La présente invention est relative à des bâtons moléculaires, à leurs utilisations dans un procédé de fixation et/ou de cristallisation de macromolécules, aux produits ainsi obtenus ainsi qu'aux applications desdits produits dans le domaine des matériaux et de la biologie structurale, notamment comme biocapteurs ou comme biomatériaux.

La connaissance de la structure des protéines et notamment de leurs sites actifs est essentielle à la compréhension de leur mécanisme d'action. On dispose, pour réaliser de telles études, de plusieurs méthodes : rayons X, RMN, électrocristal- lographie (cristallisation 2D).

Pour réaliser la cristallisation proprement dite, la technique de cris- tallisation bidimensionnelle sur monocouche ou film lipidique, à l'interface air/eau (E. E. Ugziris et al., Nature, 1983,301,125-129), permet la formation de systèmes auto-organisés de macromolécules biologiques (cristaux) et la détermination des structures de ces molécules par l'analyse par microscopie électronique des cristaux obtenus.

Cette méthode consiste à créer une monocouche lipidique au niveau d'une interface air/liquide, les lipides étant sélectionnés pour interagir avec les protéines, présentes dans la phase liquide, qui se fixent sur les lipides, puis forment un réseau organisé.

La fixation des protéines sur les lipides de la monocouche met en jeu des interactions chimiques au niveau de la tête polaire des lipides. Ces interactions sont soit aspécifiques, les lipides possédant des extrémités polaires chargées, donnant lieu à une cristallisation par interactions ioniques, soit spécifiques. Dans ce dernier cas, la tête polaire des lipides porte des ligands présentant une forte affinité avec les protéines à fixer.

En particulier, il a pu être montré que des protéines solubles peuvent cristalliser bidimensionnellement sur des films lipidiques chargés, ou fonctionnalisés par un ligand de la protéine étudiée (B. J. Jap et al., Ultramicroscopy, 1992,46,45-84).

Plus récemment, des lipides fonctionnalisés par des complexes métalliques tels que des complexes de nickel (E. W. Kubalek et al., J. Struct. Biol.,

1994,113,117-123) ont permis de cristalliser des protéines de fusion dites étiquetées histidine. Ces protéines possèdent en effet, à leur extrémité N-ou C-terminale, une séquence composée de plusieurs histidines. Il a pu être montré que la fixation de telles protéines sur un lipide-nickel était due à une interaction forte entre le complexe nickel et la séquence poly-histidine (C. Vénien-Brian et al., J. Mol. Biol., 1997,274,687- 692). De tels lipides fonctionnalisés ont permis d'obtenir une cristallisation, notam- ment dans les cas où l'on ne disposait pas du ligand approprié.

Toutefois, la cristallisation des protéines sur des films lipidiques présente l'inconvénient d'être relativement aléatoire et de dépendre de nombreux facteurs, qu'il est difficile de maîtriser simultanément : -le ligand porté par les lipides doit être suffisamment accessible, pour pouvoir interagir avec les protéines. Cette accessibilité dépend de la longueur du bras espaceur entre le lipide et le ligand : trop court, il donne lieu à une pénétration de la protéine à l'intérieur de la couche lipidique ; trop long, il confère un trop grand degré de liberté à la protéine liée et augmente l'incidence des défauts dans le cristal ; -la monocouche lipidique doit être suffisamment fluide pour confé- rer une mobilité latérale et rotationnelle suffisante à la protéine liée, permettant ainsi aux protéines de s'organiser les unes par rapport aux autres et de développer des contacts intermoléculaires, de façon à donner naissance au cristal ; -une autre difficulté, inhérente à la cristallisation sur monocouche lipidique concerne la stabilité de la monocouche ; en effet, la stabilité de l'interface air/liquide est difficilement contrôlable. En outre, la monocouche lipidique doit rester stable, non seulement avant la fixation des protéines, mais aussi après leur fixation, pour permettre l'organisation spatiale des protéines ; -pour l'étude microscopique, qui suit l'étape de cristallisation, il est nécessaire de réaliser une multitude de plans, du fait de la nature plane de la structure obtenue.

En conséquence, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à des structures, dénommées ci-après bâtons moléculaires, adaptées à la fixation et à la cristallisation en solution de macromolécules biologiques ainsi qu'à un procédé permettant de fixer en solution et éventuellement d'induire une auto-organisation

desdites macromolécules biologiques, qui réponde mieux aux besoins de la pratique que les méthodes de cristallisation 2D antérieurement utilisées.

La présente invention a pour objet des bâtons moléculaires, caracté- risés en ce qu'ils présentent une structure représentée par la formule générale I suivante :

dans laquelle : P représente un polymère sélectionné dans le groupe constitué par les polyphénylènes, les polyphénylènevinylènes, les polyphénylèneéthynylènes et les poly-vinylènes, tels qu'illustrés dans les formules ci-après :

* liaison à GpF dans lesquelles : A représente un atome hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, OH, O-alkyle, NH2, NH-alkyle, CO2H, CO,-alkyle, CONH,, CONH-alkyle, GpF (groupe fonctionnel) représente un groupe B-R, dans lequel : -B (bras de liaison) est sélectionné parmi des chaînons carbonés en C-Cl0, éventuellement substitués par des groupes alkyles, présentant ou non des insaturations ou des motifs poly-oxyéthylène pouvant présenter ou non en milieu de chaîne des groupes phosphate, tels que :

dans lesquels : m représente un nombre entier de 1 à 10, X représente O, NHCO, OCO, COO, CONH, S, CH, ou NH et constitue aux extrémités desdits chaînons carbonés des fonctions organiques d'accro- chage du type esters, amides, éthers, thioéthers ; -R représente un groupe hydrophile, sélectionné parmi les groupes chargés positivement ou négativement ; des ligands ou analogues de macromolécules biologiques, tels que de manière non limitative, la biotine, la novobiocine, l'acide rétinoïque, les stéroïdes, des antigènes ; des complexes organométalliques interagis- sant avec des acides aminés ou des acides nucléiques, tels que les complexes de cuivre, de zinc, de nickel, de cobalt, de chrome, de platine, de palladium, de fer, de ruthénium ou d'osmium avec des ligands comme IDA, NTA, EDTA, bipyridine ou terpyridine, lesdits ligands étant éventuellement fonctionnalisés par des groupements alkyles de liaison à E (au niveau de X) ; on entend par groupes chargés positivement ou négativement et ce de manière no limitative : ammoniums, carboxylates, phos- phates, sulfonates ; on peut citer par exemple les groupes suivants :-N (CH3) 3+ ou- C02-- n représente un nombre entier compris entre 5 et 1000, p représente un nombre entier compris entre 0 et 10 et E (segment espaceur) représente un motif chimique dont la nature ne perturbe pas la structure rigide du squelette formé par P et représente un motif phény- lène, éthynylène, vinylène ou la combinaison de ces motifs, telle que phénylène- éthynylène, comme illustré dans la formule ci-après :

dans laquelle A représente un atome d'hydrogène ou l'un des groupes suivants : alkyle, OH, O-alkyle, NH,, NH-alkyle, CO, H, CO,-alkyle, CONH,, CONH-alkyle.

Les différents P tels que définis ci-dessus forment avec GpF et E, les formules suivants : On entend au sens de la présente invention par alkyle : des groupe- ments alkyles en C,-C6, linéaires ou ramifiés ou éventuellement substitués.

Les substituants des chaînons carbonés en C,-C, o, représentant B sont notamment sélectionnés parmi les alkyles en Cl-C6.

Des polymères dont le squelette présente un grand nombre de conju- gaisons (poly-phénylène ; poly-phénylènevinylène ; poly-phénylèneéthynylène) ont <BR> <BR> déjà été décrits (Angew. Chem. Int. Ed. 1998, vol. 37, pp. 402-428) et sont utilisés pour leur propriétés électroniques et de fluorescence, en optique non-linéaire (Macromolecules, 1994,27,562-571 et J. Phys. Chem., 1995,99,4886-4893).

