Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, генной и белковой инженерии, к нанотехнолическим применениям модифицированных жгутиков археи H. sаliпаrит для формирования активных поверхностей на гибких и твердых подложках или капсулах в области электроники, диагностики, медицины и очистки окружающей среды. Уровень техники

Создание эффективных поверхностей для формирования гибких, твердых и капсулированных покрытий используемых в области электроники, диагностики, медицины и очистки окружающей среды является актуальной задачей.

К устройствам, содержащим покрытия можно отнести сенсорные датчики

[1], компоненты для создания элементов электроники, аккумуляторов, [2], покрытие биологических и медицинских устройств, требующих отсутствия агрессивных химических компонентов [3], компоненты покрытий или композиций в составе фармакологических препаратов [4].

Известны изобретения, в которых в качестве элементов покрытий используют биологические материалы, созданные на основе пептидов [4] или вирусов [2, 5-9]. С целью формирования развитой поверхностной структуры используют вирусы, на поверхности которых иммобилизуют как частицы неорганических веществ, так и ионы металлов [5-10]. В частности наноматериалы, выполненные на основе вируса Ml 3 успешно используются для формирования электродов литий-ионных аккумуляторов. В практике создания поверхностей с развитой поверхностной структурой особое внимание уделяется вариантам, которые включают белковые структуры, содержащие аминокислоты способные связывать ионы металлов [5-15]. Выбор биологических материалов для создания наноструктур с развитой поверхностью, обеспечивающих работу и сохранение биологически активных зон, является не простой задачей.

Известны некоторые применения материалов выполненных на основе жгутиков архей. Эти материалы обладают достаточными адгезивными свойствами и могут быть использованы для создания молекулярных клеев. В изобретении [3] рассматриваются вопросы получения клеевых материалов, содержащих, по меньшей мере, один белок, полученный из жгутиков архей. В заявке показано, что белки жгутика (флагеллины) архей хорошо прилипают не только к органическим материалам, например к клеточной стенке, но также и к поверхностям, выполненным из неорганических материалов, таких как металлы, пластмассы и кварц. Следует отметить, что не все флагеллины обладают такой возможностью [16]. Для H. sаliпаrит, в качестве примеров флагеллинов, перечисленных в заявке на изобретение [3], фигурируют только FIaBl и FlaB2, которые являются не основными белками жгутика, а выполняют связующую роль между клеточным мотором и протяженной спиральной нитью жгутика, состоящей из А-флагеллинов [17]. В уровне техники не найдено примеров получения наноструктурированного материала на основе жгутиков H. sаliпаrит. В публикаци [19], относящейся к изучению общих свойств флагеллинов Al и A2 , входящих в состав жгутика, нет связи между исследуемыми физико-химическими параметрами флагеллинов и характеристиками наноматериалов.

Для многих применений в области электроники, диагностики, медицины и очистки окружающей среды требуются разные типы наноструктурированного материала. Волокнистый наноматериал используют при создании фильтров. Материал, выполненный на основе коротких нанотрубок, обеспечивает возможность получения максимальной площади с контактируемой поверхностью нанотрубок. Такие покрытия особенно актуальны при построении биосенсоров и устройств для преобразования электрической энергии.

Целью настоящего изобретения является расширение типов покрытий с развитой наноструктурной поверхностью для формирования активных поверхностей на гибких и твердых подложках или капсулах с использованием жгутиков архей, на основе которых можно обеспечить нековалентное связывание широкого перечня веществ, таких как: ионы металлов, наночастицы металлов, полупроводники и другие лиганды, для формирования поверхностей сенсоров, пластин аккумуляторов, нетканых материалов и других материалов с новыми свойствами.

Следующей целью изобретения является повышение эффективности наноструктурной поверхности за счет формирования либо волокнистой структуры которая содержит более 50% жгутиков архей длиной более 1000 нм, либо кластерной структуры выполненной на основе фрагментов жгутиков, содержащей более 50% жгутиков длиной менее 500 нм с повышенной плотностью упаковки наноструктур, либо комбинации из волокнистой структуры и кластерной структуры наноматериалов. Сущность изобретения

Одним из объектов изобретения является способ получения наноструктурного материала на основе модифицированных жгутиков археи H. sаliпаrит, имеющих сайты для связывания ионов металлов или наночастиц. Способ включает трансформацию клеток архей рекомбинантной плазмидой, выращивание клеток, выделение жгутиков и модификацию поверхности жгутиков. Конструкция плазмиды содержит рекомбинантные гены флагеллинов Al и A2, формирующих жгутик, при этом аминокислотная последовательность флагеллина Al или флагеллина A2 или последовательности флагеллина Al и флагеллина A2 содержат по меньшей мере одну пептидную вставку для избирательного связывания ионов металлов или наночастиц, где место пептидной вставки в флагеллине Al определяют в области между первым и вторым сайтами N- гликозилирования, расположенной между поз. 86 и поз. 96 SEQ ID NO: 2, а место пептидной вставки в флагеллине A2 определяют в области между первым и вторым сайтами N-гликозилирования, расположенной между поз. 82 и поз. 92 SEQ ID NO:3.

Длина пептидной вставки составляет от 5 до 60 аминокислот. Вставка может быть выполнена за счет комбинирования нескольких коротких последовательностей с общей длиной до 60 аминокислот. Последовательность пептидной вставки выбирают таким образом, чтобы она нековалентно связывала ионы металлов выбираемых из группы в которую входят: кобальт, ванадий, никель, марганец, железо, кадмий, вольфрам, хром, цирконий, титан, скандий, иттрий, медь, кальций, алюминий, барий, бериллий, магний, и стронций и/или наночастицы металлов выбираемых из группы состоящей из золота, платины, серебра, палладия или наночастицы обладающие полупроводниковыми свойствами: например, ZnS, CdS, а также наночастицы обладающие магнитными свойствами, например, FePt, CoPt.

После выделения жгутиков осуществляют модификацию поверхности жгутиков для формирования волокнистого наноматериала. В другом варианте способа проводят фрагментацию жгутиков с последующим проведением модификации поверхности фрагментов жгутиков и одновременным формированием кластерной структуры наноматериала. Модификацию осуществляют металлическими, полупроводниковыми, магнитными наночастицами или ионами металлов с последующей минерализацией. Другим объектом изобретения является многофункциональный наноматериал содержащий волокнистую структуру, выполненную на основе модифицированных жгутиков археи H. sаliпаrит для формирования активных поверхностей. Многофункциональный наноматериал содержит жгутики из флагеллина Al с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, и флагеллина A2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, при этом дополнительно в последовательность флагеллина Al или флагеллина A2 или в последовательности флагеллина Al и флагеллина A2 включена пептидная вставка длиной от 5 до 60 аминокислот для связывания с ионами металлов или наночастицами. Наноматериал выполнен в виде волокнистой структуры, которая содержит более 50% жгутиков архей длиной более 1000 нм, поверхность которых имеет сайты, в которых связаны ионы металлов или металлические, полупроводниковые, магнитные наночастицы, при этом жгутики дополнительно связаны друг с другом и с подложкой за счет адгезивных свойств жгутиков. Другим объектом изобретения является многофункциональный наноматериал содержащий кластерную структуру на основе модифицированных жгутиков археи H. sаliпаrит для формирования активных поверхностей.

Многофункциональный наноматериал содержит связанные друг с другом фрагменты жгутиков, состоящие из флагеллина Al с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, и флагеллина A2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3. При этом дополнительно в последовательность флагеллина Al или флагеллина A2 или в последовательности флагеллина Al и флагеллина A2 включена пептидная вставка длиной от 5 до 60 аминокислот для связывания с ионами металлов или наночастицами. Наноматериал выполнен в виде кластерной структуры содержащей более

50% фрагментов жгутиков длиной менее 500 нм и имеющих сайты, в которых связаны ионы металлов или металлические, полупроводниковые, магнитные наночастицы. При этом кластерная структура наноматериала осуществляет возможность связывания отдельных кластеров диаметром от 500 нм с подложкой и друг с другом за счет адгезивных свойств жгутиков.

Следующими объектом изобретения является покровный материал, для формирования наноструктурированного покрытия пластин, пленок, капсул, текстильного материала, содержащий композицию наноматериалов из волокнистой структуры и кластерной структуры, включающий, по меньшей мере, один тип модифицированного жгутика археи H. sаlϊпаrит.

Перечень фигур

На фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность флагеллина Al . Последовательности сайтов N-гликозилирования выделены цветом.

На фиг. 2 представлена аминокислотная последовательность флагеллина A2. Последовательности сайтов N-гликозилирования выделены цветом.

