La présente demande concerne des inhibiteurs de l'infection par un rétrovirus HIV, comportant un analogue peptidique du substrat de la DPPIV ou/et des motifs conservés dans la boucle V3 de la glycoprotéine d'enveloppe d'un rétrovirus du type HIV.

Le virus humain de 1*immuno-déficience (HIV) est l'agent étiologique du syndrome d•immuno-déficience acquise (SIDA) et de troubles qui lui sont apparentés. Jusqu'à présent deux types distincts mais apparentés de rétrovirus, le type HIV-1 et le type HIV-2 ont été identifiés. L'infection des lymphocytes T CD4+, des onocytes et des macrophages par HIV, nécessite 1'interaction des produits du gène env du virus avec le récepteur CD4 cellulaire (Klatzman D, et al. Nature 1984 ; 312:767-768).

Le gène env de HIV code pour une polyprotéine précurseur qui est clivée par une protéase cellulaire, conduisant à la production de glycoprotéines extra¬ cellulaires ou de surface (SU) et transmembranaires (TM) (Eiden LE, et al.Immunol. Today 1992 13:201-206). La protéine de surface, par le biais d'interactions non covalenteε avec la protéine transmembranaire est exposée à la surface des cellules infectées ou à la surface des particules virales.

Le récepteur CD4 est une glycoprotéine composée d'une région extracellulaire amino-terminale contenant quatre domaines apparentés à la famille des immunoglobulineε et d'une région carboxy-terminale contenant les domaines transmembranaire et cytoplas ique (Eiden et al) . Le premier domaine a ino- terminal de la molécule CD4 apparaît être le site principal de liaison des protéines de surface de HIV. En conséquence, cette liaison induit un changement de

conformation du complexe SU-TM (complexe formé par les glycoprotéines de surface et transmembranaires) permettant l'interaction du domaine amino-terminal de la protéine transmembranaire avec la membrane cellulaire, causant ainsi la fusion des membranes virale et cellulaire (Marsh M, et al Immunol. Today 1988 ; 8:369-371) ; Eiden LE et al. Immunol. Today 1992 ; 13:201-206 ; Putney S. et al TIBS 1992 ; 17:191-196). Cependant avant la fusion, la protéine de surface pourrait subir une modification par clivage protéolytique, qui dans le cas de la protéine de surface de HIV-1 (GP120) semble -même si la preuve directe n'en a pas encore été rapportée- avoir lieu au niveau du troisième domaine variable, communément appelé "boucle V3", c'est-à-dire le domaine principal de neutralisation (PND) (Moore JP, et al AIDS 1991 ; 5:S21-S33) .

Différentes observations ont jusqu'à présent permis de penser que la boucle V3 joue un rôle critique dans 1•infection par HIV-1 :

1) Des anticorps neutralisants produits naturellement chez des patients séropositifs pour HIV-1 sont principalement dirigés contre la boucle V3 (Goudsmit J, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 ; 85:4478-4482),

2) Des anticorps monoclonaux spécifiques de la boucle V3 n'affectent pas la liaison de la gpl20 au récepteur CD4 mais bloquent le processus de fusion (Kinney-Thomas E, et al. AIDS 1988 ; 2:25-29) ;

3) Des mutations dans la boucle V3 génèrent des virions dont le caractère infectieux est réduit (Grimaila RJ, et al. J. Virol, 1992 ; 66:1875-1883) ;

4) Des mutations dans la boucle V3 modifient le tropisme cellulaire (Chesebro B, et al. J. Virol. 1992 ; 66:6547-6554) et suscitent une modification dans le phénotype de HIV en tant que virus induisant un syncytium ou n'induisant pas un syncytium (De Jong JJ, et al. J. Virol. 1992 ; 66:6777-6780).