Les polymères selon la présente invention sont fonctionnalisés par des groupes GpF, qui en association avec l'élément E confèrent au bâton moléculaire selon l'invention, des propriétés particulières : -il est linéaire, rigide et soluble dans les milieux aqueux, -il est régulièrement fonctionnalisé par des groupement ayant une très forte affinité pour les macromolécules biologiques et

-il est particulièrement bien adapté, lorsqu'il est mis en solution avec une macromolécule biologique, à la fixation et/ou à l'auto-organisation desdites macromolécules sur ledit bâton par reconnaissance moléculaire.

La structure des bâtons moléculaires, conformes à l'invention, est illustrée à la figure 1 : P constitue un squelette de polymère, qui doit être rigide et globa- lement linéaire, afin d'avoir un caractère de bâton moléculaire ; E permet de contrôler la distance L2 entre les groupes fonctionnels GpF, alors que le bras de liaison B de GpF permet de contrôler la distance L 1 entre le groupe R et l'axe du polymère, comme illustré à la figure 2.

Selon un mode de réalisation avantageux desdits bâtons molécu- laires, ils présentent la formule générale II suivante : dans laquelle : p=0 : absence de E, P représente le groupe b tel que défini ci-dessus.

GpF comprend un groupe B représenté par un groupef tel que défini ci-dessus, dans lequel m=3,1'un des X représente NHCO et l'autre X représente CHI, et un groupe R représenté par un complexe organométallique à base de nickel (complexe Ni-NTA) et n représente un nombre entier compris entre 5 et 1000.

Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits bâtons molé- culaires, ils présentent la formule générale III suivante :

dans laquelle : m représente un nombre entier compris entre 1 et 10 p représente un nombre entier compris entre 0 et 10, P représente le groupe b tel que défini ci-dessus, GpF comprend un groupe B représenté par un groupe h tel que défini ci-dessus, dans lequel les deux X sont identiques et représentent NHCO, associé à un groupe R représenté par un complexe organométallique à base de nickel (complexe Ni-NTA), dont le ligand NTA est fonctionnalisé par un groupe alkyle en C4= (CH2) 4, et n représente un nombre entier compris entre 5 et 1000.

La présente invention a également pour objet un procédé de fixation et/ou d'auto-organisation de macromolécules biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement l'incubation, pendant au moins 15 minutes, d'une macro- molécule biologique en solution avec un bâton moléculaire, tel que défini ci-dessus, dans des conditions de température et de pH convenables.

Après fixation et/ou auto-organisation des macromolécules, on obtient un objet supramoléculaire.

Dans le processus d'auto-organisation selon l'invention, l'objet supramoléculaire obtenu va éventuellement pouvoir évoluer vers un cristal hélicoïdal de macromolécules biologiques autour du bâton moléculaire.

Un tel procédé est particulièrement bien adapté au contrôle de la cristallisation hélicoïdale des macromolécules biologiques autour desdits bâtons molé- culaires.

De manière surprenante, les bâtons moléculaires selon l'invention permettant de fixer en solution et éventuellement d'induire une auto-organisation de macromolécules biologiques, offrent d'importantes applications dans les domaines des nanomateriaux ou de la biologie structurale : -fixation de macromolécules biologiques sur les bâtons moléculaires en contrôlant ou non l'orientation de cette fixation ; -contrôle de la cristallisation hélicoïdale des macromolécules biolo- giques autour des bâtons moléculaires ; -étude structurale des macromolécules biologiques par analyse avec un microscope électronique des cristaux hélicoïdaux obtenus.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, lesdites macromolécules biologiques sont notamment des protéines solubles, membranaires, trans-membranaires, des enzymes, des anticorps, des fragments d'anticorps ou des acides nucléiques.

Selon un autre mode de mise en oeuvre dudit procédé, ladite solution est constituée d'un solvant de solubilisation desdites macromolécules biologiques, aqueux ou hydroalcoolique et contenant éventuellement au moins un détergent, en fonction de la macromolécule biologique à cristalliser.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, les conditions d'incubation sont de préférence les suivantes : incubation à température ambiante, pendant 15 minutes à 48 heures, à un pH compris entre 5,5 et 8,5.

Le procédé selon la présente invention s'applique particulièrement à la détermination de structure tridimensionnelle de protéines solubles.

La formation d'un cristal hélicoïdal d'une macromolécule biologique comme une protéine sur un bâton moléculaire est le résultat d'un parfait accord entre les dimensions de la macromolécule (diamètre) et les paramètres du bâton (distances L 1 et L2, et longueur du bâton moléculaire). La distance L 1 représente la distance entre le groupe R et l'axe du polymère. La distance L2 représente la distance entre deux groupes R. La longueur du bâton moléculaire est équivalente au degré de polymérisa- tion du polymère (voir figure 2).

De manière surprenante, ledit procédé permet d'obtenir des arran- gements de macromolécules biologiques permettant des études structurales par micro- scopie électronique ou bien la préparation de nouveaux nano-matériaux utilisables pour leur propriétés physiques, électriques, ou biologiques.

La présente invention inclut par conséquent la préparation d'une librairie de bâtons moléculaires dans lesquels les distances L1 et L2 sont variables.

La présente invention a également pour objet un objet supramolécu- laire, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un bâton moléculaire, tel que défini ci- dessus, sur lequel des macromolécules biologiques sont fixées de manière non- covalente ou sont organisées sous une forme cristalline.

La présente invention a, en outre, pour objet les applications dudit objet supramoléculaire, à l'étude structurale des macromolécules qui lui sont associées, en tant que réactif biologique et notamment en tant que réactif immunologique et en tant que biocapteurs ou bioconducteurs.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : -la figure 1 représente un schéma descriptif d'un élément d'un bâton moléculaire selon l'invention ; -la figure 2 illustre un bâton moléculaire selon l'invention ; -la figure 3 représente un schéma descriptif de formation d'un cristal hélicoïdal de macromolécules biologiques sur un bâton moléculaire ; -la figure 4 illustre l'étude de la fixation de l'ABC23-(His) 6 de l'ARN Polymérase de levure sur un bâton moléculaire selon l'invention, par chroma- tographie de perméation sur une colonne Superose"6, avec élution par un tampon Tris (IOmM, pH 8 ; NaCl 150 mM) (smart system) ; -la figure 5 représente une photo d'un bâton moléculaire selon l'invention.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

Exemple 1 : Préparation d'un bâton moléculaire biotinylé pour la fixation de streptavidine Dans le but de fixer et de cristalliser la streptavidine ou une strepta- vidine de fusion, un polymère poly- (phénylèneéthynylène) fonctionnalisé par des biotines a été préparé.

Conditions : a. TMSA, PdCl2 (PPh3) 2, Cul, THF/TEA ; b. KOH, MeOH ; c.

NHS, DCC, THF ; d. H2N- (CH2) 3-NHBoc, CH2C12, TEA ; e. PdCl2 (PPh3) 2, Cul, THF/TEA ; f. TFA, CH2C12 ; g. Biotine-NHS, DMF, TEA.

Protocoles expérimentaux (3-aminopropyl)-carbamate de t-butyle : MODE OPERATOIRE A 0°C, 2,6 g de dicarbonate de t-butyle (11,9 mmol, 0,1 éq.), en solution dans 10 ml de MeOH, sont additionnés goutte à goutte sur 10 ml de propane diamine (120 mmol., 1 éq.) en solution dans 40 ml de MeOH. L'agitation est mainte-

nue à température ambiante pendant 15h., puis le milieu réactionnel est évaporé. Le résidu est repris dans 20 ml d'eau et 50 ml de CH2C12, la phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée puis évaporée pour conduire à 1,8 g d'une huile incolore (Rdt : 87% / Boc2O), qui est utilisée dans les étapes ultérieures sans purification supplé- mentaire.