На фиг. 3 представлены нуклеотидная и аминокислотная последовательности гена флагеллина Al и кодируемого им белка в области вставок, а также последовательности самих вставок. Последовательности сайтов N-гликозилирования подчеркнуты. Где:

101 - участок последовательности гена флагеллина Al, кодирующий 1 и 2 сайты гликозилирования и участок между ними;

102 - место, по которому эндонуклеаза рестрикции ВstХI разрезает ген Al- флагеллина;

103 - схематическое изображение олигонуклеотидной вставки, предназначенной для встраивания в последовательность гена флагеллина Al по сайту ВstХI;

104 изображение олигонуклеотидной вставки, кодирующей FLАG-пептид и предназначенной для встраивания в последовательность гена флагеллина Al по сайту ВstХI.

На фиг. 4 представлены нуклеотидная и приведенная в соответствие к ней аминокислотная последовательность флагеллина A2 в области вставок после введения сайта эндонуклеазы рестрикции АsuNНI, а также последовательности самих вставок. Последовательности сайтов N-гликозилирования подчеркнуты. Где:

201 - участок последовательности гена флагеллина A2 с введенным сайтом для АsuNНI, кодирующий 1 и 2 сайты гликозилирования и участок между ними;

202 - место, по которому эндонуклеаза рестрикции АsuNНI разрезает ген флагеллина A2; 203 - схематическое изображение олигонуклеотидной вставки, предназначенной для встраивания в последовательность гена флагеллина A2 по сайту АsuNНI;

204 - изображение олигонуклеотидной вставки, кодирующей FLАG-пептид и предназначенной для встраивания в последовательность гена флагеллина A2 по сайту АsuNНI;

205 - изображение олигонуклеотидной вставки, кодирующей золото-связывающий пептид и предназначенной для встраивания в последовательность гена флагеллина A2 по сайту АsuNНI.

На фиг. 5. представлено электронно-микроскопическое изображение жгутиков H. sаliпаrит: (А) дикий тип, (Б) модифицированные жгутики со вставкой в Al- флагеллин FLАG-пептида, (В) модифицированные жгутики со вставкой в A2- флагеллин FLАG-пептида. Препараты были мечены специфичными антителами и конъюгатами белка А с частицами коллоидного золота (10 нм). Негативное контрастирование уранил ацетатом. Масштабная линейка - 300 нм. На фиг. 6. представлена схема минерализации жгутиков H. sаliпаrит, модифицированных вставкой в Al- или A2-, или Al- и A2-флaгeллины, способной связывать ионы металлов. Где: 301 - жгутик, 302 - ион металла (Co ²⁺ , Cu ⁺ и т.п.), 303 - жгутик, связавший на своей поверхности ионы металла, 304 - частица оксида металла, 305 - наноструктурный материал, представляющий собой жгутик, покрытый частицами оксидов металлов.

На фиг. 7. представлено электронно-микроскопическое изображение жгутиков H. sаliпаrит: (А) дикого типа, которые были минерализованы оксидом кобальта. Представлены в качестве отрицательного контроля; (Б) модифицированные жгутики со вставкой в Аl-флагеллин FLАG-пептида, которые были минерализованы оксидом кобальта; (В) модифицированные жгутики со вставкой в Аl-флагеллин FLАG-пептида, которые были минерализованы оксидом меди. Негативное контрастирование проведено уранил ацетатом. Масштабная линейка - 300 нм.

На фиг. 8. представлено электронно-микроскопическое изображение жгутиков со вставкой в Аl-флагеллин FLАG-пептида, обработанных ультразвуком частотой 44 кГц в течение 20 мин. Негативное контрастирование уранил ацетатом. Масштабная линейка - 100 нм.

На фиг. 9. представлена схема минерализации жгутиков H. sаliпаrит, модифицированных вставкой в Al- или A2-, или Al- и A2-флaгeллины, способной связывать ионы металлов, и обработанных ультразвуком. Схема показывает принцип образования кластеров, представленных центральной частью из плотно упакованных частиц оксида металла с модифицированными частями фрагментов жгутиков и наружней частью из немодифицированных окончаний фрагментов жгутиков. Обозначены: 302 - ион металла (Co ²⁺ , Cu ²⁺ и т.п.); 304 - частица оксида металла; 306 - обработанные ультразвуком жгутики; 307- обработанные ультразвуком жгутики, связавшие ионы металлов; 308 - кластер, центральная часть которого состоит из плотно упакованных частиц оксида металла с модифицированными частями фрагментов жгутиков, а наружная часть из немодифицированных окончаний фрагментов жгутиков; 309 немодифицированные окончания фрагментов жгутиков в кластерах, с помощью которых кластеры могут прилипать друг к другу или к подложке; 310 - подложка.

На фиг. 10 представлено электронно-микроскопическое изображение наноструктурного материала, полученного на основе предварительно обработанных ультразвуком в течение 20 мин при 44 кГц жгутиков со вставкой в Аl-флагеллин FLАG-пептида и минерализованных оксидом кобальта. Негативное контрастирование уранил ацетатом. Масштабная линейка - 300 нм

На фиг. 11 представлено изменение разрядной емкости электродов на основе: 1) оксида кобальта, нанесенного на электрод без добавления жгутиков; 2) наноструктурного материала на основе жгутиков со вставкой в Аl-флагеллин FLАG-пептида и минерализованных оксидом кобальта; 3) наноструктурного материала полученного на основе предварительно обработанных ультразвуком (частотой 44 кГц в течение 20 мин) жгутиков со вставкой в Аl-флагеллин FLАG- пептида и минерализованных оксидом кобальта. Циклирование проводилось в IM LiPF ₆ в смеси этиленкарбонат-диэтилкарбонат-д иметил карбонат (1 :1 : 1, далее ЭК- ДЭК-ДМК) током 20 мА/г Co ₃ O ₄ . Описание

Исследование свойств натуральных волокнистых (протяженных) жгутиков H. sаliпаrит (диаметром 12 нм и длиной несколько микрометров), собранных из флагеллинов Al и A2 «дикoгo типa» (без генно-инженерных вставок), показало, что жгутики из таких флагеллинов обладают адгезивными свойствами к поверхности металлов, пластмасс и других материалов. Однако такие жгутики обладают низкой эффективностью связывания на своей поверхности ионов металлов, что не позволяет использовать жгутики из флагеллинов дикого типа для создания наноматериалов с заданными свойствами. Для получения наноструктурированного материала с заданными свойствами полимерной структуре жгутика, состоящего из Al- и A2-флaгeллинoв необходимо придать свойство специфично связывать металлические, полупроводниковые, магнитные наночастицы или ионы связывать металлов для последующей минерализации поверхности.

Известно, что возможность полимеризации белков Al и A2 в жгутик определяется характером межатомных связей, который зависит от состава первичной аминокислотной последовательности и типа укладки в 3-х мерную (третичную) структуру. Однако, разрешенной третичной структуры для жгутиков архей на сегодняшний момент нет, и как следствие, нет и информации об участках полипептидной цепи флагеллина, которые бы в собранном жгутике формировали его поверхность. Поэтому для получения жгутиков с измененной поверхностью необходимо было решить неочевидную задачу и выбрать в последовательностях флагеллинов участки, пригодные для включения в них пептидных вставок, с возможностью их последующей модификации ионами металлов или с возможностью последующего связывания наночастиц. При этом должны быть сохранены структурные механизмы, обеспечивающие полимеризацию флагеллинов Al и A2 в жгутик, а для проведения эффективной модификации вставок необходимо обеспечить выведение пептидных вставок на внешнюю поверхность сформированного жгутика. В результате получают комбинированный наноструктурированный материал волокнистой структуры, содержащий нити модифицированных жгутиков.

Известно, что флагеллины Al и A2 формирующие жгутики H. sаliпаrит N- гликозилированы, при этом каждый флагеллин содержит до 3-х сайтов гликозилирования (последовательности NXT, NXS) [17, 18].

В процессе изучения свойств жгутиков, был обнаружен неочевидный факт того, что введение коротких пептидных вставок длиной от 5 до 60 аминокислот в участки, расположенные между сайтами гликозилирования флагеллинов Al и/или A2 , не влияет на формирование структуры жгутиков, а сами пептидные вставки при синтезе жгутиков остаются экспонированными на внешней поверхности жгутиков, что дает возможность для эффективного нековалентного связывания аминокислот, входящих в состав вставок с ионами и наночастицами металлов. В общем случае способ получения наноструктурированного материала на основе рекомбинантных жгутиков архей H. sаliпаrит, имеющих множество сайтов для связывания ионов металлов или наночастиц состоит из следующих стадий: А) Выделяют фрагмент ДНК, кодирующий флагеллины Al и A2, последовательность которого определена SEQ ID NO: 1 :

Б) Выбирают участки для введения по меньшей мере одной пептидной вставки в аминокислотные последовательности флагеллина Al и/или A2. При этом участок пептидной вставки в флагеллине Al соответствует области между первым и вторым сайтом гликозилирования, расположенной между поз. 86 и поз. 96 SEQ ID NO: 2, а участок пептидной вставки в флагеллине A2 соответствует области между первым и вторым сайтом гликозилирования, расположенной между поз. 82 и поз. 92 SEQ ID NO:3.