La boucle V3 contient de 35 à 41 acides aminés dont les cystéines aux deux extrémités sont reliées, par un pont disulfure formant une boucle. La boucle V3 contient des résidus basiques conservés et en outre la séquence à proximité des cystéines liées, est similaire dans la plupart des isolats. (Cléments GJ, et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1991 ; 7:3-16). Par conséquent, il semble qu'il existe une pression de sélection pour conserver les séquences spécifiques dans la boucle V3. Les anticorps monoclonaux dirigés contre des peptides (15-mer) représentant le sommet ("crown") de la boucle V3 ont la capacité de neutraliser HIV-1 (Langedijk JPM, et al. J. Gen. Virol. 1991 ; 72:2519-2526), cela suggère que les résidus d'acides aminés du sommet de la boucle sont impliqués dans les interactions fonctionnelles de la boucle V3.

Jusqu'à présent aucune preuve directe n'a pu être établie concernant le fait que le clivage de la boucle V3 serait essentiel pour l'infection par HIV, bien que la gpl20 purifiée ait pu être clivée en fragments de 50 et 70 kDa par différentes protéases : la trombine et la tryptase clivent le site tryptique (GPGR i AFVT) , alors que la cathepsine E clive un site chymotrypsine-like (GPGRAF -I- VT) (Cléments GJ, et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1991 ; 7:3-16).

Les inventeurs se sont intéressés à une séquence particulière de la boucle V3 de la glycoprotéine de surface de l'enveloppe du rétrovirus HIV-1, distincte de celles qui ont fait l'objet d'expériences dans l'art antérieur, et aux séquences correspondantes des rétrovirus HIV-2 et SIV. Ils ont observé qu'un très grand nombre d*isolats identifiés de HIV, notamment HIV-1 (plus de 90%) présentent un motif peptidique constitué par la séquence d'acides aminés Gly-Pro-Gly (Glycine - Proline - Glycine ou selon le code à une lettre GPG) et plus particulièrement un motif Gly-Pro, conservé. Ce motif GP ou GPG reste en outre inchangé in

vivo pendant plusieurs années chez des individus infectés par HIV-1, alors que d'autres substitutions apparaissent dans la boucle V3 (Holmback et coll. J. Virol. 1993, 67:1612-1619).

De plus, l'ensemble des isolats identifiés de HIV-1, HIV-2 et SIV présentent à l'extrémité N- terminale de la boucle V3 un motif dipeptidique conservé RP (Arginine - Proline) . Par ailleurs, pour HIV-2 et SIV, on trouve .aussi un motif dipeptidique conservé RP (Arginine-Proline) ou KP (Lysine- Proline) , à l'extrémité C-terminale de la boucle V3. Par ailleurs, pour SIV MND, on trouve aussi un motif dipeptidique EP (Acide glutamique - Proline) dans la boucle V3.

En dehors de la boucle V3, dans le cas de HIV-1, on trouve plusieurs motifs conservés, par exemple les séquences IPI (Isoleucine-Proline-Isoleucine) , GPC (Glycine-Proline-Cystéine) ,PPG(Proline-Proline-Glycine) , situés respectivement aux acides aminés 185 et 208,de SU et 411 de TM, par rapport à la séquence consensus de Myers et al (1992) .

Les inventeurs ont démontré qu'une protéine cellulaire de surface interagit avec les glycoprotéines de l'enveloppe de HIV ou de SIV, en particulier au niveau de la boucle V3 et est susceptible de la cliver. Ce clivage aurait lieu en un site non identifié comme tel jusqu'à la présente invention. La protéine cellulaire de surface est la dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) également appelée antigène ou récepteur CD26 (Barclay AN, et al. (1993). Facts book. London : Harcourt Brace Jovanich) . Dans la littérature, la DPPIV/CD26 est également appelée : DPIV, DAPIV, SGP-115/107, Tal et Tal03. La DPPIV est une protéase de surface cellulaire (EC 3.4.14.5) qui possède en général une activité d'exopeptidase et dans certaines conditions une activité d'endopeptidase (Nagatsu T, et al. Anal. Bioche . 1976 ; 74:466-476 - Kudo M, et al J.