FB : C8H18O2N2 PM : 174 g/mol CCM : Rf (CH2Cl2/MeOH/TEA : 69/30/1) : 0,26 ; <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : 6 4,92 (sl, 1H, H2) ; 3,16 (tt, J3-4 = 6,6 Hz, J3-2 = 7,2 Hz, 2H, H3) ; 2,73 (t, J5-4 = 6,6 Hz, 2H, H5) ; 1,57 (tt, J4-3 et 4-5 = 6,6 Hz, 2H, H4) ; 1,41 (s, 9H, H8) ; 1,17 (sl, 2H, H6) ; RMN 13c (75,47 MHz, CDCl3) : 5 155,88 (1C, C1) ; 78,73 (1C, C7) ; 39,42 (1C, C5) ; 38,15 (1C, C3) ; 33,16 (1C, C4) ; 28,15 (3C, Cg) ; <BR> <BR> <BR> <BR> SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 175 (100, [M+1] +) ; 192 (10, [M+18] +) ; [3- (5-éthynyl-2-iodo-benzoylamino)-propyl]-carbamate de t- butyle : MODE OPERATOIRE 174 mg de (3-aminopropyl)-carbamate de t-butyle (1 mmol, 1 éq.), en solution dans 7 ml de CH2C12 et 0,5 ml de triméthylamine sont additionnés sur 369 mg de 2-iodo-5-éthynyl-benzoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle (1 mmol, 1 éq.) en solution dans 7 ml de CH2C12. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 48h., puis est évaporé. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice 60H (Hexane/EtOAc : 1/1) pour conduire à 416 mg d'un solide blanc avec un rendement de 97%.

FB : C17H2103N2 PM : 428 g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAcH : 1/1) : 0,40 ;

RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 6 7,80 (d, J12-13 = 8, Hz, 1H, H12) ; 7,46 (d, J15-13 = 2,0 Hz, 1H, H15) ; 7,17 (dd, J13-12 = 8,2 Hz, J13-15 = 2,0 Hz, 1H, H13) ; 6,55 (sl, 1H, H2) ; 4,92 (sl, 1H, H6) ; 3,48 (tt, J3-4 = 6,2 Hz, J3-2 = 6,0 Hz, 2H, H3) ; 3, 27 (tt, Jus 4 = 5,7 Hz, Jus 6 = 6,4 Hz, 2H, H5) ; 1,70-1,78 (m, 2H, H4) ; 1,41 (s, 9H, Hg) ; <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 13C (75,47 MHz, CDC13) : 6 166,70 (1 C, C 1) ; 156,44 (1C, C7) ; 142. 38 (1C, C10) ; 139,63,133,74 (2C, C12, C13) ; 131,05 (1C, C15) ; 122,22 (1C, C14) ; 92,81 (1C, C11) ; 81,62 (1C, C16) ; 79,26,79,17 (2C, C17, C7) ; 37,07, 36, 42 (2C, C5, C3) ; 29,83 (1C, C4) ; 28,14 (3C, Cg) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 429 (26, [M+1] +) ; 446 (100, [M+18] +) ; Polymérisation de [3- (5-éthynyl-2-iodo-benzoylamino)-propyl]- carbamate de t-butyle :

MODE OPERATOIRE 350 mg de [3- (5-éthynyl-2-iodo-benzoylamino)-propyl]-carbamate de t-butyle (0,81 mmol, 1 éq.) sont placés dans un mélange constitué de 24,5 ml de THF et 24,5 ml de triéthylamine, puis 57 mg de palladiumbisdichlorobistriphényl- phosphine (0,081 mmol, 0,1 éq.) et 57 mg d'iodure de cuivre (0,28 mmol, 0,3 éq.) sont additionnés. Le milieu réactionnel est chauffé à 50°C pendant 15h. Après être revenu à température ambiante le milieu réactionnel est versé sur 900 ml d'acétone. 160 mg de polymère, sous forme d'un solide jaune, sont récupérés par centrifugation de l'acétone.

Hydrolyse du polymère

MODE OPERATOIRE 50 mg de polymère sont placés en suspension dans 1 ml de CH2C12, puis à 0°C, 0,5 ml d'acide trifluoroacétique sont additionnés goutte à goutte, le milieu

réactionnel devient alors soluble. Après 2h. d'agitation le milieu réactionnel est évaporé, puis repris en suspension dans un mélange constitué de 1 ml de CH2C12 et 1 ml de triéthylamine. Le précipité est récupéré par centrifugation, lavé plusieurs à 1'eau, puis lyophilisé.

U. V. (HCI 0, 1N, 0,208mg/ml) : 348 (5856) ; 321 (5317) ; 301 (3990) ; 283 (3317) ; 201 (8519) ; Couplage de la biotine MODE OPERATOIRE 15 mg de polymère et 15 mg de biotine-N-hydroxysuccinimide sont mis en suspension dans 10 ml de DMF. Après 48h. d'agitation le milieu réactionnel est filtré, évaporé. puis repris en suspension dans une solution de CHCl2. Le précipité est récupéré par centrifugation, lavé plusieurs à l'acétate d'éthyle, puis lyophilisé.

Exemple 2 : Préparation d'un bâton moléculaire fonctionnalisé par un complexe de nickel Ni-NTA Dans le but de fixer et de cristalliser des macromolécules biolo- giques comportant une étiquette poly-histidine, nous avons préparé un polymère de type poly- (phénylèneéthynylène) fonctionnalisé par des complexes de nickel-NTA. La méthode de préparation de NTA*, l'analogue du NTA, est identique à celle décrite par C. Vénien-Brian et al (J. Mol. Biol. 1997, vol 274, pp. 687-692).

Schéma de synthèse : Préparation du polymère PO Conditions : a. TMSA, PdCl2 (PPh3) 2, CuI, THF/TEA ; b. KOH, MeOH ; c.

NHS, DCC, THF ; d. NTA* CH2Cl2 TEA ; e. PdCl2 (PPh3) 2, Cul, THF/TEA ; f.

KOH, MeOH ; g. NiC12.6H20, Tris (lOmM, pH 8).

Protocolesexpérimentaux Acide 2-iodo-5-triméthylsilanylethynyl-benzoique : MODE OPERATOIRE 1,12 g d'acide 2,5-diiodo-benzoïque (3mmol, 1 éq.), 210 mg de dichlorobis (triphenylphosphine palladium (II) (0,3,0,1 éq.) et 200 mg de iodure de cuicre (I) (1 mmol, 0,34 éq.) sont mis en solution dans 60 ml d'un mélange THF/TEA (3/1). Après addition de 425 ul de triméthylsilylacétylène (3 mmol, 1 éq.). l'agitation est poursuivie à température ambiante pendant 16 heures à l'abri de la lumière. Le milieu réactionnel est alors évaporé à sec et le résidu obtenu est purifié par flash- chromatographie sur silice 60H (Hexane/EtOAc/AcOH ; 70/30/1%) pour fournir

après séchage sous vide 754 mg d'acide 2-iodo 5-triméthylsilylanyléthynyl-benzoïque sous la forme de fines aiguilles jaunes (Rdt : 73 %).

FB : C12H13IO2Si PM : 344.221 g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAc/AcOH : 50/50/1%) : 0,55 ; RMN 1H (300 MHz, Acétone d6) : # 10,93 (s large, 1 H, H 1) ; 8,02 (d, J4-5 = 8,2 Hz <BR> <BR> <BR> <BR> 1H, H4) ; 7,92 (d, Js 7 = 1,8 Hz, 1H, H7) ; 7,27 (dd, J4-5 = 8,2 Hz, J5-7 = 1,8 Hz, 1H, H5) ; 0,25 (s, 9H, H ; RMN 13C (75,47 MHz, Acétone d6) : # 166,99 (1C, Cl) ; 142,24 (lC, C4) ; 136,85 (1C, C2) ; 135,57 (1C, C5) ; 134,16 (1C, C7) ; 123,75 (1C, C6) ; 103,59 (1C, C3) ; 97,12 (1C, C8) ; 94,52 (1C, C9) ;-0,28 (3C, Ciao) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 362 (100, [M+18] +) ; Acide 2-iodo-5-éthynyl-benzoique : MODE OPERATOIRE A une solution de 500 mg d'acide 2-iodo 5- triméthylsilylanyléthynyl-benzoïque (1,45 mmol, 1 éq.) dans 30 ml de méthanol, sont ajoutés à 0 °C, 4,5 ml d'une solution aqueuse d'hydroxyde de postassium (1N). Après 2h. d'agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est lavé avec 2x50 ml de CH2C12 puis la phase aqueuse est réacidifié jusqu'à pH 2 par addition d'une solution molaire d'acide chlohydrique. Après extraction avec 2x50 ml de CH2C12, les phases organiques sont rassemblées pour fournir après séchage et évaporation 383 mg d'acide 2-iodo-5-éthynyl-benzo que sous la forme d'un solide jaune (Rdt : 97 %).