В) Выбирают по меньшей мере один тип эндонуклеазы рестрикции для разрезания последовательности генов в выбранном месте участка для введения пептидной вставки;

Г) Выбирают длину и последовательность по меньшей мере одной пептидной вставки, где длина вставки составляет от 5 до 60 аминокислот, предпочтительно 8- 40 , более предпочтительно от 8 до 20. Д) Выбирают тип плазмиды и формируют генетическую конструкцию плазмиды на основании п. п. А-Г;

E) Создают штамм путем трансформации выбранных клеток плазмидой по п.д), выращивают клетки и осуществляют последующее выделение жгутиков из культуральной среды. Ж) Осуществляют выбор типа наноструктурированного материала, который выбирают из группы состоящей из: волокнистого материала, где длина более 50% жгутиков волокнистого материала составляет более 1000 нм. , наноструктурированного кластерного материала, где длина более 50% жгутиков, входящих в кластерных структуры составляет менее 500 нм. или их комбинации. 3) Осуществляют модификацию жгутиков для формирования волокнистого наноматериала или фрагментирование жгутиков с последующей модификацией поверхности фрагментов и одновременным формированием кластерной структуры получаемого наноматериала. И) Проводят выделение, сушку и хранение модифицированных жгутиков, предназначенных для формирования многофункциогнального наноматериала. Выделение ДНК кодирующей флагелин.

Для выделения тотальной ДНК из H. sаliпаrит, а также выделения плазмидной ДНК из E. соli используют стандартные методы, описанные в [24], либо коммерческие наборы для осуществления подобных процедур. Тотальную

ДНК H. sаliпаrит используют в качестве матрицы для наработки ПЦР-фрагментов

А-флагеллинового оперона с фланкирующими участками.

Выбор типа плазмиды и ее генетической конструкции. Рекомбинантная плазмидная ДНК рNХА имеет размер молекулы около

11000 п. о. и содержит клонированный А-флагеллиновый оперон H. sаliпаrит, содержащий области Al- и A2- генов флагеллина по сайтам клонирования Хbаl и НiпdΙII. Данная плазмида получена на основе плазмиды рNХ [19] путем клонирования ПЦР фрагмента А-флагеллинового оперона H. sаliпаrит, при этом длина клонированного фрагмента составляет около 2400 пар нуклеотидов (SEQ ID NO: 1). Плазмида содержит ген устойчивости к ампициллину (АmрR) и ген устойчивости к новобиоцину (NоvR). В плазмиде также содержится ген галофильной β-галактозидазы (bgаН). Ген АmрR и бактериальный сайт инициации репликации позволяют наращивать данную плазмиду и ее модификации в клетках E. соli. Ген NоvR обеспечивает устойчивость трансформированных клеток архей к новобиоцину, продукт гена bgаН позволяет трансформированным клеткам приобретать синюю окраску продуктами разложения коммерческого субстрата X- GaI, что служит дополнительным маркером для подтверждения трансформации. В плазмиде отсутствует галоархейный сайт инициации репликации. Это приводит к тому, что при трансформации плазмидой устойчивость к новобиоцину клетки архей приобретают только в случае встраивания плазмиды в хромосому по механизму гомологичной рекомбинации. В конструкции плазмиды около 1200 п. о. в сумме составляют Al- ген флагеллина, представленный на Фиг. 2 (SEQ ID NO: 2) и A2 ген флагеллина, представленный на Фиг. 3 (SEQ ID NO: 3), а также левый (около 600 п.о.) и правый (400 п. о.) фланкирующие участки A- флагеллинового оперона [26]. Кроме того гены Al и A2 разделяет межгенный промежуток длиной 11 пар нуклеотидов. Фрагмент ДНК А-флагеллинового оперона наработан праймерами:

5'-GTCGGTGCTCTAGACGTCGGGGATCGG-3' (SEQ ID NO: 4) З'-ТСАСGАТGСАААGСТТССАТСАGТАСGG-З ¹ (SEQ ID NO: 5) с помощью ПЦР. Фрагмент клонирован в плазмиду по сайтам рестрикции НiпdΙII и Хbаl. В зависимости от вариантов генетической конструкции плазмиды в область Al -гена, либо A2- гена либо одновременно в области Al- и A2- гена вводят последовательность, кодирующую пептидную вставку.

Выбор области в аминокислотной последовательности флагеллина для введения пептидной вставки.

Введение пептидных вставок осуществляют в области Al- и A2- флагеллинов, располагающейся между их первыми двумя сайтами N- гликозилирования от NLT до NLS. Для Al -флагеллина последовательность области выглядит как VRQААGАDNI (SEQ ID NO: 6), а для A2-флaгeллинa данная последовательность, выглядит как VRQ AAG ADNI (SEQ ID NO: 7). Допустимо введение вставки в любое место между данными сайтами гликозилирования, от позиции 86 до поз. 96 в области флагеллина Al (Фиг. 2) и между поз. 82 до поз. 92 в области флагеллина A2 (Фиг. 3). Предпочтительно вводить вставку в середину области между поз. 89 до поз. 92 для флагеллина Al . Так на фиг. 2 представлена аминокислотная последовательность Al -флагеллина, а последовательности сайтов гликозилирования выделены цветом. Для флагеллина A2. предпочтительно вводить вставку в область между поз. 85 до поз. 88. На фиг. 3 представлена аминокислотная последовательность A2-флaгeллинa, а последовательности сайтов гликозилирования также выделены цветом. При этом введенная аминокислотная последовательность экспонируется на поверхность сформированного жгутика, что позволяет осуществить его последующую обработку веществами, обладающими сродством к использованной вставке. Клонирование последовательностей, кодирующих пептидные вставки

Клонирование последовательностей, кодирующих выбранный пептид, в области Al- и/или A2-гeнa осуществляется с использованием стандартных методик, включающих в себя: 1) выбор сайта рестрикции в области генов, соответствующих аминокислотным последовательностям фрагментов белков (SEQ ID NO: 6) и (SEQ ID NO: 7), 2) синтез парных олигонуклеотидов, один из которых кодирует пептидную вставку, а другой комплементарен ему для формирования дуплекса. Данные олигонуклеотиды должны также содержать липкие концы, соответствующие выбранному сайту рестрикции, 3) клонирование дуплекса по выбранному сайту. Последовательность пептидной вставки содержит одиночную последовательность длиной от 6 до 60 аминокислот или содержит короткие соединенные друг с другом последовательности с общей длиной вставки до 60 аминокислот при этом количество коротких последовательностей лежит в пределах от 2 до 10. Ниже приведен пример клонирования последовательностей, кодирующих выбранный пептид. Так, например, для Al -гена, подобное клонирование состояло из этапов: 1) выбор эндонуклеазы рестрикции ВstХI, которая разрезает Al -ген флагеллина в месте, соответствующем 90-91 аминокислоте белка, 2) синтезолигонуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 3) клонирование дуплекса олигонуклеотидов в плазмиду рNХА (Фиг. 3). При этом все олигонуклеотидные последовательности, кодирующие выбранный пептид, можно схематически изобразить следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и содержит также липкий 3'- конец для клонирования по сайту рестрикции ВstХI: 5'-NN(NNN)xGCCG-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту ВstХI: 5'-(NNN)x NNCGGC-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в Al -ген приведена на Фиг. 3. Число х определяет число кодонов, кодирующих аминокислоту, и может достигать величины от 6 до 60 кодонов для одиночной вставки.

Если возникает необходимость введения вставки от поз. 86 до поз. 96 в области флагеллина Al и между поз 82. до поз. 92 в области флаггелина A2, но нельзя подобрать подходящий сайт для эндонуклеазы рестрикции, то возможно в данной области изменение нуклеотидной и, соответственно, аминокислотной последовательности. Подобная замена не приводит к утрате функциональности флагеллина и может при необходимости осуществляться на генах как Al-, так и A2- флагеллинов, если содержит дополнительные замены аминокислот с сохранением, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности, при этом любая замена аминокислоты является предпочтительно консервативной.

Для A2-гeнa, подобное клонирование состояло из этапов: 1) проведение замены в нуклеотидной последовательности гена флагеллина A2 в составе плазмиды рNХА синтетическими праймерами SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 с использованием QuiкСhапgе sitе-diгесtеd mutаgепеsis кit фирмы Strаtаgеп. Эта замена привела к появлению сайта рестрикции АsuNНI в гене A2, а в соответствующей аминокислотной последовательности произошла замена в поз. 86 аланина на лейцин SEQ ID NO: 8, 2) синтез олигонуклеотидной последовательности, например, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, 3) клонирование дуплекса олигонуклеотидов в плазмиду рNХА (Фиг. 4) При этом все олигонуклеотидные последовательности, кодирующие выбранный пептид, можно схематически изобразить следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и содержит также липкий 5'-кoнeц для клонирования по сайту рестрикции АsuNНI: 5'-CTAGNN(NNN)x-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту АsuNНI: 5'-CTAG(NNN)xNN-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина A2 приведена на Фиг. 4. Число х определяет число ко донов, кодирующих аминокислоту, и может достигать величины от 6 до 60 кодонов для одиночной вставки.

