GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Vorrichtung zur kontinuierlichen Aufreinigung von biotechnologischen Produkten, wobei die Vorrichtung einen modularen Aufbau mit einzelnen miteinander verbundenen Modulen aufweist.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Ein Verfahren zur Herstellung von biopharmazeutischen und biologischen Produkten umfasst in der Regel upstream bei kontinuierlicher Prozessführung eine Perfusionskultur und Zellrückhaltesystem oder bei semikontinuierlicher Prozessführung eine Fed-Batch-Kultur.

Downstream umfasst ein solches Verfahren in der Regel die Schritte Zellabtrennung bzw. die Abtrennung der Zellbruchbestandteile, Puffer- bzw. Medienaustausch bevorzugt mit Konzentrierung, BioBurden-Reduzierung bevorzugt mit Sterilfilter, und Capture Chromatographie. Üblicherweise werden weitere Schritte zur Reinigung des Produktstroms durchgeführt, insbesondere eine Virusinaktivierung, Neutralisation, optional eine weitere BioBurden-Reduzierung (mit Sterilfilter). Angesichts der hohen Qualitätsstandards bei der Herstellung von Biopharmazeutika folgen üblicherweise darüber hinaus weitere Schritte: Chromatographische Zwischen- und Feinreinigung, BioBurden Reduzierung z.B. mit Sterilfilter, Virenfiltration sowie Pufferaustausch und bevorzugt Konzentrierung.

Um in der Proteinaufreinigung von monoklonalen Antikörpern (mAb) eine hohe Reinheit zu gewährleisten, werden üblicherweise drei aufeinander folgende Chromatographie-Schritte praktiziert. Im ersten Schritt der Aufreinigung soll der mAb in größtmöglicher Ausbeute aus dem verunreinigten Überstand isoliert werden (Capture). Stand der Technik ist die Aufreinigung über die Affinitätschromatographie. Die Antikörper verfügen über eine Region, die spezifisch an Protein A bindet. Die Protein A Chromatographie erreicht hohe Ausbeuten (>90%) und ein Großteil der Verunreinigungen, Wirtzell-Proteine (host cell proteins, HCP) und DNA, werden hier schon abgetrennt. In diesem Schritt erfolgt zumeist auch die erste Virusinaktivierung. Die Elution erfolgt durch Reduzierung des pH-Wertes (< 3). Bevor das Eluat wieder neutralisiert wird, wird es über einen längeren Zeitraum auf niedrigem pH-Wert gehalten, um die Virusinaktivierung durchzuführen.

Aufgrund des meist großen Batchvolumens (>2000 L) werden dafür auch großvolumige Chromatographie-Säulen benötigt (Durchmesser> 1 m). Das Chromatographie-Gel macht dabei einen signifikanten Anteil der Produktionskosten aus. Die Verwendung von Protein A kann auch problematisch für die Produktqualität sein. Aus Sicht der geforderten Qualitätsattribute ist Protein A auch ein wichtiger Aspekt. Es kann sich aus dem Material lösen und findet sich dann im Eluat.

Im Bereich der Chromatographie gibt es Bestrebungen eine kontinuierliche Prozessführung zu gewährleisten. Bekannte Methoden dafür sind die Simulated Moving Bed Chromatography (SMBC) oder die Periodic Counter Current Chromatography (PCCC). Diese Methoden ahmen eine kontinuierliche Prozessführung nach, in dem mehrere Säulen seriell miteinander verschaltet sind. Der Produktstrom bleibt stets diskontinuierlich.

WO 2012/078677 beschreibt ein Verfahren und eine Anlage zur kontinuierlichen Herstellung von biopharmazeutischen Produkten durch Chromatographie und deren Integration in eine Produktionsanlage, insbesondere in eine Einweganlage. Insbesondere beschreibt die WO 2012/078677 die Verwendung von Behältern (=Bags) zwischen in Reihe geschalteten Einheiten.

WO 2014/137903 beschreibt eine Lösung für die integrierte kontinuierliche Herstellung einer Proteinsubstanz in einer Produktionsanlage, die Kolonnen zur Durchführung der Produktionsschritte umfasst, die in Reihe geschaltet sind. WO 2014/137903 offenbart, dass der Produktstrom im kontinuierlichen Prozess idealerweise so gesteuert wird, dass möglichst jeder Schritt oder jede Einheit gleichzeitig mit einer ähnlichen Zuführungsrate läuft, um die Produktionszeit zu minimieren. WO 2014/137903 offenbart den Einsatz von Behältern zwischen aufeinanderfolgenden Einheiten, die den Produktstrom für eine gewisse Zeit aufnehmen können.

EP 3 093 335 A1 beschreibt eine modular aufgebaute Produktionsanlage zur kontinuierlichen Herstellung bzw. Aufbereitung von biopharmazeutischen Produkten und ein computerimplementiertes Verfahren zur Prozesssteuerung der modular aufgebauten Anlage. Gemäß EP 3 093 335 A1 kann ein Modul bzw. eine Unit nur semi-kontinuierlich betrieben werden, wenn das Betreiben des Moduls den Wechsel eines Elements zur Durchführung des Schrittes voraussetzt.

Nachteile der bekannten kontinuierlichen bzw. semikontinuierlichen Systeme sind dass diese Systeme nur kurze Prozess-Laufzeiten von wenigen Stunden gewährleisten können. Die Systeme können in der Regel nicht während des Prozesses geöffnet und wieder in den Ur-Zustand rücküberführt werden und erlauben deshalb keine In-Process Maintenance. Es sind entweder unsterile Multiuse Systeme oder sind voll sterilisierbare Single-Use Systeme (Agilitech).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung basiert unter anderem auf der Entwicklung von Tandem-Abtrennungsmodulen, die zur Anwendung einer Vorrichtung mit einem real kontinuierlichen Produktstrom geeignet sind und sowohl betrieben als auch gewartet werden, ohne den Massenfluss zu unterbrechen. Ferner basiert die Erfindung auf geeigneten Steuerungs- und Überwachungskonzepten für einen voll automatisierten Betrieb, die beispielsweise über erfindungsgemäße Pumpenmodule den Produktstrom steuern und einen kontinuierlichen Produktstrom gewährleisten, ohne den Einsatz von Behältern zwischen aufeinanderfolgenden Modulen. Folglich betrifft die die Erfindung gemäß einem ersten Aspekt eine Vorrichtung zur kontinuierlichen Aufreinigung eines biotechnologischen Produkts, wobei die Vorrichtung einen modularen Aufbau mit einzelnen miteinander verbundenen Modulen aufweist, wobei die Module mindestens ein Tandem-Abtrennungsmodul, mindestens ein Pumpenmodul, und mindestens ein Dosierungsmodul umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass vom ersten bis zum letzten Modul ein ununterbrochener kontinuierlicher Produktstrom ermöglicht wird.

Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Tandem- Abtrennungsmodul zur Verwendung in einem Verfahren zur kontinuierlichen Aufreinigung eines biotechnologischen Produkts, dadurch gekennzeichnet, dass das Tandem-Abtrennungsmodul zwei identische Durchflussabtrennungseinheiten, ausgewählt aus Filter und Chromatographie-Säulen, in Parallelschaltung umfasst, wobei die zwei Durchflussabtrennungseinheiten alternierend mit dem Produktstrom verbindbar sind, und wobei das Tandem-Abtrennungsmodul mindestens einen Drucksensor aufweist, die mit der Steuerung des Moduls verbunden sind, und besonders bevorzugt sterilisierbar ausgestaltet ist.

Über ein optional enthaltenes erfindungsgemäßes Probenentnahmemodul wird eine Probeentnahme ohne Massenflussunterbrechung erreicht.

Folglich betrifft die Erfindung gemäß einem dritten Aspekt ein Probenentnahmemodul zur Verwendung in einem Verfahren zur kontinuierlichen Aufreinigung eines biotechnologischen Produkts, ausgestaltet ist, um eine Probe aus einem kontinuierlichen System zu entnehmen, ohne dabei den Produktstrom zu unterbrechen, wobei das Probenentnahmemodul bevorzugt einen Probenaufnahmebehälter und einen Pufferbehälter, die mit dem Produktstrom simultan verbindbar angeordnet sind, umfasst, so dass gleichzeitig und in gleichen Maße Flüssigkeit aus dem Produktstrom in den Probenaufnahmebehälter und Puffer aus dem Pufferbehälter in den Produktstrom fließen kann.

Zur Ausgestaltung der Vorrichtung sind die einzelne Module bevorzugt zu Einrichtungen zusammengefasst, die für die Durchführung der einzelnen Schritte des Aufreinigungsverfahren geeignet sind, beispielsweise eine DNA- Abtrennungseinrichtung, eine Proteinabtrennungseinrichtung, eine Konzentrierungseinrichtung, oder eine Umpufferungseinrichtung, eine Resolubilisierungseinrichtung.

Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur kontinuierlichen Aufreinigung eines biotechnologischen Produkts in einer Vorrichtung mit einem modularen Aufbau mit einzelnen miteinander verbundenen Modulen, wobei die Module mindestens ein Tandem-Abtrennungsmodul, mindestens ein Pumpenmodul, und mindestens ein Dosierungsmodul umfassen, umfassend die folgenden Schritte:

- kontinuierliches Zuführen eines das biotechnologische Produkt und Verunreinigungen enthaltenden Produktstroms zu einer ersten Aufreinigungseinrichtung der Vorrichtung, wobei die Einrichtung mindestens ein Tandem-Abtrennungsmodul, gegebenenfalls mindestens ein Dosierungsmodul und gegebenenfalls ein Durchmischungsmodul umfasst;

- ununterbrochener kontinuierlicher Transport des Produktstroms von einem Modul der Aufreinigungseinrichtung zum Nächsten,

- kontinuierliches Ausgeben des Produktstroms mit reduzierten Verunreinigungen aus der Einrichtung.

FIGUREN

Fig. 1 zeigt schematische Darstellungen der erfindungsgemäßen Tandem- Abtrennungsmodule: A) ein Tandem-Tangentialfluss-Filtration (TFF) Modul, umfassend zwei parallel geschaltete TFF; B) ein Tandem- Dead- End-Filter-Modul, umfassend zwei parallel geschaltete Dead-End-Filter.

Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen

Dosierungsmoduls.

Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen

Probenentnahmemoduls. Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Durchmischungsmoduls.

Fig. 5 zeigt ein Flussdiagramm einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Herstellung und Aufreinigung von Antikörpern. Die einzelnen Module sind benannt und Module der gleichen Art in der Reihenfolge, in der sie im Prozess zum Einsatz kommen, fortlaufend nummeriert. Gleiche Nummern bei Pumpen geben die Zugehörigkeit zu einem gemeinsamen Pumpenmodul an.

Fig. 6 zeigt eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Herstellung und Aufreinigung von Antikörpern, aufgrund der Übersichtlichkeit aufgeteilt auf die Abschnitte A-F. Die Vorrichtung umfasst angebunden an den Bioreaktor eine Zellabtrennungseinrichtung enthaltend ein Tandem-TFF-Modul (Fig. 6 A); eine DNA- Abtrennungseinrichtung, enthaltend ein Dosierungsmodul (Fig. 6 A), ein Durchmischungsmodul, ein Tandem-Dead-End-Modul und ein Probennahme-Modul (Fig. 6 B); eine Proteinabtrennungseinrichtung, enthaltend ein Dosierungsmodul, zwei Durchmischungsmodule und ein Tandem-TFF-Modul (Fig. 6 C), eine Konzentrierungs- und

Umpufferungseinrichtung, enthaltend ein Probennahmemodul, ein Durchmischungsmodul und ein Tandem-TFF-Modul (Fig. 6 D); einer Virusinaktivierungseinrichtung, enthaltend ein Dosierungsmodul und ein Durchmischungsmodul (Fig. 6 E) Umpufferungseinrichtung, enthaltend ein Durchmischungsmodul (Fig. 6 F). Die Nummern an den Pumpen zeigen die Zugehörigkeit zu einem Pumpenmodul. Zu- und Abläufe der einzelnen Module sind gekennzeichnet sowie die Positionen von Volumenstrom- und Drucksensoren.

