La présente invention porte sur un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier sur un polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase, sur une cellule hôte incluant ce polypeptide monomérique et sur une cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour ce polypeptide monomérique. La présente invention porte également sur un procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier sur un procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase et sur l’utilisation d’un tel polypeptide monomérique, en particulier sur l’utilisation d’un tel polypeptide monomérique recombinant.

La disponibilité décroissante de sources d'énergie fossile et la crainte d'un changement climatique dramatique ont favorisé l'émergence de technologies propres et renouvelables. L’hydrogène (H2) est considéré comme un vecteur d’énergie renouvelable prometteur en raison de sa forte teneur en énergie et de l’absence de pollution lors de son utilisation dans les piles à combustible. La production dT½ est actuellement réalisée par extraction chimique d'hydrocarbures fossiles, électrolyse de l'eau ou pyrolyse de biomasse. Cependant, le manque de systèmes de production à la fois non-polluants et commercialement viables est une limitation majeure. L'utilisation de méthodes de production biotechnologique d’H2, aussi appelé bio-hydrogène, pourrait être une solution. Le nombre de recherches sur la production de bio-hydrogène a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. Cela inclut la production microbienne principalement par le processus de la fermentation dans les bactéries et de la photosynthèse dans les microalgues, mais aussi la génération enzymatique d’hydrogène par « électro- enzymologie ». Toutes ces méthodes reposent sur des enzymes particulières appelées hydrogénases.

Les hydrogénases sont des métallo-enzymes qui catalysent la réaction chimique : 2 H ⁺ + 2e <® H2. Cette réaction de production ou de consommation de l’hydrogène dépendante de l’enzyme est définie comme l’activité hydrogénase. La réaction est réversible et sa direction dépend du potentiel redox des composants capables d'interagir avec l'enzyme. En présence d’H2et d’un accepteur d’électrons, une hydrogénase consomme l’hydrogène. En présence d’un donneur d’électrons de faible potentiel, une hydrogénase utilise des protons comme accepteurs d’électrons et produit de IΉ2. Les hydrogénases sont largement répandues parmi les microorganismes car nombre d’entre eux utilisent l’hydrogène comme vecteur ou source d'énergie. Ces enzymes comptent de nombreux représentants dans le domaine des bactéries et des archées et sont également présentes dans certains organismes eucaryotes unicellulaires. Malgré leur diversité à bien des égards (hôte, taille, structure quaternaire, donneurs ou accepteurs d'électrons), les hydrogénases sont divisées en trois classes phylogénétiquement distinctes : les [Fe]- hydrogénases, les [FeFe]-hydrogénases et les [NiFe]-hydrogénases. Chaque classe est caractérisée par une composition métallique distinctive du site actif. Physiologiquement, il a été démontré que ces enzymes fonctionnent comme une valve pour un excès d’électrons.

Le centre catalytique des [Fe]-hydrogénases ne contient aucun centre FeS ou Ni et a donc été nommé « hydrogénase libre de centre fer-soufre » ou [Fe]- hydrogénases (Shima and Thauer. 2007. A third type of hydrogénase catalyzing H2 activation. Chem Rec 7:37-46). Les [Fe]-hydrogénases sont limitées à certains microorganismes méthanogènes (Pilak et al. 2006. The crystal structure of the apoenzyme of the iron-sulphur cluster-free hydrogénase. J Mol Biol 358:798-809) où elles sont essentielles à la croissance lors d’une carence en nickel (Thauer. 1998. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson. 1998 Marjory Stephenson Prize Lecture. Microbiology 144 :2377-2406). Associé à un cofacteur spécifique, ces enzymes ont des propriétés catalytiques très différentes des autres types d’hydrogénases. En effet, elles ne catalysent pas la réaction réversible de production d’H2 (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogénases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272). Pour cette raison, ainsi que par leur faible distribution, cette classe d'hydrogénases a été peu étudiée. La grande majorité des hydrogénases connues appartiennent aux deux autres classes.

Les [FeFej-hydrogénases sont des enzymes monomériques dont le centre catalytique est hautement conservé. Il s'agit d'un site de fer bi-nucléaire lié à un centre [4Fe-4S] par un pont de cystéine. Les ligands non protéiques, le cyanure (CN) et le monoxyde de carbone (CO), sont liés aux atomes de fer du centre bi- nucléaire. Les atomes de fer partagent également deux ligands soufre (Nicolet et al. 2000. A novel FeS cluster in Fe-only hydrogenases. Trends Biochem Sci 25:138- 143, Nicolet et al. 2002. Fe-only hydrogenases: structure, function and évolution. J Inorg Biochem 91 :1-8). Des domaines supplémentaires hébergent plusieurs centres FeS et assurent le transfert d'électrons entre la source d'électrons externe et le site actif intégré dans ces protéines monomériques. De plus, un canal hydrophobe relie la surface au site actif et fournit un accès pour les protons et une sortie pour les molécules d’H2. Trois protéines chaperonnes nommées HydE, HydF et HydG sont connues comme nécessaires à l'assemblage correct des [FeFej-hydrogénases (Vignais et al. 2001 . Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS Microbiol Rev 25:455-501). Ces enzymes sont présentes dans les procaryotes anaérobies (genres Clostridium ou Desulfovibrio), mais aussi dans quelques eucaryotes inférieurs tels que les champignons anaérobies ou les microalgues unicellulaires (genres Chlorella ou Chlamydomonas ) (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272). Les [FeFej-hydrogénases favorisent thermodynamiquement la réoxydation du cofacteur (ferrédoxine ou NADH) et génèrent ainsi de IΉ2. Ces enzymes sont donc généralement impliquées dans l'élimination d’un excès d’équivalents réducteurs dans la cellule afin d’éviter, par exemple, un arrêt de la fermentation. Elles sont également capables d'interagir avec la chaîne photosynthétique d'un groupe restreint de microalgues pour oxyder la chaîne photosynthétique et ainsi activer la fixation du carbone après une incubation anoxique (Ghysels et al. 2013. Function of the chloroplast hydrogenase in the microalga Chlamydomonas: the rôle of hydrogenase and State transitions during photosynthetic activation in anaerobiosis. PLoS One 8:e64161 , Godaux et al. 2015. Induction of Photosynthetic Carbon Fixation in Anoxia Relies on Hydrogenase Activity and Proton-Gradient Regulation-Likel-Mediated Cyclic Electron Flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol 168:648-658).

Les [NiFe]-hydrogénases forment des hétéro-multimères globulaires (Volbeda et al. 1995. Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas. Nature 373:580-587). Le site actif bi-métallique [NiFe] est situé dans la grande sous-unité où il est coordonné par quatre cystéines et trois ligands non protéiques, une molécule de CO et deux CN, liés à l’atome de fer (Happe et al. 1997. Biological activation of hydrogen. Nature 385:126, Pierik et al. 1999. Carbon monoxide and cyanide as intrinsic ligands to iron in the active site of [NiFe]- hydrogenases. NiFe(CN)2CO, Biology's way to activate H2. J Biol Chem 274:3331- 3337). Les autres sous-unités de l’hétéro-multimère contiennent plusieurs centres FeS médiaux et distaux, qui conduisent les électrons entre le site actif et le donneur ou l'accepteur d'électrons physiologique. Le groupe [4Fe-4S] situé à proximité du site actif est considéré comme essentiel à l'activité (Albracht. 1994. Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochim Biophys Acta 1188:167-204). En plus des gènes structurels, il existe plusieurs gènes accessoires impliqués dans la maturation et l'insertion de Ni, Fe, CO et CN dans le site actif de ces hétéro- multimères. En effet, la maturation des [NiFe]-hydrogénases suit une voie complexe impliquant au moins sept protéines auxiliaires (HypA-F et une endopeptidase) (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272). Une autre caractéristique du site actif des [NiFe]-hydrogénases est la forte affinité pour l’hydrogène. Ces enzymes agissent donc principalement en consommant IΉ2 chez le micro organisme hôte, même si certaines [NiFe]-hydrogénases présentent une bonne capacité de production d’hydrogène. Les [NiFe]-hydrogénases sont des enzymes assez répandues parmi les procaryotes avec de nombreux représentants chez les bactéries et les archées. La classification des [NiFe]-hydrogénases est basée sur les alignements de séquences en acides aminés des différentes sous-unités et divise les [NiFe]-hydrogénases en quatre groupes. Remarquablement, cette classification est en bon accord avec les groupes dérivés des fonctions physiologiques (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272).

L’extrême sensibilité des hydrogénases à l’oxygène aussi bien in vitro que in vivo est un problème lorsqu’on considère ces enzymes pour la production d’hydrogène à un niveau industriel. L’oxygène se lie en tant que ligand au site actif, accepte les électrons et est réduit en espèce réactive de l'oxygène (ROS) piégée dans l'enzyme. Cela peut entraîner des dommages permanents lorsque le ROS survit suffisamment longtemps pour attaquer le centre catalytique vulnérable. Les [FeFe]-hydrogénases présentent une sensibilité grave à GO2 car l'enzyme est endommagée de manière irréversible après une exposition à de petites concentrations d'02 (Ghirardi et al. 1997. Oxygen sensitivity of algal H2- production. Appl Biochem Biotechnol 63-65:141 -151 ). Cependant, les [NiFe]-hydrogénases sont décrites comme étant plus résistantes que les [FeFe]-hydrogénases aux dommages causés par l'oxygène. De plus, les [NiFe]-hydrogénases sont inactivées de manière réversible par O2. Certains micro-organismes, tels que Ralstonia sp., ont même développé un site actif tolérant à l'oxygène, et sont capables d'oxyder l'hydrogène même en présence d'air (Van der Linden et al. 2004. The soluble [NiFe]- hydrogenase from Ralstonia eutropha contains four cyanides in its active site, one of which is responsible for the insensitivity towards oxygen. J Biol Inorg Chem 9:616- 626). Ces diverses caractéristiques font des [NiFe]-hydrogénases de meilleurs candidats pour une utilisation technologique industriellement viable.

HoxEFUYH est une [NiFe]-hydrogénase bien caractérisée présente chez la cyanobactérie Synéchocystis sp. PCC6803. HoxEFUYH est une [NiFe]- hydrogénase pentamérique et cytoplasmique. HoxY et HoxH forment la partie « hydrogénase » tandis que HoxE, HoxF et HoxU constituent la partie en contact avec le cofacteur redox (Carrieri et al. 2011. The rôle of the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria. Bioresour Technol 102:8368-8377). HoxH est la sous-unité responsable de l'activité catalytique, c’est-à-dire la sous-unité comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase. HoxH contient les résidus conservés pour la liaison des atomes de nickel et de fer. HoxY contient le groupe proximal [4Fe-4S] prèRs du centre catalytique NiFe. HoxF et HoxU sont des protéines de type fer-soufre responsables de l’interaction in vivo avec le substrat (NADH, flavodoxine ou ferrédoxine réduite). HoxFU contiennent les centres FeS médiaux et distaux transportant les électrons vers FloxYFI. La fonction de FloxE n'est pas claire, mais il peut s'agir d'une sous-unité d’ancrage dans la membrane. Une analyse mutationnelle de la voie de maturation a identifié sept facteurs de maturation essentiels, appelés FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW (Floffmann et al. 2006. Mutagenesis of hydrogenase accessory genes of Synechocystis sp. PCC 6803. Additional homologues of hypA and hypB are not active in hydrogenase maturation. FEBS J 273:4516-4527). Un modèle de maturation de HoxEFUYH a été proposé (Carrieri et al. 2011. The rôle of the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria. Bioresour Technol 102:8368-8377, Cassier-Chauvat et al. 2014. Advances in the function and régulation of hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis PCC6803. Int J Mol Sci 15:19938-19951). La sous-unité HoxH est traitée par la protéase spécifique HoxW et le site [Ni-Fe] est ajouté à la sous-unité catalytique par le complexe HypABCDEF. Le génome complet de Synéchocystis sp. PCC6803 a été séquencé. Les gènes HoxEFUYH ont été identifiés comme étant regroupés dans un opéron octacistronique, contrairement aux gènes hypABCDEF dispersés dans le chromosome de Synéchocystis. Le promoteur de l'opéron hoxEFUYH n'est pas très actif (Dutheil et al. 2012. The AbrB2 autorepressor, expressed from an atypical promoter, represses the hydrogenase operon to regulate hydrogen production in Synechocystis strain PCC6803. J Bacteriol 194:5423-5433). Il est régulé par diverses conditions environnementales, telles que les disponibilités en hydrogène, en lumière, en nitrates, en nickel, en oxygène ou en soufre (Oliveira and Lindblad. 2009. Transcriptional régulation of the cyanobacterial bidirectional Hox-hydrogenase. Dalton Trans 9990-9996). Il est important de noter que les gènes hox sont exprimés de manière constitutive en présence d’oxygène (Kiss et al. 2009. Transcriptional régulation of the bidirectional hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis 6803. J Biotechnol 142:31-37), mais que l'enzyme, sensible à l'oxygène, est par conséquent inactive en conditions aérobies. La fonction physiologique précise fait encore l’objet de débats, mais HoxEFUYH fonctionnerait comme une valve de sécurité qui dissipe l’excès d’électrons en conditions redox défavorables, maintenant ainsi une balance oxydation/réduction adéquate dans la cellule pendant la fermentation ou la photosynthèse (Carrieri et al. 2011 . The rôle of the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria. Bioresour Technol 102:8368-8377).

