Modifizierte Stärke aus Pflanzen, Pflanzen, die diese synthetisieren, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen, die aufgrund gentechnischer Veränderungen eine modifizierte Stärke synthetisieren, insbesondere eine Stärke, die im Ver¬ gleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verän¬ derte Verkleisterungseigenschaften und einen erhöhten Phos¬ phatgehalt besitzt. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung der transgenen Pflanzen sowie die aus diesen Pflanzen isolierbare modifizierte Stärke. Die Erfindung be¬ trifft ebenfalls die Verwendung von DNA-Sequenzen, die Dis- proportionierende Enzyme (EC 2.4.1.25) codieren, für die Herstellung von transgenen Pflanzen, die eine verringerte Aktivität dieser Enzyme aufweisen und die eine modifizierte Stärke synthetisieren.

Das Polysaccharid Stärke, das einen der wichtigsten Spei¬ cherstoffe im Pflanzenreich darstellt, findet neben der Ver¬ wendung im Nahrungsmittelbereich auch eine breite Verwendung als nachwachsender Rohstoff für die Herstellung industriel¬ ler Produkte. Um die Anwendung dieses Rohstoffes in mög¬ lichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es notwen¬ dig, eine große StoffVielfalt und eine Anpassung an die je¬ weiligen Anforderungen der zu verarbeitenden Industrie zu erreichen.

Obwohl Stärke aus einem chemisch einheitlichen Grundbau¬ stein, der Glucose, aufgebaut ist, stellt Stärke keinen ein¬ heitlichen Rohstoff dar. Es handelt sich dabei eher um ein komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Verzweigungsgrades und des Auftre¬ tens von Verzweigungen der Glucoseketten unterscheiden. Man unterscheidet insbesondere die Amylose-Stärke, ein im we¬ sentlichen unverzweigtes Polymer aus α-l,4-verknüpf en Glu-

cosemolekülen, von der Amylopektin-Stärke, die ein Gemisch aus unterschiedlich stark verzweigten Glucoseketten dar¬ stellt, wobei die Verzweigungen durch das Auftreten von c_- 1, 6-glycosidischen Verknüpfungen zustande kommen. Die molekulare Struktur der Stärke, die zu einem großen Teil durch den Verzweigungsgrad, das Amylose/Amylopektin-Verhält- nis, die durchschnittliche Kettenlänge sowie das Vorhanden¬ sein von Phosphatgruppen bestimmt wird, ist ausschlaggebend für wichtige funktioneile Eigenschaften der Stärke bzw. ihrer wässrigen Lösungen. Als wichtige funktioneile Eigen¬ schaften sind hierbei beispielsweise zu nennen die Löslich¬ keit, das Retrogradierungsverhalten, die Filmbildungseigen¬ schaften, die Viskosität, die Farbstabilität, die Verklei- sterungseigenschaften, d.h. Binde- und Klebeigenschaften, sowie die Kältestabilität . Auch die Stärkekorngröße kann für verschiedene Anwendungen von Bedeutung sein.

Die Anpassung der aus Pflanzen isolierbaren Stärke an be¬ stimmte industrielle Verwendungszwecke erfolgt häufig mit Hilfe chemischer Modifikationen, die in der Regel zeit- und kostenintensiv sind. Es erscheint daher wünschenswert, Mög¬ lichkeiten zu finden, modifizierte Stärke, die in ihren Eigenschaften bereits den Anforderungen der verarbeitenden Industrie entspricht, direkt in Pflanzen zu synthetisieren und die modifizierte Stärke aus diesen Pflanzen zu isolie¬ ren.

Herkömmliche Wege zur Herstellung von Pflanzen, die eine im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen modifizierte Stärke syntheti¬ sieren, bestehen in klassischen Züchtungsverfahren und der Erzeugung von Mutanten. So wurde beispielsweise bei Mais eine Mutante erzeugt, die eine Stärke mit veränderten Visko¬ sitätseigenschaften synthetisiert (US Patentschrift 5,331,108) , sowie eine Maissorte ( waxy maize) durch Züchtung etabliert, deren Stärke zu nahezu 100 % aus Amylopektin be ^¬ steht (Akasuka und Nelson, J. Biol. Chem. 241 (1966) , 2280- 2285) .

Alternativ können Pflanzen, die eine Stärke mit veränderten Eigenschaften synthetisieren, mit Hilfe gentechnischer Ver-

fahren erzeugt werden. Beschrieben wurde beispielsweise in mehreren Fällen die gentechnische Veränderung von Kartoffel- pflanzen, mit dem Ziel der Veränderung der in den Pflanzen synthetisierten Stärke (z.B. WO 92/11376; WO 92/14827) . Ob¬ wohl bereits in einigen Fällen die Herstellung einer verän¬ derten Stärke in Pflanzen gelang, besteht nach wie vor Be¬ darf an Verfahren zur Herstellung einer im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke modifizierten Stärke, die sich in speziellen industriellen Verarbeitungs- prozessen bevorzugt einsetzen läßt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, die sich hinsichtlich ihrer physika¬ lischen und chemischen Eigenschaften von natürlicherweise in den Pflanzen synthetisierter Stärke unterscheidet und somit für spezielle Verwendungszwecke besser geeignet ist, sowie Verfahren zur Herstellung derartiger Pflanzen.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Pa¬ tentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen¬ zellen, bei denen die Aktivität eines "Disproportionierenden Enzyms" (auch 4-α_-Glucanotransferase; EC 2.4.1.25; im fol¬ genden D-Enzym genannt) verringert ist im Vergleich zu nicht-transformierten Zellen, entweder aufgrund der Einfüh¬ rung und Expression einer exogenen DNA-Sequenz oder der Ein¬ führung einer Mutation in einem Gen, das ein Disproportio- nierendes Enzym codiert.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß transgene Pflan¬ zen, die derartige Zellen enthalten und die im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen eine verringerte Aktivität des D-Enzyms aufweisen, eine modifizierte Stärke synthetisieren, die sich hinsichtlich ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaf¬ ten stark von natürlicherweise in Pflanzen synthetisierter

Stärke unterscheidet. Wäßrige Lösungen der in diesen Pflan¬ zen synthetisierten Stärke weisen beispielsweise im Ver¬ gleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke ein deutlich verändertes Viskositätsverhalten auf. Eine verrin¬ gerte Aktivität des D-Enzyms im Vergleich zu Wildtyp-Pflan¬ zen bedeutet dabei, daß diese Pflanzen nur 50 %, vorzugs¬ weise weniger als 25 % und besonders bevorzugt weniger als 10 % der D-Enzymaktivität von Wildtyp-Pflanzen aufweisen. D-Enzyme sind dabei definiert als Enzyme, die den Transfer von Glucanen von einem 1, 4-α;-D-Glucan auf ein anderes 1,4-0.- D-Glucan oder auf Glucose katalysieren. Effektive Glucan-Do- natoren sind dabei Maltooligosaccharide, lösliche Stärke, sowie Amylopektin (Takaha et al . , J. Biol . Chem. 268 (1993) , 1391-1396) . In der Regel wird eine Maltose-Gruppe übertra¬ gen, außer wenn Maltotetraose als Donor dient. In diesem Fall wird Maltotriose übertragen.

"Exogene DNA-Sequenz" bedeutet, daß die eingeführte DNA-Se¬ quenz entweder heterolog in bezug auf die transformierte Pflanzenzelle ist, d.h. aus einer Zelle mit einem anderen genetischen Hintergrund stammt, oder homolog in bezug auf die transformierte Zelle ist, aber in diesem Fall nicht in seiner natürlichen Umgebung im Genom der transformierten Zelle lokalisiert ist. Das heißt, daß die exogene DNA-Se¬ quenz an einem Ort im Genom lokalisiert ist, an dem sie na¬ türlicherweise nicht vorkommt, und daß sie von Genen flan¬ kiert ist, die natürlicherweise nicht benachbart zu ihr lie¬ gen.

"Expression" bedeutet, daß die exogene DNA-Sequenz in den Zellen zumindestens transkribiert wird. Codiert sie ein Pro¬ tein, so umfaßt dieser Begriff auch die Translation. Die Verringerung der D-Enzyτnaktivität in den erfindungsge¬ mäßen Zellen kann prinzipiell auf verschiedene Art und Weise bewirkt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verringerung der D-Enzymaktivität in den transgenen Zellen durch die In-

hibierung der Synthese eines funktioneilen D-Enzyms in den Zellen erreicht.