Fig. 7 zeigt ein Flussdiagramm einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Solubilisierung und Aufreinigung von Inclusion Bodies. Die einzelnen Module sind benannt und Module der gleichen Art in der Reihenfolge, in der sie im Prozess zum Einsatz kommen, fortlaufend nummeriert. Gleiche Nummern bei Pumpen geben die Zugehörigkeit zu einem gemeinsamen Pumpenmodul an.

Fig. 8 zeigt eine Fotografie eines zusammengebauten Probenahmesystem mit alle Anschlüssen. Bauteile und Anschlüsse sind in der Figur beschriftet.

Fig. 9 zeigt den Transmembran- und Axial-Druck von zwei zusammengeschalteten TFF-Modulen über den Prozesslauf hinweg. Druckanstieg deutet auf Fouling der Membran hin. Umschalten auf zweiten Filter führt zu einem Druckabfall. In der ersten Stufe erfolgten sechs Umschaltungen in der zweiten Stufe zwei.

Fig. 10 zeigt die Prozessentwicklung für CaCl2- und PEGeooo-Fällungsschritte. A) Konzentration der löslichen hcDNA bei steigenden CaCI2- Konzentrationen (0-350 mM). B, C, D) Ausbeute der Trastuzumab- Fällung, Konzentration der löslichen hcDNA, Konzentration der löslichen HCPs mit (weiße Kreise, gestrichelte Linie) oder ohne (schwarze Kreise, durchgezogene Linie) CaCO-Vorbehandlung des Zellkulturüberstands bei steigenden Konzentrationen von PEGeooo (0-15 % w/w). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von dreifachen Bestimmungen dar.

Fig. 11 zeigt Screening und Test von Tiefenfiltern zur Entfernung von ausgefällter hcDNA nach Zugabe von 100 mM CaCL-Endkonzentration zum Zellkulturüberstand. A) Screening von Tiefenfiltern bei einer volumetrischen Belastung von 250 L/m2. B) Langzeittest für den Tiefenfilter Ertelalsop B4E7 für den Einsatz in einem kontinuierlichen Prozess. Sowohl das Screening als auch der Langzeittest wurden bei einer Durchflussmenge von 1 ,7 mL/min (40 LMH) durchgeführt.

Fig. 12 zeigt Experimente zum kritischen Flux von Hohlfasermodulen, die im Recycling-Modus bei einer Scherrate von 1600 s-1 und einer Konzentration an ausgefällten monoklonalen Antikörpern von 5 g/L in 18 % PEGeooo, 100 mM MOPS-Puffer, pH 7,0 durchgeführt wurden. Porengröße und Innendurchmesser (ID) für jedes Modul sind in der Legende der Abbildung angegeben, ebenso wie der maximale kritische Fluss (LMH). Die Module Nr. 1 , Nr. 2 und Nr. 3 hatten eine Pfadlänge von 30 cm. Nur Modul #4 hatte eine Weglänge von 20 cm.

Fig. 13 zeigt ein Flussdiagramm des integrierten Perfusions-Capture-Aufbaus. Der geklärte Zellkulturüberstand aus dem Perfusionsbioreaktor- Zellrückhaltegerät (TFF) wird zwei aufeinander folgenden Fällungsstufen (CaCO bzw. PEGeooo) unterzogen, die durch eine Tiefenfiltrationsstufe voneinander getrennt sind. Der ausgefällte Antikörper wird in der ersten Stufe der TFF konzentriert und zur zweiten Stufe der TFF geleitet, wo er durch Zugabe von frischem Puffer gewaschen, erneut konzentriert und als Präzipitat gesammelt wird.

Fig. 14 zeigt das Konzentrationsprofil von Trastuzumab. Schwarze Kreise, durchgezogene Linie, Trastuzumab-Konzentrationsprofil im Abfluss am Ausgang der Abscheidungseinheit; schwarze Dreiecke, durchgezogene Linie und weiße Dreiecke, gestrichelte Linie, Trastuzumab- Konzentrationsprofil im Permeat von Stufe 1 bzw. Stufe 2 der TFF; blaue Kreise, blau gestrichelte Linie, Trastuzumab-Konzentrationsprofil am Ausgang der Abscheidungseinheit, berechnet mittels Massenbilanz auf der Grundlage des Perfusionstiters und der Verluste im Permeat der TFF. A) Stand-alone-Abscheidung, B) integrierte Perfusionsabscheidung.

Fig. 15 zeigt die Bestimmung von Aggregaten und Monomeren (%), bezogen auf die Gesamtfläche, erhalten durch analytische Größenausschlusschromatographie für Zellkulturüberstand und wieder aufgelöste Trastuzumab-Proben, die während der Prozesse gewonnen wurden, inkubiert bei niedrigem pH-Wert für 1 Stunde (virale Inaktivierung). A) Aggregate und Monomere (%) für die eigenständige Erfassung über sieben Tage kontinuierlichen Prozesses. B) Aggregate und Monomere (%) für die integrierte Perfusionsabscheidung über acht Tage Prozessdauer. C) Aggregate und Monomere (%) für Zellkultur- Überstandsproben aus dem Perfusionsprozess über acht Tage Prozessintegration für die integrierte Perfusionserfassung.

Fig. 16 zeigt die Konzentration (ppm) von hcDNA (A) und HCPs (B) für den Zellkulturüberstand, der als Ausgangsmaterial für das Stand-alone- Capture verwendet wurde (weißes Dreieck, gestrichelte Linie), für das aus dem Stand-alone-Capture gewonnene wiederaufgelöste Trastuzumab (weiße Kreise, gestrichelte Linie), für den Zellkulturüberstand aus dem mit der Capture-Einheit integrierten Perfusionsprozess (schwarze Dreiecke, durchgezogene Linie), für das aus dem integrierten Perfusions-Capture gewonnene wiederaufgelöste Trastuzumab (schwarze Kreise, durchgezogene Linie).

Fig. 17 zeigt die kumulative Verteilungsfunktion der Capture-Einheit, erhalten durch Salzimpulsinjektion (Rohrreaktor für Antikörperausfällung und zwei Stufen der TFF. Schwarze durchgezogene Linie, experimentelle Daten; orange gestrichelte Linie, gelbe gestrichelte Linie, schwarze gestrichelte Linie, theoretische kumulative Verteilungsfunktion, die durch Anwendung des Tank-in-Serien-Modells für eine Reihe von CSTRs von 1 , 5 bzw. 10 CSTRs erhalten wurde.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur kontinuierlichen Aufreinigung eines biotechnologischen Produkts, wobei die Vorrichtung einen modularen Aufbau mit einzelnen miteinander verbundenen Modulen aufweist, wobei die Module mindestens ein Tandem-Abtrennungsmodul, mindestens ein Pumpenmodul, und mindestens ein Dosierungsmodul umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass vom ersten bis zum letzten Modul ein ununterbrochener kontinuierlicher Produktstrom ermöglicht wird. Der Begriff „Produktstrom" meint im Rahmen der Erfindung das Fluid aus einer heterogenen Zellkultur-Fluid-Mischung, welche das Produkt enthält, sowie das Ergebnis jeder anderen Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, also das zwischen den einzelnen Modulen strömende Fluid des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei diese Produktströme unterschiedliche Konzentrationen und Reinheitsgrade aufweisen können.

Unter einem „kontinuierlichen Verfahren“ versteht man im Rahmen der Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von mindestens zwei aufeinanderfolgenden Verfahrensschritten, bei dem der Ausgangsstrom eines vorgelagerten Schrittes einem nachgelagerten Schritt zugeführt wird. Der nachgeschaltete Schritt beginnt mit der Verarbeitung des Produktstroms, bevor der vorgeschaltete Schritt abgeschlossen ist. Typischerweise wird bei einem kontinuierlichen Prozess ein Teil des Produktstroms immer in der Produktionslinie befördert und als "kontinuierlicher Produktstrom" bezeichnet.

Der Begriff "geschlossen" bedeutet im Rahmen der Erfindung die Fahrweise des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen modularen Anlage, welche so gefahren werden kann, dass das Produkt, welches mit diesem Verfahren und dieser modularen Anlage produziert und/oder aufbereitet wird, nicht an die Raumumgebung exponiert wird. In das erfindungsgemäße geschlossene Verfahren und die entsprechende erfindungsgemäße geschlossene modulare Anlage können von außen Materialien, Gegenstände, Puffer und dergleichen zugegeben werden, wobei aber diese Zugabe in einer solchen Weise erfolgt, dass eine Exposition des produzierten und/oder aufbereiteten Produktes an die Raumumgebung vermieden wird.

Erfindungsgemäß ist die Vorrichtung in Module unterteilt. Diese Module haben jeweils eigene verfahrenstechnische Funktionen. Es ist möglich, einzelne Module auszutauschen, hinzuzufügen oder deren Reihenfolge zu ändern. In der Vorrichtung gibt es Verbindungsleitungen zwischen den verschiedenen Modulen der Vorrichtung. Die Module sind steril zusammenschließbar. Dabei können bevorzugt die Module durch Verschweißen oder durch aseptische Konnektoren wie Steam Thru Connectors®, oder Opta® SFT Sterilkonnektor miteinander verbunden werden.

Dieser ununterbrochene kontinuierliche Produktstrom wird durch eine geeignete Kombination der Module und eine Steuerung und Regelung der Fließgeschwindigkeit des Produktstroms von einem Modul zum nächsten erreicht.

Die Vorrichtung ist gemäß einer Ausführungsform hinsichtlich eines automatischen Erreichens und Aufrechterhaltens eines Fließgleichgewichts des Produktstroms und/oder hinsichtlich einer Druckverteilung in der Vorrichtung selbstregulierend ausgebildet. Gemäß einer Ausführungsform ist die Vorrichtung derart ausgestaltet, dass bei laufendem Betrieb ohne Unterbrechung des Produktstroms Funktionselemente der Module gewartet oder ausgetauscht werden können.

Für die Automatisierung der Vorrichtung können alle Pumpenmotoren der Vorrichtung aufeinander angepasst und durch manuelle Stellwertvorgabe gesteuert werden. Dazu sind eine oder mehrere Pumpen in einem Pumpenmodul zusammengefasst.

Gemäß einer Ausführungsform der Vorrichtung weist das Pumpenmodul eine oder mehrere Pumpen und Volumenstromsensoren auf, die mit der Steuerung des Pumpenmoduls verbunden sind, und konstante Flussraten gewährleisten. Bevorzugt ist jede Pumpe mit einem zugeordneten Volumenstromsensor verbunden. Die Volumenstromsensoren sind besonders bevorzugt Ultraschallvolumenstromsensoren. Insbesondere handelt es sich um nicht-invasive Clamp- On Ultraschallsensoren, also Ultraschallsensoren, die an der Außenseite des Rohres angeklemmt werden (engl. ,clamp-on‘), wodurch kein Eingriff in den Produktstrom erforderlich ist. Gemäß einer Ausführungsform weist das Pumpenmodul einen Rahmen mit Halterungen für die einzelnen Pumpen und die Volumenstromsensoren auf.