FB : C9H5I02 PM : 272,039 g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAc/AcOH : 50/50/1%) : 0,4 ; <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 1H (300 MHz, Acétone d6) : 6 8,08 (d, J4-5 = 8,1 Hz 1 H, H4) ; 7,93 (d, Jazz 1,9 Hz, 1H, H7) ; 7,36 (dd, J4-5 = 8,1 Hz, J5-7 = 1,9 Hz, 1H, H5) ; 3,87 (s, 1H, H9) ;

RMN 13C (75,47 MHz, Acétone d6) : 5 167,01 (1C, Cl) ; 142,22 (1C, C4) ; 137, 32 (1C, C2) ; 135,72 (1C, C5) ; 134,12 (1C, C7) ; 123,00 (1C, C6) ; 94,51 (1C, C3) ; 82,08 (1C, Cg) ; 81,22 (1C, C9) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 290 (100, [M+18]+); 307 (66, [M+35] +) ; 562 (8, [2M+18] +) ; 2-Iodo-5-éthynyl-benzoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle : MODE OPERATOIRE A une solution de 544 mg (2 mmol, 1 éq) d'acide 2-iodo-5-éthynyl- benzoïque et 276 mg de NHS (2,4 mmol, 1,2 éq.) dans 30 ml de THF sont ajoutés à 0°C 495 mg (2,4 mmol, 1,2 éq) de DCC en solution dans 20 ml de THF. Le mélange est agité pendant une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors filtré, puis évaporé. et le résidu obtenu est purifié par flash-chromatographie sur silice 60H (Hexane/EtOAc ; 70/30) pour fournir après séchage sous vide 568 mg de 2- iodo-5-éthynyl-benzoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-l-yle sous la forme d'un solide jaune (Rdt : 77 %).

FB : C13H8INO4 PM : 369,114 g/mol <BR> <BR> <BR> <BR> CCM : Rf (Hexane/EtOAc : 50/50) : 0,46 ;<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 6 8,18 (d, J5-7 = 2,4 Hz, 1H, H7) ; 8,3 (d, J4-5 = 8,5 Hz 1H, H4) ; 7, 34 (dd, J4-5=8,5 Hz, J5-7=2,4 Hz, 1H, H5) ; 3,22 (s, 1H, H9) ; 2,91 (s, 4H, H11); <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 13C (75,47 MHz, CDC13) : 6 168,53 (2C, C 11); 160, 49 (1 C, C l) ; 141,92 (1C, C4) ; 136,97 (1C, C5) ; 135,09 (1C, C7) ; 129,67 (1C, C2) ; 122,60 (1C, C6) ; 95,60 (1C, C3) ; 80,81 (1C, C8) ; 80,20 (1C, C9) ; 25,46 (2C, C12) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 387 (100, [M+18] +) ; 404 (27, [M+35] +) ; 2-(Bis-méthoxycarbonylméthyl-amino)-6-(2-iodo-5-éthynyl- benzoylamino)-hexanoate de méthyle :

MODE OPERATOIRE A une solution de 320 mg (1,05 mmol, 1,05 éq.) de NTA* dans 20 ml de CH2CI2 sont ajoutés 1 ml de TEA et 370 mg (1 mmol, 1 éq) de 2-iodo-5- éthynyl-benzoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle en solution dans 20 ml de CH2Cl2. Le mélange est agité pendant 16 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est alors évaporé. pour fournir après chromatographie sur silice (CH2Cl2/MeOH/TEA ; 90/10/1), 380 mg de 2- (bis-méthoxycarbonylméthyl-amino)-6- (2-iodo-5-éthynyl- benzoylamino)-hexanoate de méthyle sous la forme d'une huile orange (Rdt : 68%).

FB : C22H27IN207 PM : 558,372 g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAc : 50/50) : ; RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : 5 7,74 (d, J15-16 = 8, Hz 1H, H15) ; 7,41 (d, J16-18 = 2,1 Hz, 1H, H18) ; 7,09 (dd, J15-16 = 8,2 Hz, J16-18 = 2,1 Hz, 1H, H16) ; 6,46 (t, J6-9 = 5,1 Hz, 1H, Hg) 3,62 et 3,56 (s, 13H, H10, H11, H7); 3,38 (t, J2-3 = 7,3 Hz, 1H, H2) ; 3,36 (t, J5-6=6, 6 Hz, J6-9 = 5,1 Hz, 2H, H6) ; (m, 6H, H3, H4, H5) ; RMN 13C (75,47 MHz, CDC13) : 5 172,82 (1C, Ci) ; 171,54 (2C, Cg) ; 168,42 (1C, C12) ; 142,57 (1C, C13) ; 139,49 (1C, C15) ; 133,54 (1C, C16) ; 131,17 (1C, C18) ; 122,00 (1C, C17) ; 93,04 (1C, C14) ; 81,69 (1C, C19); 79,19 (1C, C20) ; 63,95 (1C, C2) ; 52,25 (2C, C7) ; 51,41 et 51,22 (3C, C10, C11); 39,53 (1C, C6) ; 29, 37 (1C, C3) ; 28,08 (1C, C5) ; 22,71 (1C, C4) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 631 (9, [M+1] +) ; 648 (100, [M+18] +) ; Microanalyse pour C22H27IN207 : Cale. : C, 47,32 ; H, 4,87 ; N, 5,02 ; 0,20,06 ; I, 22,73 ; Exp. : C, 47,01 ; H, 4,95 ; N, 4,87 Polymérisation de 2-(bis-méthoxycarbonylméthyl-amino)-6-(2- iodo-5-éthynyl-benzoylamino)-hexanoate de méthyle :

MODE OPERATOIRE 84 mg de 2- (bis-méthoxycarbonylméthyl-amino)-6- (2-iodo-5- éthynyl-benzoylamino)-hexanoate de méthyle (0,15 mmol, 1 éq.) sont placés dans un mélange constitué de 6 ml de THF et 2 ml de triéthylamine. puis 11 mg de palladiumbisdichlorobistriphénylphosphine (17 µmol, 0,1 éq.) et 15 mg d'iodure de cuivre (79 umol, 0,5 éq.) sont additionnés. Le milieu réactionnel est chauffé à 50°C pendant 15h. Après être revenu à température ambiante le milieu réactionnel est versé sur 200 ml d'acétone. 55 mg de polymère, sous forme d'un solide jaune, sont récupérés par centrifugation de l'acétone.

Hydrolyse du polymère MODE OPERATOIRE 50 mg de polymère sont placés en suspension dans 5 ml de MeOH, puis à 0°C, 5 ml d'une solution molaire d'hydroxyde de potassium sont additionnés goutte à goutte. Après 96h. d'agitation le milieu réactionnel est filtré, évaporé puis repris dans un minimum d'eau. La solution obtenu est alors réacidifiée par addition lente d'une solution d'acide chlorhydrique 0,1 M. Le précipité formé est récupéré par centrifugation, lavé plusieurs à l'eau, puis lyophilisé.

Complexation des ions nickel :

Polymère PO MODE OPERATOIRE 1 mg de polymère sont mis en solution dans 5,15 ml de tampon Tris (10 mM, pH 8). 20 ul d'une solution de NiCl2, 6H20 (500 mM) dans du Tris (10 mM, pH 8) sont alors additionnées à 1 ml de la solution de polymère. Après dialyse, le composé est utilisé en solution sans autre purification.

Exemple 3 : Conception d'une librairie de bâtons moléculaires fonctionnalisé par des complexes nickel-NTA (polymère Ppm) pour la fixation de protéines étiquetées-histidine.

Approche synthétique pour contrôler la distance L,

Conditions : i. TsCl, TEA, THF ; ii. NaN3, CH3CN ; iii. NaH, BrCH, CO, tBu, THF ; iv. TFA, CH2Cl2 ; v. SOCl2/TEA, CH2Cl2 ; vi. H2, Pd/C, MeOH.