Получение плазмид, с тандемно клонированными вставками перечисленных последовательностей и получение штаммов продуцентов на их основе возможно приведет к усилению или улучшению отдельных характеристик получаемого наноматериала.

Если вставка тандемно повторяется, то величина х должна уменьшиться кратно числу повторяющихся вставок.

Выбор последовательности, кодирующей пептидную вставку.

Известны пептидные последовательности, которые обладают способностью связывать определенные лиганды [5-13, 15,16]. В качестве одного из примеров, подтверждающего воспроизводимость и работоспособность способа получения наноструктурированного материала на основе жгутиков архей, создан штамм галофильного археона H. sаliпаrит, синтезирующий жгутики, модифицированные

FLАG-пептидом DYKDDDDK (SEQ ID NO: 9) как по Al-, так и по A2-флaгeллинy. Данный пример (см. пример 1) включает, но не ограничивает других вариантов жгутиков модифицированных пептидными последовательностями, имеющими высокое сродство к различным лигандам,

Подобным образом могут быть получены модифицированные и другими экспонированными на поверхности вставками флагеллины архей с сохранением протяженной надмолекулярной структуры жгутиков. В свете имеющихся данных целесообразным кажется получение жгутиков H. sаliпаrит с модифицированным Al- и/или A2-флaгeллинoм с вариантами пептидных последовательностей, которые связывают заряженные ионы, оксиды и наночастицы металлов, фосфат железа, лиганды с полупроводниковыми и магнитными свойствами.

Последовательность тетраглутамина EEEE (SEQ ID NO: 10) связывает положительно заряженные ионы металлов. Жгутики, модифицированные данной последовательностью, могут быть использованы для получения материала для электродов литий-ионных аккумуляторов [5-6]. Кроме того, показано, что данный тетрапептид способен связывать и фосфат железа, являющийся перспективным материалом для катодов литий-ионных аккумуляторов [20].

Для некоторых вариантов покрытий, использующих наноструктурные материалы, могут быть использованы жгутики архей с пептидными вставками, связывающими коллоидные наночастицы благородных металлов или жгутики архей содержащие два типа вставок, одна из них связывает ионы металла, другая наночастицы благородных металлов. В качестве примера вставки, связывающей наночастицы золота с поверхностью жгутика, служит так называемый золото- связывающий пептидный мотив LКАНLРРSRLРS (SEQ ID NO: 10) [5-6], который включает, но не ограничивает типы пептидных вставок для связывания наночастиц на поверхности жгутика архей.

Возможно совместное применение двух разных типов пептидных вставок (SEQ ID NO: 11) и (SEQ ID NO: 10), которые, например, совместно экспрессировались для связывания частиц с разными свойствами модифицированным вирусом M 13 [5-6]. В качестве пептидной вставки могут быть использованы пептидные последовательности, которые могут связывать лиганды обеспечивающие полупроводниковые и магнитные свойства. Так пептид с последовательностью CNNPMHQNC (SEQ ID NO: 12) связывает ZnS, пептид с последовательностью SLТРLТТSНLRS (SEQ ID NO: 13) связывает CdS, пептид с последовательностью НNКНLРSТQРLА (SEQ ID NO: 14) связывает FePt, пептид с последовательностью CNAGDHANC (SEQ ID NO: 15) связывает CoPt [10].

Известно, что тетрапептиды RRRR(SEQ ID NO: 16) и RKRK (SEQ ID NO: 17) связывают ионы и оксиды металлов. Пары обладают избирательным сродством к Cu2O и ZnO, соответственно [21]. Некоторые пептидные структуры, образующие петли на поверхности белка, обладают свойствами связывать ионы металлов, и, в зависимости от состава, имеют анионные или катионные свойства. К таким петлям относятся гистидиновые петли "Нis-lоор" (GHHHHHH) (SEQ ID NO: 18), глутамин- аспарагиновые петли "Glu-Аsр lоор" (DQDQDQG) (SEQ ID NO: 19), аргнинин- лизиновые петли "Аrg-Lуs lоор" (RKRKRKR) (SEQ ID NO: 20) [1 1]. Варианты плазмид

Для проверки эффективности изобретения на основе плазмиды рNХА были получены следующие варианты плазмид: 1) рекомбинантная плазмидная ДНК рNХА IFLAG обеспечивающая синтез модифицированного FLАG-пептидом Al- флагеллина при сохранении нативности A2-флaгeллинa, 2) рекомбинантная плазмидная ДНК pNXAlA2FLAG, обеспечивающая синтез модифицированных FLАG-пептидом Al- и A2-флaгeллинoв, 3) рекомбинантная плазмидная ДНК pNXAlFLAGA2GBP, обеспечивающая синтез модифицированного FLAG- пептидом Аl-флагеллина и модифицированного золотосвязывающим пептидом A2-флaгeллинa в клетках H. sаliпаrит Rl при трансформации и встраивании данной плазмиды в хромосому организма. Варианты плазмид и способы их получения приведены в примере 2.

Выбор клеток и трансформация клеток полученной плазмидой Полученными плазмидами трансформируют клетки H. sаliпаrит и выращивают их на поверхности агаризованной среды с антибиотиком. Выросшие колонии клеток пересевают в жидкую среду, и после роста из клеток либо выделяют жгутики, либо отбирают небольшие количества клеток.

Для получения штаммов-продуцентов модифицированных флагеллинов трансформируют клетки H. Sаliпаrит по приводимой методике [22]. H. sаliпаrит - это экстремальный галофильный грам-негативный археон с облигатной аэробностью. Естественной средой обитания данного организма является вода

Мертвого моря, а оптимальной для роста является экстремально высокая соленость (до 5.5 M NaCl). В лабораторных условиях выращивается на среде следующего состава: 25% NaCl, 0.2% KCl, 2% Mg2SO4 7x H2O, 0.3% Nа-цитрат,

0.5% триптон, 0.2% дрожжевой экстракт, рН 7.5 при 37 ⁰ C [23].

H. sаliпаrит представляет собой одиночные клетки палочковидной формы, не образующие спор, имеющие лофотрихиальное расположение жгутиков, на стационарной фазе у клеток H. Sаliпаrит возможна амфитрихиальная локализация. Во всех случаях нити жгутиков образуют пучок, вращение которого создаёт гидродинамическое усилие, приводящее клетку в движение. В пучок входит 5-10 нитей, представляющих собой полужёсткую спираль. При росте H. sаliпаrит в культуральной среде обнаруживается значительное количество свободных жгутиков.

Взвеси клеток в жидких питальных средах, либо колонии, выросшие на поверхности агаризованной среды обладают красным цветом за счет присутствия в клеточной стенке бактородопсина.

В России доступен штамм H. sаliпаrит Rl, предоставляемый Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (г. Москва).

Все полученные штаммы-продуценты на основе H. sаliпаrит Rl характеризуются следующими признаками:

- морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные,

- культуральные признаки: при росте на агаризованной среде для H. Sаliпаrит колонии круглые, гладкие, блестящие, край ровный, окрашены в красный цвет. При росте на жидких средах образуют интенсивную ровную муть,

- физико-биологические признаки: клетки растут при температуре от 20°C до 45°C при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы,

- устойчивость к антибиотикам: клетки проявляют устойчивость к новобиоцину (до 0.6 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде рNХА гена NоvR,

- штаммы-продуценты отличаются от штамма-реципиента H. sаliпаrит Rl только наличием различных вариантов рекомбинантной плазмидной ДНК рNХА, которая придает ему устойчивость к новобиоцину,

- отсутствие галоархейного сайта инициации репликации приводит к тому, что при трансформации плазмидой устойчивость к новобиоцину клетки архей приобретают только в случае встраивания плазмиды в хромосому по механизму гомологичной рекомбинации,

- штаммы-продуценты помимо встроенного с плазмидой модифицированного A- флагеллинового оперона также содержат в себе нативный А-оперон. Следовательно, в составе жгутиков помимо модифицированных флагеллинов (его наличие показано экспериментально иммуно-электронной микроскопией) могут содержаться и немодифицированные флагеллины.