Il existe un grand nombre d'études sur HoxEFUYH. De nombreuses caractéristiques font de cette enzyme un bon candidat pour la production de bio hydrogène. Premièrement, cette [NiFe]-hydrogénase présente un biais en faveur de la réduction des protons (Mclntosh et al. 2011. The [NiFe]-hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 works bidirectionally with a bias to H2 production. J Am Chem Soc 133:11308-11319). L’opéron, et par conséquent l’enzyme, sont faiblement exprimés dans Synéchocystis sp. PCC6803 en condition aérobie (Kiss et al. 2009. Transcriptional régulation of the bidirectional hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis 6803. J Biotechnol 142:31-37). L’inactivation de FloxEFUYFI en présence d’oxygène est totale et presque instantanée. Cependant, FloxEFUYFI peut être réactivé rapidement (délais de l’ordre de la minute) en condition redox (par exemple par réduction avec de l'hydrogène et/ou par élimination de l'oxygène) (Appel et al. 2000. The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp. PCC 6803 works as an électron valve during photosynthesis. Arch Microbiol 173:333-338, Germer et al. 2009. Overexpression, isolation, and spectroscopic characterization of the bidirectional [NiFe] hydrogenase from Synechocystis sp. PCC 6803. J Biol Chem 284:36462-36472, Mclntosh et al. 2011 . The [NiFe]-hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 works bidirectionally with a bias to H2 production. J Am Chem Soc 133:11308-11319). Plusieurs protocoles de purification (Schmitz et al. 2002. HoxE-a subunit spécifie for the pentameric bidirectional hydrogenase complex (HoxEFUYH) of cyanobacteria. Biochim Biophys Acta 1554:66-74, Germer et al. 2009. Overexpression, isolation, and spectroscopic characterization of the bidirectional [NiFe] hydrogenase from Synechocystis sp. PCC 6803. J Biol Chem 284:36462- 36472) et de mise en œuvre en électrochimie (Mclntosh et al. 2011. The [NiFe]- hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 works bidirectionally with a bias to H2 production. J Am Chem Soc 133:11308-11319) sont disponibles. La possibilité de catalyser efficacement la production d'hydrogène, et avec une sensibilité limitée à l'oxygène, a permis à HoxEFUYH d'être identifié comme un bon candidat.

Un procédé commun et efficace pour produire une grande quantité d'une protéine d'intérêt est la production recombinante de cette protéine au sein d'un hôte hétérologue. Ce processus biotechnologique implique l'introduction et l'expression de gènes d'intérêts dans le génome de l'organisme hôte afin de produire une grande quantité de la protéine d'intérêt, avec un excellent degré de pureté. Il existe plusieurs systèmes de production recombinante. Le système procaryote reste le système le plus rapide et le plus facile afin de produire une protéine d'intérêt, le système eucaryote étant plus lent et plus compliqué à mettre en œuvre. Chaque organisme a ses propres avantages et inconvénients. Il n’existe pas encore de système d’expression universellement applicable. Il est très difficile de prédire quel hôte fonctionnera le mieux pour une protéine particulière ou pour une utilisation finale particulière. Escherichia coli (E. coli) est l'organisme de référence pour la production recombinante. En effet, cette bactérie est très connue du point de vue de l’ingénierie génétique et physiologique, avec par exemple : cellule optimisée (productivité élevée, utilisation de codons, inhibition des protéases endogènes), milieu de culture optimisé, temps de doublement court, faible contamination, disponibilité de nombreux vecteurs commerciaux, mise à l'échelle industrielle, rendement de production important.

La production et l'ingénierie d'hydrogénases recombinantes, à l'instar des métalloprotéines en général, ont connu un succès limité. La littérature fournit des exemples de [FeFe]-hydrogénases exprimées de manière hétérologue dans E. coli (King et al. 2006. Functional studies of [FeFe] hydrogenase maturation in an Escherichia coli biosynthetic System. J Bacteriol 188:2163-2172, Yacoby et al. 2012. Optimized expression and purification for high-activity préparations of algal [FeFe]- hydrogenase. PLoS One 7:e35886, Kuchenreuther et al. 2009. Tyrosine, cysteine, and S-adenosyl méthionine stimulate in vitro [FeFe] hydrogenase activation. PLoS One 4:e7565). Les [FeFe]-hydrogénases sont des enzymes monomériques nécessitant un nombre limité de facteurs de maturation.

La production hétérologue de [NiFe]-hydrogénases est qualifiée de difficile (English et al. 2009. Recombinant and in vitro expression Systems for hydrogenases: new frontiers in basic and applied studies for biological and synthetic H2 production. Dalton Trans 9970-9978).

Premièrement, la difficulté provient de la complexité et de la spécificité du processus d'assemblage du site actif [NiFe], qui nécessite théoriquement au moins sept facteurs de maturation pour un assemblage fonctionnel.

Deuxièmement, le repliement correct de chacune des sous-unités de l’hétéro-multimère est requis, ce qui est particulièrement difficile à contrôler et à assurer lors d’une production hétérologue.

Troisièmement, l'assemblage correct de chaque sous-unité dans le complexe hétéro-multimérique est obligatoire. Un mauvais repliement peut mener à un phénomène d’agrégation et donc à une diminution de la quantité d’enzyme active (Singh et al. 2015. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact 14:41 ). L’obtention d’une séquence précise est nécessaire pour obtenir une activité enzymatique, ce qui peut s’avérer être difficile à contrôler et à assurer chez un hôte hétérologue.

Tout ceci explique pourquoi les [NiFe]-hydrogénases ne sont pas toujours actives lorsqu'elles sont produites par recombinaison hétérologue. Cependant, il existe plusieurs cas dans la littérature où une [NiFej-hydrogénase active a été produite dans E. coli (Kim et al. 2011 . Production of biohydrogen by heterologous expression of oxygen-tolerant Flydrogenovibrio marinus [NiFej- hydrogenase in Escherichia coli. J Biotechnol 155:312-319, Maier et al. 2015. Identification, cloning and heterologous expression of active [NiFej-hydrogenase 2 from Citrobacter sp. SG in Escherichia coli. J Biotechnol 199:1 -8, Schiffels et al. 2013. An innovative cloning platform enables large-scale production and maturation of an oxygen-tolerant [NiFej-hydrogenase from Cupriavidus necator in Escherichia coli. PLoS One 8:e68812, Weyman et al. 2011 . Genetic analysis of the Alteromonas macleodii [NiFej-hydrogenase. FEMS Microbiol Lett 322:180-187).

En particulier, les travaux de Sun et de ces collaborateurs (Sun et al. 2010. Fleterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFej- hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526) ont permis l’expression de la [NiFe]-hydrogénase de Pyrococcus furiosus en anoxie dans E. coli par l’intermédiaire de quatre vecteurs d'expression permettant la co-expression de 13 gènes hétérologues (quatre gènes de structure et neuf facteurs de maturation). Plus spécifiquement, les travaux de Sun et al. ont permis d’obtenir une enzyme recombinante tétramérique de type [NiFe]-hydrogénase comprenant les quatre sous-unités dénommées PF0891 , PF0892, PF0893 et PF0894. Après purification, cette enzyme recombinante tétramérique s'est révélée être fonctionnellement similaire à l'enzyme native purifiée à partir de P. furiosus.

FloxEFUYFI étant une protéine procaryote de la cyanobactérie Synéchocystis , le système E. coli convient à sa production recombinante. Cette production dans E. coli a déjà été réalisée avec succès. En ce sens, Maeda et ses collègues ont montré une augmentation in vivo de la production d'hydrogène dans les cellules de E. coli exprimant, en condition anoxique, l’enzyme HoxEFUYH cyanobactérienne (Maeda et al. 2007. Inhibition of hydrogen uptake in Escherichia coli by expressing the hydrogenase from the cyanobacterium Synéchocystis sp. PCC 6803. BMC Biotechnol 7:25). Une telle production d'hydrogène accrue en présence de FloxEFUYFI est due à l’inhibition de l'activité des hydrogénases endogènes 1 et 2 consommatrices d’Fte chez E. coli.

Citons également Wells et ses collaborateurs qui ont introduit les gènes FloxEFUYFI et ces facteurs de maturation associés dans E. coli (Wells et al. 2011 . Engineering a non-native hydrogen production pathway into Escherichia coli via a cyanobacterial [NiFe] hydrogenase. Metab Eng 13:445-453). Ce travail a démontré la production d'hydrogène, en anoxie, aussi bien in vivo que in vitro via HoxEFUYH dans un hôte nul pour les hydrogénases endogènes. Ils indiquent un couplage avec des systèmes de transfert d'électrons de l'hôte comme la fermentation et montrent le potentiel de HoxEFUYH dans l'ingénierie métabolique pour améliorer les rendements de production d’hydrogène.

Dans l’état de la technique, il n’y a pas de divulgation d’un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFej-hydrogénase, en particulier d’un monomère isolé issu d’un complexe de type [NiFej-hydrogénase, présentant à lui seul une activité hydrogénase, quand bien même les documents D2 (Hornhardt et al. 1986. Characterization of a native subunit of the NAD-linked hydrogenase isolated from a mutant of Alcaligenes eutrophus H16. Biochimie, Masson, Paris, FR, vol. 68(1), pages 15-24) et D3 (Przybyla et al. 1992. Structure-function relationships among the nickel-containing hydrogenases. FEMS Microbiol Rev 8:109-135) semblent vouloir le faire croire.

Le document D2 décrit la caractérisation d’une sous-unité native de la [NiFe]-hydrogénase d 'Alcaligenes eutrophus H16. Ce peptide représente la sous- unité catalytique de la [NiFe]-hydrogénase et est décrit comme totalement inactif avec le NAD comme médiateur redox, mais présentant une activité résiduelle très faible avec le bleu de méthylène, le ferricyanure et le cytochrome C.

Le document D3 suggère l’existance de monomères de type [NiFe]- hydrogénase présentant une activité hydrogénase. Comme exemples, le document D3 mentionne, en citant le document D2, la [NiFe]-hydrogénase d’ Alcaligenes eutrophus, et aussi la [NiFe]-hydrogénase-1 d ’Escherishia coli.

Cependant, des études publiées ultérieurement, y compris les études décrites dans les documents D1 (Massanz et al. 1998. Subforms and in vitro reconstitution of the NAD-reducing hydrogenase of Alcaligenes eutrophus. J Bacteriol 180:1023-1029), D4 (Senger et al. 2017. Proteolytic cleavage orchestrâtes cofactor insertion and protein assembly in [NiFe]-hydrogenase biosynthesis. J Biol Chem 292:11670-11681) et D5 (Pinske et al. 2011. Efficient électron transfer from hydrogen to benzyl viologen by the [NiFe]-hydrogenases of Escherichia coli is dépendent on the coexpression of the iron-sulfur cluster-containing small subunit. Arch Microbiol 193:893-903), ont montré que les conclusions des études des documents D2 et D3 sont erronées.

L’étude décrite dans le document D1 a démontré que la sous-unité contenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase d ’Alcaligenes eutrophus H16 toute seule ne présentait aucune activité de type hydrogénase, et ce avec plusieurs médiateurs redox, notamment le benzyl viologène. Le document D1 mentionne que la plus petite entité de la [NiFe]-hydrogénase d ’Alcaligenes eutrophus susceptible d’avoir une activité hydrogénase consiste en la large sous-unité contenant le centre [NiFe] et la petite sous-unité avec un minimum d’un centre FeS. De manière similaire, les études présentées dans les documents D4 et D5 s’opposent à l’enseignement du document D3 en montrant que la sous-unité catalytique seule de l’hydrogénase-1 [NiFe] d ’Escherishia coli ne présente aucune activité hydrogénase La majorité des travaux réalisés sur ce sujet, y compris les études des documents D1 , D4 et D5 considèrent que le centre [4Fe-4S] situé dans la petite sous-unité est essentiel et indispensable à l'activité hydrogénase de la grande sous- unité des [NiFe]-hydrogénases (Albracht. 1994. Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochim Biophys Acta 1188:167-204). En outre, les analyses structurelles des [NiFe]-hydrogénases ont largement démontré l’absence de centre FeS dans la sous-unité catalytique contenant le site actif (Lubitz et al. 2014. Hydrogenases. Chem Rev 114:4081-4148),

Ainsi, les résultats décrits précédemment dans le document D2 ne peuvent s’expliquer que par une contamination de la sous-unité catalytique par la petite sous-unité, comme en atteste la mise en évidence de centre FeS dans les préparations permettant la faible activité hydrogénase mesurée.

En conclusion, l’ensemble des travaux réalisés qui constituent l’état de la technique considèrent que la réduction du nombre de sous-unités n’est ni favorable à l’activité ni à la stabilité des hydrogénases et que la sous-unité contenant le centre NiFe, isolée des complexes multimériques des hydrogénases de type NiFe, ne présente pas d’activité hydrogénase à elle seule.

Malheureusement, comme il ressort notamment de l’état de la technique mentionné ci-dessus, il demeure plusieurs inconvénients freinant considérablement l’utilisation des [NiFe]-hydrogénases, et notamment l’utilisation de HoxEFUYH, pour une bio-production d’hydrogène commercialement rentable.

A ce jour, il existe donc un réel besoin de surmonter les obstacles freinant l’utilisation des [NiFe]-hydrogénases pour une production d’hydrogène dès lors que, comme indiqué plus haut, les [NiFe]-hydrogénases présentent indéniablement un haut potentiel pour la production d’hydrogène.

Pour résoudre ces problèmes, il est prévu suivant l’invention, un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité enzymatique, en particulier une activité enzymatique de type hydrogénase, plus particulièrement une activité catalytique, plus particulièrement encore une activité catalytique de type hydrogénase.

De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique comprend une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.

De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique est constitué d’une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.

De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique consiste en une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.

En d’autres termes, préférentiellement, il est prévu selon l’invention, un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant uniquement le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant à lui seul une activité enzymatique, en particulier une activité enzymatique de type hydrogénase, plus particulièrement une activité catalytique, plus particulièrement encore une activité catalytique de type hydrogénase.

