其中所述 ECD与介导免疫细胞激活信号的 共刺激分子的细胞内结构域 (ICD)融合； 其中所述免疫抑制受体细胞外结构域与其配体 结合在所述经修饰的免疫细胞 中产生免疫细胞激活信号而非免疫细胞失活信 号。 嵌合 转换受体使免疫抑制受体介 导的失活信号转变为免疫细胞活化信号， 从而进一步增强 修饰后免疫细胞的免疫活性。 免疫抑制受体包括 PD1、 CTLA4, BTLA, TIM3, TIGIT, TG邱受体以及其他任 意具有免疫抑制功能或与免 疫抑制信号通路相关的蛋白中的任意一种及其 组合， 且可 存在至少一个氨基酸突变。 在 一些实施例中， 本申请的 ECD为 PD1 ECD； 在一些实施例中， PD1 ECD序列可 存在至少一个氨基酸突变； 在一些实施例中， PD1 ECD存在一个氨基酸突变， 132位的 丙氨酸突变为 亮氨酸， 增加了 PD1 ECD与 PDL1的亲和力， 突变后 ECD氨基酸序列如 SEQ ID NO:9所示。 本 申请的共刺激分子包含： CD28、 4-1BB、 ICOS、 CD27、 IL-12R, CD3, 0X40及 其组合， 上述免共刺激分子的 ICD可存在至少一个氨基酸突变。 在 一些实施例中， 本申请的 ICD为 CD28 ICD； 在一些实施例中， 本申请的 ICD为 4- 1BB ICD； 在一些实施例中， CD28 IC D序列可存在至少一个氨基酸突变； 在一些实施 例中， 4-1BB IC D序列可存在至少一个氨基酸突变； 在一些实施例中， CD28 ICD氨基 酸序列 如 SEQ ID NO:12所示； 在一些实施例中， 4-1BB ICD氨基酸序列如 SEQ ID NO:13所示。 在 一些实施例中， 所述 ECD和所述 ICD通过跨膜区 (TM) 序列连接； 跨膜区包含 选 自以下的蛋白的跨膜结 构域： T细胞受体的 a, R或 (链， CD28, CD3&, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137和 CD154及其组合， 上述蛋白的跨膜结构域可存在至少一个氨基酸 突变。 在 一些实施例中， 所述跨膜区序列为 CD8跨膜区序列或 CD28跨膜区序列； 在一些 实施例中， 所述 CD8跨膜区序列如 SEQ ID NO:10所示； 在一些实施例中， 所述 CD28跨 膜区序列如 SEQ ID NO: 11所示。 在 一些实施例中， 嵌合转换受体为 PD1但 CD)-CD8(TM)-4-lBB(ICD)(简写为 PD1- BB)； 在一些实施例中， PD1-BB氨基酸序列如 SEQ ID NO: 15所示； 在一些实施例中， 嵌合转换 受体为 PD1但 CD)-CD28(TM)-CD28(ICD)(简写为 PD1-28);在一些实施例中， PD1-28氨基酸序列如 SEQ ID NO : 16所示。 核酸分子 本 申请的核酸分子， 包含编码本申请靶向乙肝表面抗原的 TCR分子的核酸序列； 和 /或， 包含编码本申请嵌合转换受体的核酸序列。 本 申请提供了编码本文上述 TCR分子或其片段的核酸分子， 所述片段可以是一个 或多个 CDR, a和 /或侪连的可变区， 以及 a链和 /或俄连。 在一 些实施例中， 所述核酸编码一种或多种结构特征， 用于增加和 /或稳定所表达 的 TCRa和俄连之间的缔合。 在一些实施例中， 所述特征可以是特定的氨基酸或氨基酸 序列。 在一些实施方式中， 所述核酸可编码一个或多个非天然半胱氨酸残 基， 用于在 所述 TCRa和俄连之间形成一个或多个二硫键。 在一些实施方式中， 所述核酸可编码所 述 TCRa和俄连的恒定域中的一个或多个非天然半� �氨酸残基。 本 申请核酸分子的核昔酸序 列可以是单链或双链的， 该核酸分子可以是 RNA或 DNA, 并且可以包含或不包含内含子。 优选地， 本申请核酸分子的核昔酸序列不包含 内含子但能够编码本申请 TCR, 和 /或本申请的嵌合转换受体。 核昔 酸序列可以是经密码子优化的。 不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的, 可以根据细胞的类型， 改变序列中的密码子来增加表达量。 哺乳动物细胞以及多种其 他生物的密码子选择表是本领域技术人员公知 的。 在一 些实施例中， 本申请的编码序列为单链， 通过 P2A编码序列将 TCRR链编码序 列和 TCRa链编码序列连接， 然后再通过 T2A编码序列和嵌合转换受体编码序列连接； 且所述单链编码核昔酸在同一阅读框中。 应 理解， 在基因克隆操作中， 常常需要设计合适的酶切位点， 这势必在所表达的 氨基酸序列末端引入了一个或多个不相 干的残基， 而这并不影响目的序列的活性。 为 了构建融合蛋白、 促进重组蛋白的表达、 获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、 或 利于重组蛋白的纯化， 常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的 N-末端、 C-末端或该 蛋白内的其它合适区域 内， 例如， 包括但不限于， 适合的接头肽、 信号肽、 前导肽、 末端延伸等。 因此， 本发明的融合蛋白的氨基端或蔑基端还可含有 一个或多个多肽片 段， 作为蛋白标签。 任何合适的标签都可 以用于本文。 例如， 所述的标签可以是 FLAG, HA, HAL c-Myc, Poly-His, Poly- Arg, Strep-TagIL AUL EE, T7, 4A6, g, B, gE以及 Tyl。 这些标签可用于对蛋白进行纯化。 载体 本 申请也涉及载体， 该载体含有本文所述的核酸分子序列， 以及与这些序列操作 性连接的一个或多个调控序列 。 本发明所述的核酸分子可以多种方式被操作以 保证所 述融合蛋白的表达。 利用重组 DNA方法来改变多核昔酸序列的技术是本领域已 知的。 调控 序列可以是合适的启动子序列。 启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操 作性连接。 启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录 活性的任何核昔酸序列， 包 括突变的、 截短的和杂合启动子， 并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞 外或 胞内多肽的基因获得 。 调控序列也可以是合适的转录终止子序列， 由宿主细胞识别以 终止转录的序列 。 终止子序列与编码该多肽的核昔酸序列的 3,末端操作性连接。 在选 择的宿主细胞中有功能 的任何终止子都可用于本发明。 调控序列也可以是合适的前导 序列， 对宿主细胞翻译重要的 mRNA的非翻译区。 前导序列与编码该多肽的核昔酸序 列的 5,末端可操作连接。 在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可 用于本申请。 本 申请的核酸分子可被克隆入许多类型的载体。 例如， 可被克隆入质粒、 噬菌粒、 噬菌体衍生物、 动物病毒和粘粒。 进一步地， 载体是表达载体。 表达载体可以以病毒 载体形式提供给细胞。 病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如 Sambrook等 (2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory , New York)和其 他病毒学和分子生物学手册 中进行了描述。 可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病 毒、 腺病毒、 腺伴随病毒、 疱疹病毒和慢病毒。 通 常， 合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的 复制起点、 启动子序列、 方 便的 限制酶位 点和一个或 多个可选择 的标记 (例如， WO 01/96584和美国专利号 6,326 ,193)o 例 如， 在某些实施方案中， 本发明使用慢病毒载体， 该慢病毒载体含有复制起始 位点， 3ITR, 5ITR, 本文所述的多核昔酸序列， 以及任选的可选择的标记。 合适 的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒 (CMV)启动子序列。 该启动子序 列是能够驱动可操作地连接至其 上的任何多核昔酸序列高水平表达的强组成型 启动子 序列。 合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子 -la(EF-la)o 然而， 也可使用其他组 成型启 动子序列， 包括但不限于类人猿 病毒 40(SV40)早期启动子、 小鼠乳癌病毒 (MMTV) 、 人免疫缺陷病毒 (HIV)长末端重复 (LTR)启动子、 MoMuLV启动子、 鸟类白 血病病毒启动子、 EB病毒即时早期启动子、 鲁斯氏肉瘤病毒启动子、 以及人基因启动 子， 诸如但不限于肌动蛋白启动子、 肌球蛋白启动子、 血红素启动子和肌酸激酶启动 子。 进一步地， 也可考虑使用诱导型启动子。 