Approche synthétique pour contrôler la distance L2

Conditions : a. TMSA, PdCl2 (PPh3) 2, CuI, THF/TEA ; b. KOH, MeOH ; c. NHS, DCC, THF ; d. MeOH, EDC, HOBT, THF ; e. HCl, NaNO2/K2CO3, HNPri2 ; f. LDA, ClPO (OEt) 2 ; g. LDA (2eq.), Me3SiCl ; h. K2CO3, MeOH ; i. PdCl2(PPh3)2, CuI, THF/TEA ; j. MeI.

Protocoles expérimentaux Les protocoles expérimentaux de polymérisation et d'hydrolyse sont identiques à ceux décrits pour le bâton PO.

Préparation du monomère pour le bâton P, o Toluène-4-sulfonate de 2-(2-hydroxy-éthoxy) éthyle :

MODE OPERATOIRE 50 ml de diéthylèneglycol (0,5 mol, 10 éq.) et 10 g de chlorure de tosyle (0,05 mol, 1 éq.) sont mis en solution dans 200 ml de dichlorométhane. Après avoir additionné goutte à goutte 7, 3 ml de triéthylamine (0,05 mol, 1 èq.), le milieu

réactionnel est agité pendant 16 heures à température ambiante. Après hydrolyse avec 100 ml d'eau, le milieu réactionnel est extrait deux fois avec 100 ml de dichlorométhane, la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis évaporée pour conduire à un résidu qui est purifié par flash-chromatographie sur silice 60H (Hexane/EtOAc : 40/60). 13,4 g de O-tosyldiéthylèneglycol sont obtenus sous la forme d'une huile légère incolore (Rdt : 99%/TSCl).

FB : C11H16O5S PM : 260,2 g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAc : 7/3) : 0,32 <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> RMN IH (300 MHz, CDC13) : b 7,78 (d, J6-7 = 8,1 Hz, 2H, H6) ; 7,33 (d, J7-6 = 8,1 Hz 2H, H7) ; 4,18 (t, J4-3 = 3,2 Hz, 2H, H4) ; 3, 69-3,63 (m, 4H, H2-3) ; 3,51 (t, J1-2 =3, 2Hz, 2H, HI) ; 2,43 (s, 3H, H9) ; 1,98 (sl, 1H, H10) ; <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 13C (75,47 MHz, CDC13) : 6 144,70 (1C, C8) ; 132,82 (1C, C5); 129,60 (2C, C6) ; 127,69 (2C, C7) ; 72,24 (1C, C2) ; 68,91 (1C, C3) ; 68, 35 (1C, C4) ; 61,40 (1C, <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Cl) ; 21,33 (1C, C9) ;<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 278 (100, [M+18] +) ; 2-(2-azido-éthoxy)-éthanol(2-azido-éthoxy)-éthanol 16a : MODE OPERATOIRE 12,27 g de toluène-4-sulfonate de 2- (2-hydroxy-éthoxy) éthyle (0,047 mol, 1 éq.) sont mis en solution dans 200 ml d'acétonitrile, puis 3,67 g d'azoture de sodium (0,056 mol, 1,2 éq.) sont additionnés. Le milieu réactionnel est chauffé à 80°C pendant 16 heures. Après hydrolyse avec 100 ml d'eau, le milieu réactionnel est extrait deux fois avec 100 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis évaporée pour conduire à 3,9 g d'une huile légère incolore (Rdt : 63%).

FB : C4H9O2N3 PM : 131 g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAc : 1/1) : 0,28 ;

RMN 1H (300 MHz, CDC13) : b 3,72 (t, J2-1 = 4,7 Hz, 2H, H2) ; 3,66 (t, J3-4 = 4,8 Hz 2H, H3) ; 3,58 (t, J1-2 = 4,7 Hz, 2H, H1) ; 3, 38 (t, J4-3 = 4,8 Hz, 2H, H4) ; 2,32 (s1,H5); <BR> <BR> RMN 13C (75,47 MHz, CDC13) : 8 72,19 (1 C, C2) ; 69,82 (l C, C3) ; 61,53 (1C, Cl) t ; 50,49 (1, C4) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 149 (100, [M+18] +) ; [2-(2-azido-éthoxy)-éthoxy]-acétate de t-butyle 19a : MODE OPERATOIRE 1,42 g d'hydrure de sodium (0,035 mol, 1,2 éq.) sont mis en suspension dans 30 ml de tétrahydrofurane, puis à 0°C, 3,89 g de 16a (0,029 mol, 1 éq.) en solution dans 10 ml de tétrahydrofurane sont additionnés goutte à goutte.

L'agitation est maintenue à cette température pendant un demi-heure avant d'additionner lentement 8,71 ml de bromo-acétate de t-butyle (0,059 mol, 2 éq.). La température est remontée lentement et l'agitation est maintenue pendant une nuit. Le milieu réactionnel est hydrolyse avec 50 ml d'eau puis ce dernier est concentré pour conduire à un résidu qui est purifié par flash-chromatographie sur silice 60H (Hexane/EtOAc : 70/30). 3,95 g de produit sont récupérés sous la forme d'une huile légèrement jaune avec un rendement de 55%.

FB : C10H19O4N3 PM : 245 g/mol <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> CCM : Rf (Hexane/EtOAc : 7/3) : 0,47 ;<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : 6 4,02 (s, 2H, H2) ; 3,70-3,66 (m, 6H, H3, 4, s) ; 3, 39 (t, J6-5 = 5,0 Hz, 2H, H6) ; 1,46 (s, 9H, Hg) ; <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 13c (75,47 MHz, CDC13) : § 169, 37 (1C, Ci) ; 81,33 (1C, C7) ; 70,55-70,49 (2C, C3et4) ; 69, 81 (1C, C5) ; 68,90 (1C, C2) ; 50,46 (1C, C6) ; 27,86 (3C, Cg) ; <BR> <BR> <BR> SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 207 (15, [M+1]+); 263 (100, [M+18] +) ; 6-(2-[2-(2-azido-éthoxy]-acétylamino)-2-(bis-méthoxycarbo nyl (méthyl-amino)-hexanoate de méthyle 20a :

MODE OPERATOIRE 3,95 g de 19a (0,016 mol, 1 éq.) sont mis en solution dans 20 ml de dichlorométhane puis 10 ml d'acide trifluoroacétique sont additionnés goutte à goutte.

Après avoir agité le milieu réactionnel à 60°C pendant deux heures, celui-ci est évaporé à sec. Le résidu obtenu est ensuite repris dans 4 ml de chlorure de thionyle et agité pendant une heure à température ambiante. Le milieu est de nouveau évaporé à sec, repris deux fois avec 4 ml de dichlorométhane puis réévaporé. Le chlorure d'acide ainsi formé est repris dans 10 ml de dichlorométhane puis 6,43 g de tête polaire NTA* (0,016 mol, 1 éq.) en solution dans 10 ml de dichlorométhane et 4,46 ml de triéthylamine (0,032 mol, 2 éq.) sont additionnés. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant une nuit puis évaporé à sec pour conduire à un résidu qui purifié par flash-chromatographie sur silice 60H (MeOH/CH2Cl2 : 3/97). 1,84 g de produit sont obenus sous la forme d'une huile jaune avec un rendement de 25%.

FB : C19H33o9N5 PM : 475 g/mol CCM : Rf (EtOAc pur) : 0,34 ; RMN 1H (300 MHz, CDC13) : # 6,79 (tl, J9-6 = 5,3 Hz, 1H, Hg) ; 3,88 (s, 2H, H13) ; 3,59-3,62 (m, 15H, HIO, H11, h15, H15, H16); 3, 54 (s, 4H, H7) ; 3, 29-3, 34 (m, 3H, H2, H17) ; 3,18 (dt, J6-5 = 6,5 Hz, J6-9 = 5,3 Hz, 2H, H6) ; 1,27-1,65 (m, 6H, Hs, H4, H5) ; RMN 13c (75,47 MHz, CDC13) : 6 172,68 (1C, Cl) ; 171,42 (2C, C8) ; 169,29 (1C, C12) ; 70,52 (1C, C15) ; 70,20 (1C, Ci3) ; 69,91 (1C, Ci4) ; 69,75 (1C, C16) ; 64,35 (1C, C2) ; 52,10 (2C, C7) ; 51,27 et 50,30 (2C, Clip, C1l) ; 51, 06 (1C, C17); 38,30 <BR> <BR> <BR> (1C, C6); 29,74 (1C, C3) ; 28,94 (1C, C5) ; 22,93 (1C, C4) ;<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 476 (100, [M+1] +) ; 6- (2- [2-amino-éthoxy)-éthoxy]-acétylamino)-2- (bis-méthoxy carbonylméthyl-amino)-hexanoate de méthyle 21a :

MODE OPERATOIRE 1,84 g de 20a (3,88 mmol., 1 éq.) sont mis en solution dans 30 ml de méthanol, puis 184 mg de palladium sur charbon (10% en masse) sont additionnés. Le milieu réactionnel est purgé trois fois avec de l'hydrogène puis abandonné à température ambiante durant une nuit sous une atmosphère d'hydrogène. Après avoir filtré sur célite le palladium, le filtrat est évaporé pour conduire à 1,70 g (Rdt : 97%) d'une huile jaune qui est utilisée dans les étapes ultérieures sans purification supplémentaire.