Dans le cadre de la présente invention, il a été mis en évidence qu’un tel polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase et présentant une activité hydrogénase permet de s’affranchir au moins en partie des obstacles freinant l’utilisation des [NiFe]-hydrogénases pour une production d’hydrogène, ceci tout en garantissant une activité hydrogénase d’au moins 0,01 mitioI H2 . min ^-1 . mg ^_1 d’enzyme, de préférence d’au moins 0,05 mitioI H2 . min ^-1 . rng ^-1 d’enzyme.

En effet, dès lors qu’il s’agit selon l’invention d’un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, les difficultés rencontrées avec les [NiFe]- hydrogénases, notamment pour assurer l’assemblage du site actif, pour assurer un repliement adéquat de chacune des sous-unités impliquées et pour assurer un assemblage correct de chaque sous-unité dans un complexe hétéro-multimérique, sont fortement réduites voire éliminées. Ceci permet d’augmenter la reproductibilité lors du processus d’obtention de la [NiFe]-hydrogénase puisqu’une seule sous-unité est impliquée. En effet, la production d’un seul polypeptide monomérique simplifie fortement le processus complexe de repliement en comparaison avec les enzymes dimérique, tétramérique et pentamérique pour lesquelles un assemblage correct du site actif, de chacune des sous-unités et enfin de l’enzyme entière est particulièrement difficile à contrôler et à garantir, ce qui constitue un obstacle à leur utilisation. Selon l’invention, le repliement adéquat d’une seule sous-unité est nécessaire et aucun assemblage entre différentes sous-unités n’est requis pour former un complexe hétéro-multimérique.

Par ailleurs, il a été mis en évidence que le procédé de fabrication d’un tel polypeptide monomérique selon l’invention peut être totalement réalisé en condition aérobie (pas de précaution requise par rapport à l’oxygène lors des étapes d’expression et de purification), ce qui écarte les problématiques rencontrées avec les procédés de fabrication des [NiFe]-hydrogénases dimériques, tétramériques et pentamériques recombinantes rencontrées dans l’état de la technique et pour lesquelles les procédés de fabrication sont réalisés en anoxie. Comme mentionné plus haut, même si l’accumulation de biomasse est réalisée en présence d’oxygène, la phase de production de l’hydrogénase recombinante est quant à elle réalisée en anoxie selon les procédés connus de l’état de la technique (Sun et al. 2010. Fleterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]- hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526, Wells et al. 2011 . Engineering a non-native hydrogen production pathway into Escherichia coli via a cyanobacterial [NiFe] hydrogenase. Metab Eng 13:445-453). L’absence d’oxygène est également rapportée (boite anoxie, dithionite de sodium dans les tampons) lors des diverses étapes chromatographiques de la purification. Le maintien d’un tel niveau d’anoxie aux cours du procédé implique évidemment une augmentation des coûts liés à la production recombinante, ce qui est solutionné par la présente invention. De façon avantageuse suivant l’invention, la taille du polypeptide monomérique selon l’invention est nettement plus faible en comparaison avec l’hétéro-multimère, une augmentation de l’activité massique de l’enzyme (nombre d’entité catalytiquement active par mg de protéine total) étant ainsi obtenue.

Une meilleure intégration et une densification du catalyseur enzymatique est également réalisable, par exemple, lors d’une mise en œuvre électrochimique du polypeptide monomérique selon l’invention, comme par exemple dans une pile à combustible.

En outre, la structure tridimensionnelle d’un polypeptide monomérique selon l’invention est facilement modélisable notamment pour déterminer les résidus exposés à la surface de la protéine, par exemple pour faciliter l’orientation ainsi que l’adsorption par rapport à une interface, par exemple par rapport à une électrode de carbone. Cette caractéristique permet avantageusement, par exemple, d’améliorer la stabilité du lien entre l’interface et le catalyseur enzymatique, mais aussi une optimisation du transfert d’électrons direct entre l’interface et le site actif. Le rendement énergétique est dès lors amélioré en l’absence de relais redox supplémentaires, ce qui limite les pertes énergétiques.

Dans le contexte de la présente invention, il a également été démontré que le polypeptide monomérique est bien actif et apte à la production par catalyse d’H2 (par exemple via le test standard de production in-vitro d’FL par les hydrogénases utilisant le méthyl-viologène réduit comme médiateur redox) ainsi qu’à la consommation par catalyse d’H2 (par exemple via le test standard de consommation in-vitro d’H2 par les hydrogénases utilisant le benzyl viologène oxydé comme médiateur redox), sans présence du centre FeS proximal présent dans la petite-sous-unité et décrit comme essentiel, ni d’ailleurs d’aucun autres relais redox. Ceci est tout à fait surprenant puisqu’une simplification aussi poussée de l’enzyme hétéro-multimérique n’a jamais permis la mise en évidence de l’activité hydrogénase dans l’état de la technique.

De façon d’autant plus avantageuse, alors que seule une production d’H2 limitée est actuellement obtenue avec les [NiFej-hydrogénases recombinantes connues (Sun et al. 2010. Fleterologous expression and maturation of an NADP- dépendent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526, Schiffels et al. 2013. An innovative cloning platform enables large-scale production and maturation of an oxygen-tolerant [NiFe]-hydrogenase from Cupriavidus necator in Escherichia coli. PLoS One 8:e68812, Maier et al. 2015. Identification, cloning and heterologous expression of active [NiFe]-hydrogenase 2 from Citrobacter sp. SG in Escherichia coli. J Biotechnol 199:1 -8), il a été montré que le polypeptide monomérique selon l’invention présente une activité hydrogénase au moins équivalente voire même supérieure à celles obtenues avec les [NiFe]-hydrogénases (recombinantes) connues.

Selon un mode de réalisation suivant l’invention, le polypeptide monomérique est isolé de son environnement naturel, en particulier isolé d’une protéine naturelle de type [NiFe]-hydrogénase.

A titre d’exemple, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique peut être issu/isolé d’un procaryote. Les exemples incluent, mais ne sont pas limité à un membre du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia coli), un membre du genre Desulfovibrio (comme par exemple Desulfovibrio gigas ), un membre du genre Hydrogenophilus (comme par exemple Hydrogenophilus thermoluteolus), un membre du genre Desulfomicrobium (comme par exemple Desulfomicrobium baculatum), Synéchocystis (comme par exemple Synéchocystis sp. PCC6803), un membre du genre Phormidium (comme par exemple Phormidium ambiguum) ou un membre du genre Spirulina (comme par exemple Spirulina platensis). Par exemple, ledit polypeptide monomérique peut être issu d’une cellule ou d’un microbe ou peut être produit in vitro ou in vivo.

Selon un mode de réalisation suivant l’invention, le polypeptide monomérique est recombinant ou hétérologue.

Avantageusement, selon l’invention, le polypeptide monomérique est purifié.

Préférentiellement, selon l’invention, le polypeptide monomérique présente une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.

De façon encore préférée, selon l’invention, le polypeptide monomérique présente une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 81 % d’identité, au moins 82% d’identité, au moins 83% d’identité, au moins 84% d’identité, au moins 85% d’identité, au moins 86% d’identité, au moins 87% d’identité, au moins 88% d’identité, au moins 89% d’identité, au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité, au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.

Avantageusement, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique est caractérisé en ce que ladite sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous-unité HoxH de la protéine de type [NiFe]- hydrogénase FloxEFUYFI chez / de Synechocystis sp. PCC6803.

De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique présente une activité hydrogénase d’au moins 0,01 mitioI H2 . min ^-1 . mg ^_1 d’enzyme, de préférence d’au moins 0,05 mitioI H2 . min ^-1 . rng ^-1 d’enzyme, préférentiellement d’au moins 10 mitioI H2 . m ¹ . rng ^-1 d’enzyme.

La présente invention porte également sur une cellule hôte incluant un polypeptide monomérique selon l’invention, ledit polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.

Préférentiellement, la présente invention porte sur une cellule hôte incluant un polypeptide monomérique selon l’invention dont la sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous-unité HoxH de la protéine de type [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH chez / de Synechocystis sp. PCC6803.

A titre d’exemple, selon l’invention, la cellule hôte, notamment pour l’expression dudit polypeptide monomérique, peut-être une cellule bactérienne hôte du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia coll), du genre Bacillus (comme par exemple Bacillus subtilis), du genre Streptomyces (comme par exemple Streptomyces coelicolor), du genre Synéchocystis (comme par exemple Synéchocystis sp. PCC6803), du genre Synéchococcus (comme par exemple Synéchococcus WFI8102), ou toute autre cellule procaryote, une cellule eucaryote par exemple du genre Chlamydomonas (comme par exemple Chlamydomonas reinhardtii), du genre Saccharomyces (comme par exemple Saccharomyces cerevisiae), de type Pichia (comme par exemple Pichia pastoris), ou un autre type de cellule eucaryotes.

Selon l’invention, ledit polypeptide monomérique indu dans ladite cellule hôte peut lui-même mais non indispensablement être issu de l’expression d’un gène indu dans un vecteur d’expression, par exemple dans un plasmide inséré dans ladite cellule hôte.

Avantageusement, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique indu dans ladite cellule hôte a une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.

De préférence, selon l’invention, ladite cellule hôte peut inclure un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase, de préférence un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.

Selon l’invention, ledit au moins un facteur de maturation peut être endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte.

Avantageusement, pour une cellule hôte selon l’invention, ledit polypeptide monomérique et/ou ledit au moins un facteur de maturation est/sont issu(s) de l’expression d’au moins un gène indu dans un vecteur d’expression, ledit vecteur d’expression étant indu dans ladite cellule hôte.

La présente invention porte également sur une cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique selon l’invention comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.

Préférentiellement, la présente invention porte sur une cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique dont la sous- unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous- unité HoxH de la protéine de type [NiFe]-hydrogénase FloxEFUYFI chez / de Synechocystis sp. PCC6803.

De préférence, selon l’invention, ledit polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique présente une séquence nucléotidique ayant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences, par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID NO :1 et/ou SEQ ID NO :3.

A titre d’exemple, selon l’invention, la cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique selon l’invention, et étant utilisée notamment pour l’expression dudit polypeptide monomérique, peut être une cellule bactérienne hôte du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia coli), du genre Bacillus (comme par exemple Bacillus subtilis), du genre Streptomyces (comme par exemple Streptomyces coelicolor), une cellule bactérienne photosynthétique du genre Synéchocystis (comme par exemple Synéchocystis sp. PCC6803) ou Synéchococcus (comme par exemple Synéchococcus WFI8102) ou toute autre cellule procaryote, une cellule eucaryote par exemple du genre Chlamydomonas (comme par exemple Chlamydomonas reinhardtii), du genre Saccharomyces (comme par exemple Saccharomyces cerevisiae), de type Pichia (comme par exemple Pichia pastoris), ou un autre type de cellule eucaryotes.

Selon l’invention, ledit polynucléotide indu dans ladite cellule hôte peut lui-même mais non indispensablement être indu dans un vecteur d’expression, par exemple dans un plasmide, inséré dans ladite cellule hôte.

Avantageusement, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique codé par ledit polynucléotide indu dans ladite cellule hôte a une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.

De préférence, selon l’invention, ladite cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique peut inclure un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase, de préférence un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID

NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.

Selon l’invention, ledit au moins un facteur de maturation peut être endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte.

Avantageusement, pour une cellule hôte selon l’invention, ledit polypeptide monomérique et/ou ledit au moins un facteur de maturation est/sont issu(s) de l’expression d’au moins un gène indu dans un vecteur d’expression, ledit vecteur d’expression étant indu dans ladite cellule hôte.

La présente invention porte encore sur un procédé d’obtention, par exemple dans une cellule hôte (par exemple dans E. coli), d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon l’invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

• modification d’un vecteur d’expression, par exemple d’un plasmide, en y incluant un polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase ; et

• incubation dudit vecteur d’expression modifié selon des conditions d’incubation permettant d’assurer une expression dudit polynucléotide exogène pour produire un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]- hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.

Le procédé selon l’invention permet de réaliser une production de la seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.

L’homme de métier est bien entendu à même de définir les conditions d’incubation requises et adéquates.

Selon l’invention, lors de l’étape de modicfication génétique d’une cellule hôte, le polynucléotide peut lui-même mais non indispensablement être indu dans un vecteur d’expression, par exemple dans un plasmide.

Avantageusement, selon l’invention, ladite étape de modification dudit vecteur d’expression consiste en une inclusion dans ledit vecteur d’expression dudit polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour ledit polypeptide monomérique dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.

De préférence, selon l’invention, ladite étape de modification dudit vecteur d’expression peut comprendre l’inclusion dans ledit vecteur d’expression d’un ou de plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase, de préférence d’un ou de plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation. Selon l’invention, lors de l’étape de modification dudit vecteur d’expression, une séquence codant pour un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase peut elle-même mais non indispensablement être incluse dans un vecteur d’expression, par exemple dans un plasmide.

Avantageusement, le procédé selon l’invention comprend une étape subséquente d’isolation et/ou de purification dudit polypeptide monomérique.

En particulier et de préférence, l’invention porte sur un procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase suivant l’invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

• une étape de modification génétique, réalisée in-vivo ou in-vitro, d’une entité comprenant un matériel génétique, par exemple d’une cellule hôte ou d’un vecteur d’expression, pour obtenir une entité génétiquement modifiée, par exemple une cellule hôte génétiquement modifiée ou un vecteur d’expression génétiquement modifié ;

• une étape d’incubation de ladite entité génétiquement modifiée, par exemple de ladite cellule hôte génétiquement modifiée ou dudit vecteur d’expression génétiquement, pour obtenir un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.