Aufgabe des Pumpenmoduls ist es, über einen langen Prozesszeitraum konstante Flussraten zu gewährleisten. Die Pumpen eines Pumpenmoduls können aufeinander angepasst werden durch die Einstellung von einfachen linearen Beziehungen zwischen den Pumpen bezüglich der Pumprate (P) oder der erzeugten volumetrischen Flussrate.

Z.B.: P1 = P2+P3 or P1 = x*P

Durch eine Rückkopplungsschleife wird gegebenenfalls die Pumpendrehzahl an die gewünschte Flussrate angepasst. Die verwendeten Pumpen können magnetisch gekoppelte Pumpen oder Peristaltikpumpen sein. Die Pumpen eines Pumpenmoduls sind insbesondere unterschiedlichen Einrichtungen der Vorrichtung zugeordnet. Jede Pumpe hat einen Zulauf und einen Ablauf, der über aseptische Konnektoren mit den zugeordneten Modulen bzw. den Verbindungsleitungen verbunden ist.

Die eingestellten Flussraten bzw. Fließgeschwindigkeiten variieren regelmäßig von Verfahrensschritt zu Verfahrensschritt um jeweils das technisch/ökonomische Optimum für den Verfahrensschritt zu erreichen. Die Fließgeschwindigkeit kann im Bereich von 0,5 ml/min bis 100 ml/min liegen. Beispielsweise kann die Fließgeschwindigkeit bei 0,5 ml/min, 1 ,0 ml/min, 1 ,5 ml/min, 2,0 ml/min, 2,5 ml/min, 3,0 ml/min, 4,0 ml/min, 5,0 ml/min, 6,0 ml/min, 7,0 ml/min, 8,0 ml/min, 9,0 ml/min, 10,0 ml/min, 11 ,0 ml/min, 12,0 ml/min, 13,0 ml/min, 14,0 ml/min, 15,0 ml/min, 16,0 ml/min, 17,0 ml/min, 18,0 ml/min, 19,0 ml/min, 20,0 ml/min, 25,0 ml/min, 30,0 ml/min, 35,0 ml/min, 40,0 ml/min, 45,0 ml/min, 50,0 ml/min, 55,0 ml/min, 60,0 ml/min, 65,0 ml/min, 70,0 ml/min, 75,0 ml/min, 80,0 ml/min, 85,0 ml/min, 90,0 ml/min, 95,0 ml/min, oder 100 ml/min liegen. Gemäß einer Ausführungsform liegt die Fließgeschwindigkeit während des gesamten

Verfahrens im Bereich von 1 ,0 ml/min bis 80 ml/min liegen. Gemäß einer Ausführungsform liegt die Fließgeschwindigkeit während des gesamten

Verfahrens im Bereich von 2,0 ml/min bis 60 ml/min liegen.

Gemäß einer Ausführungsform werden die Module einzeln und unabhängig voneinander geregelt. Es besteht in diesem Fall keine Kommunikation zwischen den Modulen, um eine Fehlerfortpflanzung bzw. Fehlsteuerung zu vermeiden. Alternativ ist es auch möglich die Steuerung mit einem Advanced Process Control System zu verknüpfen. Dieses erlaubt eine Optimierung des Verfahrens und kann beispielsweise eine modelprädiktive Steuerung, eine Softsensorik und fortgeschrittene Real-time Spektroskopie-Verfahren ermöglichen.

Unter Regelung im Sinne der Anwendung versteht man die Messung der zu beeinflussenden Größe (Regelgröße) und einen kontinuierlichen Vergleich mit dem gewünschten Wert (Sollwert). Entsprechend der Abweichung errechnet ein Regler eine Stellgröße, die so auf die Regelgröße einwirkt, dass sie die Abweichung minimiert und die Regelgröße ein gewünschtes Zeitverhalten annimmt. Dies entspricht einem geschlossenen Wirkungsablauf.

Im Vergleich dazu bezeichnet Steuerung den Vorgang in einem System, bei dem eine oder mehrere Eingangsgrößen aufgrund systemeigener Gesetzmäßigkeiten die Ausgangsgrößen beeinflussen. Kennzeichnend für die Steuerung ist der offene Wirkungspfad oder ein geschlossener Wirkungspfad, bei dem die von den Eingangsgrößen beeinflussten Ausgangsgrößen nicht ständig und nicht wieder über dieselben Eingangsgrößen auf sich selbst einwirken.

Die einzelnen Module können direkt oder indirekt jeweils über ein geeignetes Kopplungselement, vorzugsweise steril, miteinander gekoppelt sein.

Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Tandem-Abtrennungsmodul zwei identische Durchflussabtrennungseinheiten in Parallelschaltung, wobei die zwei Durchflussabtrennungseinheiten alternierend mit dem Produktstrom verbindbar sind.

Die Durchflussabtrennungseinheiten sind ausgewählt aus Filtern und Chromatographie-Säulen. Insbesondere handelt es sich um ein Tandem- Tangentialfluss-Filter (TFF) oder einen Tandem-Dead-End-Filter. Entsprechend werden die Module als Tandem-TFF-Modul oder Tandem-Dead-End-Filter-Modul bezeichnet. Bei der Tangentialflussfiltration wird die zu filtrierende Suspension parallel einer Membran oder eines Filtermediums gepumpt und das Permeat (auch Filtrat genannt) quer zur Fließrichtung abgezogen. Die aufgrund der turbulenten Strömung an der Filteroberfläche auftretenden Scherkräfte lassen sich in Abhängigkeit vom Volumenstrom variieren. Durch die hohe Geschwindigkeit wird weitgehend vermieden, dass sich ein Filterkuchen (Deckschicht oder Fouling) aus den abzutrennenden Feststoffpartikeln auf der Membran aufbaut. Er würde den Filtrationswiderstand und damit den Druckverlust über den Filter erhöhen, was die Filterleistung reduziert.

Während beim Dead-End-Filter die abzuscheidenden Feststoffe als Filterkuchen gewonnen werden, kann in der Querstromfiltration der Feststoff nur soweit konzentriert werden, dass die Suspension noch pumpbar ist. Der rückgeführte Teil des Flüssigkeitsstroms wird Retentat genannt.

Alternativ können Chromatographie-Säulen als Durchflussabtrennungseinheiten eingesetzt werden, die ein Chromatographieharz mit funktionellen Gruppen aufweisen, die nicht an das gewünschte biotechnologische Produkt binden. Stattdessen sollten die Chromatographie-Säulen Harze aufweisen die an die anzureichernden Verunreinigungen im Produktstrom binden.

Wichtig ist, dass die Tandem-Abtrennungsmodule keine Chromatographiesäulen aufweisen, die einen Elutionsschritt benötigen, da sonst keine kontinuierliche Prozessführung möglich ist. Insbesondere weist die gesamte Vorrichtung keine Abtrennungsmodule mit Elutionsschritt auf.

Das Tandem-Abtrennungsmodul kann mindestens einen Drucksensor enthalten. Drucksenoren sind vorzugsweise mit der Steuerung der Vorrichtung oder des Moduls verbunden. Über den Drucksensor kann die Beladung des Filters oder der Chromatographiesäule gemessen werden.

Das Tandem-Abtrennungsmodul ist so aufgebaut, dass es eine sterile Parallelschaltung der Durchflussabtrennungseinheiten (Filter oder Chromatographie) gewährleistet. Das Modul kann aus Edelstahl bestehen und somit bei 121 °C und 1.1 bar bedampft werden. Das Modul umfasst vorzugsweise ein Sterilization-In-Place (SIP) System. Dadurch ist das Modul vollständig sterilisiert. Sobald eine Durchflussabtrennungseinheit ausgetauscht werden muss, kann die Steuerung automatisch auf die zweite Einheit schalten. Die erste Durchflussabtrennungseinheit kann gewaschen und entnommen werden. Ein gegebenenfalls vorab sterilisierter Filter oder eine gegebenenfalls vorab sterilisierte Chromatographie-Säule wird dann als Ersatz in die erste

Durchflussabtrennungseinheit eingesetzt. Anschließend kann ein Sterilisationsschritt erfolgen, in dem die während des Austauschs offenen Flüssigkeitsleitungen sterilisiert und optional zusätzliche die Durchflussabtrennungseinheit werden. Danach kann die Einheit mit Puffer befüllt werden und in den Hauptstrom geschaltet werden, wenn die parallele Einheit des Moduls vorzugsweise ausgetauscht werden muss.

Zur Überwachung der Sterilisation kann das Tandem-Abtrennungsmodul einen Temperatursensor aufweisen. Die Steuerung der Ventile erfolgt automatisch.

Das Tandem-Dead-End-Filter-Modul ist in Fig. 1 B dargestellt. Es ist das am wenigstens komplexe Tandem-Abtrennungsmodul, da es keinen Retentat-Ablauf umfasst und die Überwachung und Steuerung des Systems wenig komplex ausfällt. Das System kann mittels Drucksensoren überwacht werden, also über den Eingangs-Druck pf oder den Differential-Druck Ap = pf / PR. Bei Druckanstieg über einen Schwellenwert, z.B. 2 bar Eingangsdruck, kann die Steuerung automatisch auf die parallele Einheit schalten.

Das Tandem-Chromatographie-Modul ist analog zu dem Tandem-Dead-End- Modul aufgebaut. Auch hier erfolgt eine Drucküberwachung, vorzugsweise eine Überwachung des Differentialdrucks.

Das komplexeste Tandem-Abtrennungsmodul ist das Tandem-TFF-Modul (Fig. 1 A). Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Tandem-TFF-Modul Halterung für die Filter vorzugsweise mit einstellbaren Klammem, beispielsweise mit einer Länge im Bereich von 30 - 65 cm und einem Durchmesser im Bereich von Diameter ~ 0.5 - 5 cm. Das Tandem-TFF-Modul verfügt entweder über ein Clean- In-Place (CIP) System oder ein SIP System. Das Tandem-TFF-Modul verfügt über mindestens drei Drucksensoren, für den Zulauf, das Retentat und das Permeat. Bei einem SIP-System ist mindestens ein weiterer Drucksensor für den Dampfzulauf notwendig.

Bei den Tangential-Filtern handelt es sich bevorzugt um Hohlfaserfilter oder Membranen. Diese können eine Fläche im Bereich von 100 cm ² - 900 cm ² aufweisen. Die Tangential-Filter verfügen über einen Zulauf und zwei Abläufe für Permeat und Retentat.

Aufgrund der vorhandenen Retentat-Ablaufs werden mehr Ventile benötigt und gegebenenfalls eine Trennung der beiden Permeat-Abläufe notwendig (aufgrund des Sterilisation-Prozesses). Als Steuerungsgröße dient der Transmembran-Druck (TMP). Dieser ergibt sich aus den gemessenen Drücken des Zulaufs, des Retentats und des Permeats.

TMP = (pt + p _r ) / 2 +p _P

PF = Druck Zulauf pp = Druck Permeat PR= Druck Retentat

Alternativ kann auch der Differentialdruck also der Quotient aus dem Zulaufdruck und dem Retentatdruck (PR) Ap = pt / PR die Steuerungsgröße sein. Der Schwellenwert für den Transmembran-Druck (TMP) liegt bei bis zu 2.5 bar und beim der Differentialdruck bei unterhalb von 2 bar.

Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Tandem-Abtrennungsmodul zur Verwendung in einem Verfahren zur kontinuierlichen Aufreinigung eines biotechnologischen Produkts bereit, das zwei identische Durchflussabtrennungseinheiten, ausgewählt aus Filter und Chromatographie-Säulen, in Parallelschaltung umfasst, wobei die zwei Durchflussabtrennungseinheiten alternierend mit dem Produktstrom verbindbar sind, und wobei das Tandem- Abtrennungsmodul mindestens einen Drucksensor, der mit der Steuerung des Moduls verbunden ist, und besonders bevorzugt sterilisierbar ausgestaltet ist. Das Tandem-Abtrennungsmodul gemäß dem zweiten Aspekt ist insbesondere wie im ersten Aspekt beschrieben.