Bioche . 1985 ; 97:1211-1218 - Kenny AJ, et al. Biochem. J. 1976 ; 155:169-182). Son activité enzymatique peut être testée par le clivage de dipeptides synthétigues couplés au substrat chromogène p-nitroanilide (para-nitroanilide) , ces peptides ayant une séquence X-Pro-p-nitroanilide, pour produire un peptide X-Pro et de la p-nitroaniline (Nagatsu T, et al. Anal. Biochem 1976 ; 74:466-476) X pouvant être un résidu acide aminé, notamment Glycine (Gly) , Alanine (Ala) , Lysine (Lys) , Arginine (Arg) , Acide Glutamique (Glu) , Acide Aspartique (Asp) ou même Proline (Pro) .

L'antigène CD26 est largement exprimé sous la forme d'une glycoprotéine transmembranaire de 110 à 120 kDa, gui est identique à la serine protéase de surface cellulaire appelée dipeptidyl peptidase IV. Cette enzyme qui est généralement considérée comme une exopeptidase, clive des dipeptides dans la partie amino-terminale de substrats polypeptidiques, dès lors que l'avant-dernier résidu est un résidu proline ; c'est-à-dire que cette enzyme permet le clivage de X- P-polypeptide, P étant un résidu Proline, lorsque X est un acide aminé N-terminal libre (Kudo M, et al. J. Biochem. 1985 ; 97:1211-1218). En outre, la DPPIV a été décrite comme capable de catalyser un clivage "endopeptidase-like", après un motif dipeptidique "GP- like" au sein de peptides synthétiques (Kenny AJ, et al. Biochem. J. 1976 ; 155:169-182) et de se fixer au collagène (Beauvois B, et al. I. Marcel Dekker (Eds.) New York, 1991) . La DPPIV lie le collagène mais cette liaison de la DPPIV au collagène n'affecte pas son activité enzymatique (Hanski C, et al. Exp. Cell Res. 1988 ; 178:64-72), suggérant ainsi l'existence de sites d'accrochage et catalytique dans différents domaines de DPPIV/CD26.

La DPPIV est une glycoprotéine comportant plusieurs chaînes oligosaccharidiques liées à des résidus N. La séquence hydrophobe près de l'extrémité

amino-terminale (peptide signal) de cette ectoenzyme, fonctionne comme un domaine d'ancrage à la membrane, les 6 acides aminés N-terminaux formant un domaine cytoplas ique et l'extrémité carboxy-terminale de la protéine constituant le domaine extracellulaire (Ogata S, et al. J. Biol. Che . 1989 ; 264:3596-3601 - Hong W, et al. J. Cell Biol. 1990 ; 111:323-328). Cette enzyme existe dans une grande variété de tissus y compris dans des organes lymphoides et non-lymphoïdes (Gorrel MD, et al. Cell. Immunol. 1991 ; 134:205-215). Elle est exprimée sur les membranes apicales de cellules épithéliales (bordures en brosse et surfaces canaliculaires) , endothéliales, certains lymphocytes T, des cellules folliculaires dendritiques et des macrophages (Gorrel MD, et al Cell. Immunol. 1991 ; 134:205-215 - McCaughan et al. 1990 Hepatology 11, 547-558. - Sannes PL, et al J. Histochem. Cytochem. 1983 ; 31:684-690). L'activité enzymatique a été détectée sur différentes lignées cellulaires humaines d'origine T et B, de même que sur des monocytes du sang périphérique (Beauvois B, et al. I. Marcel Dekker (Eds.) New York, 1991). L'expression de DPPIV/CD26 est faible dans les lymphocytes T au repos, mais elle augmente considérablement après leur activation; pour cette raison, DPPIV/CD26 est considéré comme un antigène d'activation des lymphocytes T.

On utilisera indifféremment les expressions DPPIV ou CD26 dans la suite du texte.