Préférentiellement, selon l’invention, ladite étape de modification génétique, réalisée in-vivo ou in-vitro, consiste : a) en une modification génétique d’une cellule hôte et/ou d’un vecteur d’expression en y incluant un polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour un polypeptide monomérique comportant une seule sous- unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, pour obtenir une cellule hôte génétiquement modifiée et/ou un vecteur d’expression génétiquement modifié à incuber lors de ladite étape d’incubation réalisée selon des conditions d’incubation permettant d’assurer une expression dudit polynucléotide exogène pour produire ledit polypeptide monomérique ; ou b) en l’induction d’au moins une mutation génétique dans le matériel génétique d’une cellule hôte pour obtenir une cellule hôte génétiquement modifiée à incuber lors de ladite étape d’incubation réalisée selon des conditions d’incubation pour produire ledit polypeptide monomérique.

L’homme de métier est bien entendu à même de définir les conditions d’incubation requises et adéquates.

Par exemple, selon l’invention, ladite induction d’au moins une mutation génétique est effectuée par recombinaison homologue, méthode bien connue de l’homme de métier.

Avantageusement, selon l’invention, ladite étape de modification génétique de ladite cellule hôte par inclusion d’un polynucléotide exogène consiste en une inclusion dans ladite cellule hôte d’un vecteur d’expression, en particulier d’un vecteur d’expression modifié, incluant ledit polynucléotide exogène.

De préférence, selon l’invention, ladite étape de modification génétique de ladite cellule hôte consiste en une inclusion dans ladite cellule hôte dudit polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour ledit polypeptide monomérique dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.

Avantageusement, selon l’invention, ladite étape de modification génétique de ladite cellule hôte comprend en outre l’inclusion dans ladite cellule hôte d’au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit au moins un facteur de maturation étant endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte, de préférence l’inclusion d’au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et HoxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins

80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID

NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.

De préférence, selon l’invention, ledit au moins un facteur de maturation est issu de l’expression d’au moins un gène indu dans un vecteur d’expression, ledit vecteur d’expression étant indu dans ladite cellule hôte.

Préférentiellement, le procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase suivant l’invention donne lieu à l’obtention d’un polypeptide monomérique dont la sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous-unité HoxH de la protéine de type [NiFe]-hydrogénase FloxEFUYFI chez Synechocystis sp. PCC6803.

La présente invention porte encore sur une utilisation d’un polypeptide monomérique suivant l’invention comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase et étant présent ou non dans une cellule, pour produire ou consommer de l’hydrogène par incubation dudit polypeptide monomérique selon des conditions d’incubation permettant d’assurer une production ou une consommation d’hydrogène.

La présente invention porte encore sur une utilisation d’un polypeptide monomérique suivant l’invention ou d’un polypeptide monomérique obtenu selon le procédé suivant l’invention comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase et étant présent ou non dans une cellule, pour revêtir une surface, en particulier pour revêtir une surface d’un conducteur électrique, par exemple pour revêtir une surface d’une anode ou d’une cathode.

Définitions

Par le terme « polypeptide », il est entendu, au sens de la présente invention, une chaîne unique composée d’un minimum de deux acides aminés liés entre eux par un lien peptidique entre le groupement carboxylique d’un acide aminé et le groupement amine de l’acide aminé suivant. Le terme « polypeptide » inclut également les molécules qui contiennent plus qu’un polypeptide, ceux-ci liés entre eux, par exemple par des ponts disulfures, ou des complexes de polypeptides, ceux- ci liés entre eux par exemple de manière covalente ou non-covalente, et formant un multimère (par exemple un dimère, un trimère, un quadrimère, un pentamère). Un polypeptide peut aussi contenir des ligands non-protéiques, comme par exemple le fer inorganique (Fe), le nickel (Ni), un centre fer-soufre (FeS), ou autre ligand organique comme par exemple le monoxyde de carbone (CO), le cyanure (CN) ou une flavine. Les termes peptide, polypeptide, enzyme, sous-unité ou protéine sont tous inclus dans la définition du polypeptide et ces termes peuvent être interchangeables. La définition de « polypeptide » ne tient pas compte de la longueur dudit polypeptide ni de la façon dont ledit polypeptide est produit.

Par le terme « polypeptide recombinant » ou « polypeptide hétérologue », il est entendu, au sens de la présente invention, un polypeptide qui n’est pas naturellement présent dans l’environnement et/ou qui n’est pas présent naturellement dans la cellule hôte utilisée pour sa production, en particulier dans une cellule hôte, et dont la production est réalisée par des techniques recombinantes, par exemple par ajout de matériel génétique dans une cellule hôte.

Par les termes « polypeptide monomérique », il est entendu, au sens de la présente invention, une chaîne unique composée d’un minimum de deux acides aminés liés entre eux par un lien peptidique entre le groupement carboxylique d’un acide aminé et le groupement amine de l’acide aminé suivant. Par opposition au terme « polypeptide », le terme « polypeptide monomérique » inclut seulement les molécules qui ne contiennent qu’un polypeptide, c’est-à-dire sans interaction avec d’autre polypeptide. Par exemple, il ne s’agit en aucun cas d’un multimère (par exemple un dimère, un trimère, un quadrimère, un pentamère, ...). Un polypeptide monomérique peut aussi contenir des ligands non-protéiques, comme par exemple le fer inorganique (Fe), le nickel (Ni), les centres fer-soufre (FeS), ou autre ligand organique comme par exemple le monoxyde de carbone (CO), le cyanure (CN) ou une flavine. La définition de « polypeptide monomérique » ne tient pas compte de la longueur dudit polypeptide ni de la façon dont ledit polypeptide est produit.

Par les termes « polypeptide monomérique recombinant » ou « polypeptide monomérique hétérologue », il est entendu, au sens de la présente invention, que le polypeptide monomérique n’est pas naturellement présent dans l’environnement, en particulier dans une cellule hôte, et dont la production est réalisée par des techniques recombinante, par exemple par ajout de matériel génétique dans une cellule hôte.

Par les termes « polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase », il est entendu, au sens de la présente invention, que le polypeptide monomérique est apte à catalyser la réaction réversible H2 <® 2H ⁺ + 2e . Cette définition de l’activité hydrogénase n’est pas liée aux conditions expérimentales mais seulement à la production ou la consommation d’hydrogène par l’intermédiaire de l’activité enzymatique de l’hydrogénase.

Par les termes « site actif », il est entendu, au sens de la présente invention, la partie du polypeptide qui, lorsque la structure tertiaire est formée, est responsable de l’activité catalytique dudit polypeptide, par exemple de l’activité hydrogénase. La partie du polypeptide peut comprendre, par exemple, plusieurs portions de la séquence en acides aminés et/ou la liaison avec un ou plusieurs ligands non-protéiques.

Par le terme « polynucléotide », il est entendu, au sens de la présente invention, une chaîne unique composée d’un minimum de deux nucléotides liés entre eux, par exemple par un lien covalent, peu importe qu’il s’agisse de ribonucléotides ou de désoxynucléotides. Cela inclut donc les ARN et les ADN, simple brin ou double brin. La définition de « polynucléotide » ne tient pas compte de la longueur dudit polynucléotide, ni de la fonction, ni de la forme, ni de la façon dont ledit polynucléotide est produit. Un polynucléotide peut être, par exemple, un plasmide, une partie d’un plasmide, un gène ou un fragment de gêne.

Par les termes « polynucléotide exogène », il est entendu, au sens de la présente invention, un polynucléotide qui n’est pas normalement présent dans la cellule hôte. Par exemple, le polynucléotide exogène peut être une séquence codante pour un polypeptide qui n’est pas naturellement présent dans la cellule hôte ou un plasmide.

Par le terme « concaténaire », il est entendu, au sens de la présente invention, un enchaînement de plusieurs séquences afin de n’en former qu’une seule, par exemple de séquences polynucléotidiques ou de séquences polypeptidiques.

Par le terme « plasmide », il est entendu, au sens de la présente invention, une molécule d’ADN double brins distinct de l’ADN chromosomique, exogène, capable de réplication autonome, grâce à sa propre origine de réplication. Le plasmide peut comporter également d’autres séquences d’intérêts, comme par exemple un gène codant pour un facteur de sélection (résistance à un antibiotique, etc), un site de clonage multiple permet l’ajout de polynucléotide, et/ou des séquences de régulation de la transcription. Les termes « plasmide » ou « vecteur d’expression » sont interchangeables.

Par le terme « cellule hôte », il est entendu, au sens de la présente invention, une cellule qui a subi une modification. Cette modification peut par exemple être l’introduction d’un polynucléotide exogène dans la cellule, par exemple par l’intermédiaire d’un plasmide.

Par les termes « facteur de maturation », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule, biologique, ou non, qui participe à la formation de la structure d’une autre molécule biologique, par exemple d’une protéine.

Par les termes « facteur de maturation endogène », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule, biologique, ou non, qui participe à la formation de la structure d’une autre molécule biologique, par exemple d’une protéine, et qui est naturellement présent dans la cellule hôte, c’est-à-dire sans modification génétique de ladite cellule hôte.

Par les termes « facteur de maturation exogène », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule, biologique, ou non, qui participe à la formation de la structure d’une autre molécule biologique, par exemple d’une protéine, et qui n’est pas naturellement présent dans la cellule hôte, c’est-à-dire qu’une modification génétique de ladite cellule hôte est nécessaire pour y ajouter ledit facteur de maturation exogène, par exemple par ajout d’un vecteur d’expression.

Par le terme « isolé », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule qui a été retirée de son environnement naturel, par exemple qui a été retirée d’une [NiFej-hydrogénase naturelle.

Par le terme « purifié », il est entendu au sens de la présente invention, toute molécule qui a été esseulée par l’intermédiaire de techniques biochimiques. Cette définition ne tient pas compte de la façon dont est produite la molécule, par exemple de manière naturel ou par recombinaison, synthétisée chimiquement ou enzymatiquement, ni des techniques biochimiques mises en œuvre pour la purification, comme par exemple une chromatographie d’affinité ou un tamis moléculaire. Par exemple, un polynucléotide, un polypeptide ou IΉ2 peuvent être purifiés. De manière préférentielle, une substance est purifiée lorsqu’elle représente au minimum 60% par rapport aux autres composants qui lui sont associés, préférentiellement 75% par rapport aux autres composants qui lui sont associés, préférentiellement 90% par rapport aux autres composants qui lui sont associés.

Par le terme « homogénéité apparente », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule purifiée représentant minimum 90% par rapport aux autres composants qui lui sont associés.

Par le terme « identité », il est entendu, au sein de la présente invention, une similarité structurelle entre deux polynucléotides ou deux polypeptides. La similarité structurelle est déterminée par un alignement entre les deux séquences, alignement qui optimise le nombre de nucléotides identiques ou le nombre d’acides aminés identiques le long de la séquence. Les trous dans une ou les deux séquences sont permis afin d’optimiser l’alignement et donc la similarité structurelle. Les séquences des nucléotides ou des acides aminés doivent cependant rester les mêmes.

Par les termes « matériel génétique », il est entendu, au sens de la présente invention, le génome d’une entité et plus précisément l’ensemble des acides nucléiques de cette entité, séquences codantes et non-codantes comprises.

Par les termes « mutation génétique », il est entendu, au sens de la présente invention, une modification accidentelle ou provoquée du matériel génétique d’une entité, par exemple d’une cellule hôte ou d’un vecteur d’expression.

Par les termes « entité comprenant un matériel génétique », il est entendu, au sens de la présente invention, une entité qui comprend du matériel génétique selon la définition reprise ci-dessus, par exemple une cellule hôte ou un vecteur d’expression tel qu’un plasmide.

Par les termes « entité génétiquement modifiée », il est entendu, au sens de la présente invention, une entité comprenant du matériel génétique selon la définition reprise ci-dessus et qui a subi une modification de son matériel génétique, par exemple une mutation génétique ou l’introduction d’un polynucléotide exogène dans la cellule, comme par exemple par l’intermédiaire d’un plasmide.

Par les termes « cellule hôte génétiquement modifiée », il est entendu, au sens de la présente invention, une cellule hôte selon la définition reprise ci- dessus et qui a subi une modification de son matériel génétique, par exemple une mutation génétique ou l’introduction d’un polynucléotide exogène dans la cellule, comme par exemple par l’intermédiaire d’un plasmide.

Par les termes « vecteur d’expression génétiquement modifié », il est entendu, au sens de la présente invention, un vecteur d’expression ou un plasmide selon la définition reprise ci-dessus et qui a subi une modification de son matériel génétique, par exemple l’ajout d’une séquence d’intérêts, comme par exemple un gène codant pour un polypeptide particulier.

D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention ressortiront des exemples donnés ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux figures annexées.

La figure 1 illustre la carte du plasmide pET-26b(+) (5360pb).

La figure 2 illustre l’analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d’expression pET26b(+) + HoxH par les enzymes de restrictions Ndel et Blpl.

La figure 3 illustre la carte du plasmide pACYCDuet-1 (4008pb).

La figure 4 illustre l’analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW par les enzymes de restrictions Ncol et Hindi II.

La figure 5 illustre l’analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d’expression pET26b(+) + HoxH, issus de l’ADN plasmidique d’une colonie d’E. coli, par les enzymes de restrictions Ndel et Blpl.

La figure 6 illustre l’analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW, issus de l’ADN plasmidique d’une colonie d’E. coli, par les enzymes de restrictions Ncol et Hindlll.

La figure 7 illustre la méthode de purification de la protéine recombinante d’intérêt HoxH. NA, échantillon non-absorbé sur la colonne d’affinité Ni-NTA. Lavage, échantillon élué avec le tampon de lavage contenant 10mM en Imidazole. 50mM, échantillon élué à une concentration de 50mM en imidazole. 100mM, échantillon élué à une concentration de 100mM en imidazole. 150mM, échantillon élué à une concentration de 150mM en imidazole. 200mM, échantillon élué à une concentration de 200mM en imidazole. 250mM, échantillon élué à une concentration de 250mM en imidazole.