FB : C19H35O9N3 PM : 449 g/mol CCM : Rf (MeOH/CH2Cl2 : 1/9) : 0,17 ; RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : 5 6,92 (sl, 1H, Hg) ; 3,85 (s, 2H, HI) ; 3,55-3, 13 (m, 26H, H2, H6, H7, H10, H11, h13, H14, H15, H16, H17); 1,24-1,62 (m, 6H, H3, H4, H5) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensite %) : m/e : 450 (100, [M+1] +) ; 2-(bis-méthoxycarbonylméthyl-amino)-6-(2-[2-(2-(5-éthynyl -2- iodo-benzoylamino)-éthoxy)-éthoxy]-acétylamino)-hexanoate de méthyle 22a : MODE OPERATOIRE 150 mg de 2-iodo-5-éthynyl-benzoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle (0,33 mmol., 1 éq.) en solution dans 5 ml de CH2C12 et 0,2 ml de triéthylamine sont cannulés sur 123 mg de 21a (0,33 mmol., 1 éq.) placé en solution dans 2 ml de CH2Cl2. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 24h, puis évaporé. Le résidu est chromatographié sur gel de silice 60H (MeOH/CH2Cl2 : 3/97) pour conduire à 145 mg d'une huile légèrement jaune avec un rendement de 62%.

FB : C28H380lON3I PM : 703 g/mol CCM : Rf (MeOH/CH2C12 : 1/9) : 0,50 ; RMN 1H (300 MHz, CDC13) : # 7,79 (d, J23-25 = 8,1 Hz, 1H, H23) ; 7,45 (d, J25-23 = 1,5 Hz, 1H, H25) ; 7,15 (dd, J23-25 = 1,5 Hz et J23-22 = 8,1 Hz 1 H, H23) ; 6,76 (tl, 1H, H9) ; 6,50 (tl, 1H, Hlg) ; 4, 11 (s, 2H, H13) ; 3,58-3,96 (m, 17H. HIO, H11, H14, H15, H16) ; 3,51 (s, 4H, H7) ; 3,20-3,41 (m, 5H, H2, H6, H17) ; 3.17 (s, 1H, H28) ; 1,44-1,71 (m, 6H, H3, H4, H5) ; <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 13C (75,47 MHz, CDC13) : 8 172,75 (1 C, C 19) ; 171,64 (1C, Ci) ; 171,49 (1C, C8) ; 169,38 (1C, C12) ; 142,14 (1C, C20) ; 139,69 (1C, C25) ; 133,86 (1C, C22) ; 131,21 (1C, C23) ; 122,25 (1C, C24) ; 115,97 (1C, C21) ; 92,71 (1C, C26) ; 79,45 (1C, C27) ; 70,65 (1C, C15) ; 70,36 (1C, C13) ; 69,87 (1C, C14) ; 69,41 (1C, C16) ; 64,36 (1C, C2) ; 52,39 ; 51,16 (2C, C7) ; 52,16 ; 51,37 (3C, C10, C11); 39, 46 (1C, C17) ; 39,37 (1C, C6) ; 29,77 (1C, C3) ; 28,95 (1C, C5) ; 22,98 (1C, Coq.) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 704 (100, [M+1] +) ; 721 (36, [M+18] +) Microanalyse pour C28H38N30101 : Cale. : C, 47,80 ; H, 5,44 ; N, 5,97 ; O, 22,74 ; I, 18,03 <BR> <BR> <BR> <BR> Exp. : C, 47,75 ; H, 5,71 ; N, 5,72 ;<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Préparation du monomère pour le bâton P21 6-(2-(2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy)-acétylamino) -2- (méthoxycarbonylméthyl-amino)-hexanoate de méthyle 21b : MODE OPERATOIRE Protocole identique à celui utilisé pour la préparation du produit 21a en démarrant la synthèse à partir du triéthylène glycol.

FB : C21H39O10N3 PM:493 g/mol CCM : Rf (MeOH/CH2C12/TEA : 1/9/0,1) : 0,27 ;

RMN 1H (300 MHz, CD30D) : 64,59 (sl, 3H, Hg, H20) ; 3,94 (s, 2H, H13) ; 3,10- 3,61 (m, 28H, H2, H6, H7, H10, h11, H14, H15, H16, H17, H18, H19); 1,19-1,62 (m, 6H, H3, H4, H5) SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 494 (100, [M+1] +) ; 4-(diisopropyltriazényl) acétophénone(diisopropyltriazényl) acétophénone 25 : MODE OPERATOIRE 1 g (7,4 mmol) de 4-aminoacétophénone sont mis en solution dans un mélange constitué de 30 ml d'eau et 5 ml d'acide chlorhydrique concentré. Après avoir placé le milieu réactionnel a 0°C, 520 mg (7,54 mmol, 1,02 éq.) de nitrite de sodium en solution dans 1 ml d'eau sont additionnés. Après 30 min. d'agitation, le milieu réactionnel est additionné prudemment sur une solution composée de 8g de carbonate de potassium et de 8,17 ml (5,82 mmol, 7,8 éq.) de diisopropylamine dans 50 ml d'eau, placée à 0°C. L'agitation est maintenue à cette température pendant 30 min. puis le milieu réactionnel est hydrolyse avec 50 ml d'eau et la phase aqueuse est extraite quatre fois avec 50 ml d'éther éthylique. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis évaporée pour conduire à un résidu qui est chromatographié sur gel de silice 60H (AcOEt/Hexane : 2/8) pour conduire à 1,18 g d'une poudre jaune avec un rendement de 64%.

FB : C14H21N302 PM : 247,33g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAc : 91) : 0,40 ; <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 6 7,92 (d, J3-4 = 8,6 Hz, 2H, H3) ; 7,44 (d, J4-3 = 8,6 Hz, 2H, H4) ; 5,33 (sl, 1H, H6) ; 4,03 (sl, 1H, H6) ; 2,57 (s, 3H, H3) ; 1,37 (dl, 6H, <BR> <BR> <BR> <BR> H7) ; 1,24 (dl, 6H, H7) ;<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 13C (75,47 MHz, CDC13) : 6 197,17 (1C, C1) ; 155,32 (1C, C5) ; 133,11 (1C, C2) ; 129,30 (2C, C3) ; 119,82 (2C, C4) ; 49,17 (1C, C6) ; 46,17 (1 C, C6) ; 26,23 (1C, C8) ; 23,63,19,11 (4C, C7); SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 248 (100, [M+1] +) ; :1-(Diisopropyltriazényl)-4-((triméthylsilyl)éthynyl)benz ène26

MODE OPERATOIRE 8,62 g (34,9 mmol, 1 éq.) de 4-(diisopropyltriazényl) acétophénone en solution dans 30 ml de THF sont additionnés goutte à goutte, à-78°C, sur 1,03 éq. de LDA, formée, à 0°C, à partir de 5,17 ml de diisopropylamine (36,9 mmol, 1,06 éq.) et de 22,4 ml de BuLi 1,6M dans l'hexane (35,9 mmol, 1,03 éq.) dans 38,5 ml de THF.