В примерах 4-6 приведены этапы получения рекомбинантных жгутиков: а) выращивание клеток на поверхности агаризированной среды и последующий рост клеток в жидкой среде, б) выделение жгутиков из культуральной среды для модификации и последующей минерализации поверхности жгутиков, г) модификация поверхности жгутиков наночастицами металла, полупроводника и магнитными наночастицами или модификация выбранным ионом металла и затем последующая минерализация поверхности жгутиков выбранным веществом, д) выделение, сушка и хранение минерализированных жгутиков, предназначенных для формирования материала.

Модифицированные жгутики со вставкой FLАG-пептида с последовательностью SEQ ID NO: 9, позволяют детектировать его присутствие на поверхности с помощью специфичных моноклональных антител. С помощью иммуно-электронной микроскопии препарата жгутиков FLAGAl- и FLAG A2- штамма H. sаliпаrит было показано, что данный пептид присутствует в составе флагеллина, а жгутики специфично метятся антителами. Видно, что модифицированные жгутики сохраняют нативную спиральную структуру и морфологически не отличаются от жгутиков дикого типа, при этом FLАG-пептид доступен для связывания с антителами, то есть, находится в составе поверхностного участка полипетидной цепи Al- и А 2-флaгeллинa (Фиг. 5). Известно, что выведенные на поверхность белков тетраглутаминовые или тетрааспарагиновые последовательности способны эффективно связывать ионы металлов (например, Co2+, Cu2+) [5-13]. Так как в составе FLАG-пептида также имеется 4 последовательных отрицательно заряженных аминокислотных остатка - аспартата, жгутики были проверены на связывание металлических ионов. Петля, образованная восемью остатками, оказалась достаточной для выведения кластера заряженных аминокислот на поверхность жгутика и способной связывать ионы металлов. Затем ионы в присутствии боргидрида натрия переводились в нерастворимые частицы оксидов, прикрепленные к жгутику (Фиг. 7). Выбор типа наноматериала

Для различных типов покрытий могут использоваться жгутики с волокнистой структурой, фрагменты жгутиков, сгруппированные в кластеры, и композиции жгутиков с волокнистой структурой и фрагментами жгутиков в кластерах. Наноматериал выполнений в виде волокнистой структуры, содержит более 50% жгутиков архей длиной более 1000 нм, поверхность которых имеет сайты, в которых связаны ионы металлов или металлические, полупроводниковые, магнитные наночастицы, при этом жгутики дополнительно связаны друг с другом и с подложкой за счет адгезивных свойств жгутиков.

Для формирования кластерных структур длинные волокнистые жгутики фрагментируют. Наиболее подходящим способом фрагментации является с воздействие на надмолекулярную структуру жгутиков ультразвуком. Образцы жгутиков после обработки ультразвуком анализировались на электронном микроскопе. Результат обработки ультразвуком жгутиков штамма H. sаliпаrит со вставкой в Аl-флагеллин FLАG-пептида (SEQ ID NO: 2) перед минерализацией оксидом кобальта для создания наноматериала для электрода литий-ионного аккумулятора приведен на Фиг. 8. Если в обычных условиях длина жгутика составляет несколько микрометров, то в зависимости от времени, интенсивности и частоты обработки ультразвуком основная часть длины получающихся фрагментов жгутиков будет составлять 50-300 нм. (см. Таблицу 1). В общем случае кластерные структуры содержат более 50% фрагментов жгутиков длиной менее 500 нм. Фрагменты жгутиков за счет меньшей длины, чем у нативных жгутиков, иначе ведут себя при минерализации. Из-за меньших диффузионных препятствий и меньшей протяженности фрагментам жгутиков при минерализации с частицами оксида удается формировать более плотный материал. Анализ полученных изображений фрагментированных жгутиков показывает, что из-за неоднородного состава (модифицированные и немодифицированные участки на фрагментах жгутиков) фрагментов, они ориентируются друг с другом таким образом, что при минерализации модифицированные части фрагментов связываются частицами оксида кобальта, а немодифицированные части фрагментов выступают с внешней стороны кластера (Фиг. 9, 10). Все это приводит к положительному в изменению электро-химических свойств наноматериала, выполненного в виде кластеров, по отношению к применению волокнистых наноматериалов при использовании в качестве покрытия пластин литий ионных аккумуляторов. Данные изменения были обнаружены в последующих электрохимических испытаниях (см. Пример N° 12). Примеры

Ниже приведены примеры, которые включают, но не ограничивают объем изобретения. Пример 1. Получение генетической конструкций

Генетические конструкции получают на основе плазмиды рNХ [19], содержащей ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к новобиоцину. Для выделения тотальной ДНК из H. sаliпаrит, а также выделения плазмидной ДНК из E. соli использовали колонки со стеклянным наполнителем фирмы Qiаgеп (США). ДНК выделяют согласно инструкции фирмы-производителя. Тотальную ДНК H. sаliпаrит используют в качестве матрицы для наработки ПЦР-фрагментов А-флагеллиного оперона с фланкирующими участками.

С использованием олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO:5 проводят ПЦР в 50 мкл смеси, состоящей из ПЦР буфера (для Таq ДНК- полимеразы: 57 мМ Трис-НСl , рН 8.8, 16.6 мМ (NH)2SO4, 0.1% Tween-20) с концентрацией MgC12 от 1.5 до 2.5 мМ, смеси дезоксирибонуклеотидов (в концентрации 0.2 мМ каждого), олигонуклеотидов-праймеров по 20-100 пМ каждого, 2-20 нг плазмидной или 100-200 нг хромосомной ДНК и смеси из 1-2 ед. Таq ДНК-полимеразы и 0.1-0.2 ед. Рfu ДНК-полимеразы. Длительность стадий плавления, отжига и элонгации составляет 10 с, ЗО с и З мин, соответственно. Температуру отжига праймеров определяют по максимальному выходу продуктов, стадию плавления проводят при 95 ⁰ C, а элонгацию при 72 ⁰ C, количество циклов - 25.

ПЦР-продукты, а также плазмидную ДНК анализируют методом ДНК- электрофореза в агарозном геле в ТАЕ-буфере согласно [24]. Обработку ДНК эндонуклезами рестрикции (все фирмы Fеrmепtаs, Литва) и постановку лигазной реакции с использованием T4 ДНК-лигазы (Fеrmепtаs, Литва) проводят согласно инструкции производителя.

Пример 2. Конструкции плазмид с разными типами пептидных вставок В качестве клонируемой последовательности использованы различные дуплексы синтетических олигонуклеотидов: (SEQ ID NO: 21), (SEQ ID NO: 22); (SEQ ID NO: 25), (SEQ ID NO: 26); (SEQ ID NO: 27), (SEQ ID NO: 28). Все последовательности в соответствии с комплементарностью попарно отжигают друг на друга. А) Конструкция плазмиды рNХА IFLAG

В качестве примера, который включает, но не ограничивает других вариантов, в данном примере рассмотрен способ введения вставки, которая кодирует последовательность FLАG-пептида. С этой целью используют праймер с последовательностью SEQ ID NO: 21 и праймер с комплементарной последовательностью SEQ ID NO: 22.

Праймеры отжигают друг на друга с охлаждением их смеси с 80 ⁰ C до комнатной температуры, после чего проводят их фосфорилирование по З'-концам полинуклеотидкиназой (Fеrmепtаs, Литва) согласно инструкции. Далее проводят клонирование данной синтетической двухцепочечной олигонуклеотидной последовательности, кодирующей FLАG-пептид, путем вставки в Al -ген флагеллина в месте соответствующем 90-91 аминокислоте белка по сайту рестрикции ВstХI за счет липких концов для данного сайта (Фиг. 4), образующегося при отжиге синтетических одноцепочечных олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 21) и (SEQ ID NO: 22). Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E. соli согласно [25] и высевают на чашки с агаризованной (1.5%) средой LB с 100 мкг/мл ампициллина. Для наработки плазмидной ДНК выращенную колонию с чашки пересевают в жидкую среду с антибиотиком и после подроста клеток выделяют плазмиду. Полученные плазмиды секвенируют на ДНК-секвенаторе ABI PRIZM 310 (Аррliеd Вiоsуstеms, США).

Таким образом, в приведенном примере, для клонирования в ген флагеллина Al по сайту рестрикции ВstХI олигонуклеотидов, кодирующих другие вставки, они должны выглядеть следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 3'- конец: 5'-NN(NNN)xGCCG-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту ВstХI: 5'-(NNN)x NNCGGC-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина Al приведена на Фиг. 4. Число х определяет число кодонов, кодирующих аминокислоту, и может достигать величины от 6 до 60 кодонов для одиночной вставки.