La figure 8 illustre l’analyse par SDS-PAGE de la composition protéique de diverses fractions récoltées lors de la chromatographie d’affinité. Charge, surnageant appliqué sur la colonne d’affinité Ni-NTA et issus de la lyse des cellules de E. coli recombinante ; NA, échantillon non-absorbé sur la colonne d’affinité Ni-NTA. Lavage, échantillon élué avec le tampon de lavage contenant 10mM en Imidazole. M, marqueur de poids moléculaire. 50mM, échantillon élué à une concentration de 50mM en imidazole. 100mM, échantillon élué à une concentration de 10OmM en imidazole. 150mM, échantillon élué à une concentration de 150mM en imidazole. 200mM, échantillon élué à une concentration de 200mM en imidazole. 250mM, échantillon élué à une concentration de 250mM en imidazole.

La figure 9 illustre l’analyse par immuno-détection (Western blot) de la présence de HoxH dans diverses fractions récoltées lors de la chromatographie d’affinité. M, marqueur de poids moléculaire. Charge, surnageant appliqué sur la colonne d’affinité Ni-NTA et issus de la lyse des cellules de E. coli recombinante. NA, échantillon non-absorbé sur la colonne d’affinité Ni-NTA ; 50mM, échantillon élué à une concentration de 50mM en imidazole. 200mM, échantillon élué à une concentration de 200mM en imidazole.

La figure 10 est une représentation schématique de la structure de HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC 6803. HoxE, 19KDa et 1 centre FeS ; HoxF, 57.5KDa, 2 centres FeS et un centre FMN ; HoxU, 26KDa et 4 centres FeS ; HoxY, 20KDa et un centre FeS ; HoxH, 53KDa et le site actif.

La figure 11 est une représentation schématique (flèche grisée) du transfert d’électrons et des interactions attendues avec le NADPH et le methyl- viologène (MV) chez HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC 6803.

La figure 12 est une représentation schématique où le point d’interrogation pose la question de savoir si le site actif de la protéine recombinante HoxH peut accepter ou non les électrons directement du MV et donc produire de l’hydrogène en l’absence de relais redox additionnels.

La figure 13 illustre la mise en évidence de l’activité hydrogénase par la production d’hydrogène qui résulte de l’ajout de la protéine recombinante HoxH à un réactif contenant du methyl-viologène préalablement réduit par du dithionite de sodium en absence d’oxygène. HoxH est capable de prendre les électrons du méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des protons (présents dans le tampon) afin de produire de l’hydrogène selon l’équation H2 <® 2H ⁺ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Le niveau d’hydrogène dissout dans le réactif est mesuré en continu à l’aide d’un micro-senseur (Unisense®, Danemark). La flèche montre le moment où l’ajout de la protéine recombinante HoxH est réalisé, moment concomitant avec l’augmentation du niveau d’hydrogène dissout détecté par le micro-senseur.

La figure 14 illustre la mise en évidence de l’activité hydrogénase par la réduction du benzyl viologène qui résulte de l’ajout de la protéine recombinante HoxH à un réactif contenant du benzyl viologène (BV) en présence d’H2. HoxH est capable de prendre les électrons de l’hydrogène pour les transférer à un médiateur redox, par exemple le benzyl viologène, en même temps que la production de protons selon l’équation H2 <® 2H ⁺ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Le niveau d’hydrogène consommé est équivalent au niveau de benzyl viologène réduit, niveau que l’on peut mesurer en continu par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 578nm.

La figure 15 illustre la mise en évidence de l’activité hydrogénase par la production d’hydrogène qui résulte de l’ajout de la protéine recombinante HoxH, produite en l’absence des facteurs de maturation HupABCDEFHoxW exogènes à E. coli, à un réactif contenant du methyl-viologène préalablement réduit par du dithionite de sodium en absence d’oxygène. HoxH est capable de prendre les électrons du méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des protons (présents dans le tampon) afin de produire de l’hydrogène selon l’équation H2 <® 2H ⁺ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Exemples

1. Construction d’un vecteur d’expression de HoxH 1.1. Séquence « simple » de HoxH

HoxH correspond à la grande sous-unité comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18091.1. Le point isoélectrique théorique de HoxH est de 5,86 pour une masse moléculaire théorique de 52996.53 Daltons. La séquence en nucléotides (1425bp) de HoxH est la suivante et est nommée SEQ ID NO:1 dans le cadre de la présente invention : atgtctaaaaccattgttatcgatcccgttacccggattgaaggccatgccaaaatctcc attttcctcaacgaccagg gcaacgtagatgatgttcgtttccatgtggtggagtatcggggttttgaaaaattttgcg aaggtcgtcccatgtggga aatggctggtattaccgcccgtatttgcggcatttgtccggttagccatctgctctgtgc ggctaaaaccggggataag ttactggcggtgcaaatccctccagccggggaaaaactgcgccgtttaatgaatttaggg caaattacccaatccc acgccctaagttttttccatctcagcagtcctgattttctgcttggttgggacagtgatc ccgctactcgcaatgtgtttggt ttaattgctgctgaccccgatttagctagggcaggtattcggttacggcaatttggccaa acggtaattgaacttttggg agctaaaaaaatccactctgcttggtcagtgcccggtggagtccgatcgccgttgtcgga agaaggcagacaatg gattgtggaccgtttaccagaagcaaaagaaaccgtttatttagccttaaatttgtttaa aaatatgttggaccgcttcc aaacagaagtggcagaatttggcaaatttccctccctatttatgggcttagttgggaaaa ataatgaatgggaacatt atggcggctccctgcggtttaccgacagtgaaggcaatattgtcgcggacaatctcagtg aagataattacgctgat tttattggtgaatcggtggaaaaatggtcctatttaaaatttccctactacaaatctctg ggttatcccgatggcatttatc gggttggtccccttgcccgccttaatgtttgtcatcacattggcaccccggaagcagacc aagaattagaagaatat cggcaacgggctggaggtgtggccacgtcctctttcttttatcattacgcccgcttggtg gaaattcttgcctgtttagaa gccatcgaattgttaatggctgaccctgatattttgtccaaaaattgtcgagctaaggca gaaattaattgtaccgaag cggtgggagtgagcgaagcaccccggggtactttattccaccattacaagatagatgaag atggtctaattaagaa agtgaatttgatcattgccacgggcaacaataacttagccatgaataaaaccgtggccca aattgccaaacactac attcgcaatcatgatgtgcaagaagggtttttaaaccgggtggaagcgggtattcgttgt tatgatccctgccttagttgt tctacccatgcagcgggacaaatgccattgatgatcgatttagttaaccctcagggggaa ctaattaagtccatcca gcgggattaa

La séquence en acides aminés (474 aa) de HoxH est la suivante et est nommée SEQ ID NO:2 dans le cadre de la présente invention : MSKTIVIDPVTRIEGHAKISIFLNDQGNVDDVRFHVVEYRGFEKFCEGRPMWEMA GITARICGICPVSHLLCAAKTGDKLLAVQIPPAGEKLRRLMNLGQITQSHALSFFHL SSPDFLLGWDSDPATRNVFGLIAADPDLARAGIRLRQFGQTVIELLGAKKIHSAWS VPGGVRSPLSEEGRQWIVDRLPEAKETVYLALNLFKNMLDRFQTEVAEFGKFPSL FMGLVGKNNEWEHYGGSLRFTDSEGNIVADNLSEDNYADFIGESVEKWSYLKFP YYKSLGYPDGIYRVGPLARLNVCHHIGTPEADQELEEYRQRAGGVATSSFFYHYA RLVEILACLEAIELLMADPDILSKNCRAKAEINCTEAVGVSEAPRGTLFHHYKIDED GLIKKVNLIIATGNNNLAMNKTVAQIAKHYIRNHDVQEGFLNRVEAGIRCYDPCLSC STHAAGQMPLMIDLVNPQGELIKSIQRD

La figure 1 représente la carte du plasmide pET26b(+) utilisé pour construire le vecteur d’expression de FloxFI par insertion de SEQ ID NO:3 dans pET26b(+). pET26b(+) est un plasmide de 5360pb possédant une origine de réplication pour E. coli, un gène de résistance à la kanamycine, un site de clonage multiple (MCS) contenant de nombreux sites de restriction, le promoteur 77 et le terminateur de transcription T7. Il contient également le gène lad codant pour un répresseur de transcription. Cette répression de la transcription peut être levée par ajout d’IPTG.

1.2. Séquence « optimisée » de HoxH

Optionnellement, selon un mode de réalisation suivant l’invention, les séquences SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:2 sont optimisées pour l’usage des codons chez E. coli. En particulier, les sites de restriction Ndel ( catatg ) et Blpl ( gctnagc ) sont ajoutés respectivement en début et en fin de la séquence de nucléotides pour le clonage dans le plasmide pET26b(+) et la séquence caccaccaccaccatcac (soulignée ci-dessous) est également ajoutée (séquence codant pour l’étiquette poly-histidines proche de l’extrémité N-terminal de la protéine). La séquence de nucléotides optimisée (1453bp) est la suivante et est nommée SEQ ID NO:3 dans le cadre de la présente invention : cafafqaqccaccaccaccaccatcacaaaaccatcqtcatcqacccaqtcacccqcatc qaaqqccacqcca aaattagcatttttctgaacgaccagggcaacgtcgacgacgtccgctttcacgttgttg aataccgtggcttcgaaa aattttgtgaaggtcgtccgatgtgggaaatggccggtatcacggcacgtatttgtggaa tttgtccggtgagccatct gctgtgtgccgcaaaaaccggagataaactgctggcagtgcagattccgccggcaggtga aaaactgcgtcgtct gatgaatctgggtcagattacacagtcgcatgcactgtctttctttcatctgagtagccc agattttctgctggggtggg atagcgacccggcaacacgtaatgtgtttggtctgattgcggctgatccggatctggcgc gtgccggtattcgtctgc gtcagtttggtcagacagttattgagctgctgggggcgaaaaagattcatagtgcatggt ctgtgccgggtggtgttc gtagtccgctgagtgaagaaggtcgtcagtggattgttgatcgtctgccggaggcaaaag aaacggtctatctggc actgaatctgtttaaaaatatgctggatcgtttccagacagaagttgcagaatttggaaa atttccgtcactgtttatgg gtctggttggtaaaaataatgaatgggaacactatggtggtagcctgcgtttcacggact ctgaaggtaatattgttgc ggataatctgagcgaagacaattatgcagattttatcggtgaaagtgtggaaaaatggag ctatctgaaatttccgta ttacaaaagcctgggctatccggatgggatctaccgtgttggaccgctggcacgtctgaa cgtttgtcatcatattggt accccggaagcagatcaggaactggaagaatatcgtcagcgtgcgggtggtgttgcgact agcagctttttttatca ttatgcacgtctggttgaaattctggcctgtctggaggcaattgaactgctgatggcaga tcctgatattctgtctaaaa attgtcgtgcaaaagcagaaattaactgtaccgaggcagttggtgttagtgaggcgccgc gtggtaccctgtttcatc actataaaattgacgaagatggtctgattaaaaaggttaatctgattatcgcaaccggta acaataatctggcaatg aataaaaccgttgcacagattgcaaaacactacattcgcaaccacgatgttcaggaaggg tttctgaatcgtgtag aagccggcattcgctgttatgatccgtgtctgagctgtagcacccatgcagcaggtcaga tgcctctgatgattgacc tggttaatccgcagggtgagctgattaaaagcattcagcgtgattaagcigagc

La séquence en acides aminés (480 aa) optimisée est la suivante et est nommée SEQ ID N0:4 dans le cadre de la présente invention :

MSHHHHHHKTIVIDPVTRIEGHAKISIFLNDQGNVDDVRFHVVEYRGFEKFCEGRP MWEMAGITARICGICPVSHLLCAAKTGDKLLAVQIPPAGEKLRRLMNLGQITQSHA LSFFHLSSPDFLLGWDSDPATRNVFGLIAADPDLARAGIRLRQFGQTVIELLGAKKI HSAWSVPGGVRSPLSEEGRQWIVDRLPEAKETVYLALNLFKNMLDRFQTEVAEF GKFPSLFMGLVGKNNEWEHYGGSLRFTDSEGNIVADNLSEDNYADFIGESVEKW SYLKFPYYKSLGYPDGIYRVGPLARLNVCHHIGTPEADQELEEYRQRAGGVATSS FFYHYARLVEILACLEAIELLMADPDILSKNCRAKAEINCTEAVGVSEAPRGTLFHH YKIDEDGLIKKVNLIIATGNNNLAMNKTVAQIAKHYIRNHDVQEGFLNRVEAGIRCY DPCLSCSTHAAGQMPLMIDLVNPQGELIKSIQRD

Le plasmide pET26b(+) est utilisé pour construire le vecteur d’expression de HoxH par insertion de SEQ ID NO:3 dans pET26b(+).

La figure 2 montre l’analyse de la digestion du vecteur d’expression pET26b(+) + HoxH (SEQ ID NO:3) par les enzymes de restrictions Ndel et Blpl. Deux fragments d’ADN à environ 5300pb (pET26b(+) linéarisé) et à environ 1500pb (séquence HoxH excisé du plasmide pET26b(+)) sont mis en évidence. Ceci confirme la présence de la séquence HoxH d’intérêt dans le vecteur d’expression pET26b(+).

2. Construction du vecteur d’expression d’au moins un facteur de maturation

Au moins les facteurs de maturation suivants sont considérés dans le cadre de la présente invention : HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW.