诱导型启动子的使用提供了分子开关， 其能够在期限表达时打开可操作地 连接诱导型启动子的多核昔酸序列的表达， 而在当 表达是不期望的时关 闭表达。 诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白 启动子、 糖皮质激素启动子、 孕酮启动子和四环素启动子。 为 了评估目的基因的表达， 被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记 基因或 报道基因中的任一个或两者 ， 以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细 胞群中鉴 定和选择表达细胞。 在其他方面， 可选择的标记可被携带在单独一段 DNA上并用于共 转染程序。 可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有 适当的调节序列， 以便能够 在宿主细胞中表达。 有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因， 诸如 neo等等。 报道基 因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序 列的功能性。 在 DNA已经被 引入受体细胞后， 报道基因的表达在合适的时间下进行测定。 合适的报道基因可包括 将基 因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领 域中是已知的。 载体可通过在 本领域中的任何方法容易地 引入宿主细胞， 例如， 哺乳动物、 细菌、 酵母或昆虫细胞。 例如， 表达载体可通过物理、 化学或生物学手段转移入宿主细胞。 将多核昔 酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、 脂质转染法、 粒子轰击、 微注射、 电穿孔等等。 将感兴趣的多核昔酸引入宿主细胞的生物学方 法包括使用 DNA 和 RNA载体。 将多核昔酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体 分散系统， 诸如大分子复 合物、 纳米胶囊、 微球； 和基于脂质的系统， 包括水包油乳剂、 胶束、 混合胶束和脂 质体。 将多核昔 酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载 体， 特别是慢病毒载体， 这已经成为最广泛使用的将基 因插入哺乳动物例如人细胞的方法。 其他病毒载体可源 自痘病毒、 单纯疱疹病毒 I、 腺病毒和腺伴随病毒等等。 已经开发了许多基于病毒的系 统， 用于将基因转移入哺乳动物细胞。 例如， 逆转录病毒提供了用于基因传递系统的 方便的平台。 可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入 载体并包装入逆转录病毒 颗粒。 该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体 的对象细胞。 许多反转录病毒系 统在本领域中是已知的。 在一些实施方案中， 使用腺病毒载体。 许多腺病毒载体在本 领域中是已知的。 在一个实施方案中， 使用慢病毒载体。 免疫细胞 本 申请的免疫细胞选自淋巴细胞、 树突状细胞、 单核 /巨噬细胞、 粒细胞、 肥大细 胞。 在一些实施例中， 免疫细胞为淋巴细胞； 在一些实施例中， 免疫细胞为 NK细胞； 在一 些实施例中， 免疫细胞为 B细胞； 在一些实施例中， 免疫细胞为 TIL细胞。 在一些实施 例中， 免疫细胞为 T细胞， 所述 T细胞可衍生自从受试者分离的 T细胞， 或者可以是从 受试者中分离的混合细胞群， 诸如外周血淋巴细胞 (PBL)群的一部分。 如， 该细胞可以 分离自外周血单核细胞 (PBMC), 可以是 CD4 +辅助 T细胞或 CD8 +细胞毒性 T细胞。 该细 胞可在 CD4 +辅助 T细胞 /CD8 +细胞毒性 T细胞的混合群中。 一般地， 该细胞可以用抗体 (如， 抗 -CD3抗体)活化， 以便使它们能够更容易接受转染。 本 申请经修饰的免疫细胞， 为包含上述 TCR受体分子和上述嵌合转换受体的免疫 细胞； 在一些实施例中， 通过向分离的免疫细胞导入编码上述 TCR受体分子和上述嵌 合转换受体的编码序列或包含 上述编码序列的载体构建经修饰的免疫细胞； 在一些实 施例中， 向体内的免疫细胞导入编码上述 TCR受体分子和上述嵌合转换受体的编码序 列或包含上述编码序列 的载体构建经修饰的免疫细胞； 在一些实施例中， TCR受体分 子和嵌合转换受体的编码序列串联表达， 且处于同一个阅读框中。 组合物 本 申请还提供了包含本发明的经修饰的免疫细胞 、 核酸或载体的组合物。 在一些 实施例中， 所述组合物是药物组合物。 在一些实施方式中， 所述组合物是适合用于研 究、 治疗、 预防和 /或诊断的组合物。 在 一些实施例中， 本申请的经修饰的免疫细胞、 核酸或载体优选与本领域技术人 员公知的一种或多种其它可药用成 分一起配制成药剂或药物， 所述可药用成分包括但 不限于可药用载体、 佐剂、 赋形剂、 稀释剂、 填充剂、 缓冲剂、 防腐剂、 抗氧化剂、 润滑剂、 稳定剂、 增溶剂、 表面活性剂、 掩蔽剂、 着色剂、 调味剂和甜味剂。 术语 “可 药用”用于本文中时涉及化合物、 成分、 材料、 组合物、 剂型等， 它们在合理的医学判 断范围内、 适合用于接触所讨论的对象（例如人类）的组 织而没有过度的毒性、 刺激、 变态反应或者其它问题或并发症、 与合理的效益 /风险比相称。 每种载体、 佐剂、 赋形 剂等在与制剂的其它成分相 容的意义上， 也必须是“可接受的”。 合适的载体、 佐剂， 赋形剂 等可以在标准的药 物教科书中找到 ， 例如， 《雷氏药物科学》（Remington 's Pharmaceutical Sciences）； 以及 《药用赋形剂手册》（Hand book of Pharmaceutical Excipients） o 本 发明的药物组合物可以以适于待治疗（或预防 ）的疾病的方式施用。 施用的数量 和频率将由这样的因素确定， 如患者的病症、 和患者疾病的类型和严重度。 当指出 “免疫学上有效量”、 “抗肿瘤有效量”、 “肿瘤 -抑制有效量 ”或“治疗量 ”时， 待施用的本发 明组合物的精确量可由医师确定， 其考虑患者（对象）的年龄、 重量、 肿 瘤大小、 感染或转移程度和病症的个体差异。 可通常指出： 包括本文描述的 T细胞的 药物组合物可 以以 E4至 E9个细胞 /kg体重的剂量， 优选 E5至 E7个细胞 /kg体重的剂量。 T细胞组合物也可 以以这些剂量多次施用。 细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技 术（见例如 Rosenberg等， New Eng .J .of Med .319: 1676, 1988）施用。 对于具体患者的最 佳剂量和治疗方案可通过监测 患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技 术人员容 易地确定。 对 象组合物的施用可以以任何方便的方式进行， 包括通过喷雾法、 注射、 吞咽、 输液、 植入或移植。 本文描述的组合物可被皮下、 皮内、 瘤内、 结内、 脊髓内、 肌肉 内、 通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。 医药用途 在另一方 面， 提供了本申请的经修饰的免疫细胞、 核酸、 载体或药物组合物在制 备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的应用 。 在一些 实施例中， 本申请的经修饰的免疫细胞、 核酸、 载体或药物组合物可用于 预防或治疗由 HBV感染所引发的相关疾病。 由 HBV感染所引发的相关疾病包括急性肝 炎 (包括暴发性肝衰竭)、 慢性肝炎、 肝纤维化、 肝硬化、 肝癌如肝细胞癌 (HCC)、 或胰 腺癌。 治疗和预防方法 可 以通过分离患有与 HBV相关疾病的病人或志愿者的 T细胞， 并将本申请的核酸 分子或载体导入上述 T细胞中， 随后将这些基因工程修饰的细胞回输到病人体 内来进 行治疗。 因此， 本申请提供了一种治疗 HBV相关疾病的方法， 包括将分离的表达本申 请 TCR和嵌合转换受体的 T细胞， 优选地， 该 T细胞来源于病人本身， 输入到病人体内。 一般地， 包括 (1)分离病人的 T细胞， (2)用本申请核酸分子或载体， 体外转导 T细胞， (3) 将基因工程修饰 的 T细胞输入到病人体内。 分离、 转染及回输的细胞的数量可以由医 师决定。 在本发 明的一些实施方案中， 本发明的经修饰的免疫细胞、 核酸、 载体或药物组 合物可与本领域已知的其它疗法结合 。 所述疗法包括但不限于化疗、 放疗、 免疫抑制 剂和病毒抑制剂。 例如， 可结合本领域周知的治疗 HBV诱发的疾病的核昔酸类似物或 干扰素进行治疗， 核昔酸类似于物包括拉米夫定、 阿德福韦酯、 替比夫定、 恩替卡韦、 替诺福韦酯和克拉夫定。