Gemäß einer Ausführungsform ist das Dosierungsmodul ausgebildet, um eine kontinuierliche Dosierung von Zugabestoffen zu gewährleisten. Das Dosierungsmodul kann einen Versorgungsbehälter und einen Zwischenbehälter aufweisen. Zwischen diesen ist bevorzugt eine Filtereinheit angeordnet. Diese ist vorteilhafterweise mit einem Drucksensor ausgestattet ist.

Aufgabe des Dosierungsmoduls (Fig. 2) ist es, eine kontinuierliche Dosierung von Puffern und anderen Lösungen (z.B.: Präzipitant) über einen langen Zeitraum zu gewährleisten. Das Modul besitzt einen großen Versorgungsbehälter mit einem Volumen von mindestens 40 I, bevorzugt mindestens 50 I, besonders bevorzugt mindestens 60 I, und einen kleineren Zwischenbehälter von weniger als 1 I, bevorzugt weniger als 800 ml, besonders bevorzugt von weniger als 500 ml. Sowohl beim Versorgungsbehälter als auch Zwischenbehälter handelt es sich bevorzugt um Beutel. Der Zwischenbehälter gewährleistet, dass es bei dem Austausch des Versorgungsbehälters zu keinen Unterbrechungen des Massenflusses kommt. Um die Sterilität des Systems zu wahren, kann eine Dead- End-Filter-Kapsel dem Zwischenbehälter vorgeschaltet sein, die mittels eines Drucksensors überwacht wird. Der Versorgungsbehälter kann gravimetrisch überwacht werden.

Neben dem mindestens einen Tandem-Abtrennungsmodul, mindestens einem Pumpenmodul, und mindestens einem Dosierungsmodul weist die Vorrichtung bevorzugt mindestens ein Probenentnahmemodul und/oder oder ein Durchmischungsmodul auf.

Gemäß ist einer Ausführungsform ist das Durchmischungsmodul ausgebildet, um mehrere Teilströme mit einer geringen Verweilzeitverteilung zu vermischen. Die mittlere Verweilzeit berechnet als Quotient des Fluidvolumens im Reaktor zum austretenden Volumenstrom. Die mittlere Verweilzeit ist ein Maß dafür, wieviel Zeit die Reaktionsmasse im Mittel benötigt, um einen Reaktor zu durchströmen. Dabei können allerdings die effektiven Verweilzeiten einzelner Teilchen sehr unterschiedlich sein, wodurch sich eine Verweilzeitverteilung ergibt.

Je nach durchzuführender Reaktion kann für das entsprechende Durchmischungsmodul eine für die Reaktion geeignete Verweilzeit über die Dimensionierung des Durchmischungsmoduls und Einstellung der Fließgeschwindigkeit definiert werden. Im Verfahren gemäß Beispiel 1 liegen die mittleren Verweilzeiten im Bereich von 5 min bis 60 min. Für eine homogene Umsetzung bzw. Vermischung soll die Varianz der Verweilzeit möglichst geringgehalten werden. Das Durchmischungsmodul weist bevorzugt einen Röhrenreaktor auf. Schon bei einer geringen Strömungsgeschwindigkeit von unter 3 ml/min ist die Varianz der Verweilzeit eines Röhrenreaktors mit einem Volumen von 2 L nur etwa halb so groß wie bei einem Rührkessel mit gleichem Volumen. Zudem kann bei höheren Fließgeschwindigkeiten die Varianz der Verweilzeit noch weiter reduziert werden. Bei einer Fließgeschwindigkeit von 7.5 ml/min ist die Varianz nur halb so groß wie bei etwa 3 ml/min. Bei dem Röhrenreaktor handelt es sich insbesondere um ein Schlauchsystem mit Mischeinsatz. Vorzugsweise ist das Durchmischungsmodul ein Einwegartikel.

Der Begriff "Einwegartikel" bedeutet im Rahmen der Erfindung, dass die entsprechenden produktberührenden Teile, insbesondere Apparate, Behälter, Filter und Verbindungselemente, zum einmaligen Gebrauch mit anschließender Entsorgung geeignet sind, wobei diese Behälter aus Kunststoff oder Metall bestehen können. Im Rahmen der Erfindung umfasst der Begriff auch wiederverwendbare Gegenstände, beispielsweise aus Stahl, die nur einmal im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden und danach nicht mehr im Verfahren verwendet werden. Solche gebrauchten Einwegartikel können dann im erfindungsgemäßen Verfahren auch als "disposabel“ oder "Single Use" Artikel bezeichnet werden ("SU-Technologie").

Gemäß einer Ausführungsform weist das Durchmischungsmodul ein Spektrometer zur Bestimmung der volumetrischen Konzentration und/oder der Vermischungseffizienz auf. Das Durchmischungsmodul (Fig. 3) dient also dazu, mehrere Ströme optimal homogen zu vermengen bei geringst möglicher Verweilzeitverteilung. Es besteht die Möglichkeit der Anbindung von bis zu zwei Flusszellen, um mittels einer spektrometrischen Methode die Vermischungseffizienz, aber auch die volumentrische Konzentration (und damit auch die Proteinkonzentration) zu messen. Das Durchmischungsmodul hat vorzugsweise keine Steuerungsalgorithmen implementiert. Der Röhrenreaktor kann aus einem Schlauchsystem mit Mischeinsatz bestehen. Vorzugsweise ist das Durchmischungsmodul ein Einwegartikel. Das Durchmischungsmodul weist mindestens zwei Eingänge und mindestens einen Ausgang, bevorzugt zwei Ausgänge, auf.

Gemäß einer Ausführungsform ist das Probenentnahmemodul ausgestaltet, um eine Probe aus dem kontinuierlichen System zu entnehmen, ohne dabei den Produktstrom zu unterbrechen. Gemäß einer Ausführungsform weist das Probenentnahmemodul einen Probenaufnahmebehälter und einen Pufferbehälter auf, die mit dem Produktstrom simultan verbindbar angeordnet sind, so dass gleichzeitig im gleichen Maße Flüssigkeit aus dem Produktstrom in den Probenaufnahmebehälter und Puffer aus dem Pufferbehälter in den Produktstrom fließen kann.

Aufgabe des Probenentnahmemoduls ist es, eine Probe aus einem kontinuierlichen System zu ziehen, ohne dabei den Massenfluss zu unterbrechen. Bei der Probenentnahme wird der Produktstrom weg von der Prozessrichtung in ein Probeentnahmegefäß umgelenkt. Simultan öffnet sich der Weg zu einem Pufferbehälter der den fehlenden Volumenstrom in der Hauptleitung in Prozessrichtung ersetzt. Nach erfolgter Probeentnahme dreht das Ventil wieder auf die Eingangsstellung und der Produktstrom fließt wieder in Prozessrichtung zum nächsten Modul. Der Füllstand des Pufferbehälters kann dabei gravimetrisch überwacht werden. Die Puffer-Flussrate kann über einen Ultraschall-Clamp-on- Sensor überwacht werden und die Pumpe über einen Feedback-Loop gesteuert werden. Gemäß einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein zuvor beschriebenes Probenentnahmemodul bereit.

Gemäß einer Ausführungsform ist die Vorrichtung zur Durchführung mehrerer Aufreinigungsschritte ausgebildet. Dafür weist die Vorrichtung bevorzugt mehrere aus den Modulen aufgebaute Einrichtungen auf.

Ein Beispiel solch einer Einrichtung ist eine Zellaufschluss- bzw. Zellabtrennungseinrichtung. Diese enthält insbesondere ein Dosierungsmodul, ein Durchmischungsmodul und ein Tandem-Abtrennungsmodul. Ein Beispiel solch einer Einrichtung ist eine DNA-Abtrennungseinrichtung. Diese enthält insbesondere ein Dosierungsmodul, ein Durchmischungsmodul und ein Tandem- Abtrennungsmodul. Ein weiteres Beispiel solch einer Einrichtung ist eine Proteinabtrennungseinrichtung. Diese enthält insbesondere ein Dosierungsmodul, ein Durchmischungsmodul und ein Tandem-Abtrennungsmodul. Ein weiteres Beispiel solch einer Einrichtung ist eine Konzentrierungseinrichtung. Diese enthält insbesondere ein Tandem-Abtrennungsmodul. Ein weiteres Beispiel solch einer Einrichtung ist eine Umpufferungseinrichtung. Diese enthält insbesondere ein Dosierungsmodul, ein Durchmischungsmodul und ein Tandem- Abtrennungsmodul. Ein weiteres Beispiel solch einer Einrichtung ist eine Resolubilisierungseinrichtung. Diese enthält insbesondere ein Dosierungsmodul und ein Durchmischungsmodul. Ein weiteres Beispiel solch einer Einrichtung ist eine Virusinaktivierungseinrichtung. Diese enthält insbesondere ein Dosierungsmodul und ein Durchmischungsmodul.

Aufgrund der modularen Bauweise kann die Vorrichtung in einfacher Weise für die Aufreinigung jeder Art von Proteinen oder Nukleinsäuren angepasst. Beispielsweise kann der Aufbau - wie in Beispiel 2 gezeigt - in einfacher Weise an die Aufreinigung von Proteinen aus Inclusion Bodies angepasst werden. Genau so können je nach Bedarf mehr Proteinaufreinigungseinrichtungen eingesetzt werden, um ggf. eine höhere Reinheit zu erreichen.

Die Vorrichtung enthält vorzugsweise keine Zwischentanks zwischen den Modulen und/oder Einrichtungen. Ein Verzicht auf Zwischentank wird durch den dauerhaften Betrieb ohne Unterbrechung für den Austausch von Materialien, den Verzicht auf Aufreinigungsmodule, die einen Elutionsschritt erfordern, sowie geeigneten zueinanderpassende Fließgeschwindigkeiten der einzelnen Prozessabschnitte erreicht.

Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur kontinuierlichen Aufreinigung eines biotechnologischen Produkts in einer Vorrichtung mit einem modularen Aufbau mit einzelnen miteinander verbundenen Modulen, wobei die Module mindestens ein Tandem-Abtrennungsmodul, mindestens ein Pumpenmodul, und mindestens ein Dosierungsmodul umfassen, umfassend die folgenden Schritte:

- kontinuierliches Zuführen eines das biotechnologische Produkt und Verunreinigungen enthaltenden Produktstroms zur einer ersten Aufreinigungseinrichtung der Vorrichtung, wobei die Einrichtung mindestens ein Tandem-Abtrennungsmodul, gegebenenfalls mindestens ein Dosierungsmodul und gegebenenfalls ein Durchmischungsmodul umfasst;

- ununterbrochener kontinuierlicher Transport des Produktstroms von einem Modul der Aufreinigungseinrichtung zum Nächsten, und

- kontinuierliches Ausgeben des Produktstroms mit reduzierten Verunreinigungen aus der Einrichtung.

Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens ist das biotechnologische Produkt ein Protein oder eine Nukleinsäure. Das Protein kann ausgewählt sein aus einem Blutgerinnungsfaktor, einem Peptid-Hormon, einem Wachstumsfaktor, einem Interferon, einem Interleukin-Analogon, oder einem Impfstoff, oder einem Antikörper, bevorzugt Antikörper der Klassen lgG1-4, IgM und IgG, IgE, oder Derivaten davon. Das Protein kann ferner ein Protein zur Verwendung als Nahrungsmittel sein. Die Nukleinsäure kann ausgewählt sein aus DNA, RNA, wie Antisense-RNA, oder Antisense-Oligonukleotiden.