HypA est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogenase FloxEFUYFI chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18357.1. Le point isoélectrique théorique de HypA est de 4,94 pour une masse moléculaire théorique : 12773,47 Daltons. La séquence en nucléotides (342bp) de HypA est la suivante et est nommée SEQ ID NO:5 dans le cadre de la présente invention : atgcacgaagttagtctgatggagcaaactttggcgatcgccattgcccaggcggaagac catggagccagcca aatccatcgtttaaccctgcgggtggggcaacagtctggggtggtggccgatgccctacg gtttgcgtttgaagtggt gcgacaaaataccatggccgccgaggcgagattggaaattgaagaaattcccgttacctg tcgttgccaacactg ccacgaaaattttcagccagaggattggatttaccgctgtccccactgcgaccagattag ccaaacagtaatggat ggcaaacagttggaactagcatccctagaactgagttga

La séquence en acides aminés (113 aa) de HypA est la suivante et est nommée SEQ ID NO:6 dans le cadre de la présente invention :

MHEVSLMEQTLAIAIAQAEDHGASQIHRLTLRVGQQSGVVADALRFAFEVVRQNT

MAAEARLEIEEIPVTCRCQHCHENFQPEDWIYRCPHCDQISQTVMDGKQLELASL

ELS

HypB est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18312.1. Le point isoélectrique théorique de HyB est de 5,75 pour une masse moléculaire théorique : 31242,97 Daltons. La séquence en nucléotides (858bp) de HypB est la suivante et est nommée SEQ ID NO:7 dans le cadre de la présente invention : atgtgccaaaactgcggttgtagtgcggtgggaaccgttgcccatagccaccatcaccat ggcgatggaaattttgc ccacagccatgatgaccatgaccagcaagaacatcatcaccaccatggcaactacagcaa aagtccaagtcag cagactgtgaccattgaacccgatcgccagtccattgccattggccaaggcattctcagc aagaatgaccgcctag cggaaaggaatcggggctatttccaggctaagggcttactggtgatgaatttcctctctt ctcccggagccggtaaaa ctgctctgatcgaaaaaatggtcggcgatcgacaaaaagaccatcccaccgccgtcattg tgggggatttagcca ccgataacgatgcccaacgtctccgcagtgccggggcgatcgccattcaggtcaccacag gaaatatttgccatct ggaagcggaaatggtggccaaggcggcccaaaagttagatttagacaatatcgatcaatt gatcattgaaaatgtt ggtaatttggtttgccccaccacctatgatctaggggaagatttacgggtcgtattattt tccgtcacagaaggggagg ataaaccccttaaatatcccgccaccttcaaatcagcccaggttattttagtcaccaaac aggacattgccgccgca gtggattttgatgcagagctggcttggcaaaacctacggcaagtggccccccaagcccaa atttttgcagtgtctgc ccgcacggggaaaggattgcagtcctggtatgagtatttggatcaatggcaactccaaca ctattcgccgttggttg atccagcattggcctaa

La séquence en acides aminés (285 aa) de HypB est la suivante et est nommée SEQ ID N0:8 dans le cadre de la présente invention :

MCQNCGCSAVGTVAHSHHHHGDGNFAHSHDDHDQQEHHHHHGNYSKSPSQQ TVTIEPDRQSIAIGQGILSKNDRLAERNRGYFQAKGLLVMNFLSSPGAGKTALIEK MVGDRQKDHPTAVIVGDLATDNDAQRLRSAGAIAIQVTTGNICHLEAEMVAKAAQ KLDLDNIDQLIIENVGNLVCPTTYDLGEDLRVVLFSVTEGEDKPLKYPATFKSAQVI LVTKQDIAAAVDFDAELAWQNLRQVAPQAQIFAVSARTGKGLQSWYEYLDQWQL QHYSPLVDPALA

FlypC est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogenase FloxEFUYFI chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18180.1. Le point isoélectrique théorique de HypC est de 4,20 pour une masse moléculaire théorique : 7987,42 Daltons. La séquence en nucléotides (231 bp) de HypC est la suivante et est nommée SEQ ID NO:9 dans le cadre de la présente invention : atgtgtctagccctacctggccaggttgtcagtttaatgcccaactccgatcccctgtta ctgacgggaaaggttagct ttgggggcatcattaaaaccattagccttgcctacgtacccgaggttaaggtgggggatt acgtgattgtccatgtgg gctttgccattagcattgtggacgaagaggcggcccaggaaactttgatagacttggcag aaatgggagtttaa La séquence en acides aminés (76 aa) de HypC est la suivante et est nommée SEQ ID NO:10 dans le cadre de la présente invention :

MCLALPGQVVSLMPNSDPLLLTGKVSFGGIIKTISLAYVPEVKVGDYVIVHVGFAIS I

VDEEAAQETLIDLAEMGV

FlypD est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase FloxEFUYFI chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA16622.1. Le point isoélectrique théorique de HypD est de 6,31 pour une masse moléculaire théorique de 40632,94 Daltons. La séquence en nucléotides (1125bp) de HypD est la suivante et est nommée SEQ ID NO:11 dans le cadre de la présente invention : atgaaatacgttgatgaatatcgggatgcccaggcggtggcccattaccgtcaggcgatc gccagggagataacc aaaccttggacgctgatggagatttgcggcggccagacccacagcattgtcaaatatggc ttggatgctttgttgccg aagaatttgactctgatccatggtcccggctgtcctgtgtgcgtcactccgatggaatta attgaccaggctttgtggtta gctaagcaaccggagatcattttttgttcctttggcgatatgttgcgggtgcccggcagt ggggcggatttgctgagca ttaaagcccagggcggcgatgtgcgcattgtctattctcctttggattgtttggcgatcg ccagggagaatcctaatcg ggaagtggtatttttcggagtaggttttgaaactacagcccctgccacggccatgactct ccaccaagctagggccc agggaattagcaatttcagtttactttgcgcccatgtattggtgcccccggctatggagg ctttattaggcaatcccaatt ccctcgtgcagggctttttggcggcagggcatgtctgtacggtgaccggggaaagggcct atcaacatatcgctga aaaataccaagtacccattgtcatcactggctttgaacctgtggatattatgcagggcat ctttgcctgtgtgcgccaa ctggagtcgggacaattcacctgcaacaatcaatatcggcgatcggtccaaccccagggc aatgcccatgctcag aaaattattgaccaagtgtttgagccagtcgatcgccattggcggggtttgggattaatt ccggccagcggtttgggttt aaggccagcatttgccccctgggatgccgcagttaaattcgccaatttattgcaaaccat ggccccaacgatggga gaaacagtgtgtattagcggggaaattttacagggacaacggaagcccagcgattgtcca gcctttggtactatctg caccccagaacaacccttgggggctcccatggtttcctcggaaggagcctgtgccgccta ttaccgttatcgccaac aattaccggaaccagtgggagcggccagagtttag

La séquence en acides aminés (374 aa) de HypD est la suivante et est nommée SEQ ID NO:12 dans le cadre de la présente invention : MKYVDEYRDAQAVAHYRQAIAREITKPWTLMEICGGQTHSIVKYGLDALLPKNLTL IHGPGCPVCVTPMELIDQALWLAKQPEIIFCSFGDMLRVPGSGADLLSIKAQGGDV RIVYSPLDCLAIARENPNREVVFFGVGFETTAPATAMTLHQARAQGISNFSLLCAH VLVPPAMEALLGNPNSLVQGFLAAGHVCTVTGERAYQHIAEKYQVPIVITGFEPVD IMQGIFACVRQLESGQFTCNNQYRRSVQPQGNAHAQKIIDQVFEPVDRHWRGLG LIPASGLGLRPAFAPWDAAVKFANLLQTMAPTMGETVCISGEILQGQRKPSDCPA FGTICTPEQPLGAPMVSSEGACAAYYRYRQQLPEPVGAARV

FlypE est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase FloxEFUYFI chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA17478.1. Le point isoélectrique théorique de HypE est de 4,93 pour une masse moléculaire théorique de 36425,60 Daltons. La séquence en nucléotides (1038bp) de HypE est la suivante et est nommée SEQ ID NO:13 dans le cadre de la présente invention : gtgaacttagtctgtcccgttccccttgatcgttatccccaggtactgttagcccacggc ggcggcggtaagttgagcc aacaattacttaagcaaatttttttaccggcctttggcgcttctgaaacgggtagtcatg atgcggcggtttttactgcca accaaagttctttagctttcaccaccgactcctatgtgatcaatcccctcttttttcctg ggggcgatattggttctttggca gtccacggcaccgttaatgacctagccatggccggcgcaacccctcgctatatcagcgtt ggttttatcctcgaaga aggattgcccatggagaccctctggcgggtggcccaatccctagggcaagcggcccaaaa ctgtggggtggaa attcttaccggtgataccaaagtggtggaccggggtaagggagacggcattttcatcaac accagcggcattggtt ccctcgaccatcaacaaactatccatcccaatcaggtacaggtaggcgatcgcctaattt tgagcggtgatttggga cgtcatggcatggccattatggcagtgcgccaaggattagaatttgaaaccaccattgaa agtgattcggccccggt tcacagagaagtgcaggcattattgtcggcagggatcccaatccattgtctgcgggattt aaccagggggggatta gccagtgcggttaatgaaattgcccaaacttccggggtaaccatggctttacgagaaacg ttaatcccggtggagg ccgaagtacaagccgcctgtgaactgttgggttttgaccccctctatgtggccaatgagg gaagattcctggccattg tgcccccggaagcagaacagaagaccgtggaaattttgcaaactttccatccccaagcta cggcgatcggtaca gtaacaggcaaaagtgcacaaaccttggggttagtcagtttggaaagttccattggtgcc ccccggttgctagacat gatcagtggggagcaattaccccgtatttgttag

La séquence en acides aminés (345 aa) de HypE est la suivante et est nommée SEQ ID N0:14 dans le cadre de la présente invention : MNLVCPVPLDRYPQVLLAHGGGGKLSQQLLKQIFLPAFGASETGSHDAAVFTAN QSSLAFTTDSYVINPLFFPGGDIGSLAVHGTVNDLAMAGATPRYISVGFILEEGLP METLWRVAQSLGQAAQNCGVEILTGDTKVVDRGKGDGIFINTSGIGSLDHQQTIH PNQVQVGDRLILSGDLGRHGMAIMAVRQGLEFETTIESDSAPVHREVQALLSAGI PIHCLRDLTRGGLASAVNEIAQTSGVTMALRETLIPVEAEVQAACELLGFDPLYVA NEGRFLAIVPPEAEQKTVEILQTFHPQATAIGTVTGKSAQTLGLVSLESSIGAPRLL DMISGEQLPRIC

FlypF est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase FloxEFUYFI chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA10154.1. Le point isoélectrique théorique de FlypF est de 8,19 pour une masse moléculaire théorique de 85358,25 Daltons. La séquence en nucléotides (2304bp) de HypF est la suivante et est nommée SEQ ID NO:15 dans le cadre de la présente invention : atgttaaaaaccgttgccatacaggtccagggaagggtgcaaggagtgggttttcgtccc tttgtttatacccttgccc aggaaatgggactgaatggttgggtgaataattccactcaaggagctaccgttgtcatta ccgccgacgaaaagg cgatcgccgactttacggagagattaacgaagacattacctccccctggtttgattgaac aattagccgttgaacagt taccgctggaaagttttactaactttactatccgccccagtagtgatggccctaaaactg cgagtattttacccgatttat ccacttgttccgcctgcttaacagaactatttgaccctagcgatcgccgttatctttacc cctttattaactgtacccattg cggtccccgctacaccattattgaagccctaccttacgaccgttgtcgtaccaccatggc taggtttcgccaatgtacc gactgtgaaagggaatataagcaaccaggcgatagacgcttccatgcccaacctaatgcc tgtcctcgctgtggc ccccaactggctttttggaaccgacaaggccaagtaattgcagaagcaaatgaagcttta aactttgctgtagataa tttaaaagtcggcaatattatcgctattaaaggcttaggtggcttccatttgtgttgtga tgccactgattttgaagctgtg gaaaaattaagattaaggaaacatcgaccggataaacctttggcggtaatgtatggtaat cttggtcaaattgtgga gcattaccaacctaataatctagaagttgaattgttacaaagtgccgccgcccctattgt gttattaaacaaaaaaaa acaattaattttggtggaaaatattgccccaggcaacccccgagtcggcgtaatgttagc ctatactcctttgcatcac ttattactaaaaaaattaaagaaacccatggtagctaccagtggtaacttagctggggag caaatttgcattgataat attgacgctttaacccggttacaaaatattgctgacggttttctcgttcatgatcgcccg attgtttgtccagtggatgattc cgttgtccaaatagtagctgggaagccattatttttgcgtcgagcccggggttacgctcc tcaacccattactttacca aagcctactcaaaaaaaactattggcgatgggaggtcattataaaaatacagtggcgatc gccaaacaaaatca agcttacgtcagccaacatttgggcgatttgaattctgctcccacctaccaaaattttga agaagccattgcccattta agccagctatacgatttctctccccaggaaattgttgcagatttacaccctgattatttc agtcatcaatatgctgaaaa ccaagctttgcctgtcacttttgtgcagcatcactatgctcatattttagcggttatggc ggaacatggagttatggagg agtccgtgttaggtattgcttgggatggcactggctacggcatggacggtactatttggg ggggagaatttttaaaaat cacccaaggtacttggcagagaattgctcatctacaaccatttcatttattaggtaatca acaagccattaaatatccc catcggattgctttggcgttgttatggcccacttttggtgatgatttttctgctgattct ttaggaaattggttgaatttcaata atgggtttaaaaacaagataaacagcaggttaaatcaggatctaaacaacaaaaatttac gtcaactttggcaac gagggcaagcaccgctcacttcgagtatgggaagattatttgacggtattgcgacactga taggattgattaacgaa gtaacttttgaaggtcaggcggccatagctctggaagctcagattatgccaaatttaact gaggagtattatcctttga ctctaaacaacaaggaaaaaaaattagctgttgattggcgccccttaattaaagctataa ccacagaagatagaa gcaaaactaacctaatagccactaaattccacaacagtttagtaaatttaattatcacta ttgcccaacagcaggga atcgaaaaagttgctctggggggaggttgctttcaaaattgttatttgcttgccagtacc attactgccctcaaaaaag ctggtttttctcctttgtggcccagagaactaccgcccaacgacggtgccatttgcatgg gtcaactgttagctaaaatt caggctcggcaatatatctgttaa