Le milieu réactionnel est agité à-78°C pendant une heure, puis 5,04 ml de chlorophosphate de diéthyle (34,9 mmol, 1 éq.) sont additionnés goutte à goutte et la température est remontée jusqu'à l'ambiante. Après 3 heures d'agitation, cette solution est additionnée sur 2,25 éq. de LDA, formée, à 0°C, à partir de 11 ml de diisopropylamine (78,5 mmol, 2,25 éq.) et de 49 ml de BuLi 1,6M dans l'hexane (78,5 mmol, 2,25 éq.) dans 80 ml de THF. Le milieu réactionnel est abandonné pendant la nuit, au cours de laquelle la température remonte lentement. Après avoir placé le ballon à 0°C, 4,86 ml de chlorure de triméthylsilyle (38,3 mmol, 1,1 éq.) sont additionnés, l'agitation est maintenue pendant 15 min., puis on hydrolyse avec 100 ml d'eau. La phase aqueuse est extraite trois fois avec 100 ml d'éther éthylique, puis la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis évaporée. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie sur gel de silice 60H (Hexane pur) pour conduire à 6,08 g de 1-(diisopropyltriazényl)-4-((triméthylsilyl)éthylnyl)benz ène avec un rendement de 58%.

FB : C17H27N3Si PM : 301 g/mol CCM : Rf (Hexane) : 0,30 ; RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 8 7,40 (d, J2-3 = 8,5 Hz, 2H, H2) ; 7, 32 (d, J3-2 = 8,5 Hz, 2H, H3) ; 5,33 (sl, 1H, Hg) ; 4,03 (sl, 1H, Hg) ; 1,29 (sl, 12H, H9) ; 0,24 (s, 9H, H7);

RMN 13C (75,47 MHz, CDCl3) : 8 151,45 (1C, C1) ; 132,42 (2C, C2) ; 119,82 (2C, C3) ; 118,66 (1C, C4) ; 105,72 (1C, C6) ; 93,05 (1C, C5) ; 17 (2C, Cg) ; 23,80,19,11 (4C, C9) ;-0,15 (3C, C7) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 302 (100, [M+1] +) ; 1-(Diisopropyltriazényl)-4-éthynylbenzène(Diisopropyltria zényl)-4-éthynylbenzène 27 : MODE OPERATOIRE 6 g de 1-(diisopropyltriazényl)-4-((triméthylsilyl)éthynyl)benzà ¨ne (19,9 mmol, 1 éq.) sont mis en solution dans 100 ml de MeOH et 13,7 g de K2CO3 (99,5 mmol, 5 éq.) sont additionnés petit à petit. Après avoir agité le milieu réactionnel à température ambiante pendant 15h., celui-ci est évaporé à sec, repris avec 100 ml d'eau et 100ml d'EtOAc. La phase aqueuse est extraite quatre fois avec 50 ml d'EtOAc, puis la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis évaporée pour conduire à 4,38 g de 1- (diisopropyltriazényl)-4-éthynylbenzène, avec un rendement de 96%.

FB : C14Hl9N3 PM : 229g/mol CCM : Rf (Hexane pur) : 0,30 ; <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 8 7,46 (d, J2-3 = 8,6 Hz, 2H, H2) ; 7,37 (d, J3-2 = 8,6 Hz, 2H, H3) ; 5,33 (s1, 1H, H8) ; 4,03 (sl, 1H, H8); 3, 06 (s, 1H, H7) ; 1,29 (sl, 12H, H9) ; <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 13c (75,47 MHz, CDC13) : 6 151,75 (1C, C1) ; 132,57 (2C, C2) ; 119,95 (2C, C3) ; 117,56 (1C, C4) ; 84,14 (1C, C5) ; 76,28 (1C, C6) ; 48,68,45,75 (2C, C8) ; 23,61,19,28 (4C, C9) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 230 (100, [M+1] +) ; 2-iodo-4-triméthylsilanyléthynyl-benzoate de méthyle 28 :

MODE OPERATOIRE 2,6 g d'acide 2-iodo-5- ( (triméthylsilyl) éthynyl) benzoïque (7,56 mmol, 1 éq.) sont mis en solution dans 50 ml de THF puis 2, 17 g de N-éthyl-N'-(3- diméthylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) (11,3 mmol, 1,5 éq.) et 1,52 g d'hydroxybenzotriazole ou HOBT (11,3 mmol, 1,5 éq.) sont additionnés, enfin 18 ml de MeOH sont additionnés goutte à goutte. Après avoir agité le milieu réactionnel à température ambiante pendant 4h., celui-ci est évaporé à sec, repris avec 50 ml d'eau et 50 ml d'EtOAc. La phase organique est lavée avec 25 ml d'une solution aqueuse à 5% en KHSO4, 25 ml d'une solution aqueuse à 5% en NaHC03, et 25 ml d'une solution aqueuse saturée en NaCl. Elle est ensuite séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis évaporée pour conduire à 2,93 g d'une huile jaune (Rdt : quantitatif) qui est utilisée sans purification supplémentaire dans les étapes ultérieures.

FB : C13H1502ISi PM : 357, 9 g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAc : 9/1) : 0,46 ; RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 5 7,91 (d, J4-6 = 8,0 Hz, 1H, H4) ; 7,87 (d, J7-6 = 2,1 Hz, 1H, H7) ; 7,18 (dd, J6-7 = 2,1 Hz, J6-4 = 8,0 Hz, 1H, H6) ; 3,91 (s, 3H, H11) ; 0,23 (s, 9H, H 10) ; <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 13C (75,47 MHz, CDCl3) : 6 165,86 (1C, Ci) ; 141,05 (1 C, C4) ; 134,99 ; 133,90 (2C, C6, C7) ; 134,78 (1C, C2) ; 123,10 (1C, C5) ; 102,61 (1C, C3) ; 96,60 (1C, C9) ; 93,83 (1C, C8) ; 52, 31 (1C, Ci D ;-0,44 (3C, Ciao) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 376 (100, [M+18] +) ; 2- (4-trisopropyltriazènylphényléthynyl)-5-triméthylsilanyl éthynyl benzoate de méthyle 29 :

MODE OPERATOIRE 676 mg de 27 (1,88 mmol, 1 éq.) sont mis en solution dans 7 ml de THF, puis 132 mg de Pd (0, 18 mmol, 0,01 éq.) et 132 mg d'iodure de cuivre (3,76 mmol, 0,02 éq.) sont additionnes. Après agitation du milieu réactionnel pendant 15 min., 430 mg de 28 (1,88 mmol, 1 éq.) en solution dans 7 ml de THF sont additionnés goutte à goutte. L'agitation est maintenue pendant 15h., a température ambiante. Après évaporation à sec, le résidu est purifié sur gel de silice 60H (Hexane/EtOAc : 97/3) pour conduire à 683 mg d'une poudre jaune citron avec un rendement de 79%.

FB : C27H33N302Si PM : 459 g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAc : 9/1) : 0,28 ; <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 8 8,06 (s, 1H, H3) ; 7,34-7,57 (m, 6H, H5, H6, H11, H12) ; 5,27 (sl, 1H, H14) ; 3,96 (s, 4H, H14, H19) ; 1,31 (sl, 12H, H15) ; 0,25 (s, 9H, <BR> <BR> <BR> <BR> H18) ;<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 13C (75,47 MHz, CDC13) : 6 165,84 (1C, C1) ; 151,78 (1C, C13) ; 134,28 ; 133,85 ; 133,45 ; 132,99 (4C, C3, C5, C6) ; 132,99 (2C, Cll) ; 131,36 (1C, C2) ; 123,80 ; 122,16 (2C, C7, C10) ; 102,08 (2C, C12) ; 118,54 1C, C4) ; 103,47 (1C, C17) ; 97,21,96,83 (2C, C8, C9) ; 87,69 (1C, C16) ; 52,02 (1C, C19) ; 48,88,45,97 (2C, C14) ; 23,72,19,16 (4C, C15) ;-0,36 (3C, C18) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 460 (100, [M+1)+) ; 2-(4-iodo-phényléthynyl)-5-triméthylsilanyléthynyl(4-iod o-phényléthynyl)-5-triméthylsilanyléthynyl benzoate de méthyle :

MODE OPERATOIRE Dans un tube scellé sont placés 2, 3 g de 29 (5 mmol, 1 éq.) dans 5 ml d'iodure de méthyle (90 mmol, 18 éq.) Le milieu réactionnel est chauffé à 120°C pendant 72h., puis est évaporé à sec. Le résidu est repris dans 20 ml d'éther éthylique, filtré puis évaporé pour conduire à 2,2 g d'une huile jaune avec un rendement de 96%.