Gemäß einer Ausführungsform wird das Verfahren ohne Lagerung des Produktstroms in Zwischentanks realisiert und/oder ohne Elutionschromatographie ausgeführt. Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens ist die Vorrichtung eine Vorrichtung gemäß dem ersten Aspekt. Gemäß einer Ausführungsform wird in der Aufreinigungseinrichtung eine Flow- Through-Chromatographie oder eine Proteinfällung gefolgt von einer Filtration, beispielsweise eine Dead-End- oder Tangentialfluss-Filtration, verwendet.

Gemäß einer Ausführungsform weist das Tandem-Abtrennungsmodul zwei identische Durchflussabtrennungseinheiten, ausgewählt aus Filter und Chromatographie-Säulen, in Parallelschaltung und einen Drucksensor auf. Eine der beiden Durchflussabtrennungseinheiten steht mit dem Produktstrom in Verbindung und bei Überschreiten eines Schwellenwerts für den Druck als Maß für das Erreichen der Füllkapazität der Durchflussabtrennungseinheit, wird der Produktstrom auf die andere Durchflussabtrennungseinheit umgeschaltet. Diese Umschaltung kann automatisch erfolgen oder von einer Bestätigung des Operateurs der Anlage abhängig sein. Bei einem Tandem-TFF-Modul wird der Transmembrandruck (TMP), der Differentialdruck Ap = pt / PR und/oder der Druckanstieg bestimmt. Beim Tandem-Dead End-Modul Der Schwellenwert liegt für den TMP im Bereich von 2 bis 2,5 bar. Für den Differentialdruck liegt der Schwellenwert unterhalb von 2 bar.

Die Tandemoperation erlaubt das kontinuierliche Hin- und Herschalten zwischen den Einheiten (Tiefenfilter, Membranen, etc.) Durch die Drucküberwachung wird eine Überschreitung des kritischen Drucks verhindert und somit die kontinuierliche Operation ermöglicht (siehe auch Figur 9). Bei erhöhten Druck wird der Massenfluss auf die zweite Stufe gelenkt. Dadurch entsteht ein Druckabfall. Der Prozess wird dabei nicht gestoppt und läuft kontinuierlich weiter. Der Gleichgewichtszustand bleibt erhalten.

Beim Druckanstieg existiert kein konkreter Schwellenwert, sondern ein beispielsweise exponentieller Anstieg signalisiert das Erreichen der Füllkapazität. Als zusätzliche Sicherheitsfunktion kann in der Regel schon unterhalb des Schwellenwerts ein Alarmsignal ausgelöst werden. Dann kann die erste Durchflussabtrennungseinheit unter Sterilisation der Verbindungstücke gegen eine neue Durchflussabtrennungseinheit ausgetauscht werden.

Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens werden Zugabestoffe, wie der Präzipitant für die Fällung, über ein Dosierungsmodul dem Produktstrom zugeführt. Das Dosierungsmodul weist dabei einen Versorgungsbehälter und einen Zwischenbehälter auf, zwischen denen eine Filtereinheit angeordnet ist, die mit einem Drucksensor ausgestattet ist. Der Zwischenbehälter wird mit dem Produktstrom verbunden und gleichzeitig der Versorgungsbehälter vom Produktstrom getrennt, wenn der Versorgungsbehälter leer ist und/oder der Druck an der Filtereinheit einen Schwellenwert überschreitet. Druck an der Filtereinheit oberhalb des Schwellenwerts zeigt eine Kontamination des Dosierungsmoduls an.

Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens wird über ein Probenentnahmemodul, umfassend einen Probenaufnahmebehälter und einen Pufferbehälter, eine Probe aus dem Produktstrom entnommen, ohne dabei den Produktstrom zu unterbrechen. Dabei werden der Probenaufnahmebehälter und der Pufferbehälter mit dem Produktstrom simultan verbunden, so dass gleichzeitig Flüssigkeit aus dem Produktstrom in den Probenaufnahmebehälter und im gleichen Maße Puffer aus dem Pufferbehälter in den Produktstrom fließt.

Der Hauptfluss kann über einen eigenhändig designten Zylinderhahn unter Beachtung der 3D Regel geregelt werden. Um das Probenentnahmemodul abzudichten wird beispielsweise ein O-Ring (D = 2 mm) und ein Stift in den Zylinderhahn integriert sowie Polytetrafluoroethylen (PTFE)-Dichtungen zwischen den Tri-Clamps eingestezt.

Die Sensoren dienen zur Überwachung des Druckes. Überschreitet der Druck den max. zulässigen Druck wird dies durch die Drucksensoren erkannt. Bei Einsatz des Probenentnahmemoduls in einem Anlagenprozess würde bei Überschreiten des Druckes ein Alarm ausgelöst werden. Der vorliegende Sampling loop ist für eine Probenahme von 2 ml geeignet. Der Vorteil dieser Konstruktion ist die Anpassung der Probemenge durch Ersetzen des Sampling loops durch einen längeren Sampling loop.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind alle in Modulen eingesetzten, produkt-berührten Einheiten oder Elemente keimreduziert. Der Begriff „keimreduziert" meint im Rahmen der Erfindung einen Zustand reduzierter Keimzahl, also einer Zahl an Mikroorganismen pro Flächen- oder Volumeneinheit von nahezu Null. Bevorzugt kann die Keimreduktionsmethode ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Gamma-Bestrahlung, Beta- Bestrahlung, Autoklavieren, Ethylenoxid (ETO)- Behandlung, Ozon-Behandlung (O3), Wasserstoffperoxid-Behandlung (H2O2) und Steam- in-place (SIP) Behandlung.

Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens umfasst die Aufreinigung einen oder mehrere der folgenden Schritte in dafür geeigneten Eirichtungen: Zellabtrennung, DNA-Abtrennung, Proteinabtrennung, Umpufferung, Proteinkonzentration und Virusinaktivierung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das biotechnologische Produkt ein Antikörper und das Verfahren umfasst jeden der genannten Schritte. Gemäß einer Ausführungsform der Antikörperaufreinigung liegt die Fließgeschwindigkeit in der Zell- Abtrennungseinrichtung im Bereich von 5 ml/min bis 10 ml/min, bevorzugt im Bereich von 6 ml /min bis 9 ml/min, besonders bevorzugt im Bereich von 6,5 ml Zmin bis 7,5 ml/min. Gemäß einer Ausführungsform liegt die Fließgeschwindigkeit in der DNA-Abtrennungseinrichtung im Bereich von 5 ml/min bis 10 ml/min, bevorzugt im Bereich von 6 ml /min bis 9 ml/min, besonders bevorzugt im Bereich von 7 ml /min bis 8 ml/min. Gemäß einer Ausführungsform liegt die Fließgeschwindigkeit in der Protein-Abtrennungseinrichtung im Bereich von 7 ml/min bis 14 ml/min, bevorzugt im Bereich von 8 ml /min bis 12 ml/min, besonders bevorzugt im Bereich von 9 ml /min bis 11 ml/min. Gemäß einer Ausführungsform liegt die Fließgeschwindigkeit in der Umpufferungseinrichtung, der Konzentrierungseinrichtung und der Virusinaktivierungseinrichtung im Bereich von 0.5 ml/min bis 5,0 ml/min, bevorzugt im Bereich von 1 ,0 ml /min bis 3,0 ml/min, besonders bevorzugt im Bereich von 1 ,0 ml /min bis 2,0 ml/min. Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens wird das Fließgleichgewicht der kontinuierlichen Aufreinigung über einen Zeitraum von mindestens einer Woche, bevorzugt mindestens 4 Wochen, besonders bevorzugt mindestens 3 Monaten, vorzugsweise mindestens 6 Monaten aufrechterhalten. Eine derart lange Laufzeit von mehreren Wochen kontinuierlichem Betriebs wird ermöglicht durch den geschlossenen und keim reduzierten Betrieb der Vorrichtung, sowie die Möglichkeit der Wartung der einzelnen Module und den Matenalaustausch im laufenden Betrieb etwa durch den Einsatz der Tandem-Abtrennungsmodule mit Durchflusseinheiten.

Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens wird die kontinuierliche Aufreinigung mit einer kontinuierlichen Proteinherstellung gekoppelt. Die kontinuierliche Proteinherstellung kann in einem kontinuierlich betriebenen Bioreaktor durchgeführt werden.

BEISPIELE

Beispiel 1 - Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) aus Zellkulturüberständen

Die mAb-Aufreinigung kann aus den folgenden 6 Prozessschritten bestehen:

• Zellaufschluss bzw. Zellabtrennung

• DNA Abtrennung bzw. Fällung

• (selektive) Protein Fällung

• Konzentrierung

• Waschen & Um puffern

• Resolubilisierung

• Neutralisation

Ein schematischer modularer Aufbau der Vorrichtung für die kontinuierliche Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern ist in Fig. 6 dargestellt sowie als Flussdiagramm in Fig. 5. Die aus dem Bioreaktorprozess gewonnene Zellsuspension wird zunächst durch Filtration von den Zellen befreit (Zellabtrennungseinrichtung) und in die DNA- Abtrennungseinrichtung, enthaltend ein Dosierungsmodul, ein Rohrreaktor-Modul und ein Tandem-Dead-End-modul sowie Pumpen eines Pumpenmoduls überführt.

Über das Dosierungsmodul wird aus einer CaCl2 Stock-Lösung die CaCL Konzentration im Produktstrom auf 100 mM eingestellt. Gegebenenfalls ist vorher die Addition einer minimalen Konzentration von Phosphat in den Überstand notwendig. Die Reaktionszeit der DNA-Fällung beläuft sich auf wenige Minuten. Eine optimale Mischung sowie die notwendige Verweilzeit, wird über die Länge des Rohrreaktor-Moduls erreicht. Das Präzipitat wird anschließend in dem Tandem Dead-End-Modul über Tiefenfilter (23 cm ² bis 250 cm ² ) abgetrennt. Über den Druck (max. 2 - 2.5 bar) wird System überwacht und bei Fouling des Filters automatisiert auf den zweiten Filter geschaltet. Der Filter kann ausgetauscht werden, die Wegstrecke bedämpft (121 °C, 1.1 bar) und wieder steril in das System eingefügt werden (Funktional geschlossenes System).

Die Proteinpräzipitation erfolgt in einer Proteinabtrennungseinrichtung, enthaltend ein Dosierungsmodul, für die Zugabe chaotroper Substanzen. Die mAb Fällung erfolgt bei einer PEGeooo (Polyethylenglycol) Konzentration von 12 - 15 Vol.-%. Auch diese Substanz wird aus einer ca. 50 Vol.-% Stocklösung über ein Dosierungsmodul hinzugefügt. Die Reaktionszeit dieser Fällung beträgt rund 20 min und die optimale Verweilzeit und Mischung wird wie im ersten Schritt über ein Rohrreaktor-Modul ermöglicht.