La séquence en acides aminés (767 aa) de HypF est la suivante et est nommée SEQ ID NO:16 dans le cadre de la présente invention : mlktvaiqvqgrvqgvgfrpfvytlaqemglngwvnnstqgatvvitadekaiadfterl tktlpppglieqlaveqlpl esftnftirpssdgpktasilpdlstcsacltelfdpsdrrylypfincthcgprytiie alpydrcrttmarfrqctdcereyk qpgdrrfhaqpnacprcgpqlafwnrqgqviaeanealnfavdnlkvgniiaikglggfh lccdatdfeaveklrlrkh rpdkplavmygnlgqivehyqpnnlevellqsaaapivllnkkkqlilveniapgnprvg vmlaytplhhlllkklkkp mvatsgnlageqicidnidaltrlqniadgflvhdrpivcpvddsvvqivagkplflrra rgyapqpitlpkptqkkllam gghykntvaiakqnqayvsqhlgdlnsaptyqnfeeaiahlsqlydfspqeivadlhpdy fshqyaenqalpvtfv qhhyahilavmaehgvmeesvlgiawdgtgygmdgtiwggeflkitqgtwqriahlqpfh llgnqqaikyphrial allwptfgddfsadslgnwlnfnngfknkinsrlnqdlnnknlrqlwqrgqapltssmgr lfdgiatliglinevtfegqa aialeaqimpnlteeyypltlnnkekklavdwrplikaittedrsktnliatkfhnslvn liitiaqqqgiekvalgggcfqn cyllastitalkkagfsplwprelppndgaicmgqllakiqarqyic

HoxW est une protéine hypothétique chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA17680.1. Le point isoélectrique théorique de HoxW est de 4,93 pour une masse moléculaire théorique de 17129,53 Daltons. La séquence en nucléotides (474bp) de HoxW est la suivante et est nommée SEQ ID NO:17 dans le cadre de la présente invention : atgccaggccaatccaccaagtccactttaatcatcggttacggcaataccctgcggggg gacgacggcgtggg gcgttacctagcggaagaaattgctcagcaaaactggccccattgtggagttatttccac ccatcaactcaccccag aattggccgaggcgatcgccgctgtggaccgggtaattttcattgatgcccaactgcagg aatcagcaaacgaac catcggtggaagttgtggccttaaaaaccctggaacccaacgaactgtcaggggatttgg ggcaccggggtaatc ccagggaactcttgaccctggctaaaattctctacggcgttgaggtaaaggcttggtggg tgttgattccggccttcac ctttgattatggagagaaattgtctcccctgaccgcccgggcccaagccgaagccttagc ccagatccgccccttg gtattgggggagagataa La séquence en acides aminés (157 aa) de HoxW est la suivante et est nommée SEQ ID N0:18 dans le cadre de la présente invention :

MPGQSTKSTLIIGYGNTLRGDDGVGRYLAEEIAQQNWPHCGVISTHQLTPELAEAI AAVDRVIFIDAQLQESANEPSVEVVALKTLEPNELSGDLGHRGNPRELLTLAKILY GVEVKAWWVLIPAFTFDYGEKLSPLTARAQAEALAQIRPLVLGER

Optionnellement, selon un mode de réalisation suivant l’invention, l’ensemble des facteurs de maturations FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW sont assemblés sous forme d’une séquence nucléotidique concaténaire (6515bp). Cette séquence nucléotidique comporte le site de restriction Ncol ( CCATGG ) en début de séquence et le site de restriction Avril ( CCTAGG ) en fin de séquence pour réaliser le clonage dans le plasmide pACYCDuet-1 . Cette séquence nucléotidique concaténaire est la suivante et est nommée SEQ ID NO:19 dans le cadre de la présente invention : ccaiggcccacgaagttagcctgatggaacagacgctggccattgccattgcgcaggcgg aagaccacggggc gagccaaattcaccgtttaacgctgcgcgttgggcagcagtcgggtgttgttgcagatgc attacgctttgcatttgaa gttgttcgccagaacacaatggctgcagaagcacgtctggaaatcgaggaaattccggtt acctgtcgttgtcagca ttgtcatgaaaattttcagccggaggattggatatatagatgtccccattgtgaccagat tagtcaaaccgttatggac ggcaaacagctggagttagcaagcctggaactgagctaagcatggaaaggaggtcgttat tatgtgccagaactg tgggtgtagcgcggttgggaccgttgcgcatagccaccatcaccacggggatggcaactt tgcgcatagccatga cgaccacgaccagcaggagcaccaccaccaccacggtaactattcaaaatcaccatcaca gcagaccgtaac catagaaccagacagacaaagcatagcaattggccaaggaattctgagcaaaaacgatcg tctggcagaacg caaccgcggctacttccaggccaaaggtctgttagtaatgaatttcctgagcagcccggg agcaggcaaaaccg cactgatcgaaaaaatggttggtgatcgtcagaaagatcatccgaccgcagttattgttg gtgatctggcaaccgat aatgatgcacagcgtctgcgtagcgcaggtgcaattgcaattcaggttaccaccggtaat atttgtcatctggaagc 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gggggggggaagctgagtcagcagctgttaaaacagatttttctgccggcgtttggtgca tcagaaaccggtagcc atgatgcagcagtttttaccgcaaatcagagcagcttagcatttacaacagattcctatg ttatcaatccgctgttttttcc tggtggtgatattggtagtcttgcagttcatggaaccgttaatgatttagcaatggcagg tgcaacaccgcgttatatta gcgttgggtttattctggaggagggtttaccgatggagacactttggcgtgttgcacaaa gcctgggtcaggcagca cagaattgtggagttgaaatattaacaggtgataccaaagttgttgatcgtgggaaggga gatggtatttttattaata catcgggtatcggtagtttagatcaccagcaaaccattcatccgaatcaggttcaggttg gtgatcgtctgattctgag tggggatttaggacggcatggtatggcaattatggcagttcgtcagggcctggaatttga aacaaccattgaaagc gatagcgcaccggttcatcgtgaggttcaggctctgctgagcgcagggattccgattcac tgtctgcgtgacttaaca cgtggtggtctggcaagcgccgtgaacgaaattgcacaaacctcaggtgttacaatggct ctgcgtgaaaccttaat tccggttgaggcggaagttcaagccgcctgtgaactgctgggttttgatcctttatatgt tgcgaacgaaggccgtttcc tggccattgttccgccggaagccgaacagaaaaccgttgaaattctgcagacctttcacc cgcaggcgaccgcaa ttggtaccgttaccggcaagagtgcacagaccttaggtctggttagcctggagagtagca taggtgccccacgtctg ttagatatgattagcggagaacaactgccacgtatttgttaagactccaaaggaggctag attaatgctgaaaaccg ttgccattcaggttcaggggcgcgttcagggggttggttttcggccgtttgtttacacct tagcccaggaaatgggtctg aatggctgggttaataactctacgcagggtgcaaccgttgttattaccgcagatgagaaa gcaattgcagattttacc gaacgtctgaccaaaacactgccgccaccgggactgatcgaacaactggcagtggaacag ctgccgctggaa agctttaccaactttaccattagaccgagtagcgatggtccgaaaaccgcaagcatcctg ccagatctgagcacat gtagcgcctgtctgaccgaattatttgatcccagtgatcgtcgttatctgtaccctttta ttaattgtacccactgtggtcct cgctataccattattgaagcactgccttatgaccgttgtcgtaccacaatggctcgtttt cgtcagtgtacggattgtgaa cgtgaatataagcagccgggggaccgccgttttcatgcacagccaaacgcgtgtccgcgt tgtggtccgcagctg gcattctggaaccgtcagggtcaagttattgcagaagccaatgaagcactgaatttcgca gtagataatttaaaggt cggtaatattatcgcaatcaaaggtctgggtggttttcatttatgttgtgatgcaaccga ttttgaagccgttgaaaaact gcgtttacgtaaacatcgcccggataagccgctggccgttatgtacggtaatctgggtca gattgttgagcattatca gccgaataatttagaagttgagctgctgcagagcgcagcagcacctattgttcttctgaa taaaaagaaacagctg 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atcgcccttaacagcacgtgctcaggccgaagcactggcacagattcgtccgctggttct gggggaacgttaaccf agg

La figure 3 représente la carte du plasmide pACYCDuet-1 utilisé pour construire le vecteur d’expression d’au moins un des facteurs de maturation HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW par insertion de SEQ ID NO:5 et/ou SEQ ID NO:7 et/ou SEQ ID NO:9 et/ou SEQ ID NO:11 et/ou SEQ ID NO:13 et/ou SEQ ID NO:15 et/ou SEQ ID NO:17 et/ou SEQ ID NO:19 dans pACYCDuet-1. pACYCDuet- 1 est un plasmide de 4008pb, possédant une origine de réplication pour E. coli, un gène de résistance au chloramphénicol, deux sites de clonage multiple (MCS) contenant de nombreux sites de restriction, le promoteur T7 et le terminateur de transcription T7. Il contient également le gène lad codant pour un répresseur de transcription. Cette répression de la transcription peut être levée par ajout d’IPTG. La figure 4 montre l’analyse de la digestion du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW (séquence concaténaire SEQ ID NO:19) par les enzymes de restrictions Ncol et Hindlll. Deux fragments d’ADN à environ 6000pb et à environ 4000pb sont mis en évidence, comme attendu pour une telle digestion enzymatique du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW. Ceci confirme la présence de la séquence HypABCDEFHoxW dans le vecteur d’expression pACYCDuet-1 .

3. Introduction des vecteurs d’expressions pET26b(+) + HoxH et pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW chez E. coli.

Les cellules compétentes BL21 (DE3) d’E. coli ont été utilisées pour l’expression recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803. Ces cellules sont utilisées en routine pour la production de protéine recombinante sous le contrôle du promoteur T7.

Les deux vecteurs d’expression « pET26b(+) + HoxH » et

« pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW » ont été introduits dans ces cellules par co transformation selon la méthode traditionnelle du choc thermique bien connue de l’homme de métier. Les transformants présentant la double résistance à la kanamycine (50pg/ml) et au chloramphénicol (25pg/ml) ont été conservés sur milieu gélosé à 4°C.

4. Vérification de la présence des séquences d’ADN d’intérêts chez E. coli.

Il est possible que certaines colonies possèdent les deux plasmides permettant la résistance aux marqueurs de sélections utilisés sans pour autant posséder les séquences d’ADN d’intérêts, à savoir HoxH et HypABCDEFHoxW. Par conséquent, il est important de vérifier la présence de ces séquences d’ADN d’intérêts. Une expérience, bien connue de l’homme de métier et consistant en une extraction de l’ADN plasmidique de la colonie suivie par une digestion enzymatique de cet ADN plasmidique par les enzymes de restrictions utilisés lors de l’insertion des séquences d’ADN d’intérêts dans les plasmides, a été réalisé.

Ainsi, une extraction d’ADN plasmidique, selon un protocole bien connu de l’homme de métier, a été réalisée sur une colonie présentant la double résistance à la kanamycine et au chloramphénicol.

La digestion enzymatique a ensuite été réalisée, selon un protocole bien connu de l’homme de métier. La digestion du vecteur d’expression pET26b(+) + HoxH par les enzymes de restriction Ndel et Blpl donne deux fragments d’ADN, respectivement le plasmide pET26b(+) linéarisé à 5300pb et le fragment d’ADN d’intérêt HoxH à 1500pb (voir figure 5). La digestion du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW par les enzymes de restriction Ncol et Hindi II donne deux fragments d’ADN, respectivement le plasmide pACYCDuet-1 linéarisé à 4000pb et le fragment d’ADN d’intérêt HypABCDEFHoxW à 6500pb (voir la figure 6). Ceci confirme la présence dans la colonie bactérienne de la séquence HoxH et HypABCDEFHoxW, respectivement dans les vecteurs d’expression pET26b(+) et PACYCDuet-1 .

5. Production recombinante et purification par chromatographie d’affinité de HoxH chez E. coli.

Pour obtenir la forme recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]- hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803, une colonie d’E. coli contenant les deux vecteurs d’expressions a été utilisée pour ensemencer 4 erlenmeyers d’un volume de 250ml chacun. Le milieu de culture utilisé est le milieu 2XYT (16g de tryptone, 10g d’extrait de levure, 5g de NaCI par litre) complété par FeAmCi 100mM, NiSC 50mM, cystéine 50mM, kanamycine 50mg/ml et chloramphénicol 25pg/ml. A une densité optique (DO 600nm) de 1.2, 0,2mM IPTG sont ajoutés à la culture afin d’induire la production recombinante de la sous-unité HoxH à 18°C et sous agitation (vitesse d’agitation) de 200rpm. La durée de la production est de 20h à 18°C. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation (15min à 4500rpm) avant d’entamer le processus de purification.

Une méthode de purification a été mise au point afin de confirmer la production de la forme recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]- hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803. Cette méthode (voir figure 7) permet de purifier FloxFI jusqu’à une apparente homogénéité en une seule étape de chromatographie d’affinité. La méthode implique une chromatographie d’affinité avec un métal immobilisé (IMAC). L’agent chélatant est l’acide nitrilotriacetique (NTA) qui permet la liaison entre la phase immobile et l’ion métallique. Le métal immobilisé est le nickel (Ni). Cette chromatographie permet une séparation très spécifique de protéines contenant une étiquette poly-histidines. Après 20 h de production recombinante de HoxH à 18°C, 1 litre de culture d’E. coli est récolté par centrifugation (15min à 4500rpm). Les cellules sont re-suspendues dans 25ml de tampon de lyse (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5300mM KCI + 2mI benzonase + 50mI MgCL 1 M + 1 pastille composée d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases sans EDTA) et ensuite lysées par la presse de French. Le surnageant (25ml) est récupéré par centrifugation (15min à 15000rpm), filtré (0,45miti) et appliqué sur la colonne Ni-NTA (1 ml) préalablement équilibré dans le tampon de lavage (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5 300mM KCI + 10mM imidazole). La colonne est ensuite lavée avec 35ml de tampon de lavage (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5 300mM KCI + 10mM imidazole) jusqu’à ce que l’absorbance à 280nm (représentative de la concentration en protéine) retombe à zéro. L’élution est alors réalisée par l’intermédiaire de 5 paliers avec concentration croissante en imidazole, respectivement 50mM, 100mM, 150mM, 200mM et 250mM) (voir figure 7).