“患者”、 “对象”、 “个体 ”等在本文中可交换使用， 指可引起免疫应答的活有机体, 如哺乳动物。 例子包括但不限于人、 狗、 猫、 小鼠、 大鼠和其转基因物种。 下面将 结合具体实施例， 对本申请的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所 描述的实施例仅仅是本 申请一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本申请中的实 施例， 本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下 所获得的所有其他实施例， 都属 于本申请保护的范围。 需说明的是， 以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺 序 的限定。 下面实施 例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人在 分子克隆： 实验室手册 (Molecular cloning-A Laboratory manual,第三版. 2001)中的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另有说明， 否则百分比和份数按重量计算。 除非 另有说明， 文中涉及的试剂与材料均可商购获得， 或本领域技术人员可依据公知常识 自行制备。 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆 可应用于本申请中。 文中的 较佳实施方法与材料仅作示范之用， 但不能限制本申请的内容。 实施例 1: 表达 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28病毒载体构建

HBV TCR-PD1-BB及 HBV TCR-PD1-28结构原理如图 1所示， HBV TCR、 HBV TCR-PD1-28和 HBV TCR-PD1-BB序列结构如图 2所示， 全基因合成 HBV TCR片段 （氨基酸序列如 SEQ IDN0:14所示） 编码序列、 HBVTCR-PD1-BB片段（氨基酸序列 如 SEQ ID NO:17所示） 编码序列、 HBV TCR-PD1-28片段 （氨基酸序列如 SEQ ID NO:18所示 ） 编码序列， 合成基因经双酶切后插入慢载体构建质粒， 构建得到的载体。 结构上， TCR由 a和 R两条链组成， 它们都由可变结构域 （负责与 MHC-肽复合 体相结合） 和恒定结构域 （负责与两条 TCR链相结合） 组成， 增加的 PD-1共刺激域 融合受体 （嵌合转换受体） 作为抗耗竭序列， TCRa链和 R链通过 P2A自剪切肽连接， 然后再通过 T2A自剪切肽与 PD-1共刺激域融合受体连接。 其中恒定区经过序列改造来 减少内源 TCR错配。

HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28包含 T细胞受体 p链可变区 （TCR R可变 区）、 T细胞受体 R链恒定区 （TCR R恒定区）、 T细胞受体 a链可变区 （TCR a可变 区）、 T细胞受体 a链恒定区 （TCR a恒定区）、 PD1胞外区、 CD8或 CD28跨膜区、 41BB或 CD28胞内信号区 （图 2）。 克隆目的基因到骨架质粒： 为了提高目的基因的表达效 率， 选择合适的骨架质粒至关重要。 我们以公开的 pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP质粒原始序列为基础 （慢病毒骨架质粒酶切位点信息如 表 1）， 将其氨节青霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性 基因后进行了骨架质粒的全基因 合成。 再分别设计目的基因序列两端引物引入 EcoRI和 Sall酶切位点， 对目的基因片段 进行 PCR扩增， 根据 PCR产物电泳结果选择目的基因条带进行纯化回 收。 同时将回收 的 PCR产物和 pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP骨架质粒用 EcoRI和 Sall双酶切回收， 2个片 段利用 T4 DNA连接酶连接， 连接产物利用 Stbl3感受态细胞进行转化， 挑单克隆培养， 提取质粒后通过双酶切 、 电泳和测序对目的质粒进行鉴定。 构建完成的目的质粒包括 5'LTR（长末端重复序列）、 HIV-1 （包装整合信号）、 RRE（Rev反应元件）、 cPPT/CTS （中心多 d票吟管道 /中心终止序列）、 EF-la core promoter（人类 EF-la的核心启动子）、 WPRE （土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件）、 3'LTR-SIN（自灭活型的长末端重复序列） 等主要功能元件 （慢病毒骨架质粒关键功能元件及位置如表 2所示）， 以及 TCR-HBsAg 基因。 表 1.慢病毒骨架质粒酶切位点信息汇总表 表 2.慢病毒骨架质粒关键功能元件及位置表 实施例 2: 慢病毒包装

HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28细胞产品生产使用的慢病毒载 体是来自于 HIV-1的第三代“自灭活 （self-inactivating, SIN） ”具有 VSV-G假性包膜的慢 病毒载体， 携带编码靶向 HBsAg特异性 T细胞受体 （HBsAg TCR） 的核酸。 该慢病毒 载体仅具有感染活性， 无复制能力， 其颗粒直径约为 80-120nm, 形状大致呈球体或者 20面体对称结构。 病毒外膜是类脂包膜， 并嵌有 VSV-G包膜蛋白， 向内是由蛋白 pl7形 成的球形基质 （Matrix）, 以及蛋白 p24形成的半锥形衣壳 （Capsid）, 衣壳内含有携带 TCR的 RNA核酸信息。 第三代 自灭活的慢病毒载体的核酸分子各元件功能描 述如下： 在 TCR基因两端分别是截短型 /嵌合长末端重复序列， 分别为 ASITR和 △3ITR。 其 中 △ 5ITR为缺失 U3 , 更换为上呼吸道合 胞病 毒 （respiratory syncytial virus pneumonia, RSV） 的增强子和启动子， 使载体的复制不再依赖 tat； △3ITR为删除 U3 , 使其不再有启动 /增强活性， 使其成为自灭活载体。

RRE 元件功能： Rev的顺式作用元件， 促使未经拼接的大 mRNA分子从细胞核向胞 浆转运。 cPPT元件功能： 提高载体转导效率。 EF-la启动子功能： 调控基因表达 (转录) 的起始时间和表达程度。

WPRE 元件功能： 可上调转录物的多聚腺昔化及促进转录物出核 ， 提高目的基因 的表达效率。 慢病 毒载体由第三代四质粒系统瞬时转染 293T细胞并经纯化获得， 其中四质粒系 统由三个包装质粒 (又称 “辅助质粒”) 和一个目的质粒组成。 包装 质粒 pGagPol-KanR编码病毒结构蛋白 Gag及逆转录酶 Pol, 前者形成病毒核心 结构， 后者为 RNA逆转录及整合所必需。 包装质粒 pRev-KanR编码 Rev蛋白， 与 RNA结合促进 mRNA转运及蛋白表达。 包 装质粒 pVSV-G-KanR编码水疱性口炎病毒包膜蛋白 VSV-G, 替换 HIV病毒包膜 蛋白， 使慢病毒载体几乎可感染所有组织来源的细胞 ， 并提升了慢病毒颗粒的稳定性。

D10细 胞 完 全 培 养 基 配 制 ： DMEM(Gibco, 11965092-092)、 10% FBS(Gibco, 10099141)、 1% Sodium Pyruvate(Gibco, 11360070)、 置于 4。(2冰箱中备用。

Day 0： 293T细胞小于 20代， 不过分长满； 以 2>< 1。7铺 150mm皿 (Coming, 430599), 20mL D10培养基， 充分混匀细胞， 37。(2培养过夜。