"Inhibierung der Synthese" bedeutet dabei, daß die Synthese eines endogenen D-Enzyms im Vergleich zu nichttransformier- ten Zellen verringert ist, vorzugsweise um mindestens 50 %, insbesondere um mindestens 75 % und besonders bevorzugt um mindestens 90 %. Nachweisbar ist die Verringerung der Syn¬ these beispielsweise durch Nachweis des Enzyms im Western- Blot mit Hilfe D-Enzym-spezifischer Antikörper. Die D- Enzymaktivität kann auch bestimmt werden wie in Takaha et al (J. Biol. Chem. 268 (1993) , 1391-1396) beschrieben. Möglich ist ferner der Nachweis der D-Enzym-Transkripte im Northern- blot.

"Punktione11" bedeutet, daß das Enzym seine natürliche oben beschriebene Enzymaktivität aufweist und diese etwa so hoch ist wie in Wildtyp-Zellen.

Eine Verringerung der Synthese eines D-Enzyms in den erfin¬ dungsgemäßen Zellen kann auf verschiedene Art und Weise er¬ reicht werden. Eine erste Möglichkeit ist die Veränderung der endogenen, in dem Genom der Zelle vorliegenden Sequen¬ zen, die D-Enzyme codieren, oder von deren regulatorischen Regionen.

Diese können beispielsweise durch Transposonmutagenese, an¬ dere herkömmliche Mutageneseverfahren oder "gene tagging" inaktiviert werden, so daß die Synthese endogener D-Enzyme weitgehend oder vollkommen inhibiert ist.

Möglichkeiten, die genomischen Sequenzen zu verändern umfas¬ sen beispielsweise Gendisruption, Insertion, Deletion, Re¬ kombination, Addition etc.

Neben einer vollständigen Inaktivierung der genomischen DNA- Sequenzen, die D-Enzyme codieren, ist es auch denkbar, diese derart zu modifizieren, daß kein funktionelles D-Enzym in den Zellen mehr synthetisiert wird.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Transkription oder Translation der endogen in der Zelle vorliegenden Gene

für D-Enzyme zu stören. Techniken, wie dies erreicht werden kann, sind dem Fachmann bekannt.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verringe¬ rung der Synthese funktioneilen D-Enzyms in den erfindungs¬ gemäßen Zellen mittels eines antisense-Effektes .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verringerung der Synthese funktionellen D-Enzyms in den er¬ findungsgemäßen Zellen mittels der Expression eines Ribo- zy s, das spezifisch Transkripte spaltet, die D-Enzym codie¬ ren. Besonders bevorzugt sind hierbei Ribozyme, die mit Se¬ quenzen kombiniert sind, die einen antisense-Effekt bewir¬ ken, d.h. die komplementär zu D-Enzym-Transkripten sind.

Eine weitere Möglichkeit zur Verringerung der Synthese funk¬ tioneilen D-Enzyms besteht in der Ausnutzung eines Co- suppressions-Effektes.

Eine weitere Möglichkeit der Verringerung der D-Enzymaktivi¬ tät in Pflanzenzellen besteht in der Inaktivierung bereits synthetisierter D-Enzyme.

Somit codiert in einer bevorzugten Ausführungsform die exo¬ gene DNA-Sequenz ein Polypeptid, das zu einer Verringerung der D-Enzymaktivität führt. Denkbar ist hierbei beispiels¬ weise die Expression von D-Enzym-spezifischen Antikörpern.

Soll die exogene DNA-Sequenz in den transgenen Zellen expri- miεrt werden, so wird sie mit regulatorischen Elementen ver¬ knüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewähr¬ leisten. Hierzu zählen beispielsweise Promotoren. Für die Expression kommt im Prinzip jeder in pflanzlichen Zellen ak¬ tive Promotor in Frage. Es können sowohl virale als auch pflanzliche Promotoren verwendet werden. Der Promotor kann homolog oder heterolog sowohl in bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein als auch in bezug auf die exogene DNA- Sequenz. Geeignet sind sowohl Promotoren, die eine konstitu-

tive Expression gewährleisten, wie beispielsweise der 35S- Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al . , Nature 313 (1985) 810-812) und das in der WO 94/01571 beschriebene Promotorkonstrukt, als auch Promotoren, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt (siehe bei¬ spielsweise WO 93/07279) oder in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachgeschalteter Sequenzen füh¬ ren (siehe z. B. Stockhaus et al . , EMBO J. 8 (1989) 2245- 2251) . Präferentiell werden Promotoren eingesetzt, die in typischen "sink"-Organen von Pflanzen aktiv sind. "Sink"-Ge¬ webe sind definiert als Nettoimporteure des in photosynthe¬ tisch aktiven Geweben fixierten Kohlenstoffs. Typische sink- Organe sind z.B. Wurzeln, Blüten und Speicherorgane. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden ferner bevorzugt Promo¬ toren verwendet, die in den stärkespeichernden Organen der zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Als stärkespei¬ chernde Organe kommen z.B. die Samen von verschiedenen Ge¬ treidearten, Mais, Reis, und Erbse in Frage, sowie die Knol¬ len von Kartoffeln. Bekannt ist zum Beispiel der USP-Promo- tor aus Vicia faba , der eine samenspezifische Expression in Vicia faba sowie in anderen Pflanzenarten gewährleistet (Fiedler et al. , Plant Mol. Biol . 22 (1993) , 669-679; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet . 225 (1991) , 459-467) , so¬ wie der Promotor des Acyl Carrier Protein-Gens (Baerson et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) , 255-267) . Promotoren, von denen bekannt ist, daß sie im Endosperm von Maiskörnern ak¬ tiv sind, sind beispielsweise die Promotoren der Zein-Gene (Pedersen et al . , Cell 29 (1982) , 1015-1026; Quattrocchio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990) , 81-93) . Zur Transformation der Kartoffel können insbesondere, aber nicht ausschlie߬ lich, Promotoren der Patatingene der Klasse I aus Kartoffel verwendet werden, die eine knollenspezifische Expression ge¬ währleisten, wie beispielsweise der B33-Promotor (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989) , 23-29) .

Neben dem Promotor können die regulatorischen Elemente auch DNA-Sequenzen enthalten, die eine weitere Steigerung der Transkription gewährleisten, beispielsweise sogenannte

Enhancer-Elemente. Derartige Regionen können von viralen Ge¬ nen oder geeigneten eukaryontischen Genen gewonnen werden oder synthetisch hergestellt werden. Sie können homolog oder heterolog in bezug auf den verwendeten Promotor sein. Codiert die exogene DNA-Sequenz ein Polypeptid, so kann sie ferner verknüpft sein mit Sequenzen, die im transkribierten Bereich liegen und eine effizientere Translation der synthe¬ tisierten RNA in das entsprechende Protein gewährleisten, z.B. mit sogenannten Translationsenhancern.

Die regulatorischen Elemente können ferner Sequenzen umfas¬ sen, die der korrekten Beendigung der Transkription sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript die¬ nen, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Trans¬ kripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Li¬ teratur beschrieben und sind beliebig austauschbar. Bei¬ spiele für derartige Terminationssequenzen sind die 3 ' - nichttranslatierten Regionen, die das Polyadenylierungssig- nal des Nopalin-Synthase-Gens (NOS-Gen) oder des Octopinsyn- thase-Gens (Gielen et al., EMBO J. 8 (1989) , 23-29) aus Agrobakterien umfassen, oder die 3 ' -nichttranslatierten Re¬ gionen der Gene der Speicherproteine aus Sojabohne, sowie die der Gene der kleinen Untereinheit der Ribulose-1, 5- Bisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO) .

Wird für die Verringerung der Synthese funktioneilen D- Enzyms eine antisense-RNA exprimiert, so kommt für die exo¬ gene DNA-Sequenz, die diese codiert prinzipiell jede belie¬ bige DNA-Sequenz in Frage, die ein D-Enzym codiert und die eine ausreichend hohe Homologie aufweist, um in den Zellen einen antisense-Effekt zu bewirken. Bevorzugt werden DNA-Se¬ quenzen aus Pflanzen verwendet. Es handelt sich dabei vor¬ zugsweise um eine DNA-Sequenz homologen Ursprungs in bezug auf die zu transformierende Pflanzenspezies. Es können je¬ doch auch DNA-Sequenzen aus anderen Spezies verwendet wer ^¬ den, solange gewährleistet ist, daß die Homologie zu den en ^¬ dogenen DNA-Sequenzen der zu transformierenden Spezies hoch

genug ist, um einen antisense-Effekt zu gewährleisten. Dabei sollte die Homologie höher als 80 %, vorzugsweise höher als 90 % und insbesondere höher als 95 % sein.