FB : C21H19O2SiI PM : 458 g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAc : 9/1) : 0,38 ; <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 1H (300 MHz, CDCI3) : b 8,06 (s, 1H, H3) ; 7,68 (d, J11-12 = 8, 0 Hz, 2H, H12); 7,54 (s, 2H, H3, H5) ; 7, 26 (d, J11-12 = 8,0 Hz, 2H, H11); 3,93 (s, 3H, H17); 0,25 (s, 9H, H16) ; <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 13c (75,47 MHz, CDC13) : # 165, 51 (1C, Cl) ; 137,36 (2C, C12) ; 134,40 ; 133,87 ; 133,59 (3C, C3, C5, C6) ; 132,97 (2C, C 11) ; 131, 54 (1C, C2) ; 122,95 (2C, C7, C10) ; (1C, C15) ; 97,35, 94,96 (2C, C8, C9) ; 89,19 (13C, C14) ; 94,54 (1C, C13) ; 52,08 (1C, Ci ?) ;-0,40 (3C, C16) ; SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 459 (59, [M+1] +) ; 476 (100, [M+18]+) 5-éthynyl-2-(4-iodo-phényléthynyl)-benzoate(4-iodo-phény léthynyl)-benzoate de 2,5-dioxo- pyrrolidine-1-yle 30 : MODE OPERATOIRE Après un traitement basique dans le méthanol de 500 mg de 2- (4- iodo-phényléthynyl)-5-triméthylsilanyléthynyl benzoate de méthyle, 68 mg d'acide 5-

éthynyl-2- (4-iodo-phényléthynyl) benzoique (0,18 mmol, 1 éq.) sont mis en solution dans 3 ml de THF, puis 25 mg de N-hydroxysuccinimide (0,22 mmol, 1,2 éq.) et 13 mg de diméthylaminopyridine (0,10 mmol, 0,55 éq.) sont additionnés. Après avoir placé le milieu réactionnel à 0°C, 45 mg de dicyclohexylcarbodiimide (0.22 mmol. 1,2 éq.) en solution dans 1 ml de CH2C12 sont additionnés goutte à goutte. L'agitation est maintenue pendant 15 en laissant monter la température lentement. Le milieu réactionnel est ensuite filtré puis évaporé pour conduire à un résidu qui est purifié par chromatographie sur gel de silice. Le produit ainsi obtenu est lavé une fois à l'EtOAc et 50 mg d'un solide jaune pale avec un rendement de 60%.

FB : C2lHi204NI PM : 469 g/mol CCM : Rf (Hexane/EtOAc : 60/40) : 0,5 ; <BR> <BR> <BR> RMN 1H (300 MHz, CD30D) : 6 8,03 (s, 1H, H3) ; 7,44-7,50 (m, 4H, H5, H6, H12) ; 7,06 (d, J11-12=8,2 Hz, 2H, H11);3, 22 (s, 1H, H16) ; 2,74 (s, 4H, Hlg) SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 470 (9,8, [M+1] +) ; 477 (100, [M+18] +) 2- (bis) méthoxycarbonylméthyl-amino)-6- (2- [2- (2- (2- [5-éthynyl- <BR> <BR> 2- (4-iodo-phényléthynyl)-benzoylamino]-éthoxy)-ethoxy)-éth oxy]-acétylamino)-<BR> <BR> <BR> <BR> hexanoate de méthyle 31b : MODE OPERATOIRE 92 mg de 30 (0,18 mmol, 1 éq.) en solution dans 3 ml de CH2Cl2 et 0,25 ml de triéthylamine (1,8 mmol, 10 2q.) sont additionnés goutte à goutte sur 88 mg de 21b (0,18 mmol, 1 éq.) en solution dans 2 ml de CH2C12. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 4h, puis est évaporé à sec. Le résidu obtenu

est chromatographié sur gel de silice 60H (CH2Cl2/MeOH : 97/3) pour conduire à 60 mg d'une huile légèrement jaune avec un rendement de 40%.

FB : C38H460i 1N3I PM : 847 g/mol CCM : Rf (MeOH/CH2C12 : 1/9) : 0,47 ; <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> RMN 1H (300 MHz, CDC13) : 8 8,00 (s, 1H, H27) ; 7,70 (d, J32-3 1 = 8,2 Hz, 2H, H32) ; 7,50 (sl, 3H, H24, H25, H20) ; 7, 26 (d, J31-32 = 8,2 Hz, 2H. H31) ; 6,61 (tl, 1H, H9) ; 3,88 (s, 2H, H13) ; (m, 25H, H7, HlO, H11, H14, H15, H16, H17, H18 H1g) ; 3,16-3,25 (m, 4H, H2, H6, H35) ; 1,41-1,69 (m, 6H, H3, H4, H5); SM (70eV/DCI/NH3/intensité %) : m/e : 848 (7, [M+1] +) ; Microanalyse pour I: Calc. : C, 53,84 ; H, 5,46 ; N, 4,95 ; O, 20,76 ; I, 14,97 Exp. : C, 52,62 ; H, 5,84 ; N, 4,98 ; Exemple 4 : Fixation de protéines His-tag sur un bâton moléculaire fonctionna- lisé par un complexe de nickel Ni-NTA.

La fixation de la sous-unité ABC23-(His)6 des ARN Polymérases de levure sur le polymère PO fonctionnalisé par des complexes de nickel-NTA a été étu- diée. Une étude par chromatographie de perméation a permis de mettre en évidence la fixation spécifique de protéines"étiquetées-histidine"sur le polymère. En effet, en présence de polymère l'élution de la protéine est accélérée. Plusieurs protéines se fixent sur le polymère formant ainsi des complexes protéiques de plus hauts poids moléculaires. De plus, cette fixation est induite par une interaction entre le nickel et l'étiquette polyhistidine car la protéine ABC23 sans étiquette ne semble pas ou peu se fixer sur le polymère PO.

Protocole : 1 5 u. l d'une solution 500M de bâton moléculaire PO dans du tampon Tris (10 mM, pH 8) sont additionnés soit à 5 ul d'une solution de protéine ABC23-His6 (3,2 mg/ml dans du tampon Tris 10 mM, NaCl 150 mM), soit à 7 µl d'une solution de protéine ABC23 (2,3 mg/ml dans du tampon Tris 10 mM, NaCl 150 mM), ou bien à 5 ul de tampon Tris (10 mM, pH 8). Après 18h. sans agitation, le

volume de la solution est complété à 5 Oui par addition de tampon Tris (10 mM, pH 8) et 1'ensemble est injecté dans une boucle d'injection de 50 u. l du Smart system.

Conditions : Etude de la fixation de l'ABC23- (His) 6 de l'ARN Polymérase de levure sur le polymère PO par chromatographie de perméation a l'aide d'un Smart system (Colonne Superose 6 ; elution Tris (lOmM, pH 8 ; NaCl 150 mM) Exemple 5 : Observation par microscopie électronique de protéines His-tag sur un bâton moléculaire fonctionnalisé par un complexe de nickel Ni-NTA : La fixation d'une phosphatase- (His) 6 sur le polymère PO fonctionna- lisé par des complexes de nickel-NTA par chromatographie de perméation a été étu- diée. On observe la structure des objets supramoléculaires formés par microscopie électronique. On note la formation d'agrégats linéaires de protéines.

Conditions expérimentales : Après purification par chromatographie de perméation sur Smart system (Colonne Superose 6 ; élution Tris (lOmM, pH 8 ; NaCl 150 mM), 5 ul de solution sont déposés sur un grille de microscopie électronique recouverte d'un film de carbone et préalablement déchargée sous vide avec un courant de 20 mA. La grille est alors colorée négativement avec une solution d'acétate d'uranyle et observée dans le microscope électronique.

Photos enregistrées sur des films KODAK S0163 à un grossisse- ment 45,000 x, avec un microscope électronique à transmission Philips CM 120 fonc- tionnant à 100kV et dans des conditions minimales du faisceau d'électron (< 10 élec- trons/Å2).

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.