Day 1： 293T细胞融合度达到 60-80%时进行转染， 铺板到转染的时间不大于 24h。 慢病毒包装按表 3准备质粒复合物。 表 3.质粒复合物所需材料 一边 轻轻涡旋质粒， 一边将 PEIpro滴加进去， 充分混匀并在室温下静置 15min, 形 成质粒 -PEI复合物； 将复合物缓缓加入到 150mm皿 293T细胞中， 充分混匀， 置二氧化 碳培养箱 37。(2培养 6h。

Day 1： 将转染 6h的 293T细胞， 轻轻换液成 20mL新鲜 D10培养基。

Day 3： 收集转染 48h的病毒上清， 暂存于 4。(2冰箱中， 继续添加 D10培养基 20mL。

Day 4： 收集转染 72h的病毒上清， 与收集转染 48h的病毒上清混合； 4度， 3000g离 心 10min, 过 0.45um滤器去除碎片保留上清， 使用 100K的超滤杯进行病毒浓缩。

4°C, 3000g离心至所需病毒浓缩的体积， 离心结束后， 取出离心装置， 将过滤杯 和下面的过滤液收集杯分 开， 将过滤杯倒扣在样品收集杯上； 4°C, 1000g离心 2min, 样品收集杯中的即为病毒浓缩液， 收集浓缩液， 分装， -7CTC以下保存。 病毒 液滴度检测： 准备 24孔板， Jurkat按 1*10“孑 L, 500ul, 加入一定量病毒浓缩液, 梯度稀释， 培养 72H后， 流式检测病毒滴度。 病毒滴度检测 ： 流 式缓冲液配制： DPBS(Gibco, 14190250)、 2%FBS(Gibco, 10099141), 置于 4。(2冰 箱中备用 取 Jurkat细胞， 每组 l x"细胞， 400g 5min离心弃上清， 用流式缓冲液洗涤 2次；

PE Dextramer HBV-S20按 1 : 100比例用流式缓冲液稀释， 每个样本加入 lOOul抗体稀 释液， 4。(2避光孵育 30分钟， 加入流式缓冲液洗涤细胞， 400g 5min离心弃上清， 重复 2 次； 用 lOOul流式缓冲液重悬细胞， 上样流式检测； 载体感染滴度 (TU/mL) =每孔细胞铺板数 x阳性率 (％)x稀释倍数 /滴定体积 (mL) 结 果如图 3a所示， HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28慢病毒载体 的滴度都在 1E7 TU/ml以上， 说明 3个 HBV TCR都可以成功包装病毒且滴度较高。 实施例 3： 制备 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28

T细胞 培养基配制： PRIME-XV- T cell CDM(Irvine, 91154)、 400IU/mlIL-2。

T细 胞冻存液 配制： 75%CS10(ThermoFisher, A2596101 )+25%HS A(FLEXBUMIN, S20181007)o

DayO： 从单采血中分离获得较纯的 CD3+T细胞， 用 T细胞培养基调整细胞浓度至 l x lO ⁶ /mL, 按 Transact(CD3/CD28微球 )( Macs, 6201000014)： 细胞悬液 =1 :30加入激活剂, 轻轻充分混匀， 再加入终浓度为 400IU/mL的白细胞介素 2, 刺激培养 24h后病毒感染；

Dayl： 计数细胞， 调整 T细胞的密度在 5x l0 ⁵ /mL, 加入病毒液；

Day2-ll： 细胞感染后， 每天观察细胞状态， 适时补加含 IL-2 400IU/m L的 T细胞培 养液， 使 T细胞的密度维持在 5x l0 ⁵ /mL， 使细胞扩增；

Dayl2： 300g离心 5分钟收获细胞， 用含 5%人血白蛋白的生理盐水溶液清洗细胞， 用 T细胞专用冻存液按照适当的密度进行冻存， 经程序降温仪冷冻后保存于液氮中。 实施例 4： 流式细胞仪检测 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28的 MOI 检测及 TCR特异表达

HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28 MOI检测 流 式缓冲液配制： DPBS(Gibco, 14190250)、 2%FBS(Gibco, 10099141), 置 4。(2冰箱 备用。 取 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28细胞和 UT细胞 (对照组)， PBS洗涤 1次后弃上清， 加入 PE Dextramer HBV-S20(Immudex, WB3290-PE), 4。(2避光 30min后 PBS洗涤， 重悬， 最后流式细胞仪 (Beckman CytoFLEX)检测。 结 果如图 3b所示， HBV TCR表达较 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28更高， 各组 MOI=1.0时， TCR阳性率都在 30%以上， HBV TCR的阳性率更高达 60%, 说明三个 单克隆号的 HBV S20 TCR-T MOI梯度检测都稳定表达。

HBV TCR-T特异表达及错配率检测 流式缓冲液配制 ： DPBS、 2%FBS, 置于 4。(2冰箱中备用。 取 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28各组制备好的细胞和 UT细胞 (对照组)， PB S洗涤 1次后弃上清， 每组均分为 2份， 分别加入 PE Dextramer HBV- S20/BV421 PD-1和 PE Dextramer HBV-S20/ APC TCR vp 5.1 , 4。(2避光 30min后流式缓冲 液洗涤 3次， 重悬， 最后流式细胞仪检测。 结果如 图 4所示， HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28表达的错配率 均较低， 特异表达都达到 30%以上， 说明各组 HBV TCR-T都可以特异表达， 且错配率 较低。 实施例 5： HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28对肝癌细胞的杀伤 及细胞因子检测

M10 细胞 完全 培 养配 制： DMEM 、 10% FBS(Gibco, 10099141)、 1% Sodium Pyruvate(Gibco, 11360070)、 l%HEPES(Gibco, 15630080)、 l%NEAA(Gibco, 11140-050) 置于 4。(2冰箱中备用。

T细胞 培养基配制： PRIME-XV- T cell CDM(Irvine, 91154)、 400IU/ml IL-2。

HBV TCR> HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28对肝癌细胞的杀伤 (RTCA)