Es können Sequenzen bis zu einer Mindestlänge von 15 bp ver¬ wendet werden. Eine inhibierende Wirkung ist aber auch bei der Verwendung kürzerer Sequenzen nicht ausgeschlossen. Be¬ vorzugt werden längere Sequenzen zwischen 100 und 500 Basen¬ paaren verwendet, für eine effiziente antisense-Inhibition werden insbesondere Sequenzen mit einer Länge über 500 Ba¬ senpaaren verwendet. In der Regel werden Sequenzen verwen¬ det, die kürzer als 5000 Basenpaare sind, bevorzugt Sequen¬ zen, die kürzer als 2500 Basenpaare sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsge¬ mäßen Zellen transgene Kartoffelzellen, die mit einer DNA- Sequenz aus Kartoffel transformiert sind, die das D-Enzym codiert, oder mit Teilen einer derartigen Sequenz, insbeson¬ dere der DNA-Sequenz, die von Takaha et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) , 1391-1396) beschrieben wird (zugänglich in der GenEMBL-Datenbank unter der Zugriffsnummer X68664) . Es ist jedoch auch möglich andere DNA-Sequenzen zu verwen¬ den, die D-Enzyme codieren und die sich aus anderen Organis¬ men, insbesondere aus anderen Pflanzenspezies, isolieren lassen, z.B. mit Hilfe der bereits bekannten Sequenzen über Hybridisierung oder andere Standardtechniken.

Zur Inhibierung der Synthese von D-Enzym in Zellen transge- ner Pflanzen mit Hilfe eines geeigneten Ribozyms, gibt es wiederum verschiedene Möglichkeiten.

Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Moleküle, die in der Lage sind, RNA-Moleküle an spezifischen Zielsequenzen zu spalten. Mit Hilfe gentechnologischer Methoden ist es mög ^¬ lich, die Spezifität von Ribozymen zu verändern. Es existie ^¬ ren verschiedene Klassen von Ribozymen. Für die praktische Anwendung mit dem Ziel, das Transkript eines bestimmten Gens gezielt zu spalten, werden bevorzugt Vertreter zweier ver ^¬ schiedener Gruppen von Ribozymen verwendet. Die eine Gruppe

wird gebildet von Ribozymen die dem Typ der Gruppe I-Intron- Ribozymen zuzuordnen sind. Die zweite Gruppe wird von Ribo¬ zymen gebildet, die als charakteristisches Strukturmerkmal ein sogenanntes "hammerhead"-Motiv aufweisen. Die spezifi¬ sche Erkennung des Ziel-RNA-Moleküls kann modifiziert werden durch Änderung der Sequenzen, die dieses Motiv flankieren. Diese Sequenzen bestimmen über Basenpaarung mit Sequenzen im Zielmolekül die Stelle, an der die katalytische Reaktion und somit die Spaltung des Zielmoleküls erfolgt. Da die Sequenz- anforderungen für eine effiziente Spaltung äußerst gering sind, erscheint es daher im Prinzip möglich, spezifische Ri- bozyme für praktisch jedes beliebige RNA-Molekül zu ent¬ wickeln.

Die Herstellung genetisch veränderter Pflanzenzellen, deren Aktivität des D-Enzyms reduziert ist, kann daher auch erfol¬ gen durch Einführung und Expression eines rekombinanten dop- pelsträngigen DNA-Moleküls in Pflanzen, das sich zusammen¬ setzt aus:

(a) einem in Pflanzen funktionalen Promotor

(b) einer DNA-Sequenz, die eine katalytische Domäne eines Ribozyms codiert und die flankiert ist von DNA-Sequen¬ zen, die homolog sind zu Sequenzen des Zielmoleküls, und

(c) , falls erforderlich, einem in Pflanzen funktionalen Signal für die Transkriptionstermination und Poly- adenylierung eines RNA-Moleküls .

Für die unter Punkt (b) genannte Sequenz kommt z.B. die ka¬ talytische Domäne der Satelliten-DNA des SCMo-Virus (Davies et al., Virology 177 (1990) , 216-224) oder die der Satelli¬ ten-DNA des TobR-Virus (Steinecke et al . , EMBO J. 11 (1992) , 1525-1530; Haseloff and Gerlach, Nature 334 (1988) , 585-591) in Betracht .

Die DNA-Sequenzen, die die katalytische Domäne flankieren, werden gebildet von DNA-Sequenzen, die homolog sind zu den Sequenzen endogener D-Enzym-Gene.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen können prin¬ zipiell von jeder beliebigen Pflanzenspezies stammen, insbe¬ sondere von Pflanzen, die ein Protein mit D-Enzymaktivität exprimieren. Von Interesse sind sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt wird das Verfahren auf Nutz¬ pflanzen angewendet, insbesondere auf Pflanzen, die Stärke als Speichersubstanz synthetisieren und Stärke-speichernde Organe bilden, wie zum Beispiel Getreidearten, Reis, Kartof¬ feln, Leguminosen oder Maniok.

Unter Getreidepflanzen werden insbesondere monokotyle Pflan¬ zen verstanden, die zur Ordnung Poales, bevorzugt solche, die zur Familie der Poaceae gehören. Beispiele hierfür sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer) , Triticum (Weizen) , Seeale (Roggen) , Hordeum (Gerste) , Oryza (Reis) , Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse) , Zea (Mais) etc. gehören. Stärkespeichernde Leguminosen sind z.B. manche Arten der Gattung Pisum (z.B. Pisum sativum) , Vicia (z.B. Vicia faba) , Cicer (z.B. Cicer arietinum) , Lens (z.B. Lens culinaris) , Phaseolus (z.B. Phaseolus vulgaris und Phaseolus coccineus) , etc.

Für Herstellung von Expressionkassetten, die in den pflanz¬ lichen Zellen zur Synthese eines Polypeptids, einer anti- sense-RNA oder eines Ribozyms etc. führen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Repli- kationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Gängige Clonierungsmethoden sind in der Lite¬ ratur vielfach beschrieben (siehe z.B. Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) , (Cold Spring Harbour, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press) . Für die Einführung der Expressionskassette in eine pflanzli¬ che Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfü¬ gung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzli¬ cher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transforma-

tionsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Die Einführung der beschriebenen Expressionskassette in pflanzliche Zellen erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von Plasmiden, insbesondere von Plasmiden, die für die Transfor¬ mation von Pflanzenzellen geeignet sind und die Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom gewährlei¬ sten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzen¬ zellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus der¬ artig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert wer¬ den, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Je nach Einführungsmethode in die Pflanzenzelle können wei¬ tere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plas¬ mid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Die Infektion einer Pflanzenzelle führt dann zum Einbau der T-DNA einschließlich der neuen Gene in die Chromosomen der Pflanzenzellen.

Für die Transformation mit Hilfe der Agrobakterien muß die einzuführende DNA zunächst in spezielle Plasmide cloniert werden, z.B. in ' einen intermediären oder in einen binären Vektor. Der intermediäre Vektor kann mittels eines Helfer- plasmids durch Konjugation auf Agrobacterium tumefaciens übertragen und dann aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Diese Plasmide enthalten zusätzlich die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region.

Im Gegensatz zu intermediären Vektoren, die nicht in Agro¬ bakterien replizieren, können sich binäre Vektoren sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien vermehren. Sie besitzen ein Selektions arker-Gen und einen Linker oder Polylinker, wel¬ che von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden, und können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al . , Mol. Gen. Genet 163 (1978) , 181- 187) . Bekannte binäre Vektoren sind beispielsweise der Vek¬ tor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant. Sei. 66 (1990) , 221-230) oder der Vektor pBinl9 (Bevan, Nucl . Acids Res . 12 (1984) , 8711-8721) , der kommerziell erhältlich ist (Clontech Laboratories, Inc., USA) .

Die Übertragung der T-DNA einschließlich der neuen Gene in Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985) , Chapter V; Fraley et al . , Crit . Rev. Plant Sei. 4 (1986) , 1-46 und An et al . , EMBO J. 4 (1985) , 277-287 beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan- zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert wer¬ den. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Sus- pensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Se¬ lektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen kön¬ nen dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.

Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plas- mid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobac¬ terium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) , 491-506; Hiei et al . , Plant J. 6 (1994) , 271-282; Deng et al . , Science in China 33 (1990) , 28-34; Wilmink et al . , Plant Cell Reports 11 (1992) ,

76-80; May et al . , Bio/Technology 13 (1995) , 486-492; Conner und Domisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992) , 550-555; Ritchie et al., Transgenic Res . 2 (1993) , 252-265) .

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994) , 37-48; Vasil et al. , Bio/Technology 11 (1993) , 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24 (1994) , 317-325; Spencer et al . , Theor. Appl . Genet . 79 (1990), 625-631) , die Protoplasten- transformation, die Elektroporation von partiell permeabili- sierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (vgl. z.B. WO95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm et al . , Biotechnology 8 (1990) , 833-844; Gordon-Kamm et al. , Plant Cell 2 (1990) , 603-618; Koziel et al. , Biotechnology 11 (1993) , 194-200) . In EP 292 435 wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe des¬ sen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden können. Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989) , 581) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Re- generierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwendig ist, von Kal- lus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich tei¬ lende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro Kultivie¬ rungszeit von 7 bis 8 Monaten erhalten Shillito et al . Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormali- täten in der Morphologie und der Reproduktivität aufweisen. Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989) , 589) beschrei ^¬ ben die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus Mais-Protoplasten der Cateto Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1. Die Autoren vermuten, daß die Protoplasten-Regeneration zu fertilen Pflanzen abhängig ist von einer Anzahl verschiede¬ ner Faktoren, wie z.B. von Genotyp, vom physiologischen Zu¬ stand der Donor-Zellen und von den Kultivierungsbedingungen. Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z.B. für Gerste (Wan und Lemaux,

s.o.; Ritala et al . , s.o.) und für Weizen (Nehra et al . , Plant J. 5 (1994) , 285-297) .

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektions- marker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz ge¬ genüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u.a. ver¬ mittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al . , Plant Cell Reports 5 (1986) , 81-84) . Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Gegenstand der Erfindung sind auch Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen erfindungsgemäßen Pflanzenzellen enthalten. Solche Pflanzen können beispielsweise mittels mikrobiologischer Verfahren, wie in den Beispielen beschrie¬ ben, aus erfindungsgemäßen Pflanzenzellen regeneriert wer¬ den. Der Begriff "Pflanze" umfaßt hierbei auch Teile der Pflanze, wie z.B. einzelne Organe (Blätter, Wurzel, Stamm) etc., erntebare Teile, Gewebe etc. Erntebare Teile sind z.B. Samen, Knollen, photosynthetisches Gewebe, Rüben usw. Die Erfindung betrifft ferner Vermehrungsmaterial der erfin¬ dungsgemäßen Pflanzen, das oben beschriebene transgene

Pflanzenzellen enthält. Dazu zählen beispielsweise Früchte, Samen, Stecklinge, Wurzelstöcke, Knollen, etc.

Aufgrund der Verringerung der Aktivität des D-Enzyms wird in den erfindungsgemäßen Zellen und Pflanzen eine modifizierte Stärke synthetisiert, die sich hinsichtlich ihrer physikali¬ schen und chemischen Eigenschaften, insbesondere ihrer Ver- kleisterungseigenschaften sowie ihres Phosphatgehaltes, von in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke unterscheidet. Gegenstand der Erfindung ist daher auch eine Stärke, die er¬ hältlich ist aus den erfindungsgemäßen Zellen, Pflanzen oder Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, die im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen eine verringerte D-Enzym-Aktivität aufwei¬ sen.

Die Stärke, die aus den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen und Pflanzen erhältlich ist, bei denen die Synthese des D-Enzyms inhibiert ist, zeigt Charakteristika, die stark von denen abweichen, die Stärke zeigt, die aus Wildtyp-Pflanzen iso¬ lierbar ist, z.B. veränderte Verkleisterungseigenschaften. Dies zeigt sich in einer veränderten Vikosität wäßriger Lö¬ sungen dieser Stärke im Vergleich zu wäßrigen Lösungen von Wildtyp-Stärke (siehe Fig. 3, 4, 5 und 6) .

Ein gängiger Test, der verwendet wird, um die Viskositäts¬ eigenschaften zu bestimmen, ist der sogenannte Brabender- Test . Dieser Test wird durchgeführt unter der Verwendung eines Apparates, der beispielsweise als Viskograph E bekannt ist. Hergestellt und vertrieben wird dieses Instrument unter anderem von der Firma Brabender OHG Duisburg (Deutschland) . Der Test besteht im wesentlichen darin, daß Stärke in Gegen¬ wart von Wasser zunächst erhitzt wird, um zu bestimmen, wann die Hydratisierung und das Schwellen der Stärkekörner ein¬ setzt. Dieser Vorgang, der auch als Gelatinisierung bzw. Verkleisterung bezeichnet wird, beruht auf der Auflösung von Wasserstoffbrückenbindungen und geht einher mit einer meßba¬ ren Viskositätszunahme der Stärkesuspension. Während eine weitere Erhitzung nach der Gelatinisierung zur vollständigen

Auflösung der Stärkepartikel und einer Abnahme der Viskosi¬ tät führt, kommt es bei einer Abkühlung unmittelbar nach der Gelatinisierung typischerweise zu einer Viskositätszunahme (siehe Fig. 6) . Das Resultat eines Brabendertests ist eine Kurve, die die Viskosität in Abhängigkeit von der Zeit an¬ gibt, wobei zunächst eine Temperaturzunahme bis über die Ge- latinisierungstemperatur und anschließend eine Abkühlung er¬ folgt.

Die Analyse einer Brabender-Kurve zielt in der Regel ab auf die Bestimmung der Verkleisterungsstemperatur, der maximalen Viskosität bei Erhitzen,der Viskosität nach längerem Kochen, der Viskositätszunahme bei Abkühlung sowie der Viskosität nach dem Erkalten Diese Parameter sind wichtige Charakteri- stika, die die Qualität einer Stärke sowie ihre Verwendbar¬ keit für verschiedene Anwendungen bestimmen.

Ferner zeigt die Stärke, die aus den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen und Pflanzen mit einer verringerten D- Enzymaktivität erhältlich ist, im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen einen erhöhten Phosphatgehalt, insbesondere einen Phosphatgehalt, der um mindestens 10 % höher, vorzugs¬ weise um 20 % höher ist, als der Phosphatgehalt von Stärke aus Wildtyp-Pflanzen.

Unter dem Begriff "modifizierte Stärke" wird daher im Rahmen dieser Erfindung eine Stärke verstanden, die sich hinsicht¬ lich ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften von Wildtyp-Stärke unterscheidet, insbesondere eine Stärke, die im Vergleich zu Wildtyp-Stärke veränderte Verkleisterungs- eigenschaften aufweist und deren wäßrige Lösungen im Ver¬ gleich zu wäßrigen Lösungen von Wildtyp-Stärke eine verän¬ derte Viskosität zeigen. Dabei wird die Viskosität vorzugs¬ weise mittels eines Brabender-Viskographen bestimmt. Ferner kann eine derartige modifizierte Stärke im Vergleich zu Wildtyp-Stärke einen erhöhten Phosphatgehalt aufweisen. Da¬ bei ist der Phosphatgehalt dieser Stärke mindestens um 10 %, vorzugsweise um 20 % und besonders bevorzugt um 30 % höher als der Phosphatgehalt von Wildtyp-Stärke.

