Die Erfindung betrifft eine modifizierte alkalistabile Lactatdehydrogenase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und hre Verwendung in Testreagenzien, insbesondere zur

Lactat- und Alanin-Aminotransferaseoestimmung.

Lactatdehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27 und EC 1.1.1.28) ist eine Oxidoreduktase (MG 100.000 - 150.000) , die m verschiedenen Organen (Leber, Herz) und in Muskeln von Säugern sowie in verschiedenen Mikroorganismen, wie z.B. Lactobacillus, Bacillus stearothermophilis und Pedio- coccus vorkommt und die Gleichgewichtsreaktion

Pyruvat + NADH + H ⁺ <—> Lactat + NAD ⁺

katalysiert, wobei NAD ⁺ und NADH Nikotinamid-adenm- dmucleotid m seiner oxidierten bzw. reduzierten Form bedeutet. Diese Reaktion ist im anaeroben Stoffwechsel

(z.B. im arbeitenden Muskel und bei Milchsäurebakterien) , zur Regenerierung des in der Glycolyse benötigen NAD ⁺ von Bedeutung. LDH findet in der enzymatisehen Analyse m ge¬ koppelten optischen Tests Verwendung, z.B. zur Bestimmung von Lactat gemäß obigem Reaktionsschema, wobei die Um¬ setzung von Lactat zu Pyruvat bevorzugt im alkalischen pH-Bereich > 8,5 durchgeführt wird, die Umsetzung von Pyruvat zu Lactat dagegen bei einem pH-Wert < 8,0 statt¬ findet. Zum anderen ist LDH von Bedeutung zur Bestimmung von Alanin-Ammotransferase (EC 2.6.1.2, ALAT, alte Be¬ zeichnung GPT) im Serum, Plasma oder Blut nach dem Reaktlonsschema

GPT - Ketoglutarat + L-Alamn → 1-Glutamat + Pyruvat

LDH

Pvruvat + NADH + H ⁺ → Lactat + NAD ⁺

In den derzeitigen kommerziellen Testreagenzien zur Be¬ stimmung von GPT w rd in einem Reagenz (Rl) ein Gemisch aus LDH und NADH als Lyophilisat bzw. Granulat angeboten, in einer getrennten Lösung ist das α-Ketoglutarat als

Startreagenz (R2) enthalten. Das LDH und NADH enthaltende Lyophilisat oder Granulat Rl wird erst kurz vor der Mes¬ sung im Testpuffer gelöst. Da die GPT-Best mmung bei einem pH-Wert von 7,5 bis 7,8 durchgeführt wird, NADH aber erst oberhalb eines pH-Wertes von 8,5 in Lösung über einen längeren Zeitraum stabil ist, ist die Haltbarkeit der rekonstituierten Lösung sehr begrenzt.

Daneben erfordert die Herstellung solcher Reagenzien einen erhöhten Kosten- und Materialaufwand, der durch

Lyophilisations- oder Granulierschritte unter Verwendung von für die Funktion des Reagenzes an sich nicht rele¬ vanten galenischen Hilfsstoffen sowie durch einen zusätz¬ lichen Packmittelbedarf bedingt ist. Das m dieser Form angebotene Reagenz entspricht nicht mehr dem aktuellen

Standard, auch sind beim Rekonstituieren des Lyophilisats Handlingsfehler nicht ausgeschlossen.

Andererseits werden die Kombinationsmöglichkeiten der Testreagenzien zur Bestimmung von GPT dadurch einge¬ schränkt, daß die LDH-Präparate eine α-Ketoglutarat-DH- Nebenaktivität aufweisen, und somit die LDH nicht zusam¬ men mit dem α-Ketoglutarat m einem Reagenz untergebracht werden kann. Weiter ist das α-Ketoglutarat bei einem pH- Wert > 8,5 aufgrund von Hydrolyse instabil, wogegen die NADH erst oberhalb dieses pH-Wertes im Fiüssigreagenz über einen längeren Zeitraum genügend stabil ist.

Bedingt durcn die pH-Inkompatibilität der LDH unα der Co- Faktoren könnte die Herstellung von ausschließlichen Flüssigreagenzien derzeit nur durch die Bereitstellung drei verschiedener Reagenzien (LDH, α-Ketogiutarat und NADH als Emzelreagenzien) realisiert werden, d e der Nutzer vor der Anwendung zur vereinigen hat, da die meisten Analysenautomaten lediglich die Pipettierung von zwei verschiedenen Reagenzien erlauben. Auch diese ge¬ brauchsfertigen Lösungen besitzen nur eine sehr begrenzte Haltbarkeit.

Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein Testreagenz zu entwickeln, das e ne gebrauchsfertige Lösung aus LDH unα NADH umfaßt und über einen Zeitraum von mindestens 12 Monaten lagerstabil ist. Aus NADH-Stabilitätsgründen setzt dies voraus, daß auch die verwendete LDH bei einem pH-Wert > 8,5 in Lösung ausreichend stabil ist, so daß die Funktionsfähigkeit des Flüssigreagenzes über diesen Haltbarkeitszeitraum erhalten bleibt. Aufgabe der Erfin- düng war es deshalb auch, eine bei pH-Werten > 8,5 n

Lösung bei Kühlschranktemperaturen alkalistabile LDH zur Verfügung zu stellen.

Es wurde gefunden, daß die Aufgabe der Erfindung mit einer modifizierten LDH gelöst werden kann, die zum einen kovalent an ein wasserlösliches aktiviertes Polysaccharid gebunden ist und gleichzeitig intramolekular vernetzt ist. Im Sinne der Erfindung sind wasserlösliche Poly¬ saccharide, Dextrane, Stärken, Zucker oder synthetische Zuckerpolymere. Bevorzugt wird die LDH an Dextrane ge¬ bunden.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß die LDH an ein mit l-Cyano-4-dιmethyl- amino-pyndiniumbromid(CDAP-Br) aktiviertes Dextran kovalent gebunden und gleichzeitig intramolekular ver¬ netzt wird. Die intramolekulare Vernetzung erfolgt erfin¬ dungsgemäß bevorzugt über Tπethanolamm.

Modifizierte, bei pH-Werten > 8,5 alkalistabile LDH st bisner nicnt bekannt Die m der Literatur bescnrieoenen Moαifizierungen durcn Vernetzung m t Glutaraidenyα '3ιo- tecnnology and Applied Biocnemistry, 9 (1987) 389 - ^00) durcn Acetamidierung (Biochimica et Biopnysica Acta, 484

(1977) 1 - 8) oder als Dextran-Kon^ugat zusammen mit Hexamethylendiamm (J. Fac. Agric . Kyushu Univ , 38

(1993) 1-2, 111-117) liefern nicht die erfmdungsgemaße Alkalistabilität der LDH.

Die LDH für die Erfindung wird aus einem Saugetierorgan, bevorzugt aus Herz und insbesondere bevorzugt aus Schweinenerz gewonnen. Es zeigte sich, daß die ikro- biellen LDH's - obwohl sie generell etwas stabiler sinα als die Enzyme aus Säugetierorganen - eine um den Faktor 10 höhere Michaelis-Konstante Km gegen Pyruvat und NADH besitzen, was für die TransaminasebeStimmung nachteilig ist. D e erfmdungsgemaße LDH besitzt einen, dem entspre¬ chenden Enzym aus Säugetierorganen analogen vorteilhaften niedrigen km-Wert .

Die LDH-Isolierung aus Schweineherz erfolgt nach an sich bekannten Methoden, so z.B. nach Jaenicke, R. und R Rudolph, FEBS Symp. 49, 351-367 (1977) und Storey, K B. , Co p. Biochem. Physiol . , 56, 181-187 (1977) .

Durch die erfindungsgemäße Modifizierung von LDH aus Schweineherz mit aktiviertem Dextran und Triethanolamm als Neutralisationsbase wird eine LDH erhalten, die m Lösung eine Langzeitstabilitat von mindestens 12 Monaten bei einem pH-Wert > 8,5 besitzt und im Vergleich zu unmo- difizierter LDH aus Mikroorganismen oder Saugetierorganen eine um ein Vielfaches höhere Restaktivitat aufweist. Insbesondere hat sich gezeigt, daß die erfmdungsgemaße LDH in einem pH-Wert-Bereich von ca. 9,0 bis 10,0 eine akzeptable Stabilität aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Her¬ stellung modifizierter alkalistabiler Lactatdehydroge¬ nase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in an sich be¬ kannter Weise eine wäßrige, ein aktiviertes Polysaccharid enthaltende Lösung zunächst mit einem Vernetzungsmittel inkubiert und anschließend mit einer Lactatdehydrogenase- Lösung versetzt und inkubiert wird. Gemäß der Erfindung wird das Polysaccharid in Wasser gelöst, die Lösung ge¬ kühlt (vorzugsweise auf Temperaturen zwischen l°C bis I0°C) und anschließend das Polysaccharid durch Zugabe des Aktivierungsmitteis aktiviert. Sofort nach Auflösung des Aktivierungsmittels wird die Lösung des Vernetzungs- mitteis zugegeben und unter Kühlung kubier . Zur wei¬ teren Umsetzung mit der LDH-Lösung wird das kalte Reak- tionsgemisch dann auf Umgebungstemperatur erwärmt.

Die erfindungsgemäß hergestellte, modifizierte LDH ist aufgrund ihrer Alkalistabilität zur Verwendung in Test- reagenzien hervorragend geeignet. Insbesondere kann die erfindungsgemäß modifizierte LDH in Testreagenzien zur Bestimmung von Lactat bzw. von Reaktionsfolgeprodukten, die über den Schritt der Lactatbildung führen, und in Testreagenzien zur Bestimmung von Alamn-Aminotransferase Verwendung finden.

Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Testreagen¬ zien, die eine erfindungsgemäß modifizierte, alkalista- bile LDH neben üblichen Puffern und gegebenenfalls an¬ deren Hilfs- und Zusatzstoffen enthalten. Insbesondere läßt sich mit der erfindungsgemäßen modifizierten LDH ein Flüssigreagenz zur Verfügung stellen, das eine lager¬ stabile wäßrige Lösung mit einem pH-Wert > 8,5, bevorzugt ca. 9,0 bis 10,0, umfaßt, die die erfindungsgemäß modifi¬ zierte LDH und NADH enthält. Diese Lösung ist ohne die aufwendige Lyophilisation und Granulierung auch nach 12 Monaten voll einsatzfähig. Insbesondere zur Bestimmung von Alamn-Aminotransferase kann damit ein Flüssigrea¬ genzkonzept realisiert werden, das zum einen eine ge-

brauchsfertige alkalistabile Lösung mit LDH und NADH umfaßt und zum anderen das α-Ketoglutarat als E zeirea- genz in einem Puffer mit einem für die GPT optimalen pH- Wert von 7,5 bis 7,8 zur Verfügung stellt. Damit wird ein gebrauchsfertiges Testreagenz zur Bestimmung von Alamn- Aminotransferase zur Verfügung gestellt, das zwei Flüs¬ sigreagenzien umfaßt, die keine weiteren Arbeitsscnntte zum Herstellen von Testlόsungen vom Anwender erfordern, wodurch Handlingsfehler vermieden werden.

Anschließend soll die Erfindung an Beispielen näher er¬ läutert werden, ohne sie darauf einzuschränken.

Beispiel l ;

Bindung der Lactatdehydrogenase an Dextran

2,0 g Dextran T40 (Fa. Roth) werden in 40 ml dest. Wasser gelöst und auf 2 bis 6 °C gekühlt. Unter Rühren werden 667 mg CDAP-Bromid zugegeben und gelöst. Anschließend wird sofort 8 ml einer 0,2 M Triethanolam lösung zugege¬ ben und 10 mm bei 2 bis 6 °C unter Rühren inkubiert. Der pH-Wert des kalten Reaktionsgemisches wird am Ende der Inkubation mit einer 1 M Kaliumdihydrogenphosphatlösung sofort auf 7,6 eingestellt und anschließend auf 20 bis 25 °C erwärmt.

Die aktivierte Dextranlösung wird mit 50 ml einer LDH- Lösung in 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,6 (20mg/ml Protein enthaltend, LDH aus Schweineherz) vereinigt und unter Rühren 2 h bei 20 bis 25°C inkubiert. Anschließend wird die Polymerisationsreaktion mit 2,5 ml einer 1 M Lysinhydrochloridlösung abgestoppt und das Reaktionsge¬ misch gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,6 dialy- siert . Das Dialysat wird mit 2,0 g Mannit versetzt, über einem 0,22 μ-Membranfilter keimarm filtriert und lyophilisiert . Die Aktivitätsausbeute beträαt 45 bis 60%.

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Der Km-Wert entsprach dem des nativen Enzyms.

Beispiel 7:

Stabilität von LDH in CAPSO-Puffer bei 60 °C

30 U/ml LDH wird in 50 mM CAPSO-Puffer, pH = 9,4 gelöst, 1 h bei 60 °C inkubiert und die Restaktivität des Enzyms bestimmt:

Beispiel

Stabilität von LDH in CAPSO-Puffer bei 35 °C

30 U/ml LDH werden in 50 mM CAPSO, pH = 9,4 gelöst und 2 Wochen bei 35 °C inkubiert.

Be isp ie l -, :

Thermostaciiität von LDH

30 U/ml LDH werden m einem 100 mM Tris-Puffer, pH 7 , 5 unter Zusatz von 500 mM Alanin (Puffer entspricht der Empfehlung der IFCC für die Bestimmung GPT) bzw. 50 mM CAPSO, pH = 9,4 gelöst und die Lösungen 30 min bei ver¬ schiedenen Temperaturen inkubiert . Die in nachfolgender Tabelle angegeoenen Werte der Thermostabilitat entspechen der Temperatur, bei der die Restaktivität der LDH noch > 90% betragt.

Abkürzungsverzeichnis :

NAD ^~ : ß-N cotinam d-adenm-dinucleotid

NADH: ß-Nicotmamid-adenm-dinucleotid, reduziert

LDH: Lactatdehydrogenase

GPT : Glutamat- Pyruvat -Transam ase

ALAT: Alamn-Aminotrans erase

α-KGDK: α-Ketoσiutaratdehydrogenase

7DAP-3r : 1 -Cyano-4 -dimethylammo-pyr diniumbrom d

CAPSO: 3- (Cyclohexylammo) - 2 -hydroxy- 1 -propansulronsaure

IFCC: International Federation of Clinical Chemistry