Б) Конструкция плазмиды pNXAlA2FLAG Плазмида pNXAlA2FLAG была получена в два этапа: во-первых, созданы условия для вставки в область A2-флaгeллинoвoгo гена различных последовательностей. Так как сайта рестрикции для ВstХI в A2-гeнe не имеется, а также не удалось подобрать других уникальных сайтов в выбранной области между сайтами гликозилирования, было решено ввести искусственный сайт путем замены нескольких нуклеотидов. Такая замена была осуществлена в плазмиде рNХА с использованием синтетических олигу нуклеотидов: 5' - САССGТGСGССАGСТАGССGGАGСС - 3' (SEQ ID NO: 23) и 5' - GGСТССGGСТАGСТGGСGСАСGGТG - 3' (SEQ ID NO: 24) и набора реактивов QuikСhапgе sitе-dirесtеd mutаgепеsis kit (фирмы Strаtаgепе). Таким образом, был введен сайт для эндонуклеазы рестрикции AIuNHI, приводящей к замене в продукте A2-гeнa 86 аминокислоты аланина на лейцин. В результате фрагмент флагеллина A2, ограниченный первыми двумя сайтами гликозилирования, после замены выглядит как VRQLAG ADNI (SEQ ID NO: 8). Подобная замена не приводит к утрате функциональности флагеллина и может при необходимости осуществляться как на гене флагеллина Al, так и на на гене флагеллина A2. Количество замен в области из 10 аминокислот между первыми двумя сайтами гликозилирования как в Al, так и A2 флагеллинах может достигать 20% процентов с сохранением, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности, при этом любая замена аминокислоты является предпочтительно консервативной заменой.

Далее, ген флагеллина Al в месте соответствующем 90-91 аминокислоте и ген флагеллина A2 в месте соответствующем 86-87 аминокислоте каждого белка вставили по синтетической двухцепочечной олигонуклеотидной последовательности, кодирующей FLАG-пептид. Данная последовательность встроена в ген флагеллина Al по сайту рестрикции ВstХI за счет липких концов для данного сайта, образующегося при отжиге синтетических одноцепочечных олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 21) и (SEQ ID NO: 22), а в ген флагеллина A2 по сайту рестрикции AIuNHI также за счет липких концов для данного сайта, образующегося при отжиге синтетических одноцепочечных олигонуклеотидов

(Фиг. 4-5):

5' - СТАGGТGАСТАСААGGАСGАТGАСGАТААGGGТ - 3' (SEQ ID NO: 25) 5' - CTAGACCCTTATCGTCATCGTCCTTGTAGTCAC - 3' (SEQ ID NO: 26)

Таким образом, в приведенном примере, для клонирования по сайту рестрикции ВstХI в ген Аl-флагеллина олигонуклеотидов, кодирующих другие вставки, они должны выглядеть следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 3'- конец: 5'-NN(NNN)xGCCG-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту ВstХI: 5'-(NNN)x NNCGGC-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина Al приведена на Фиг. 4. Для вставки в ген флагеллина A2: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 5'-кoнeц для клонирования по сайту рестрикции АsuNНI: 5'-CTAGNN(NNN)x-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и кроме того содержит липкий конец для клонирования по сайту АsuNНI: 5'-CTAG(NNN)xNN-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина A2 приведена на Фиг. 5. Число х определяет число кодонов, кодирующих аминокислоту и может достигать величины от 6 до 60 кодонов для одиночной вставки. В) Конструкция плазмиды рNХА 1 FLAGA2GBP

Плазмида pNXAlFLAGA2GBP также была получена в два этапа: во- первых, аналогично получению плазмиды pNXAlA2FLAG в область A2- флагеллинового гена был введен сайт для эндонуклеазы рестрикции AIuNHI, приводящей к замене в продукте гена флагеллина A2 86 аминокислоты аланина на лейцин. Далее, в ген флагеллина Al в месте соответствующем 90-91 аминокислоте белка вставили синтетическую двухцепочечную олигонуклеотидную последовательность, кодирующую FLАG-пептид, а в ген флагеллина A2 в месте соответствующем 86-87 аминокислоте белка синтетическую двухцепочечную олигонуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 11) кодирующую пептид, связывающую наночастицы коллоидного золота (Gоldеп Вiпdiпg Рерtidе). Последовательность золото-связывающего пептидного мотива (SEQ ID NO: 1 1) определена методом фагового дисплея. Последовательность, кодирующая FLАG- пептид, встроена в ген флагеллина Al по сайту рестрикции ВstХI за счет липких концов для данного сайта, образующегося при отжиге двух синтетических одноцепочечных олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 21) и (SEQ ID NO: 22). Последовательность (SEQ ID NO: 1 1), кодирующую пептид, вставили в ген флагеллина A2 по сайту рестрикции AIuNHI также за счет липких концов для данного сайта, образующегося при отжиге синтетических одноцепочечных олигонуклеотидов (Фиг. 4-5):

S'-СТАGGТСТАААGGСССАТСТАССТССТАG� �АGGСТАССТАGТGGТ-З' (SEQ ID NO: 27)

5' - САGАТТТССGGGТАGАТGGАGGАТСАТССGАТGGАТ САССАGАТС -3' (SEQ ID NO: 28). Таким образом, в приведенном примере, для клонирования по сайту рестрикции ВstХI в ген флагеллина Al олигонуклеотидов, кодирующих другие вставки, они должны выглядеть следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 3'- конец: 5'-NN(NNN)xGCCG-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту ВstХI: 5'-(NNN)x NNCGGC-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина Al приведена на Фиг. 4. Для вставки в ген флагеллина A2: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 5'-кoнeц для клонирования по сайту рестрикции АsuNНI: 5'-CTAGNN(NNN)x-3 (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому^для формирования дуплекса и кроме того содержит липкий конец для клонирования по сайту АsuNНI: 5'-CTAG(NNN)xNN-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина A2 приведена на Фиг. 5. Число х определяет число кодонов, кодирующих аминокислоту, и может достигать величины от 6 до 60 кодонов для одиночной вставки.

Пример 3. Получение штаммов продуцентов модифицированных жгутиков H. sаliпаrит Rl Использован штамм H. sаliпаrит Rl, предоставленный Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (г. Москва). Клетки H. sаliпаrит выращивают на среде следующего состава: 25% NaCl, 0.2% KCl, 2% Mg2SO4 7x H2O, 0.3% Nа-цитрат, 0.5% триптон, 0.2% дрожжевой экстракт, рН 7.5 при 37 ⁰ C [23]. Штамм получают путем трансформации клеток H. sаliпаrит с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) по описанной ранее методике [22] со следующими модификациями. Сферопласты получают отдельно для каждой аликвоты (1.5 мл) клеточной культуры. Клетки осаждают в 1.5 мл пробирках центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин и затем ресуспендируют в 150 мкл сферопластирующего раствора. Для получения сферопластов к клеточной суспензии добавляют 15 мкл 0.5 M ЭДТА и выдерживают смесь 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 10 мкл раствора, содержащего около 5 мкг плазмидной ДНК, и инкубируют смесь в течение 5 мин, после чего добавляют равный объем раствора, содержащего 60% ПЭГ-600 и 40% сферопластирующего раствора (вес/объем). Клетки инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Для восстановления клеток к суспензии добавляют 15 мл культуральной среды, содержащей 15 % сахарозы, и инкубируют в течение 12-24 часов при 37 ⁰ C с покачиванием. Селекция трансформантов осуществляют на агаризованной среде, содержащей 15 % сахарозы и 0.1-0.2 мкг/мл антибиотика новобиоцина (Sigmа, США). Инкубацию осуществляют при 37 ⁰ C в течение 10-14 сут. Культуры клеток H. sаliпаrит хранят на чашках Петри на соответствующих средах с 1.5% агаром при при комнатной температуре. Полученные штаммы культивируются аналогично нетрансформированным клеткам H. Sаliпаrит Rl за исключением добавки 0.1-0.2 мкг/мл антибиотика новобиоцина.

Пример 4. Выделение и очистка жгутиков

Для выделения жгутиков культуру H. sаliпаrит выращивают в литровых колбах с 200 мл среды до поздней стационарной фазы. Полученную биомассу осаждают центрифугированием при 8000 g в течение 30 мин. К супернатанту, полученному после осаждения клеток, добавляют 4% ПЭГ-6000 и затем осаждают жгутики центрифугированием при 15000 g в течение 45 мин. Далее, для очистки жгутиков используют центрифугирование в градиенте плотности CsCl (12 часов при 55000 об/мин, ротор VTI-80, Весkmап, США). Хлористый цезий растворяют в солевой среде до получения плотности 1.36 г/смЗ. Фракция, содержащая жгутики, образовывала видимую зону в средней части пробирки. Содержимое фракции разводят (в 10 раз) солевой средой, содержащей 25% NaCl, 20 мМ MgSO4, и, далее, жгутики переосаждают центрифугированием при 80000 g в течение 1 часа. Пример 5. Связывание ионов металлов и минерализация волокнистых жгутиков.