Die Konzentrierung (5-20-fach) erfolgt in einer Umpufferungseinrichtung mit einem Tandem TFF System. Dabei wird kontinuierlich Flüssigkeit entzogen und neues präzipitiertes Protein hinzugefügt. Auch hier wird über den Druck bzw. den Transmembran-Druck das System überwacht und bei erhöhtem Fouling der Membran (Druckanstieg) automatisiert auf den zweiten Filter geschaltet. Der nicht verwendete Filter kann ausgetauscht werden und die Wegstrecke bedampft und wieder steril in das System eingefügt werden (funktional geschlossenes System). Umpuffern bzw. Waschen des Präzipitats erfolgt in einer Umpufferungs- Einrichtung analog zur Konzentrierung außer, dass noch eine zusätzliche Leitung mit einem wässrigen Puffer (z.B.: 100 mM MOPS Puffer) an das TFF-System angeschlossen ist. Es wird ein Umpufferungsfaktor von 10 angestrebt, um das Präzipitat größtmöglich vom Überstand und den restlichen löslichen Medien und Zellkulturbestandteilen zu befreien. Auch hier wird das System über den Druck überwacht und weist die oben genannte Redundanz auf.

Das Präzipitat wird im nächsten Schritt gelöst. Dies kann bei niedrigem pH (< 3,2) erfolgen. Die Reaktion selber benötigt nur eine kurze Verweilzeit kann aber auf 1 h verlängert werden um simultan eine Virusinaktivierung durchzuführen. Die optimale Durchmischung und Verweilzeit wird durch die Länge des Rohrreaktor- Moduls bestimmt. Im letzten Schritt wird die Lösung neutralisiert (pH = 7).

Die Zugabe der einzelnen Lösungen erfolgt über die Dosierungs-Module. Alle Durchflüsse werden mit Flusssensoren überwacht und über die dazugehörigen Pumpen gesteuert. Das System befindet sich kontinuierlich im Fließgleichgewicht. Es gibt keine Zwischenbehälter, die sich negativ auf die Verweilzeit auswirken.

Beispiel 2 - Aufreinigung und Resolubilisierung von Inclusion Bodies

Die Inclusion Body (IB) Aufreinigung und Resolubilisierung umfasst die folgenden Schritte:

• IB Solubilisierung

• IB Refolding

• Proteinlösung umpuffern

• Proteinlösung aufkonzentrieren

Ein schematischer modularer Aufbau der Vorrichtung für die kontinuierliche Prozessierung von Inclusion Bodies ist in Fig. 7 dargestellt.

IBs, auch Einschlusskörper genannt, entstammen aus einem mikrobiellen Prozess, nämlich der Proteinexpression in Bakterien, insbesondere Escherichia Coli. Bei der Expression kommt es zur Falschfaltung des in großen Mengen produzierten Zielproteins, zur Aggregation und damit zur Bildung der IBs, in denen das Zielprotein zwar nicht richtig gefaltet, dafür aber in hoher Reinheit vorliegt. Nach dem Aufbrechen der Zelle können die IBs durch Zentrifugieren von Zellbruchbestandteilen und dem restlichen Medium abgetrennt werden.

Das IB Pellet liegt als Slurry mit einem hohen Proteinanteil vor. Bei Bedarf kann dem IB Slurry Puffer hinzugefügt werden und diese auf einen gewünschten End- Proteinanteil gebracht werden.

Der verdünnte Slurry wird in die kontinuierliche Anlage über Pumpen eingebracht. Im ersten Prozessschritt kommt es zur Solubilisierung der IBs mit einem chaotropen oder neutralem Detergenz in hoher Molarität, z.B.: 8 M Guanidin Hydrochlorid oder 6 M Harnstoff. Je nach Produkt, falls Di-Sulfidbrückenbindungen ausgebildet werden müssen, muss dieser Prozess bereits unter reduzierenden Bedienungen stattfinden. Dies geschieht zumeist unter Zugabe von Dithiothreitol (DTT), z.B.: 100 mM.

Nach erfolgter Solubilisierung kommt es zum Refolding des Proteins. Mittels Umpufferung, zum Beispiel mit einem 100mM Tris-HCI Puffersystem mit stabilisierenden Zusätzen wie 300 mM NaCI und 50 mM Arginin bei einem pH von 7 wird das solubilisierte Protein in ihre aktive Form gefaltet.

Im letzten Schritt wird die (zumeist) aus dem Prozess kommende verdünnte Proteinlösung aufkonzentriert.

Die verwendeten Tandemfiltermodule entsprechen denen aus Beispiel 1. Ferner kommen dieselben Kontrollstrategien zur Anwendung. Aufgrund der Größe der IBs kommen allerdings (Hohlfaser)-Filtermembranen mit einem unterschiedlichen Cut- Off zum Einsatz. Für das erste Tandem TFF Modul, wo das Zielprotein noch im aggregierten Festzustand vorliegt, kommt eine Hohlfaser-Membran mit einem Cut- Off von 0,2 pm zur Verwendung. Ab dem Solubilisierungsschritt werden Membranen, abhängig von der Größe des Zielproteins, mit Cut Offs von 3-10 kDa verwendet. Theoretisch kann jedes Protein, welches sich in E. coli exprimieren lässt und als IB vorliegt, mit diesem Prozess Setup kontinuierlich aufgereinigt werden. Beispiel für industrierelevante Produkte sind Insulin, FAb-Fragmente (Fragmente von monoklonalen Antikörpern) und Casein.

Beispiel 3 Herstellung eines rekombinantes lgG1 und Aufreinigung mit dem erfindungsgemäßen kontinuierlichen Verfahren in einer modularen Produktionsanlage

3.1 Methoden

3.1.1 Zellkultur

In dieser Studie wurde ein rekombinantes lgG1 (Handelsname Trastuzumab, PI 8.4-8.6) verwendet. CHO-Zellen wurden im Perfusion-Modus in einem Labfors 5 Tisch-Bioreaktor (Infors Ht, Schweiz) kultiviert. Die Zellvermehrung erfolgte in Schüttelkolbenkulturen (Corning, New York, USA) mit einem Arbeitsvolumen von bis zu 500 mL. Die Bioreaktoren wurden mit einer Zelldichte von 3-5 x 10 ⁶ Zellen/mL beimpft. Die Perfusion wurde am gleichen Tag mit 0,5 WD durch kontinuierliche Zufuhr von frischem Perfusionsmedium und Entnahme von Ernte aus dem Permeat eingeleitet. Eine Perfusionsrate von 0,5 WD wurde beibehalten, bis eine Zelldichte von 10 x 10 ⁶ Zellen/mL erreicht war und wurde schrittweise mit der Zelldichte bis auf 1 WD erhöht, bis der Sollwert für die lebende Zellkonzentration (VCC) von 60 ± 10 x 10 ⁶ Zellen/mL erreicht war. Zellbluten wurde über eine automatisierte Blutungs-Rückkopplungsschleife mit VCC-Prognose aus einer Online-Kapazitätssonde (Incyte, Hamilton, Schweiz) angewendet. Das Arbeitsvolumen wurde durch gleichbleibende Ein- und Ausflussraten bei 2 L gehalten. Rückkopplungsschleifen von Bioreaktorgewicht, Zufuhr (Feed) und Entnahme (Bleed) wurden zur Anpassung der Pumpenflussraten verwendet. Die Kulturen wurden mit einem Medium, bestehend aus 4Cell XtraCHO Produktionsmedium (Sartorius) mit Feed A und Feed B (6 %/1 %) Ergänzung (Sartorius) und 60 mM D-Glucose, perfundiert. Die Sollwerte der Prozesstemperatur, der gelösten Sauerstoffkonzentration und des Kultur-pH- Werts betrugen jeweils 37°C, 40 % und 7.0 ± 0.1. Zur Sammlung von Überstand für die Prozessentwicklung und Chargenkapazität erfolgte die Ernte von Überstand aus dem Bioreaktor mit einem ATF 2 (Repligen, Waltham, MA) Zellrückhaltegerät ausgestattet mit einer Polyethersulfon HF mit einer Porengröße von 0,2 pm und einer Oberfläche von 0,13 m ² bei einer Scherrate von 1500 s ^-1 (Repligen, Waltham, MA). Für die integrierte Perfusionserfassung wurde die Ernte des Überstands über TFF mit einer Polyvinylidenfluorid HF (Asahi Kasei, Tokio, Japan) mit einer Porengröße von 0.2 pm und einer Membranfläche von 0.08 m ² bei einer Scherrate von 1000 s ^-1 durchgeführt. Eine magnetisch schwebende Pumpe (Levitronix, Framingham, MA, USA) wurde zur Rezirkulation verwendet.

3.1.2 hcDNA-Fällung durch CaCF

Um die besten Bedingungen für eine effiziente hcDNA-Fällung zu bestimmen, wurden steigende Konzentrationen von CaCl2 von 0 bis 350 mM aus einer 1 M Lagerlösung von CaCL in 100 mM MOPS, pH 7,0, zum CCCS hinzugefügt. Das Screening wurde in 1 ,5 mL Zentrifugenröhrchen mit einem Gesamtarbeitsvolumen von 1 mL durchgeführt. Die Proben wurden für 5 Minuten sanft auf dem End-to- End-Shaker (Stuart Rotator SB3; Cole- Parmer, Vernon Hills, IL) gerüttelt. Diese Zeit war ausreichend für die maximale hcDNA-Fällung bei der entsprechenden CaCI2-Konzentration. Nach der Fällung wurden die Proben bei 6000 g für 6 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde in frischen Zentrifugenröhrchen für die anschließende Analyse gesammelt.

3.7.3 Tiefen filtration der ausgefällten Verunreinigungen

Für die Entfernung der mit CaCL ausgefällten Verunreinigungen aus dem Produktstrom wurden Tiefenfilterkapseln mit verschiedenen Porengrößen und von zwei verschiedenen Herstellern getestet. Zur Trübungsmessung wurde ein tragbares 2100Q Trübungsmessgerät verwendet (HACH Lange GmbH, Düsseldorf, Deutschland). Zur Aufzeichnung des Einlassdrucks wurde ein PressureMAT® mit einem Drucksensor für den Labormaßstab eingesetzt (PendoTech, New Jersey, USA). Die Qubicon® Online-Software (Qubicon, Wien, Österreich) ermöglichte die Online-Überwachung und Aufzeichnung des Einlassdrucks während der Experimente. Für jeden getesteten Tiefenfilter wurde eine endgültige Konzentration von 100 mM CaCI2 aus einer 1 M Lagerlösung von CaCO in 100 mM MOPS, pH 7,0, in handelsüblichen Laborglaswaren zum CCCS hinzugefügt. Das Präzipitat wurde mit einem magnetischen Rührer in Suspension gehalten. Tiefenfilter wurden vor Gebrauch mit 40 L/m ² deionisiertem Wasser gespült. Eine Peristaltikpumpe (114 DV, Watson Marlow, Guntramsdorf, Österreich) wurde verwendet, um die Lösung mit 1 ,7 mL/min (40 LMH) bis zu einer volumetrischen Beladung von 250 L/m ² zum Einlass des Tiefenfilters zu fördern. Trübungsmessungen wurden alle 30 Minuten am Ausgang des Tiefenfilters und am Pool der tiefengefilterten Lösung durchgeführt. PharMed® BPT Schläuche (Saint-Gobain, Courbevoie, Frankreich) wurden am Pumpenkopf verwendet und mit Masterflex® Luer Lock-Anschlüssen an Silikonschläuche (Tygon R-3603, Saint-Gobain, Courbevoie, Frankreich) für die Zuführungs- und Auslassleitungen der Tiefenfilter angeschlossen. Alle Schläuche hatten einen Innendurchmesser (ID) von 3,2 mm (3/32 Zoll).