Eine derartige modifizierte Stärke, die Gegenstand der Er¬ findung ist, weist vorzugsweise die in Fig. 3, 4 und 5 dar¬ gestellten charakteristischen Brabenderkurven auf. Die modi¬ fizierte Stärke weist insbesondere unter den in Beispiel 4 genannten Bedingungen zur Bestimmung der Viskosität mit Hilfe eines Brabender-Viskographen mindestens einen der fol¬ gende charakteristische Werte auf oder eine Kombination der folgenden Werte : eine Verkleisterungstemperatur von 67,3 ± 0,0°C, eine maximale Viskosität von 2823,7 + 82,0 BE eine Viskosität zu Beginn der Haltezeit von 1517,3 ± 62,3 BE eine Viskosität zu Beginn der Kühlzeit von 641,3 ± 19,7 BE eine Viskosität nach dem Erkalten von 998,0 ± 18,3 BE. Im Rahmen der Meßgenauigkeit, können diese Durchschnitts¬ werte um bis zu 10 % nach oben oder unten von den genannten Werten abweichen, so daß die genannten charakteristischen Werte für die modifizierte Stärke folgende Werte annehmen können: eine Verkleisterungstemperatur von 67,3 ± 6,7°C, eine maximale Viskosität von 2824 ± 283 BE eine Viskosität zu Beginn der Haltezeit von 1517 ± 152 BE eine Viskosität zu Beginn der Kühlzeit von 641 ± 65 BE eine Viskosität nach dem Erkalten von 998 ± 100 BE. Die modifizierte Stärke weist in der Regel mindestens einen der oben genannten charakteristischen Werte auf, vorzugs¬ weise eine Kombination mehrerer Werte. Besonders bevorzugt liegen alle Werte in den angegebenen Bereichen. Durch Anwendung der antisense-Technologie ist es ferner mög ^¬ lich, Pflanzen herzustellen, bei denen die Expression von DNA-Sequenzen, die D-Enzyme codieren, in unterschiedlich starkem Maße inhibiert ist, und die daher eine unterschied¬ lich starke Reduktion der Aktivität des D-Enzyms aufweisen. Je nach dem Grad der Reduktion der D-Enzym-Aktivität synthe¬ tisieren derartige transgene Pflanzen Stärke, die sich hin ^¬ sichtlich ihrer Verkleisterungseigenschaften und ihres Phos ^¬ phatgehaltes mehr oder weniger stark von Stärke aus Wildtyp- Pflanzen unterscheidet.

Generell weisen derartige modifizierte Stärken folgenden Eigenschaften im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen auf:

1. eine höhere maximale Viskosität bei Erhitzen

2. eine höhere Viskosität nach Abkühlung.

Die Isolierung der Stärke erfolgt nach herkömmlichen Metho¬ den, wie z.B. beschrieben in "Handbuch der Stärke" (Band I, Max Ulimann (Hrsg.), 1974, Paul Parey Verlag, Berlin, Deutschland) oder in Morrison und Karkalas (Methods in Plant Biochemistry, 2 (1990), 323-352; Academic Press Ltd., London) .

Die erfindungsgemäßen Stärken können nach dem Fachmann be¬ kannten Verfahren modifiziert werden und eignen sich in un- modifizierter oder modifizierter Form für verschiedene Ver¬ wendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht-Nahrungsmittelbe¬ reich.

Grundsätzlich läßt sich die Einsatzmöglichkeit der Stärke in zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glucose und Glu- canbausteine, die über enzymatische oder chemische Verfahren erhalten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Für eine Reduktion der Kosten kann hierbei die Einfachheit und kostengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens von Be¬ deutung sein. Gegenwärtig verläuft es im wesentlichen enzy- matisch unter Verwendung von Amyloglucosidase. Vorstellbar wäre eine Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz von Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z.B. Ober¬ flächenvergrößerung des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Verzweigungsgrad oder eine sterische Struk¬ tur, die die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme be¬ grenzt, könnte dies bewirken.

Der andere Bereich, in dem die Stärke wegen ihrer polymeren Struktur als sogenannte native Stärke verwendet wird, glie¬ dert sich in zwei weitere Einsatzgebiete:

1. Nahrungsmittelindustrie

Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nah¬ rungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw. eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gelbildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Verkleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungs- leistung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säuresta¬ bilität, die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdau¬ lichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z.B. anorganischen oder organischen Ionen.

2. Nicht-Nahrungmittelindustrie

In diesem großen Bereich kann die Stärke als Hilfsstoff für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zu¬ satzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der Verwendung der Stärke als Hilfsstoff ist hier insbeson¬ dere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Die Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation (Zu¬ rückhaltung von Feststoffen) , der Abbindung von Füll¬ stoff- und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen Eigenschaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.

2.1 Papier- und Pappeindustrie

Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier An¬ wendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden.

Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Ober¬ flächenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weiße¬ grad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositäts-

Stabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbildung. Bei der Verwendung im Strich spielt der Feststoffgehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Bindevermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, verlustfreie Verteilung, eine hohe mecha¬ nische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Fest¬ stoffgehalt, hohe Viskosität sowie ein hohes Bindever¬ mögen von Bedeutung.

2.2 Klebstoffindustrie

Ein großer Einsatzbereich der Stärken besteht in der Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemika¬ lien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymer¬ dispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90 % der Klebstoffe auf Stärkebasis werden in den Bereichen Wellpappenherstellung, Herstellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Brief¬ marken usw. eingesetzt.

2.3 Textil- und Textilpflegemittelindustrie

Ein großes Einsatzfeld für die Stärken als Hilfmittel und Zusatzstoff ist der Bereich Herstellung von Tex¬ tilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilin¬ dustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu un¬ terscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d.h. als Hilfstoff zur Glättung und Stärkung des Klett¬ verhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim

Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsverschlechternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw. , Stärke als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen sowie Stärke als Zusatz zu Ket- tungsmitteln für Nähgarne.

2.4 Baustoffindustrie

Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung der Stär¬ ken als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die Herstellung von Gipskartonplatten, bei der die im Gips¬ brei vermischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Oberfläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Beimischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton werden Stärkeprodukte zur Verzögerung der Abbindung eingesetzt.

2.5 Bodenstabilisation

Ein weiterer Markt für die Stärke bietet sich bei der Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kom¬ binationsprodukte aus der Stärke und Polymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und ver- krustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten Produkten gleichzusetzen, liegen preislich aber deut¬ lich unter diesen.

2.6 Einsatz bei Pflanzenschutz- und Düngemitteln

Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifi¬ schen Eigenschaften der Präparate. So kann die Stärke zur Verbesserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemitteln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwandlung flüssiger, flüchtiger und/oder übelrie¬ chender Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, form-

bare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindun¬ gen und zur Verlängerung der Wirkdauer durch Verminde¬ rung der Zersetzung eingesetzt werden.

2.7 Phar aka, Medizin und Kosmetikindustrie

Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Phar¬ maka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeu¬ tischen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für Tabletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln eingesetzt werden. Weiterhin kann die Stärke als Ta- blettensprengmittel dienen, da sie nach dem Schlucken Flüssigkeit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizini¬ sche Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke. Im Bereich der Kosmetik werden Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstof¬ fen, wie Düften und Salicylsäure eingesetzt. Ein rela¬ tiv großer Anwendungsbereich für die Stärke liegt bei Zahnpasta.

2.8 Stärkezusatz zu Kohlen und Briketts

Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert werden, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwischen 4 und 6 %, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und 0,5 %. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemit¬ tel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermin¬ dert werden kann.

2.9 Erz- und Kohleschlammaufbereitung

Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlamm¬ aufbereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.

2.10 Gießereihilfsstoff

Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gießereihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwiegend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist. Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfe¬ stigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Darüber hinaus können die Quellstärken weitere produk¬ tionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dispergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.

2.11 Einsatz in der Kautschukindustrie

In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesse¬ rung der technischen und optischen Qualität eingesetzt werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflä¬ chenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Ausse¬ hens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen gestreut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks.

2.12 Herstellung von Lederersatzstoffen

Eine weitere Absatzmöglichkeit der modifizierten Stär¬ ken besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.

2.13 Stärke in synthetischen Polymeren

Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Ein¬ satzgebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozess (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Polymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein) .

Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist vergli¬ chen mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfä¬ hig. Anders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigen¬ schaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigen¬ schaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyäthylen. Hierbei werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koex- pression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem 'master batch' kombiniert, aus dem mit granuliertem Polyäthylen unter An¬ wendung herkömmlicher Verfahrenstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Einbindung von Stärke in Poly¬ äthylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässigkeit, ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Anti- blockverhalten sowie eine verbesserte Bedruckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden.

Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Po¬ lyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydro- xygruppen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Polyurethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke fol¬ gende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeausdehnungskoeffizienten, Verringerung des Schrumpfver¬ haltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Wasserdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasser ^¬ aufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufriß ^¬ dichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vor ^¬ handen sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfestigkeit.

Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr nur auf Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe, Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50 % herzustellen. Des weiteren sind Stärke/ Polymermischungen

günstig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologi¬ sche Abbaubarkeit aufweisen.

Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres extremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate ge¬ wonnen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus auf¬ gepfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die An¬ wendungsbereiche für diese Superabsorber haben sich in den letzten Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebe¬ reich mit Produkten Windeln und Unterlagen sowie im land¬ wirtschaftlichen Sektor, z.B. bei Saatgutpillierungen.