Связывание ионов металлов проводят аналогично методу, описанному Белчер [5-6] с модификациями. Жгутики при концентрации 0.1 мг/мл выдерживают в течение часа в водном растворе 0.15 -2.5 M NaCl, содержащем 5 мМ хлорида Со или Cu.. Затем к трем объемам раствора жгутиков добавляли один объем раствора, содержащего 1.5 M NaCl и 100 мМ NaBH4, и инкубируют в течение 1 часа до прекращения реакции. При этом методе концентрация жгутиков и солей металлов выбирается исходя из характеристик материала, который необходимо получить. Концентрация хлорида натрия не должна быть меньше 0.15 M, так как при меньшей концентрации наступает необратимое разрушение жгутиков. Величина рН выбирается исходя из свойств веденной пептидной группы. Так, для FLАG-пептида необходима депротонизация кислотных групп 4-х аспарагинов с тем, чтобы они могли связать ион металла. Отсюда следует, что рН реакции для минерализации жгутиков с введенным FLАG-пептидом должен быть в пределах 4-13, желательно 6-12, и еще более желательно 7-11. Для остальных групп оптимальный для реакции рН может быть другим, но не выходить за пределы 4-13. Температура должна находиться в пределах O ⁰ C - 5O ⁰ C, желательно 10 ⁰ C - 4O ⁰ C, еще более желательно 15 ⁰ C - 3O ⁰ C. Пример 6. Получение наноструктурированного материала на основе минерализованных жгутиков с модификациями.

После минерализации модифицированных жгутиков (пример. 4) они переходят в легко осаждаемый (400Og, 10 минут) осадок черного цвета (цвет оксидов Со и Cu). Данный осадок отделяется от супернатанта, затем суспендируется в воде и заново осаждается для отмывки от соли. Отделение осадка производят при температуре от 20 до 25 ⁰ C.

Полученный осадок переносится на инертную подложку, сушится под ваккумом при комнатной температуре в течение суток. Полученный сухой порошок черного цвета хранится при комнатной температуре длительное время. Пример 7. Получение электронных микрофотографий и исследование жгутиков с помощью иммуно-электронной микроскопии.

Для получения электронных микрофотографий использовали микроскоп JEM-IOOc «JEOL» (Япония). Все манипуляции производятся при комнатной температуре. Для приготовления электронно-микроскопических образцов препараты наносят на электронно-микроскопические медные сетки с формваровой пленкой-подложкой, выдерживают 1 мин и отбирают раствор фильтровальной бумагой, после чего помещают сетку на раствор 2% уранилацетата, выдерживают 30 с, отбирают раствор фильтровальной бумагой и далее высушивают. Образцы жгутиков наносят на электронно-микроскопические медные сетки с формваровой пленкой-подложкой и выдерживают 5 мин. Сетки с образцами жгутиков помещают на блокирующий буфер для ИЭМ (10 мМ Трис-НСl, рН 8, 150 мМ NaCl, 1% БСА) на 30 мин, а затем переносят на тот же буфер с препаратом моноклональных ANTI FLAG M2-aнтитeл (Sigmа, США) и выдерживают 30 мин. Антитела разводят в 500, 200 и 100 раз. Затем сетки отмывают от антител в блокирующем буфере для ИЭМ 3-4 раза по 1 мин и переносят на тот же буфер с добавлением конъюгатов белка А с частицами коллоидного золота (размер частиц 10 нм, Jаппsеп Вiоtесh, Бельгия) на 45-60 мин. Конъюгаты разводят в 50, 20 и 10 раз. Далее сетки отмывают блокирующим буфером для ИЭМ без БСА 2-3 раза по 5-10 мин, отбирают раствор фильтровальной бумагой и помещают на раствор 2% уранилацетата для негативного контрастирования. Через 30 с раствор 2% уранилацетата отбирают фильтровальной бумагой, сетки высушивают и исследуют образцы на микроскопе. Наилучшее мечение препаратов жгутиков было достигнуто при разведении антител в 200-100, а конъюгатов в 20-10 раз. Пример 8. Ультразвуковая обработка рекомбинантных жгутиков.

Выделенные и очищенные жгутики (Пример 4) обрабатывают ультразвуком на частоте 22 и 44 Кгц ультразвуковым диспергатором (модель УЗДH-2T) на номинальной выходной мощности генератора прибора в рабочем диапазоне частот на активной нагрузке, составляющей 400 Вт. Обрабатываемый образец помещают в 1.5 мл центрифужную пробирку (Еррепdоrf), которую в свою очередь устанавливают в специальную насадку для обработки образцов в пробирках [27]. Пробирка с образцом и насадка находились в охлаждающем стакане, наполненном водой со льдом. Ультразвук подают периодами по 1 минуте с паузами по 1 минуте для охлаждения обрабатываемого образца. Образцы жгутиков после обработки ультразвуком анализируют на электронном микроскопе.

Данные фрагментации приведены в табл. 1.

Таблица JVgI Длина фрагментированных жгутиков в зависимости от частоты и длительности воздействия ультразвуком

Окончательным способом фрагментации жгутиков для последующей минерализации была выбрана обработка на частоте ультразвука 44 Кгц интервалами по 1 минуте и охлаждением в течение 1 мин общей продолжительностью 40 минут. На фиг. 10 представлено электронно- микроскопическое изображение наноструктурного материала, полученного на основе предварительно обработанных ультразвуком в течение 20 мин при 44 кГц жгутиков со вставкой в Аl-флагеллин FLАG-пептида и минерализованных оксидом кобальта. Негативное контрастирование уранил ацетатом. Масштабная линейка - 300 нм

Пример 9. Связывание ионов металлов и минерализация предварительно обработанных ультразвуком жгутиков.

Связывание ионов металлов проводят аналогично (Примеру 5) методу, описанному Белчер [5-6] с модификациями жгутики. Обработанные ультразвуком жгутики при концентрации 0.1 мг/мл выдерживают в течение часа в водном растворе 0.15 -2.5 M NaCl, содержащем 5 мМ хлорида Со или Cu. Затем к трем объемам раствора жгутиков добавляли один объем раствора, содержащего 1.5 M NaCl и 100 мМ NaBH4, и инкубируют в течение 1 часа до прекращения реакции. При этом методе концентрация жгутиков и солей металлов выбирается исходя из характеристик материала, который необходимо получить. Концентрация хлорида натрия не должна быть меньше 0.15 M, так как при меньшей концентрации наступает необратимое разрушение жгутиков. Величина рН выбирается исходя из свойств веденной пептидной группы. Так, для FLАG-пептида необходима депротонизация кислотных групп 4-х аспарагинов с тем, чтобы они могли связать ион металла. Отсюда следует, что рН реакции для минерализации жгутиков с введенным FLАG-пептидом должен быть в пределах 4-13, желательно 6-12, и еще более желательно 7-11. Для остальных групп оптимальный для рекции рН может быть другим, но не выходить за пределы 4-13. Температура должна находиться в пределах O ⁰ C - 5O ⁰ C, желательно 10 ⁰ C - 4O ⁰ C, еще более желательно 15 ⁰ C - 3O ⁰ C.

Пример 10. Получение наноструктурированного материала на основе минерализованных жгутиков с модификациями и предварительной обработкой ультразвуком.

Модификация проводится аналогично примеру 6. После минерализации модифицированных жгутиков (пример. 4) они переходят в легко осаждаемый (400Og, 10 минут) осадок черного цвета (цвет оксидов Со и Cu). Данный осадок отделяется от супернатанта, затем суспендируется в воде и заново осаждается для отмывки от соли. Отделение осадка производят при температуре от 20 до 25 ⁰ C. Полученный осадок переносится на инертную подложку сушится под вакуумом при комнатной температуре в течение суток. Полученный сухой порошок черного цвета хранится при комнатной температуре длительное время.

Пример 11. Сборка электрохимической ячейки литий-ионного аккумулятора с анодом на основе наноструктурного материала оксид кобальта — рекомбинантные модифицированные жгутики. Электроды были изготовлены по стандартной намазной технологии, которая включала приготовление активной массы, нанесение ее на токопроводящую основу, первоначальную сушку в сушильном шкафу, прессование, окончательную сушку в вакууме форвакуумного насоса [28]. Рабочая масса являлась механической смесью из активного вещества модифицированных оксидом кобальта жгутиков (75 мае. %) и ацетиленовой сажи (15 мае. %) с добавлением связующего вещества (поливинилиденфторид, 10 мac.%).

Пример 12. Измерение электрохимической емкости аккумулятора с отрицательно заряженным электродом из наноструктурированного материала на основе модифицированных жгутиков с предварительной обработкой ультразвуком или без предварительной обработки ультразвуком.