3. 1.4 Trastuzumab-Fällunq durch PEGeooo

Steigende Konzentrationen von PEGeooo im Bereich von 0 bis 15 % (w/w) wurden aus einer 50%igen Lagerlösung von PEGeooo in 100 mM MOPS pH 7,0 zum CCCS hinzugefügt. Alternativ wurde CCCS mit einer endgültigen Konzentration von 100 mM CaCL vorbehandelt, um die Auswirkungen der CaCL-Fällung auf die Trastuzumab-Aufnahme durch PEGeooo zu bewerten. Die Experimente wurden in

1.5 mL Zentrifugenröhrchen mit einem Arbeitsvolumen von 1 mL durchgeführt. Nach der Zugabe von PEGeooo wurden die Proben für 15 Minuten auf dem End-to- End-Shaker (Stuart Rotator SB3; Cole- Parmer, Vernon Hills, IL) inkubiert. Für die anschließende Analyse wurden die Proben bei 2000 g für 2 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde in frischen Zentrifugenröhrchen gesammelt.

3. 1.5 Experimente zum kritischen Fluss

Experimente zum kritischen Fluss wurden gemäß Li and Zidney 2017 auf verschiedenen HFs durchgeführt. Das Fällungsprodukt wurde mit einer Peristaltikpumpe (313 DV Watson Marlow, Guntramsdorf, Österreich) aus einem 100 mL Reservoir mit einer Konzentration von 5 g/L zum Einlass des HF gefördert, wobei das Retentat und das Permeat zurück in dasselbe Reservoir recycelt wurden. Eine zweite Peristaltikpumpe (114DV, Watson Marlow, Guntramsdorf, Österreich) wurde verwendet, um den Permeatfluss zu steuern und zu modulieren, der in einem Bereich von 11 LMH bis 109 LMH variiert wurde. Der transmembrane Druck (TMP) wurde durch Installation von Drucksensoren für Labormaßstab (PendoTech, New Jersey, USA) an Einlass-, Retentat- und Permeatleitungen des HF überwacht. Die Drucksensoren wurden an einen PressureMAT® (PendoTech, New Jersey, USA) angeschlossen und die Qubicon® Online-Software wurde zur Überwachung und Aufzeichnung verwendet.

3. 1.6 Resolubisierung von Trastuzumab bei niedrigem pH-Wert

Die Resolubisierung von eingefangenem Trastuzumab wurde chargenweise mit einem 50 mM Phosphatpuffer pH 2,5 bei einem volumetrischen Verdünnungsverhältnis Probe:Puffer von 1 :5 durchgeführt. Die Proben wurden 60 Minuten bei niedrigem pH-Wert (<3,5) auf dem End-to-End-Shaker (Stuart Rotator SB3; Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) inkubiert und durch Zugabe von 200 mM Phosphatpuffer pH 8,0 mit einem volumetrischen Verdünnungsverhältnis Probe: Puffer von 4:1 neutralisiert. Dieses Verhältnis ergab eine Lösung mit einem End-pH-Wert von 6,5. Die Proben wurden dann sofort analysiert, bei 4°C gelagert oder bei -20°C für eine längere Lagerung eingefroren.

3.1.7 Kontinuierliche 2-Stufen-Fällung und 2-Stufen-TFF

Der während eines Perfusionprozesses geerntete Überstand wurde entweder in Einweg-10-L-Flexboy® 2D-Taschen (Sartorius, Ort) gesammelt und bei -20°C eingefroren, bevor er für die eigenständige Fällung von Trastuzumab verwendet wurde, oder direkt zur ersten Fällungsstufe in einem poollosen integrierten Perfusion-Einfang geführt. Lagerlösungen von CaCL und PEGeooo wurden entsprechend den vorherigen Experimenten hergestellt. Alle Lösungen wurden mit 0,2 pm Filtern Sartopore® 2 XLG Kapsel (Sartorius) in zuvor autoklavierten Kunststoffflaschen mit 3-Wege-Kappen (Nalgene, Rochester, USA) steril filtriert. Peristaltikpumpen wurden zum Transport der Flüssigkeiten verwendet. Alle Schläuche, die in der Anordnung verwendet wurden, waren Silikonschläuche (3,2 mm ID) oder PharMed® BPT Schläuche (Saint-Gobain, Courbevoie, Frankreich, 3,2 mm ID) an den Köpfen der Peristaltikpumpen. Die Rohrreaktoren wurden intern hergestellt, indem statische Mischer (HT-40-6.30-24-AC; Material Acetal; Stamixco AG, Wollerau, Schweiz) in flexible Standardlabor-Schläuche (Tygon® R- 3603, 4,8 mm Innendurchmesser; Saint-Gobain, Courbevoie, Frankreich) eingefügt wurden, die spiralförmig angeordnet und vertikal gestapelt wurden. Die Länge der Rohrreaktoren wurde nach der für eine effiziente Fällung benötigten Verweilzeit bestimmt (5 Minuten für CaCL-Fällung, 15 Minuten für PEGeooo- Fällung).

3. 1.8 Durchfluss-Anionenaustausch-Membranchromatoc/raphie

Das während des integrierten Perfusion-Erfassungsprozesses geerntete Präzipitat wurde bei niedrigem pH gelöst, wie im Abschnitt 2.6 berichtet. Zur Prozessoptimierung haben wir einen DoE-Ansatz angewendet. Die Software, die für das Design der Experimente und die statistische Auswertung verwendet wurde, war Design-Expert® (Stat-ease inc.). Der pH-Wert der Lösung wurde durch Titration mit 0,02 M NaOH auf den erforderlichen pH-Wert neutralisiert. Die Leitfähigkeit wurde durch Zugabe von 1 M NaCI oder durch Verdünnung mit HQ- Wasser eingestellt. Für diese Experimente wurden ein Äkta pure 25 (Cytiva) und ein negativ geladener Membranadsorber, der 3M™ Polisher ST (1 cm2 Fläche), verwendet. Vor dem Laden wurde das Gerät mit 400 L/m2 eines 50 mM Phosphatpuffers durchgespült, dessen pH-Wert und Leitfähigkeit entsprechend der Zuführungslösung eingestellt wurden. 50 mL (500 L/m ² ) des wiederaufgelösten Trastuzumab wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 mL/min (600 LMH), wie vom Hersteller vorgeschlagen, auf das Gerät geladen. Der Durchfluss wurde gesammelt und vor der Analyse bei 4°C gelagert.

3. 1.9 Puls-Injektions-Experimente

Die Verweilzeitverteilung (RTD) für Trastuzumab wurde durch Puls- Injektionsexperimente in allen Einheiten ermittelt, in denen das Antikörper in Form eines Präzipitats vorliegt (der PEGeooo-Rohrreaktor und die beiden TFF-Stufen). Der ausgefällte Antikörper wird im Retentat des HF zurückgehalten. Um den Pfad nachzuahmen, dem das Antikörper mit Salz folgt, wurden die Permeatleitungen während der Experimente geschlossen. Der Ausgang des Systems war an ein Äkta pure 25 (Cytiva) zur Leitfähigkeitsaufzeichnung angeschlossen. Zunächst wurde das System mit deionisiertem Wasser durchgespült, bis die Leitfähigkeit unter 0,3 mS/cm lag. Pulsinjektionen mit einem Gesamtvolumen von 10 mL 1 M NaCI wurden durch Umschalten der Zuführungsleitung von deionisiertem Wasser auf die Salzlösung und zurück durchgeführt. Wir haben das Modell der in Serie geschalteten Tanks mit steigender Anzahl (N) von kontinuierlich gerührten Tankreaktoren (CSTR) verwendet, um unsere experimentellen Daten anzupassen. Die kumulative Verteilungsfunktion (F) für eine Reihe von ideal gerührten Tanks wird durch Gleichung 1 gegeben: F=1-e ^A (-N0) [1 +N0+ (N0) ^A 2/2!+ (N0) ^A (N-1 )/(N- 1)1] (1 ) Wobei 0 das Gesamtbeladungsvolumen [ml] normiert durch das Systemvolumen [ml] bezeichnet.

3.1.10 HCPs-Konzentrationsbestimmunp, Bradford-Assav und ELISA

Für die kleinen Screening-Experimente, die während der Prozessentwicklung durchgeführt wurden, wurde der Bradford-Assay für die HCPs-Bestimmung verwendet, wie in der Literatur bereits beschrieben (Sissolak et al. 2019). Die HC Ps-Konzentration wurde durch Massenbilanz auf CCCS und dem Überstand von Proben, die während der Experimente erzeugt wurden, nach Zentrifugation des gefällten oder nicht wiederaufgelösten Materials bei 2000g für 2 min, bestimmt. Für die kontinuierliche Verarbeitung wurde die HCPs-Bestimmung mit einem 3rd Generation CHO HCP ELISA Kit (Cignus technologies, Southport, US) durchgeführt.

3.1.11 hcDNA -Konzentrationsbestimmunci

Die Konzentration von doppelsträngiger DNA (dsDNA) in den während der Experimente erzeugten Proben wurde mit einem Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) gemessen, entsprechend den Anweisungen des Herstellers und wie in der Literatur bereits beschrieben (Dutra et al. 2020).

3.1.12 Analytische und präparative Protein A Affinitätschromatopraphie, analytische Größenausschlusschromatopraphie (SEC)

Analytische und präparative Protein A Affinitätschromatographie und analytische SEC wurden wie in einer früheren Arbeit beschrieben durchgeführt (Recanati et al. 2022).

3.1.13 Glykosylierunpsanalyse

Antikörperproben wurden direkt auf einem U3000 nanoRSLC-System (Thermo Fisher Scientific) analysiert. 5 pL der Probe wurden auf eine C4-Fallensäule (5,0 x 0,3 mm i.d., Acclaim PepMap; Thermo Fisher Scientific) injiziert, mit einer Fließrate von 15 pL/min und einer mobilen Phase bestehend aus H2O + 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA; Merck, Darmstadt), bei einer Temperatur von 60 °C für 5 min. Nach dem Einfangen der Antikörper wurde das 6-Port-Ventil umgeschaltet und die Falle wurde in Reihe mit der Trennsäule (Diphenyl-Umkehrphasensäule (15,0 x 0,1 mm ID, Halo® Bioclass, 1000 A Porengröße; Advanced Material Technology, Wilmington, DE) gesetzt. Die Trennung der mAb-Proben wurde mit einer Fließrate von 1 ,0 pL/min bei einer Temperatur von 80 °C durchgeführt. Ein mehrstufiger Gradient mit Lösungsmittel A (H2O (ELGA Labwater, Ede, Niederlande) + 0,1 % TFA) und Lösungsmittel B (Acetonitril (Actu-All Chemicals, Oss, Niederlande) + 0,1 % TFA) wurde wie folgt programmiert: 20,0% B für 5 min, 20,0% bis 32% in 1 ,0 min, 32-50% B in 12 min, 50,0-60,0 % B in 2 min gefolgt von 90,0 % B für 5 min und 20% B für 5 min.

Das LC-System wurde mit einem qTOF-Massenspektrometer (Maxis HD) über eine nano-ESI-Quelle (CaptiveSpray; beide von Bruker, Bremen, Deutschland) gekoppelt. Acetonitril-angereichertes Stickstoffdopantgas wurde bei einem Druck von 0,40 bar eingesetzt (nanoBooster-System; Bruker). Trocknungsgas wurde mit einer Durchflussrate von 3,0 L/min bei einer Temperatur von 220 °C aufgebracht. Das System wurde im positiven lonenmodus mit einer Kapillarspannung von 1200 V betrieben. Die In-Source-CID-Energie wurde auf 180 eV, die Quadrupol- lonenenergie auf 5,0 und die Kollisionszellenenergie auf 5,0 eV eingestellt. Eine Vorpulsspeicherzeit von 25,0 ps und eine Transferzeit von 200,0 ps wurden verwendet. Der Massenbereich wurde von m/z 1000 - 6000 inklusive einem rollenden Durchschnitt von drei Scans eingestellt. Die Datenanalyse wurde mit der Compass DataAnalysis-Software (Bruker) durchgeführt. Die Deconvolution von rohen Massenspektren wurde durch den maximalen Entropiealgorithmus erreicht, indem eine Auflösung von 5000 und eine minimale Signal/Rausch-Verhältnis von 5,0 eingestellt wurden. 3.2 Ergebnisse

3.2.1. Entwicklung von CaCO- und PEGeooo-Fällungsschritten

Die CaCI2-Fällung wurde im Prozess implementiert, um den Gehalt an löslicher hcDNA zu reduzieren. Steigende CaCO-Konzentrationen im Bereich von 0 bis 350 mM bei pH 7,0 wurden dem CCCS (Zellkulturüberstand nach Klärung) zugesetzt (Figur 10A). 100 mM CaCI2 waren ausreichend, um den Großteil der in dem geklärten Zellkulturüberstand vorhandenen hcDNA auszufällen, und diese Salzkonzentration wurde für alle weiteren Experimente verwendet.