Entscheidend für den Einsatz der neuen, gentechnisch verän¬ derten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt,

Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmas¬ senverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallinität, zum anderen auch die Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur und -transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbil¬ dung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität .

Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer Eingriffe in einer transgenen Pflanze kann zum einen die Eigenschaften der aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahinge¬ hend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemi¬ scher oder physikalischer Verfahren nicht mehr notwendig er¬ scheinen. Zum anderen können die durch gentechnische Verfah¬ ren veränderte Stärken weiteren chemischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qua¬ lität für bestimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete

führt. Diese chemischen Modifikationen sind grundsätzlich bekannt. Insbesondere handelt es sich dabei um Modifikatio¬ nen durch

- Hitzebehandlung,

- Säurebehandlung,

- Oxidation und

- Veresterungen,

welche zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Weitere organi¬ sche Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt wer¬ den:

- Erzeugung von Stärkeethern

Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether

- Erzeugung von vernetzten Stärken

- Erzeugung von Stärke-Pfropf-Polymerisaten

Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung der erfin¬ dungsgemäßen Stärke zur Herstellung von Lebensmitteln oder industriellen Produkten.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen, die Enzyme mit der enzymatischen Aktivität eines D-Enzyms codieren, für die gentechnische Veränderung von Pflanzen, um Pflanzen zu erzeugen, die eine im Vergleich zu Wildtyp-Stärke veränderte Stärke synthetisieren,

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten und verwendeten Plasmide wurden bei der als internationale Hin¬ terlegungsstelle anerkannten Deutschen Sammlung von Mikroor¬ ganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland,

entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroor¬ ganismen zum Zwecke der Patentierung hinterlegt. Am 26.08.1993 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroor¬ ganismen (DSM) in Braunschweig, Deutschland, folgendes Plas¬ mid hinterlegt (Hinterlegungsnummer) :

Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479)

Am 10.08.1994 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroor¬ ganismen (DSM) in Braunschweig, Deutschland, folgendes Plas¬ mid hinterlegt (Hinterlegungsnummer) :

Plasmid p35S-anti-D (DSM 9365)

Ferner wurde am 20.10.1994 bei der oben genannten Hinterle¬ gungsstelle folgendes Plasmid hinterlegt (Hinterlegungsnum¬ mer) :

Plasmid pBinAR-Hyg (DSM 9505)

Fig. 1 zeigt das Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) .

Das Plasmid enthält folgende Fragmente :

A = Fragment A (529 bp) umfaßt den 35S Promotor des Blumen¬ kohl-Mosaik-Virus (CaMV) , Nucleotide 6906-7437 des CaMV.

B = Fragment B (2909 bp) umfaßt ein DNA-Fragment, das die codierende Region für das Disproportionierende Enzym aus

Kartoffel umfaßt (Takaha et al . , J. Biol. Chem. 268

(1993) , 1391-1396; Nucleotide 303 bis 1777) , und in antisense-Orientierung an den Promotor gekoppelt ist.

C = Fragment C (192 bp) umfaßt das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nucleotide 11749-11939.

Das Plasmid ist ca. 12,7 kb groß und erlaubt Selektion auf

Hygromycinresistenz in transformierten Pflanzenzellen.

Fig. 2 zeigt das Plasmid p35S-anti-D (DSM 9365)

Das Plasmid enthält folgende Fragmente :

A = Fragment A (529 bp) umfaßt den 35S Promotor des Blumen¬ kohl-Mosaik-Virus (CaMV) , Nucleotide 6906-7437 des CaMV.

B = Fragment B (2909 bp) umfaßt ein DNA-Fragment, das die codierende Region für das Disproportionierende Enzym aus Kartoffel umfaßt (Takaha et al . , J. Biol. Chem. 268 (1993) , 1391-1396; Nucleotide 303 bis 1777) , und in antisense-Orientierung an den Promotor gekoppelt ist.

C = Fragment C (192 bp) umfaßt das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nucleotide 11749-11939.

Das Plasmid ist ca. 12,2 kb groß und erlaubt Selektion auf

Kanamycinresistenz in transformierten Pflanzenzellen.

Fig. 3 zeigt eine Brabenderkurve für eine wäßrige Lösung von

Stärke aus der transgenen Kartoffellinie JDl-32. Die Kurve wurde wie in Beispiel 3 erläutert aufgenommen. Dabei bedeuten:

Drehm. Drehmoment

[BE] Brabender-Einheit

Temp. Temperatur

A Verkleisterungsbeginn

B Maximale Viskosität

C Start der Haltezeit

D Start der Kühlzeit

E Ende der Kühlzeit

F Ende der End-Haltezeit

Die blaue Linie gibt die Viskosität (gemessen in Brabender- Einheiten) an. Die rote Linie gibt den Temperaturverlauf an.

Meßbedingungen:

Apparat: Brabender Viskograph E (Brabender OHG Duisburg, Deutschland)

Verwendete Menge Stärke: 30 g

Verwendetes Volumen Lösungsmittel: 450 ml destilliertes Was¬ ser

Rührgeschwindigkeit: 75 Umdrehungen pro min

Erhitzen: von 50°C auf 96°C mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro min

Halten der Temperatur: 30 min bei 96°C

Kühlen: von 96°C auf 50°C mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro min.

Fig. 4 zeigt eine Brabenderkurve für eine wäßrige Lösung von Stärke aus der transgenen Kartoffellinie JD1-33. Die Kurve wurde wie in Beispiel 3 erläutert aufgenommen. Die Abkürzungen sind definiert wie für Fig. 3 beschrieben. Die Meßbedingungen entsprechen den unter Fig. 3 beschriebe¬ nen.

Fig. 5 zeigt eine Brabenderkurve für eine wäßrige Lösung von Stärke aus der transgenen Kartoffellinie JD1-71. Die Kurve wurde wie in Beispiel 3 erläutert aufgenommen. Die Abkürzungen sind definiert wie für Fig. 3 beschrieben. Die Meßbedingungen entsprechen den unter Fig. 3 beschriebe¬ nen.

Fig. 6 zeigt eine Brabenderkurve für eine wäßrige Lösung von Stärke aus Wildtyp-Pflanzen Solanu tuberoεum cv. Desiree. Die Kurve wurde wie in Beispiel 3 erläutert aufgenommen. Die Abkürzungen sind definiert wie für Fig. 3 beschrieben. Die Meßbedingungen entsprechen den unter Fig. 3 beschriebe ^¬ nen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Verwendete Medien und Lösungen

20 x SSC 175.3 g NaCl

88.2 g Natrium-Citrat ad 1000 ml mit ddH ₂ 0 pH 7,0 mit 10 N NaOH

10 x MEN 200 mM MOPS

50 mM Natriumacetat 10 mM EDTA pH 7, 0

NSEB-Puffer 0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2

7 % SDS 1 mM EDTA 1 % BSA (w/v)

Verwendete Methoden

1. Clonierungsverfahren

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in die binären Vektoren BIN19 (Bevan, Nucl . Acids Res. 12 (1984) , 8711-8720) und pBinAR-Hyg (DSM 9505) cloniert .

2. Bakterienstämme

Für die binären Vektoren wurde der E. coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwen ^¬ det.

Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-S ammes C58C1 pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al . , Nucl. Acids Res. 13 (1985) , 4777-4788) .

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen&Willmitzer (Nucleic Acids Res. 16 (1988) , 9877) . Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakte¬ rien wurde nach der Methode von Birnboim&Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979) , 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Re¬ striktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.

4. Transformation von Kartoffeln

Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kar¬ toffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L.cv. Desiree) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige&Skoog Physiol. Plant. 15 (1962) , 473) mit 2 % Saccharose gelegt, welches 50 μl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Über- nachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Dar¬ aufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6 % Glucose, 5 mg/1 Naphthylessigsäure, 0,2 mg/1 Ben- zylaminopurin, 250 mg/1 Claforan, 50 mg/1 Kanamycin bzw. 1 mg/1 Hygromycin B, und 0,80 % Bacto Agar gelegt. Nach einwö- chiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6 % Glucose, 1,4 mg/1 Zeatinribose, 20 mg/1 Naphthylessigsäure, 20 mg/1 Giberel- linsäure, 250 mg/1 Claforan, 50 mg/1 Kanamycin bzw. 3 mg/1 Hygromycin B, und 0,80 % Bacto Agar gelegt.

5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit

Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma

Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt .

6. Northern Blot-Analyse

RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50 μg der RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5 % Agarose, 1 x MEN-Puffer, 16,6% Formalde¬ hyd) . Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser gewa¬ schen. Die RNA wurde mit 20 x SSC mittels Kapillarblot auf eine Νylonmembran vom Typ Hybond Ν (Amersham, UK) transfe¬ riert. Die Membran wurde anschließend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden gebacken.

Die Membran wurde in ΝSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähybri¬ disiert und anschließend in ΝSEB-Puffer über Nacht bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Probe hybridisiert.

7. Pflanzenhaltung

Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Be¬ dingungen gehalten:

Lichtperiode 16 h bei 25000 Lux und 22°C

Dunkelperiode 8 h bei 15°C

Luftfeuchte 60 %

8. Isolierung der Stärke aus Kartoffelpflanzen

Zur Isolierung von Stärke aus Kartoffelknollen wurden die Knollen zunächst in einer Saftpresse zerkleinert. Der resul¬ tierende Saft wurde mit geringen Mengen an Natriumsulfit und Natriumbisulfit versetzt und stehengelassen, damit sich die Stärke absetzen konnte. Nach dem Absetzen der Stärke wurde der Überstand abgenommen und die Stärke mindestens 3 mal in destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde die Stärke bei 37°C unter mehrmaligem Wenden getrocknet.

9. Bestimmung des Phosphatgehaltes von Stärke

Der Phosphatgehalt der Stärke wurde bestimmt, indem die Menge an Phosphat, das an der C-6-Position von Glucoseresten gebunden war, gemessen wurde. Hierzu wurde Stärke zunächst durch Säurehydrolyse gespalten und anschließend der Gehalt an Glucose-6-Phosphat mittels eines Enzymtests bestimmt, wie im folgenden beschrieben:

100 mg Stärke wurden in 500 μl 0,7 N HC1 4 h bei 100°C inku¬ biert. Nach der Säurehydrolyse wurden 10 ml des Ansatzes in 600 μl Imidazolpuffer (100 mM Imidazol, 5 mM MgCl ₂ , pH 6,9; 2 mM NADP ⁺ ) gegeben. Die Bestimmung der Menge an Glucose-6- Phosphat in dem Ansatz erfolgte durch Umsetzung mit dem Enzym Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase. Dazu wurde dem An¬ satz 1 U Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (aus Hefe) zuge¬ setzt und die Menge an gebildetem NADPH durch Messung der Absorption bei 340 nm bestimmt.

Beispiel 1

Konstruktion des binären Plasmids p35SH-anti-D

Unter Verwendung zweier synthetisch hergestellter Oligo- nucleotide mit den Sequenzen:

5'- GCCCCCGGGC TTTTAAGTTC CTTG -3' (Seq ID No. 1)

und

5'- CAGGGTACCT AACATCTTAA TCATC -3' (Seq ID No. 2)

als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwen ^¬ dung von cDNA aus Knollengewebe von Solanum tuberosum wurde eine Kopie der codierenden Region des Gens, das für das D- Enzym codiert, hergestellt. Das resultierende Fragment um ^¬ faßt die Nucleotide 303 bis 1777 der in Takaha et al . (J.

Biol. Chem. 268 (1993) , 1391-1396) dargestellten Nucleotid- sequenz . Durch die spezifische Sequenz der für die Amplifi- kation gewählten Oligonucleotide wird am 5 '-Ende des codoge- nen Stranges eine Sma I-Schnittstelle und am 3 ' -Ende eine Kpn I-Schnittstelle eingeführt. Das PCR-Fragment wurde mit den Restriktionsendonucleasen Sma I und Kpn I geschnitten und in den mit Sma I und Kpn I geschnittenen Vektor pBinAR- Hyg (DSM 9505) ligiert.

Das resultierende Plasmid wurde p35SH-anti-D (DSM 8479) ge¬ nannt und ist in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 2

Konstruktion des binären Plasmids p35S-anti-D

Für die Herstellung des Plasmids p35S-anti-D wurde zunächst das Plasmid pBIN19-AC hergestellt. Zu diesem Zweck wurde ein 529 bp Fragment, das den 35S-Promotor des CaMV umfaßt (Nucleotide 6909-7437, Franck et al. , Cell 21, 285-294) , aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al . , Nucl. Acids Res. 14, 5857-5868) mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen EcoR I und Kpn I isoliert . Dieses Fragment wurde in den mit EcoR I und Kpn I geschnittenen Vektor pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984) , 8711-8721) ligiert. Dabei entstand das Plas¬ mid pBIN19-A.

Anschließend wurde ein 192 bp-Fragment, das das Poly¬ adenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. , EMBO J. 3, 835-846; Nucleotide 11749-11939) umfaßt, als Pvu II/Hind III-Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al . , Nature 303, 209- 213) isoliert. Nach Addition eines Sph I-Linkers an die Pvu II-Schnittstelle wurde das Fragment in den mit Sph I und Hind III geschnittenen Vektor pBIN19-A ligiert. Das resul¬ tierende Plasmid wurde pBIN19-AC genannt.

Für die Konstruktion des Plasmids p35S-anti-D wurde das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte PCR-Fragment in den mit Kpn I und Sma I geschnittenen Vektor pBIN19-AC ligiert.

Das resultierende Plasmid ist in Fig. 2 dargestellt.

Beispiel 3

Herstellung transgener Kartoffelpflanzen mit einer reduzier¬ ten Aktivität des D-Enzyms und Isolierung der in den Pflan¬ zen synthetisierten Stärke

Zur Herstellung transgener Kartoffelpflanzen, bei denen die Aktivität des D-Enzyms verringert ist im Vergleich zu Wild¬ typ-Pflanzen, wurden Agrobakterien der Spezies Agobacterium tumefaciens mit dem Plasmid p35S-anti-D transformiert. Das Plasmid wurde mit Hilfe Agrobakterien-vermittelter Transfor¬ mation in Zellen von Kartoffelpflanzen der Varietät Desiree transferiert wie oben beschrieben. Aus den transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert. Die transformier¬ ten Pflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen kultiviert. Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung der Pflanzen erfolgte durch Analyse der Gesamt-RNA in einer Northern-Blot-Analyse bezüglich des Verschwindens der Trans¬ kripte, die das D-Enzym codieren. Hierzu wurde Gesamt-RNA aus Blättern transformierter Pflanzen nach Standardmethoden isoliert, gelelektrophoretisch auf einem Agarosegel aufge¬ trennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit einer ra¬ dioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die D-Enzym aus Kartoffel codierende Region oder einen Teil dieser Region umfaßt. Bei erfolgreich transformierten Pflanzen fehlt in der Northern-Blot-Analyse die Bande, die das spezifische Transkript des D-Enzym-Gens darstellt.

Vier unabhängige Linien transgener Kartoffelpflanzen, die Linien JDl-32, JD1-33, JD1-65 und JD1-71, bei denen in der Northern-Blot-Analyse nur noch sehr geringe bis gar keine Mengen des D-Enzym-spezifischen Transkriptes nachgewiesen werden konnten, wurden näher hinsichtlich der synthetisier¬ ten Stärke untersucht .

Dazu wurde aus Knollen der transgenen Pflanzen Stärke nach Standardverfahren isoliert.

Beispiel 4

Analyse der Stärke aus Kartoffelpflanzen, die mit dem Plas¬ mid p35S-anti-D transformiert worden waren

a) Bestimmung der Viskosität

Die aus den transgenen Kartoffelpflanzen isolierte Stärke wurde hinsichtlich der Viskosität wäßriger Lösungen dieser Stärke untersucht .