DO ： 取生长状态良好的 HepG2-LMS-LG细胞和 HepG2细胞 (阴性对照)， 消化后调 整细胞 密度至 4x l0 ⁵ /ml备用， 取一块 Collagen包被好的 RTCA用 96孔板， 加入 50ul/孔 M10培养基 进行仪器基线测定， 再每孔加入密度为 4xl0 ⁵ /ml对应的细胞 50ul, 静置约 5min后上机约 16h连续检测生长曲线；

D1 ： 取已测好 TCR%和细胞活率的 TCR-T、 UT, 按照阳性率准备效应细胞， 按照 效靶比 1 : 1和 1： 5, 加入效应细胞 50ul/孔， 上机连续检测杀伤曲线。

D3 ： 拷贝 RTCA的生长和杀伤曲线， 停机， 收集共培养上清进行细胞因子检测。 细胞 因子检测： 取 CBA试剂盒 (Human Thl/Th2 Cytokine Cytometric Bead Array Kit II,BD,551809) 平衡至室温。 吸取 2ml Assay Diluent复溶标准品至浓度 5000pg/ml, 室温平衡 30min。 标准 品配制： 取标准品， 标记为 S1 , 依次 2倍稀释标准品 S2-S9, S10为空白。 配 fiHuman Thl/Th2 Cytokine Capture Beads混合液： 取微球溶液 A1-A6, 震荡混匀 后按相同体积混合。 取 96孑 LU形底板， 加入 50ul的 Human Thl/Th2 Cytokine Capture Beads混合液， 再加 入 50ul的 Human Thl/Th2 PE Detection Reagent o 细胞 因子检测样本 400g 5min离心， 按每个样本 50ul加入样本检测孔， 标曲孔加入 50ul配制 SlO-Sl o 室温避光孵 育 180min, 加入 100ul Wash buffer, 300g 5min离心， 弃上清。 用 100ul2ntWash buffer重悬， 上样流式检测， 进行流式结果分析。 结 果显示： 经过 48H共孵育， 效靶比 1 :5的 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28对 HepG2-LMS-LG靶细胞的杀伤比例都达到 90%以上， UT对靶细胞无明显 杀伤 （图 5）。 效靶比 1 : 1时， HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28和 UT与 阴性靶细胞 （HepG2） 共孵育几乎不分泌细胞因子； 与阳性靶细胞共孵育时， HBV TCR-PD1-BB的 IFN-y细胞因子分泌约为 HBV TCR-PD1-28的 10倍， HBV TCR组的 20倍, UT没有明显细胞因子分泌 （图 5）。 实施例 6： HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28针对肿瘤耗竭进 行的靶细胞多轮刺激试验 针对实体瘤通过 PD-L1进行逃逸这一实际困难， 我们通过多轮肿瘤细胞刺激实验 模拟体内 T细胞受肿瘤细胞表面 PD-L1信号影响而耗竭的状况， 对 HBV TCR-PD1-BB 和 HBV TCR-PD1-28 （抗耗竭型 TCR-T细胞） 和 HBV TCR（仅表达 TCR的 T细胞） 杀伤肿瘤细胞的能力进行了对比， 以验证 PD-1辅助序列的作用。 靶细胞多轮刺激 ：

T细胞 培养基配制： PRIME-XV- T cell CDM（Irvine, 91154）、 400IU/mlIL-2。

D1 ： 取已测好细胞活率的 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB、 HBV TCR-PD1-28和 UT, 计数， 调整细胞密度至 5x l0 ⁵ /ml, 4ml加入 6孔板中， 加入等量的靶细胞 HepAD38-PDLl；

D5 ： 计数， 调整细胞量至 5x l0 ⁵ /ml, 4ml, 加入等量靶细胞进行第 2轮刺激；

D10： 收获细胞， 计数， 进行后续试验； 细胞杀伤功 能检测

M10 细胞 完全 培 养配 制： DMEM 、 10% FBS（Gibco, 10099141）、 1% Sodium Pyruvate（Gibco, 11360070）、 l%HEPES（Gibco, 15630080）、 l%NEAA（Gibco, 11140-050） 置于 4。（2冰箱中备用。

DO： 取靶细胞 HepAD38-PDLl消化后调整细胞密度至 4x l0 ⁵ /m 1备用， 取一块 Collagen 包被好的 RTCA用 96孔板， 加入 50ul/孔 M10培养基进行仪器基线测定， 再每孔加入 密度为 4x l05/ml对应的细胞 50ul, 静置约 5min后上机约 24h连续检测生长曲线；

D1 ： 取已测好 TCR%和细胞活率的 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB、 HBV TCR- PD1-28和 UT, 按照阳性活细胞数 4xl0 ⁵ /ml进行效应细胞准备， 按照效靶比 1:1 , 加入 效应细胞 50ul/孔， 上机连续检测杀伤曲线；

D3 ： 拷贝 RTCA的生长和杀伤曲线， 停机， 收集共培养上清进行细胞因子检测。 细胞 因子检测按照实施例 5细胞因子的检测步骤进行。 结果 显示： 经过两轮肿瘤细胞刺激后， 只有 HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1- 28对靶细胞 HepAD38-PDLl仍有明显杀伤作用， 而 HBV TCR已经基本没有功能， 这 表明 HBV TCR-PD1-BB和 HBVTCR-PD1-28在接受两轮肿瘤细胞刺激后仍然能� �保持 抗肿瘤作用， 且在 48小时仍可杀伤近 80%的肿瘤细胞， 表明其杀伤能力并未遭到影响 和减弱 (图 6) o 同时， 阴性靶细胞 (HepG2) 各组均未检测到细胞因子分泌， 与阳性 靶细胞 (HepAD38-PDLl ) 共孵育时， HBV TCR和 UT几乎不分泌细胞因子， HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28可检测到细胞因子 IFN-y和 TNF-a, 且 HBV TCR- PD1-BB组明显高于 HBV TCR-PD1-28组 (图 7)。 综上分析 ， HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR-PD1-28能够在多轮肿瘤刺激后仍维持 其抗肿瘤作用、 保持杀伤能力， 这是因为能够通过其抗耗竭序列 (PD-1辅助序列) 将 肿瘤细胞系表面 的刹车信号 (PD-L1 ) 转变成为刺激信号， 防止细胞提早进入耗竭状 态， 从而具有抗耗竭能力并起到持续杀伤作用。 实施例 7： HBV TCR和 HBV TCR-PD1-BB对各种靶细胞功能的杀伤及细胞因子� � 放检测 我们 接下来对 HBV TCR-PD1-BB的抗肿瘤效应也进行了分析。 因为 HBV TCR- PD1-BB所携带的激活信号包含有 HBsAg和 PD-L1两种， 为了验证 HBV TCR-PD1-BB 对于肿瘤细胞 表达 HBsAg和 PD-L1 的差异是否具有不同的杀伤能力， 我们构建了 HBsAg+/PD-Ll+、 HBsAg+/ PD-L1-、 HBsAg-/ PD -LI +、 HBsAg-/ PD-L1-四种肝癌细胞 系进行功能评估。