L’analyse SDS-PAGE des diverses fractions obtenues lors de la chromatographie montre une bande prédominante proche de 54kDa, ce qui est la taille attendue pour la sous-unité HoxH, dans les fractions éluées à une concentration de 100mM, 150mM, 200mM et 250mM en imidazole (voir figure 8). HoxH montre par ailleurs un excellent degré de pureté puisqu’aucune bande supplémentaire n’est visualisable dans les fractions éluées à des concentrations de 150mM, 200mM et 250mM en imidazole. Ceci nous permet de conclure que HoxH a été purifié jusqu’à une apparente homogénéité en une seule étape de chromatographie d’affinité. Afin de confirmer qu’il s’agit bien de la forme recombinante de la sous- unité HoxH comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803, une immuno-détection à l’aide d’un anticorps anti étiquette poly-histidines a été réalisée (voir figure 9). Un marqueur de poids moléculaire contenant une protéine marquée d’une étiquette poly-histidines a été ajouté afin de servir de contrôle positif. La protéine recombinante FloxFI est bien détectée dans la charge, c’est-à-dire le surnageant issu de la lyse des cellules d’E. coli et appliqué sur la colonne d’affinité Ni-NTA. La protéine recombinante HoxH est également présente dans la fraction non-absorbée par la colonne Ni-NTA. Cela indique que la capacité de chargement de la colonne Ni-NTA est dépassée et qu’une proportion de la protéine recombinante HoxH n’a pas pu s’y fixer. Aucun signal n’apparait dans la « fraction élution 50mM ». La protéine recombinante HoxH reste accrochée à la colonne Ni-NTA à cette faible concentration en imidazole. Enfin, la présence de la protéine recombinante HoxH est confirmée par immuno-détection dans la fraction 200mM à la taille attendue, c’est-à-dire proche de 54 kDa. Ceci confirme de manière non-ambiguë la purification de la protéine recombinante HoxH en une seule étape de chromatographie d’affinité. Lorsque la protéine recombinante HoxH est mise en évidence par immuno-détection dans une fraction, quelques bandes de faible intensité apparaissent également à des poids moléculaires inférieurs à 54kDa. Il s’agit vraisemblablement de la protéine recombinante HoxH partiellement dégradé à l’extrémité C-terminal. La proportion de protéines recombinantes HoxH dégradées semble minimum car l’analyse SDS-PAGE ne montre pas la présence de ces bandes. Pour rappel, l’immuno-détection est une méthode extrêmement sensible mettant en évidence de très petite quantité de protéine. 6. Mise en évidence de l’activité hydrogénase chez la protéine recombinante HoxH

La faculté d’exprimer de manière recombinante les [NiFej- hydrogénases permet une large gamme de possibilités dans l’optique de produire des formes mutantes aux propriétés très différentes de l’enzyme native. La figure 10 montre la structure de HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC 6803. Le NADPH est le cofacteur de HoxEFUYH in vivo chez Synéchocystis sp. PCC 6803. Le méthyl-viologène (MV) est utilisé comme médiateur redox lors du test standard d’activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases. La figure 11 est une représentation schématique (flèche grisée) du transfert d’électrons et des interactions attendues entre HoxEFUYH et le NADPH et/ou le MV.

Il est généralement acquis de l’homme de métier que le MV peut transmettre directement les électrons à un ou plusieurs centres FeS en évitant le FMN. Cependant, comme illustré à la figure 12, il n’est pas connu à ce jour si la seule sous-unité HoxH, contenant le site actif de la [NiFej-hydrogénases HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC 6803, peut accepter les électrons directement du MV et donc produire de l’hydrogène en l’absence de relais redox additionnel.

Dans le cadre de la présente invention, pour tester cette possibilité, a été mis en oeuvre le test standard d’activité in vitro des [NiFej-hydrogénases en présence de la protéine recombinante HoxH et de MV préalablement réduit par le dithionite de sodium (voir figure 13). HoxH est capable de prendre les électrons du méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des protons présents dans le tampon afin de produire de l’hydrogène selon l’équation H2 <® 2H ⁺ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Ce test standard d’activité in vitro des [NiFej-hydrogénases, selon un protocole bien connu de l’homme de métier, inclut l’utilisation d’une fiole de 2ml fermée par un septum, étanche à l’air et dégazé à l’azote. 1 ml de mélange réactionnel, composé de 100mM de dithionite de sodium et 10mM de MV dissout dans du tampon phosphate 10mM pH 6.8 et également dégazé à l’azote, est ajouté dans la fiole à l’aide d’une seringue. 200pg de protéines recombinantes HoxH sont également ajoutés au mélange réactionnel. La production d’hydrogène démarre dès le moment où les protéines recombinantes HoxH sont ajoutées (moment indiqué par une flèche sur la figure 13). Le contenu en protéines a été déterminé par la méthode Bradford (Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254). La production d’hydrogène est monitorée en continu à l’aide d’un micro-senseur à hydrogène préalablement calibré (Unisense, Aarhus, Danemark).

L’activité de la protéine recombinante HoxH peut donc être calculée puisque la quantité de protéine recombinante HoxH ajoutée (en mg.ml ^_1 ) est connue tout comme la vitesse de dégagement d’hydrogène (pmol H2.min ^_1 ) pour cette quantité spécifique de protéine recombinante ajouté. Cette activité spécifique peut, par exemple, être de 0.1 mitioI H2.min ^_1 .mg ^_1 d’enzyme.

De façon inattendue et surprenante, le fait que la seule sous-unité catalytique HoxH contenant le site actif de la [NiFej-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803 puisse catalyser la réduction des protons, acceptant les électrons d’un médiateur redox (par exemple, le méthyl-viologène) sans l’intermédiaire de centres FeS additionnel servant de relais redox, a été mis en évidence dans le cadre de la présente invention.

Dans le cadre de la présente invention a également été mis en oeuvre le test standard d’activité in vitro des [NiFej-hydrogénases en présence de la protéine recombinante HoxH, de benzyl viologène et d’hydrogène (voir figure 14). HoxH est capable de prendre les électrons de l’hydrogène pour les donner au benzyl viologène, produisant au passage des protons selon l’équation H2 <® 2H ⁺ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Ce test standard d’activité in vitro des [NiFej-hydrogénases, selon un protocole bien connu de l’homme de métier, inclut l’utilisation d’une fiole de 2ml fermée par un septum, étanche à l’air et saturé en gaz hydrogène. 2ml de mélange réactionnel, composé de 40pmoles de benzyl viologène dissout dans du tampon Tris 50mM pH 7.6 et également dégazé à l’hydrogène, est ajouté dans la fiole à l’aide d’une seringue. L’expérience est réalisée à 40°C. 340pg de protéines recombinantes HoxH sont également ajoutés au mélange réactionnel. La consommation de l’hydrogène et donc la réduction du benzyl viologène démarre dès le moment où les protéines recombinantes HoxH sont ajoutées. Le contenu en protéines a été déterminé par la méthode Bradford (Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254). La réduction du benzyl viologène est monitorée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 578nm. Un coefficient d’extinction molaire de 8.600 M ^_1 cm ^-1 a été pris en compte.

L’activité de la protéine recombinante HoxH peut donc être calculée puisque la quantité de protéine recombinante HoxH ajoutée (en mg.ml ^-1 ) est connue tout comme la vitesse de consommation d’hydrogène (pmol H2.min ^_1 ), équivalente à la vitesse de réduction du benzyl viologène pour cette quantité spécifique de protéine recombinante ajoutée. Cette activité spécifique peut, par exemple, être de 0.1 mitioI H2.min ^_1 .mg ^·1 d’enzyme.

De façon inattendue et surprenante, le fait que la seule sous-unité catalytique HoxH contenant le site actif de la [NiFej-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803 puisse catalyser l’oxydation de l’hydrogène, produisant des protons et donnant les électrons à un médiateur redox (par exemple, le benzyl viologène) sans l’intermédiaire de centres FeS additionnel servant de relais redox, a été mis en évidence dans le cadre de la présente invention.

En l’absence de l’expression des autres sous-unités du pentamère HoxEFUYH, les problèmes inhérents à l’état de la technique sont solutionnés au moins en partie : la protéine recombinante HoxH est capable à elle seule de catalyser la réduction des protons, acceptant les électrons d’un médiateur redox (par exemple le méthyl-viologène) sans l’intermédiaire de centres FeS additionnel servant de relais redox. La protéine HoxH est également capable à elle seule de catalyser l’oxydation de IΉ2, réduisant un médiateur redox (par exemple le benzyl viologène) sans l’intermédiaire de centre FeS additionnel servant de relais redox. Cette caractéristique exceptionnelle démontre le grand avantage de la présente invention, en particulier la production recombinante d’une seule sous-unité possédant le site actif d’une [NiFej-hydrogénase et étant catalytiquement active. 7. Production recombinante, purification par chromatographie d’affinité et mise en évidence de l’activité hydrogénase chez la protéine recombinante HoxH produite de manière recombinante chez E. coli en l’absence des facteurs de maturation exogène

De manière semblable à l’exemple 3 ci-dessus, le vecteur d’expression pET26b(+) + HoxH est introduit chez E. coli (cellules compétentes BL21 (DE3)) par transformation selon la méthode traditionnelle du choc thermique bien connue de l’homme de métier, et cela en l’absence du vecteur d’expression pACYCDUET-1 + HypABCDEFHoxW. Les transformants présentent la résistance à la kanamycine (50pg/ml).

De manière semblable à l’exemple 4 ci-dessus, la présence de la séquence d’ADN d’intérêts HoxH a été vérifiée par l’enchainement des expériences bien connues de l’homme de métier que sont l’extraction d’ADN plasmidique et la digestion enzymatique.

De manière semblable à l’exemple 5 ci-dessus, la protéine HoxH a été produite de manière recombinante chez E. coli, mais en absence du plasmide pACYCDUET-1 + HupABCDEFHoxW codant pour les facteurs de maturation exogènes HupABCDEFHoxW. La protéine HoxH a ensuite été purifiée par chromatographie d’affinité, de manière semblable à l’exemple 5 ci-dessus.

De manière semblable à l’exemple 6 ci-dessus, l’activité hydrogénase de la protéine HoxH produite de manière recombinante chez E. coli en l’absence des facteurs de maturation exogène a été mise en évidence selon le protocole impliquant le MV et bien connu de l’homme de métier

Ainsi, dans le cadre de la présente invention a été mis en oeuvre le test standard d’activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases en présence de la protéine recombinante HoxH et de MV préalablement réduit par le dithionite de sodium (voir figure 15). HoxH est capable de prendre les électrons du méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des protons présents dans le tampon afin de produire de l’hydrogène selon l’équation H2 <® 2H ⁺ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Ce test standard d’activité in vitro des [NiFe]- hydrogénases, selon un protocole bien connu de l’homme de métier, inclut l'utilisation d’une fiole de 2ml fermée par un septum, étanche à l’air et dégazé à l’azote. 1 ml de mélange réactionnel, composé de 10OmM de dithionite de sodium et 10mM de MV dissout dans du tampon phosphate 10mM pH 6.8 et également dégazé à l’azote, est ajouté dans la fiole à l’aide d’une seringue. 750pg de protéines recombinantes HoxH sont également ajoutés au mélange réactionnel. La production d’hydrogène démarre dès le moment où les protéines recombinantes HoxH sont ajoutées (moment indiqué par une flèche sur la figure 15). Le contenu en protéines a été déterminé par la méthode Bradford (Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254). La production d’hydrogène est monitorée en continu à l’aide d’un micro-senseur à hydrogène préalablement calibré (Unisense, Aarhus, Danemark).

L’activité de la protéine recombinante HoxH peut donc être calculée puisque la quantité de protéine recombinante HoxH ajoutée (en mg.ml ^_1 ) est connue tout comme la vitesse de dégagement d’hydrogène (pmol H2.min ^_1 ) pour cette quantité spécifique de protéine recombinante ajouté. Cette activité spécifique peut, par exemple, être de 0.1 mitioI H2.min ¹ .mg ¹ d’enzyme.

A été mis en évidence, dans le cadre de la présente invention, le fait que la seule sous-unité catalytique HoxH contenant le site actif de la [NiFe]- hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803 peut catalyser la réduction des protons, acceptant les électrons d’un médiateur redox (par exemple, le méthyl-viologène) sans l’intervention des facteurs de maturation HupABCDEFHoxW exogènes à E. coli.

La présente invention a été décrite en relation avec des modes de réalisations spécifiques, qui ont une valeur purement illustrative et ne doivent pas être considérés comme limitatifs. D’une manière générale, il apparaîtra évident pour l’homme du métier que la présente invention n’est pas limitée aux exemples illustrés et/ou décrits ci-dessus.

L’usage des verbes « comprendre », « inclure », « comporter », ou toute autre variante, ainsi que leurs conjugaisons, ne peut en aucune façon exclure la présence d’éléments autres que ceux mentionnés.

L’usage de l’article indéfini « un », « une », ou de l’article défini « le », « la » ou « », pour introduire un élément n’exclut pas la présence d’une pluralité de ces éléments.