Zur Bestimmung der Viskosität der wäßrigen Lösungen der in transformierten Kartoffelpflanzen synthetisierten Stärke wurden jeweils 30 g Stärke in 450 ml H ₂ 0 aufgenommen und für die Analyse in einem Viskograph E (Brabender OHG Duisburg (Deutschland)) verwendet. Der Betrieb des Gerätes erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Zur Bestimmung der Visko¬ sität der wäßrigen Lösung der Stärke wurde die Stärkesuspen¬ sion zunächst von 50°C auf 96°C erhitzt mit einer Geschwin¬ digkeit von 3°C pro min. Anschließend wurde die Temperatur für 30 min bei 96°C gehalten. Danach wurde die Lösung von 96°C auf 50°C abgekühlt mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro min. Während der gesamten Dauer wurde die Suspension ge¬ rührt (75 Umdrehungen pro Minute) und die Viskosität (in Brabender-Einheiten) bestimmt. Die Ergebnisse derartiger Messungen sind in Form von Kurven, in denen die Viskosität in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt ist, in den Figuren 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben. Fig. 3 zeigt eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus transgenen Kartoffel- pflanzen der Linie JDl-32 isoliert wurde. Fig. 4 zeigt eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus transgenen Kar¬ toffelpflanzen der Linie JD1-33. Fig. 5 zeigt eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus transgenen Kartoffel- pflanzen der Linie JD1-71 isoliert wurde. In Fig. 6 ist da¬ gegen eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus nicht-transformierten Kartoffelpflanzen der Varietät Desiree

isoliert wurde, gezeigt. Aus den Kurven geht zum einen her¬ vor, daß in allen drei transgenen Linien eine Stärke mit fast identischen Viskositätseigenschaften isoliert werden kann. Ferner ist erkennbar, daß die Stärke aus transgenen Kartoffeln Eigenschaften aufweist, die deutlich von denen der Wildtyp-Stärke abweichen. Aus den dargestellten Kurven lassen sich verschiedene charakteristische Werte ableiten.

Für Wildtyp-Pflanzen ergeben sich dabei folgende charakteri¬ stische Werte:

Wert Name

A Ver leisterungsbeginn

B Maximale Viskosität

C Start der Haltezeit

D Start der Kühlzeit

E Ende der Kühl zeit

F Ende der End-Haltezeit

Anzahl der Messungen n=2

Angegeben sind die Durchschnittswerte der Viskosität bei verschiedenen Temperaturen und zu verschiedenen Zeitpunkten in Brabender-Einheiten zusammen mit den Standardabweichun¬ gen , sowie die Verkleisterungstemperatur und die Temperatur, bei der die maximale Viskosität erreicht wird .

Für Pf lanzen , die mit dem Plasmid p35S-anti -D transformiert worden waren, ergeben sich dabei folgende charakteristische Werte :

Tabelle II Transgene Linie JDl-3

Wert Name

A Verkleisterungsbeginn

B Maximale Viskosität

C Start der Haltezeit

D Start der Kühlzeit

E Ende der Kühlzeit

F Ende der End-Haltezeit

Tabelle III Transgene Linie JD1-33

Wert Name

A Verkleisterungsbeginn

B Maximale Viskosität

C Start der Haltezeit

D Start der Kühlzeit

E Ende der Kühlzeit

F Ende der End-Haltezeit

Tabelle IV Transgene Linie JD1-71:

Wert Name Zeit Drehmoment Temperatur [min:sec] [BE] [°C]

A Verkleisterungsbeginn 5:45 60,0 67,3

B Maximale Viskosität 9:15 2741,0 77,8

C Start der Haltezeit 15:15 1510,0 96,0

D Start der Kühlzeit 45:15 629,0 96,0

E Ende der Kühlzeit 60:30 989,0 50,0

F Ende der End-Haltezeit 70:45 1011,0 50, 0

Für die Stärke aus transgenen Kartoffelpflanzen, bei denen die Aktivität des D-Enzyms stark verringert ist, lassen sich unter den genannten Versuchsbedingungen somit folgende cha¬ rakteristische Werte ermitteln: eine Verkleisterungstemperatur von 67,3 ± ,0°C, eine maximale Viskosität von 2823,7 + 82,0 BE eine Viskosität zu Beginn der Haltezeit von 1517,3 ± 62,3 BE eine Viskosität zu Beginn der Kühlzeit von 641,3 + 19,7 BE eine Viskosität nach dem Erkalten von 998,0 ± 18,3 BE. Unter Berücksichtigung von Meßungenauigkeiten und Schwankun¬ gen zwischen verschiedenen transgenen Linien mit unter¬ schiedlichen D-Enzym-Aktivitäten können die ermittelten Durchschnittswerte um bis zu 10 % nach oben oder unten ab¬ weichen, so daß die modifizierte Stärke folgende charakteri¬ stischen Werte aufweisen kann: eine Verkleisterungstemperatur von 67,3 ± 6,7°C, eine maximale Viskosität von 2824 ± 283 BE eine Viskosität zu Beginn der Haltezeit von 1517 ± 152 BE eine Viskosität zu Beginn der Kühlzeit von 641 ± 65 BE eine Viskosität nach dem Erkalten von 998 ± 100 BE. Da es mit Hilfe der antisense-Technologie möglich ist, Pflanzen herzustellen, bei denen die Expression von DNA-Se¬ quenzen, die D-Enzyme codieren, in unterschiedlich starkem Maße inhibiert ist, können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens transgene Pflanzen hergestellt werden, die eine mehr oder weniger starke Reduktion der Aktivität des D- Enzyms aufweisen und die daher eine Stärke synthetisieren, die sich hinsichtlich ihrer Verkleisterungseigenschaften mehr oder weniger stark von Wildtyp-Pflanzen unterscheidet.

b) Bestimmung des Phosphatgehaltes

Die Bestimmung des Phosphatgehaltes von Stärke aus transge ^¬ nen und aus Wildtyp-Pflanzen erfolgte wie oben beschrieben.

Der Gehalt an Glucose-6-Phosphat (angegeben in nmol/mg Stärke) ist in der folgenden Tabelle für nicht-transfor-

mierte Kartoffelpflanzen der Varietät Desiree sowie als Durchschnittswert für drei Linien (JDl-32; JD1-65; JD1-71) transgener Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-anti- D transformiert worden waren, angegeben.

Tabelle V

Pflanzen nMol Glucose-6-Phosphat %

/mg Stärke

Wildtyp 9,55±0,62 100 transgene Linien 12,80±1,80 134

Die Werte zeigen, daß der Phosphatgehalt der modifizierten Stärke aus transgenen Kartoffelpflanzen im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen um ca. 34 % erhöht ist.

SEQUΞNZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin

GmbH

(B) STRASSE: Ihnestr. 63

(C) ORT: Berlin

(E) LAND: Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: 14195

(G) TELEFON: +49 30 83000760 (H) TELEFAX: +49 30 83000736

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Modifizierte Staerke aus Pflanzen, Pflanzen, die diese synthetisieren, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk <B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 {EPA)

<vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 19509695.9

(B) ANMELDETAG: 08-MAR-1995

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 24 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure

(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligonucleotid"

(iii) HYPOTHETISCH: JA

{iv) ANTISENSE: NEIN

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: GCCCCCGGGC TTTTAAGTTC CTTG 24

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 25 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure

(A) BESCHREI3UNG: /desc = "Oligonucleotid"

(iii) HYPOTHETISCH: JA

(iv) ANTISENSE: NEIN

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: CAGGGTACCT AACATCTTAA TCATC 25

f _t enzeichen des Anmelders IniemauonaiesAXtenzeichen oder Anwalts A 1273 PCT PCT/tP 96/01007

ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (Regeln ¹ " PCT)

A. Die nachstehenden Angaben betreffen den Mücrpopanisrnus. der in der Beschreiounβ genannt ist auf Seite ²⁸ Zeile 4-21 .

B. KENNZEICHNUNG DER HINTERLEGUNG Weitere Hinterlegungen sind auf einem r — , zusätzlichen Blau gekennzeichnet I — '

Name der Hinterlegungsstelle

DSM - Deutsche-Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

Anscnriϊt der Hinterlegungsstelle (einschließlich Posilenzani und xLand)

Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE

Datum der Hinterlegung Eingangsnummer

26.08.1993/ 10.08.1994/ 20.10.1994 DSM 8479/ DSM 9365/ DSM 9505

C. WEITERE ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen) Die Angaben werden auf einem i — ι gesondeπen Blatt fortgesetzt I — I

Der Anmelder macht Gebrauch von Regel 28(4) EPU.

BESTIMMUNGSSTAATEN, FÜR DIE ANGABEN GEMACHT WERDEN

(falls die Angaben nicht für alle Bestimmungsstaaten gelten) .

EP

E. NACHREICHUNG VON ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen)

Die nachstehenden Angaben werden später beim Internationalen Büro eingereicht (bitte An der Angaben nennen. z. B. "Eingangsπummer der Hinterlegung")

Nur zur Verwendung im Anmeldea t

[2] Dieses Blatt ist eingegangen mit der internationalen .Anmeldung

Bevollmächtigter Bedienstete: fv _j *'

PETHE R.

Formbliπ PCT/Rθ/134 (Juli 1992)