T细胞 培养基配制： PRIME-XV- T cell CDM(Irvine, 91154)、 400IU/mlIL-2。

M10 细胞 完全 培 养配 制： DMEM 、 10% FBS(Gibco, 10099141)、 1% Sodium Pyruvate(Gibco, 11360070)、 l%HEPES(Gibco, 15630080)、 l%NEAA(Gibco, 11140-050) 置于 4。(2冰箱中备用。

DO： 取上述 4种靶细胞消化后调整细胞密度至 4xl0 ⁵ /ml备用， 取一块 C ollagen包被好 的 RTCA用 96孔板， 加入 50ul/孔 M10培养基进行仪器基线测定， 再每孔加入密度为 4xl0 ⁵ /ml对应的细胞 50ul, 静置约 5min后上机约 16h连续检测生长曲线；

D1 ： 取已测好 TCR%和细胞活率的 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 UT, 按照阳 性活细胞数 4xlO ⁵ /mU 0.8xl0 ⁵ /ml进行效应细胞准备， 按照效靶比 1:1、 1:5, 加入效应 细胞 50ul/孔， 上机连续检测杀伤曲线；

D3 ： 拷贝 RTCA的生长和杀伤曲线， 停机， 收集共培养上清进行细胞因子检测。 细胞因子检测按照实施例 5细胞因子的检测步骤进行。 结果显示 (图 8), 未转染 T细胞未对两种靶细胞起到明显的杀伤作用， HBVTCR- PD1-BB和 HBV TCR对 HBsAg-/ PD-L1+和 HBsAg-/ PD-L1-靶细胞无明显杀伤作用。 在效靶比 1:5时， HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR对 HBsAg+靶细胞 24h杀伤均大于 60%, 且 HBV TCR-PD1-BB对 HBsAg+/PD-Ll+、 HBsAg+/ PD-L1-杀伤均强于 HBV TCR； HBV TCR-PD1-BB对 HBsAg+/PD-Ll+靶细胞的杀伤比 HBsAg+/ PD-L1-更强， 而 HBV TCR则相反。 此外 ， 细胞因子检测结果显示， HBV TCR-PD1-BB与 HBsAg-/PD-Ll+或 HBsAg- /PD-L1-靶细胞共培养时几乎不分泌细胞因子， 与 HBsAg+/PD-Ll-靶细胞共同培养时分 泌的 IFN-Y与 HBV TCR的分泌量相当， 而与 HBsAg+/PD-Ll+靶细胞共同培养时分泌 的 IFN-y显著高于 HBV TCR- 上述实验表 明， HBV TCR-PD1-BB能够靶向杀伤 HBsAg+的肝癌细胞， 由于 HBV TCR-PD1-BB 能将 PD-1 的抑制信号转换成活化刺激信号， 对于高表达 PD-L1 的 HBsAg+肝癌细胞， HBV TCR-PD1-BB的抗肿瘤作用更加突出， 表现为分泌的细胞因 子明显上升、 肿瘤杀伤能力更强。 此外， HBVTCR-PD1-BB仅靶向杀伤表达 HBsAg的 肝癌细胞， 针对只表达 PD-L1而不表达 HBsAg的肿瘤细胞， HBVTCR-PD1-BB无非特 异杀伤。 实施例 8： HBV TCR-PD1-BB和 HBV TCR靶细胞多轮刺激后增殖能力检测 在 多轮刺激后， T细胞受到刺激后是否能再次增值扩增的能力� �是抗肿瘤活性的 重要评价指标。 CPDF450 (Cell Proliferation Dye eFluor™ 450) 是一种可用于监测单个 细胞分裂的紫色荧光染料。 这种荧光染料可结合至任何含有伯胺的细胞蛋 白上， 随着 细胞分裂， 该染料会均匀分布到子细胞之间， 可通过该染料的荧光强度的连续减半情 况对细胞分裂次数进行检测。 靶细胞多轮刺激 ：

T细胞 培养基配制： PRIME-XV- T cell CDM(Irvine, 91154)、 400IU/mlIL-2。

D1 ： 取已测好细胞活率的 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 UT, 计数， 调整细胞 量至 5xl0 ⁵ /ml, 4ml加入 6孔板中， 加入等量的靶细胞 HepAD38-PDLl；

D2 : 计数， 观察细胞状态， 适时补液；

D5 ： 计数， 调整细胞量至 5xl0 ⁵ /ml, 4ml, 加入等量靶细胞进行第 2轮刺激； 以此类推， 共进行 4轮刺激， 按照计数和培养体积， 按细胞总量， 计算增殖倍数; 结果显示， 经过 3轮和 4轮刺激后， HBV TCR-PD1-BB仍保持很高的增殖活性， 总增 殖倍数突破 200倍， 明显高于 HBV TCR和 UT组（图 9）。 细胞增殖能力检测 ： 流式缓冲液配制 ： DPBS、 2%FBS, 置于 4。（2冰箱中备用； 取 2轮刺激后的 HBV TCR、 HBV TCR-PD1-BB和 UT细胞， 400g 5min离心弃上 清； 加入 CPDF450, 置培养箱内避光染色 30min； 加入流式缓冲液洗涤细胞 ， 400g 5min离心弃上清， 重复 2次； 用 T细胞培养基洗涤细胞 2次；