Гальваностатическое циклирование исследуемых электродов проводили током 20 м А/г активного вещества (Co ₃ O ₄ ). Пределы циклирования составляли 3.0 - 0.01 В. Результат циклирования различных наноструктурированных материалов представлен на фиг. 11. На фиг. 11 представлено изменение разрядной емкости электродов на основе: 1) оксида кобальта, нанесенного на электрод без добавления жгутиков; 2) наноструктурного материала на основе жгутиков со вставкой в Al- флагеллин FLАG-пептида и минерализованных оксидом кобальта; 3) наноструктурного материала полученного на основе предварительно обработанных ультразвуком (частотой 44 кГц в течение 20 мин) жгутиков со вставкой в Аl-флагеллин FLАG-пептида и минерализованных оксидом кобальта. Циклирование проводилось в IM LiPF ₆ в смеси этиленкарбонат-диэтилкарбонат- диметилкарбонат (1 :1 :1, далее ЭК-ДЭК-ДМК) током 20 мА/г Co ₃ O ₄ .

Результаты испытаний показали наибольшую эффективность наноструктурного материала полученного на основе предварительно обработанных ультразвуком жгутиков флагеллина.

Несмотря на то, что настоящее изобретение описывает конкретные и предпочтительные варианты его реализации, следует иметь в виду, что указанные варианты не ограничивают возможные модификации и варианты настоящего изобретения.

Литература

[1] Воск L. еt аl. Nапо-Сhеm-Fеt Ваsеd Вiоsепsоrs. US Раt. Аррliс. N° 20080044911

(February 21, 2008).

[2] Тrап В.Q. NАNО-еlесtгопiсs. US Раt. Аррliс. JVb 20070285843 (Dесеmbеr 13, 2007).

[3] Wirth R. еt аl. Моlесulаr Gluе. US Раt. Аррliс. JV° 20080305524 (Dесеmbеr 11, 2008).

[4] Gаzit E. еt аl. Рерtidе nanostructures encapsulating а fоrеigп mаtеriаl апd mеthоd оf mапufасturiпg sаmе. US Раt. Аррliс. Ш 20060079455 (Арril 13, 2006).

[5] Nаm К.Т. еt аl. Virus-Епаblеd Sупthеsis апd Аssеmblу оf Nапоwirеs fоr Lithium Iоп Ваttеrу Еlесtrоdеs. Sсiепсе, V. 312, P. 885-888 (2006). [6] Веlсhеr А.М. еt аl. Nапоsсаliпg оrdеriпg оf hуbrid mаtеriаls usiпg gепеtiсаllу епgiпееrеd mеsоsсаlе virus. US Раt. Аррliс. JVe 20030073104 (Арril 17, 2003). [7] Belcher A. M. еt аl. Мultifuпсtiопаl biоmаtеriаls аs sсаffоlds fоr еlесtrопiс, орtiсаl, mаgпеtiс, sеmiсопduсtiпg, апd biоtесhпоlоgiсаl аррliсаtiопs. US Раt. Аррliс. N« 20050170336 (Аugust 4, 2005).

[8] Belcher A. M. еt аl. Вiоlоgiсаl control of nanoparticle пuсlеаtiоп, shаре апd сrуstаl рhаsе US Раt. Аррliс. N° 20060275791 (Dесеmbеr 7, 2006).

[9] Nаm К. T. еt аl. Virus sсаffоld fоr sеlf-аssеmblеd, flехiblе апd light lithium bаttеrу.US Раt. Аррliс. Ш 20060121346 (Juпе 8, 2006).

[10] Мао С. еt аl., Vims-Ваsеd Тооlкit fоr thе Dirесtеd Sупthеsis оf Mаgпеtiс апd Sеmiсопduсtiпg Nапоwirеs. Sсiепсе, 2004, V. 303, P. 213-217 [1 1] Кumаrа M. T. еt аl., Sеlf-аssеmblу оf mеtаl папораrtiсlеs апd папоtubеs оп biоепgiпееrеd flаgеllа sсаffоlds. Сhеm. Маtеr., 2007, V. 19, P. 2056-2064.

[12] Yu В. еt аl., А Nоvеl Вiоmеtаlliс Iпtеrfасе: Нigh Аffiпitу Тiр-Аssосiаtеd Вiпdiпg bу Рiliп-Dеrivеd Рrоtеiп Nапоtubеs. J. Вiопапоsсi., 2007, V.l, 73-83.

[13] Аudеttе G.F., Наzеs В. Dеvеlорmепt оf рrоtеiп папоtubеs frоm а multi- рurроsе biоlоgiсаl struсturе. J. Nапоsсi. Nапоtесhпоl., 2007, V. 7, P. 2222-2229.

[14] Мudаligе Тhilаk Кumаrа еt аl., Biоепgiпееrеd Flаgеllа Рrоtеiп Nапоtubеs with Суstеiпе Lоорs: SeIf- Аssеmblу апd Мапiрulаtiоп iп ап Орtiсаl Тrар Nапо Lеtt., VoI. 6, No. 9, 2006.

[15] Вепitа Wеstеrluпd-Wikstrо еt аl., Fuпсtiопаl ехрrеssiоп оf аdhеsivе рерtidеs аs fusiопs tо Еsсhеriсhiа соli flаgеlliп. Рrоtеiп Епgiпееriпg vol.10 по.11 рр.1319-1326, 1997.

[16] Тrрерi M., Роlsсhrоdеr M., Наlоfеrах vоlсапii flаgеllа аrе rеquirеd fоr mоtilitу but аrе поt iпvоlvеd iп РibD-dерепdепt surfасе аdhеsiоп. 2010, J. Васtеriоl., doi: 10.1128/JB.00133-10. [17] Тhоmаs А.N. еt аl., Thе аrсhаеаl flаgеllum: а diffеrепt kiпd оf рrоkаrуоtiс mоtilitу struсturе. FEMS Мiсrоbiоl. Rеviеws, 2001, V. 25, P. 147-174.

[18] Lоgап S. M. Flаgеllаr glусоsуlаtiоп - а пеw соmропепt оf thе mоtilitу rереrtоirе? Мiсrоbiоl., 2006, V. 152, P. 1249-1262.

[19] Таrаsоv V.Y., Руаtibrаtоv M.G., Тапg S., Dуаll-Smith M., Fеdоrоv О.V. // RoIe оf flаgеlliпs frоm А апd В lосi iп flаgеllа fоrmаtiоп оf Наlоbасtеriит sаliпаrит. MoI. Мiсrоbiоl., 2000, V. 35, P. 69-78.

[20] Fаbriсаtiпg Gепеtiсаllу Епgiпееrеd Нigh-Роwеr Lithium Iоп Ваttеriеs Usiпg Мultiрlе Virus Gепеs. Yuп Juпg Lее, Нуuпjuпg Yi, Wоо-Jае Кim, Кisuk Капg, Dопg Sоо Yuп, Мiсhаеl S. Strапо, Gеrbrапd Сеdеr, Angela M. Веlсhег. 2 Аргil 2009/ 10.1 126/science

[21] Corrine K. Тhаi еt аl., Idепtifiсаtiоп апd Сhаrасtеrizаtiоп оf Cu2O- апd ZпО-Вiпdiпg Роlурерtidеs bу Еsсhеriсhiа соli CeIl Surfасе Disрlау: Тоwаrd ап Understanding оf Меtаl Охidе Вiпdiпg. ВЮТЕСНNОLОGY AND ВЮЕNGINЕЕRING, VOL. 87, NO. 2, JULY 20, 2004

[22] Cline S. W. еt аl., Тrапsfоrmаtiоп mеthоds fоr hаlорhiliс аrсhаеbасtеriа. Сап. J. Мiсrоbiоl., 1989, V. 35, P. 148-152.

[23] Dуаll-Smith M. Тhе hаlоhапdbоок: рrоtосоls fоr hаlоbасtеriаl gепеtiсs. 2008, (http://www.haloarchaea.com/resouгces/halohaпdbook).

[24] Sатbrоок J., Russеll D. W. Моlесulаr сlопiпg: а lаbоrаtоrу тапuаl. CoId Sрriпg Наrbоr, NY: CoId Sрriпg Наrbоr Lаbоrаtоrу Рrеss, 2001.

[25] Iпоuе H. еt аl., Нigh еffϊсiепсу trапsfоrтаtiоп оf Еsсhеriсhiа соli with рlаsтids. Gепе, 1990, V. 96, P. 23-28. [26] Оеstеrhеlt Тhе sуstет wаs сопсеivеd апd iтрlетепtеd withiп thе Dерt. оf

Метbrапе Вiосhетistrу оf thе Мах-Рlапск-lпstitutе оf Вiосhетistrу, Маrtiпsriеd, Gеrтапу (http://www.halolex.mpg.de/public)

[27] Эльпинер И. E. «Биoфизиκa ультразвука)) // Наука, M. 1973, 384 с, ил.

[28] Под редакцией Н.В.Коровина и А.М.Скундина., «Xимичecкиe источники тока: Справочник)) // M.: Издательство МЭИ, 2003, 740 с, ил.