Die Anwesenheit von CaCl2 erhöhte die Löslichkeit des Antikörpers (Figur 10B). Da Ca2+ ein kosmotropes Ion ist, begünstigt es gemäß der Hofmeister-Reihe ein Salting-in-Verhalten. Daraus resultiert, dass eine höhere PEG-Konzentration notwendig ist, um die gleiche Ausfällungsrate zu erzielen, verglichen mit dem unbehandelten CCCS. Die Zugabe von CaCL führte zu einer Reduktion von HCPs und hcDNA um das Zweifache bzw. 22-fache. Hingegen kam es zu einer umfangreichen Co-Fällung von hcDNA, HCPs und Trastuzumab, wenn die PEGeooo-Fällung allein auf CCCS durchgeführt wurde (Figur 10 C,D). Co-Fällung erschwert die Reinigung des Proteins von Interesse (POI), was zur gleichzeitigen Konzentration von Verunreinigungen und Produkt während der Tangentialflussfiltration (TFF) führt. Zudem verbessert die Reduktion von hcDNA (in unserem Fall vor der Erfassung) die Leistung der TFF-Filtration und verringert die Membranverschmutzung im Laufe der Zeit (Mercille et al. 1994). Daraus ist zu folgern, dass die Zugabe von CaCL zum CCCS vor der Erfassung beide genannten Probleme mindert.

3.2.2. Tiefenfilter-Screening und La ngzeittest

Kontinuierliche Tiefenfiltration kann durch Implementierung von Redundanzen und den Betrieb von Filtern im Tandemmodus erreicht werden. Allerdings muss die Größe der Filter zum Produktmassenstrom passen, um häufige Gerätewechsel zu vermeiden, die ein Risiko für Prozessfehler darstellen. Wir haben Doppelschicht- Tiefenfilter mit unterschiedlichen Medien und Porengrößenbewertungen von zwei verschiedenen Anbietern hinsichtlich des Einlassdrucks und der Trübung des ausgefilterten Stroms untersucht. Alle Filter reduzierten die Trübung am Ausgang auf unter 10 NTU. In Anbetracht dessen wird in Figur 11A nur der Einlassdruck aus Gründen der Einfachheit berichtet. Der Tiefenfilter Ertelalsop B4E7 verursachte den geringsten Druckanstieg während des Screenings. In einem Langzeitexperiment blieb der Einlassdruck dieses Geräts weit unter dem vom Hersteller angegebenen Druckschwellenwert (2,4 bar) über etwa 11 Stunden Betriebsdauer bei gegebenem Futterfluss von 1 ,7 ml/min (40 LMH), ohne Trübungserhöhung am Auslass (Figur 11 B). Dieser Filter wurde für den Einsatz im kontinuierlichen Prozess ausgewählt, wobei eine Wechselrate von zwei Filtern pro Tag zu erwarten ist.

3.2.3. Kritische Flussbewertung für verschiedene Hohlfaser-Geometrien

Die Bestimmung des kritischen Flusses ist nützlich für die Auswahl von HF- Modulen für spezifische Anwendungen. Das unter definierten Bedingungen und Konzentrationen erzeugte Fällungsmaterial wird auf dem Modul recycelt, während der Permeatfluss stufenweise erhöht wird. Der kritische Fluss wird willkürlich als der Permeatfluss definiert, bei dem der transmembranale Druck (TMP) stark ansteigt. Für die kontinuierliche Produktion werden HFs weit unterhalb des kritischen Flusses betrieben und normalerweise im Bereich von 1 bis 15 LMH. Dennoch kann die Bestimmung des kritischen Flusses als Parameter zum Vergleich verschiedener Module und zur Auswahl des in spezifischen Prozessbedingungen am besten performenden Moduls verwendet werden. Ein TMP-Anstieg entsprechend maximal 60 Pa/min ist eine übliche Schwelle. Mit dieser Verschmutzungsrate kann ein HF 24 Stunden lang betrieben werden, bevor es ersetzt werden muss (Li and Zidney 2017).

Die Erfinder haben Membranen mit unterschiedlichen Geometrien wie Faserinnendurchmesser, Porengröße und Weglänge untersucht. Alle HFs wurden bei einer Scherrate von 1600 s-1 getestet. Der kritische Fluss für alle getesteten Module betrug 109 LMH (Figur 12).

3.2.4 Kontinuierliche Verarbeitung, eigenständige Erfassung und integrierte Perfusions-Erfassung

Ein Flussdiagramm des gesamten Systems ist in Figur 13 dargestellt. Mit der maßgeschneiderten Einrichtung haben die Erfinder einen kontinuierlichen Prozess entweder als eigenständige Erfassung oder als integrierte Perfusions-Erfassung für bis zu 8 Tage durchgeführt. Die gesamte Prozessrückgewinnung betrug 84,5 % und 78,4 % für den eigenständigen und den integrierten Prozess. Ein Vergleich der Perfusionsproduktivität und der Reduktion von Verunreinigungen ist in Tabelle 1 dargestellt. Bei der eigenständigen Erfassung blieb der Trastuzumab-Titer im Abfluss über die letzten drei Tage des Laufs konstant (Figur 14A). Kleine Schwankungen der Produktkonzentration im Abfluss sind auf den Austausch von Filtern und HF-Modulen (Cytiva, 0,011 m2) zurückzuführen. Während des integrierten Prozesses hatten die verfügbaren Module eine größere Membranfläche (Asahi Kasei, Microza, 0,02 m2), daher ein größeres Totvolumen. Dies führte zu höheren Schwankungen der Trastuzumab-Konzentration nach dem Austausch der HF-Module (Figur 14B).

Tabelle 1. Vergleich der Perfusionsproduktivität, der Rückgewinnung von Abscheidungsschritten und der Verringerung von Verunreinigungen bei der alleinigen Abscheidung und bei den integrierten Perfusions-Abscheidungsverfahren.

Stand-alone Integrated

PVP g ■ (L pro Tag) - ¹ * 0.4 1.0

Prozessiertes Volumen (L / 2 2

Tag) gereinigter mAb (g) 4.5 11.9

HCPs (LRV) 1.1 1 hcDNA (LRV) 1.7 1.9

Rückgewinnung (%) 84.5 78.4

Dennoch war die resultierende Produktreinheit für die beiden Prozesse vergleichbar, konstant über die Zeit und lag zwischen 85 % und 95 % (Figur 15). Bei beiden Prozessen lag die endgültige Konzentration von hcDNA und HCPs nach der Erfassung durchschnittlich bei 30 ppm bzw. 50 000 ppm. Bemerkenswert ist, dass während des integrierten Perfusions-Erfassungsprozesses der Gehalt an Verunreinigungen im CCCS an allen Tagen variierte, während im eigenständigen Prozess einen Pool verwendet werden und somit eine konstante Zusammensetzung des CCCS während des gesamten Prozesses vorlag. Dennoch erzielten wir für beide Prozesse ein ähnliches Niveau an verbleibenden Verunreinigungen (Figur 16A und B). Dies unterstreicht die Robustheit des Fällungsschritts: Die Löslichkeit von POI und Verunreinigungen wird durch die Fällungsbedingungen bestimmt. Aus diesem Grund wird erwartet, dass das Verhältnis dieser Komponenten nach der Fällung (wenn identische Fällungsbedingungen angewendet werden) konstant ist, wie in den Experimenten festgestellt werden.

3.2.5 Verweilzeitverteilung der kontinuierlichen Fällung und TFF

Die Erfinder haben die Verweilzeitverteilung des Systems ermittelt, in dem das Antikörper in Form von Fällung vorliegt (der PEGeooo-Röhrenreaktor und die beiden Stufen der TFF) durch Pulsspritzexperimente. Frühere Arbeiten haben bereits bewiesen, dass das Verhalten des ausgefällten Antikörpers dem Verhalten von Salz entspricht, wenn statische Mischer in Röhrenreaktoren verwendet werden (Burgstaller 2019). Daher werden NaCI als Tracer für die Experimente verwendet. Ungefähr 7 Reaktorvolumina (0) waren notwendig, um das gesamte eingeführte Salz aus dem System zu spülen (Figur 17). Die durchschnittliche Verweilzeit bei den gegebenen Prozessflussraten und dem Systemvolumen beträgt 15,4 Stunden. Diese Zeit könnte jedoch drastisch reduziert werden, abhängig vom Gesamtvolumen des Systems, dem Upstream-Maßstab und den gewünschten Umwandlungsraten in den beiden TFF-Stufen (ausgedrückt als Prozentsatz der Zufuhr zu den Abflussraten in jeder Stufe). Als Beispiel wurde in dem Prozess eine Umwandlungsrate von 95% angewendet.

Abhängig vom Grad der löslichen Verunreinigungen könnte eine Umwandlungsrate von 90% oder weniger angewendet werden. In diesem Fall würde die durchschnittliche Verweilzeit auf 7,8 Stunden halbiert. Darüber hinaus wird die gemeldete durchschnittliche Verweilzeit bei einem kontinuierlichen Prozess von 30 Tagen oder mehr im Vergleich zur Prozessdauer und zur durchschnittlichen Verweilzeit des Produkts im Perfusionsbioreaktor vernachlässigbar. Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Ansprüche verwiesen.

Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.

REFERENZEN

Burgstaller, Continuous recovery of antibodies with non-interrupted mass flow of the product, Wien, 2019, pp. VII, 38 Blätter, 10 ungezählte Blätter, 13 Blätter, Illustrationen, Diagramme.

Dutra, D. Komuczki, A. Jungbauer, P. Satzer, Continuous capture of recombinant antibodies by ZnCI2 precipitation without polyethylene glycol, Engineering in Life Sciences 20(7) (2020) 265-274.

Li, A.L. Zydney, Effect of zinc chloride and PEG concentrations on the critical flux during tangential flow microfiltration of BSA precipitates, Biotechnology Progress 33(6) (2017) 1561 -1567.

Mercille, M. Johnson, R. Lemieux, B. Massie, Filtration-based perfusion of hybridoma cultures in protein-free medium: Reduction of membrane fouling by medium supplementation with DNase I, Biotechnol Bioeng 43(9) (1994) 833-46.

Recanati, R. Coca-Whiteford, P. Scheidl, B. Sissolak, A. Jungbauer, Redissolution of recombinant antibodies precipitated by ZnCI2, Process Biochemistry 118 (2022) 145-153.

Sissolak, C. Zabik, N. Saric, W. Sommeregger, K. Vorauer-Uhl, G. Striedner, Application of the Bradford Assay for Cell Lysis Quantification: Residual Protein Content in Cell Culture Supernatants, Biotechnology Journal 14(7) (2019) 1800714.