Dayl： 计数， 调整细胞量至 5xl0 ⁵ /ml, 4ml加入 6孔板中， 加入等量的靶细胞 HepAD38-PDLl；

Day5： 取细胞， 400g 5min离心弃上清， 加入流式缓冲液洗涤细胞； 用 100ul流式 缓冲液重悬细胞， 上样流式检测； 结果 显示， 经过 2轮刺激后阴性对照胞组和加入阳性靶细胞的 HBV TCR仅有 15%左右的细胞有增殖活性， 同时， 加入阳性靶细胞的 HBV TCR-PD1-BB组有超过 70%细胞仍有增殖活性 （图 9） 实施例 9： 免疫缺陷小鼠 HBsAg+人 HCC移植瘤模型 HBV TCR-PD1-BB体内药效和 成 试验 为 了了解 HBV TCR-PD1-BB在体内环境中对肿瘤细胞的杀伤作用� � 我们使用了免 疫缺陷小鼠和 HBsAg+肝癌细胞进行建模， 构建了小鼠的 CDX模型 （肿瘤细胞系移植 模型）， 以模拟临床肝癌病人在清淋化疗状态下接受不 同剂量的 HBV TCR-PD1-BB细 胞后对体内肝癌细胞的杀伤清除效果。 我 们使用了 NSG免疫缺陷小 鼠， 于 Day-12天在小鼠身体右测接种 b" 个 HBsAg+肿瘤细胞。 Day O时， 肿瘤大小达到约 120mm ³ , 我们将小鼠分为五组， 其中三 组接受不同剂量的 HBVTCR-PD1-BB细胞注射， 分别为高剂量组（IxlO ⁷ 个细胞 /只）、 中剂量组 （3x106个细胞 /只） 和低剂量组（1x106个细胞 /只））， 剩余两组作为对照组， 分别接受细胞冻存液 （Control） 和未转染的 T细胞（UT） 进行试验。 此后每间隔 3至 4天对肿瘤大小进行测量， 并收集数据。 试验结果 显示， 不同剂量的 HBV TCR-PD1-BB细胞均对肿瘤的生长有显著的抑制 作用， 接受 lx"个细胞的小鼠体内肿瘤体积明显小于其他两 个剂量组（图 10a） o 此外, 在回输 IxlO?个细胞的小鼠中， 肿瘤在三周时间内几乎完全消失， 同时 HBVTCR-PD1- BB 小鼠在 6天内未出现明显体重减轻（图 10b）。 这代表着 HBV TCR-PD1-BB在小鼠 体内能保持其抗癌作用， 且一定浓度的 HBV TCR-PD1-BB细胞对肿瘤细胞的清除有明 显效果。

HBV TCR-PD1-BB小鼠体内存续情况： 为了检测 HBV TCR-PD1-BB在小鼠体内的存续情况， 在细胞注射后的第 20天对 小鼠血液样本进行 了 qPCR的检测， 并使用 WPRE作为特 征片段以确定转染阳性的 HBV TCR-PD1-BB T细胞在小鼠外周血的基因拷贝数。 其中， 在回输 1 x lO ⁶ HBV TCR- PD1-BB组、 3 x 10 ⁶ HB V TCR-PD 1 -BB组和 b io’ HBV TCR-PD1-BB组的小鼠血液中可 以检测到明显的细胞存 续， 小鼠外周血 VCN拷贝数分别为 91.56± 37.34 copies/曲、 1256.35± 661.43 copies/曲、 6330.33± 4662.88 copies/|ig (P<0.01 ), 证明在回输 20天后 仍可见 HBV TCR-PD1-BB活性细胞的存在 (图 10c)。 另夕卜， HBV TCR-PD1-BB在小 鼠体内的扩增程度 (VCN拷贝数) 与肿瘤大小呈现出明显的负相关性， 在 VCN拷贝 数较高的小鼠实验组中， 肿瘤体积明显小于其他组别。 结果表明在 HBV TCR-PD1-BB 在小鼠体内扩增越明显， 对肿瘤的杀伤抑制作用更强。 实施例 10： 为免疫缺陷小鼠 HBsAg+PDLl+移植瘤模型 HBV TCR-PD1-BB体内 长期药效 实验目的： 对受试 TCR-T细胞在人源肝癌 HepAD38-PDLl-LG-G5细胞株皮下异种 移植 NCG雌性 小鼠模型中的药效学评价。 实验动物： NCG小鼠， 雌性， 6-8周龄， 体重 18-22克。 肿瘤细胞接种 ： 目的细胞株皮下接种于 NCG小鼠的右侧前腿腋窝， 接种量为 lx " 个细胞 ( PBS with Matrigel, 1 : 1 , 0.2 ml)。 平均肿瘤体积达到 100-150 mm ³ 分组开 始给药 给药方案如下： 结果显示 HBVTCR-PD1-BB高剂量组 (2*10 ⁷ ) 已完全清除小鼠体内肿瘤， 且持续 到 42天没有复发， 低剂量组 (0.2*10 ⁷ ) 也具有一定的抑瘤作用； HBV TCR高剂量组 (2*10 ⁷ ) 显示较强的肿瘤抑制能力， 但一个月后肿瘤有明显的复发现象， 而 HBV TCR 低剂量组、 阴性对照组 (UT) 和空白对照组 (Cryoprotectant) 都没有看到肿瘤抑 制作用 (图 11 )。

HBVTCR-PD1-BB 相比 HBVTCR-T在 HBsAg+PDLl+移植瘤模型有更好的体内药 效， 能克服体内免疫抑制， 且长期抑瘤不复发。 以上对本申请进行了详细介绍， 本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施 方 式进行了阐述， 以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的 方法及其核心思想； 同 时， 对于本领域的技术人员， 依据本申请的思想， 在具体实施方式及应用范围上均会 有改变之处， 综上， 本说明书内容不应理解为对本申请的限制。