L'identification d'un nouveau mécanisme impliquant le récepteur CD26 comme médiateur de l'infection chez l'homme par un rétrovirus du SIDA, et plus particulièrement son implication dans l'entrée du rétrovirus dans les cellules telles que les lymphocytes T, les monocytes et les macrophages, permet de définir de nouveaux moyens pour lutter contre 1•infection par un rétrovirus HIV ou SIV, et en particulier donne accès

à de nouveaux inhibiteurs de l'infection des cellules par le rétrovirus.

Les inventeurs ont plus particulièrement montré que la DPPIV est un co-récepteur pour HIV, qui est susceptible de lier la boucle V3, et/ou d'autres régions dans les glycoprotéines de l'enveloppe virale SU et TM. Cette étape concernant l'interaction du complexe SU/TM avec DPPIV/CD26 est essentielle pour la pénétration de HIV dans les cellules T CD4.

L'invention a donc pour objet des inhibiteurs de l'infection par un rétrovirus HIV, comportant une pluralité de motifs susceptibles d'être reconnus par une ectoprotéine (à la surface des cellules) notamment par le récepteur CD26 (encore appelé enzyme DPPIV) ces motifs étant tous portés par une matrice peptidique ou non autorisant leur présentation multiple à l'enzyme. Dans ce qui suit, il sera fait référence à l'ensemble de ces motifs ainsi présentés à l'enzyme sous l'expression "motifs répétés".

La matrice permettant la présentation multiple d'un motif choisi, est définie par rapport à sa capacité à rendre accessible le susdit motif.

Il est important de remarquer que l'expression "peptidique(s)", telle qu'utilisée dans le présent contexte, qu'il s'agisse des "motifs répétés peptidiques" ou de la "matrice peptidique", s'entend comme couvrant tant des molécules purement peptidiques (en tant qu'elles sont à base de résidus d'acides aminés naturels) que des molécules dérivées des précédentes par remplacement de tout ou partie de ses résidus d'acides aminés naturels par des isomères optiques de ces acides aminés naturels ou même par des groupes "non peptidiques" (conduisant par exemple à des "pseudo-peptides") , dès lors que ces remplacements n'entraînent pas une altération sensible des propriétés pertinentes desdits motifs répétés (notamment leur capacité à être reconnus par l'enzyme DPPIV) ou de la

matrice (notamment capacité de présentation desdits motifs répétés à l'enzyme).

Selon un premier mode de réalisation des produits de l'invention la matrice peptidique portant les "motifs répétés" contient des résidus d'acides aminés possédant une fonction réactive non engagée dans une liaison peptidique avec des résidus voisins d'acides aminés, ces fonctions réactives intervenant dans la fixation desdits motifs répétés sur cette matrice. De préférence, la matrice peptidique comprend des résidus d'acides aminés de type lysine (K) , les susdits motifs répétés étant alors greffés sur les groupes epsilon- a ino d'une partie au moins de ces résidus lysine.

D'autres résidus d'acides aminés peuvent également être mis en oeuvre pour le greffage des susdits motifs répétés, tels que l'arginine ou encore des résidus glutamyle qui porterune fonction carboxyle non engagée dans les liaisons peptidiques avec d'autres acides aminés de la matrice.

La matrice peut être synthétique et par conséquent préparée par synthèse chimique notamment en utilisant la synthèse en phase solide telle que décrite par Merrifield.

Une première molécule intéressante dans le cadre de la réalisation de l'invention est par exemple caractérisée en ce que la matrice peptidique comprend l'enchaînement d'acides aminés suivant : K X., K X ₂ X ₃ dans lequel X _: est, de préférence, la lysine, la valine, l'alanine ou l'acide glutamique ou l'isoleucine, X ₂ et X ₃ représentent la glycine ou la proline et sont différents l'un de l'autre.

Les motifs répétés peuvent dans ce cas être liés aux fonctions e-amino des résidus lysine, notamment par des liaisons peptidiques, et peuvent être présentés dans un même plan ou au contraire dans des plans différents. De même ces motifs peuvent être liés du

même côté de la matrice par rapport au résidu lysine ou de façon opposée.

Le résidu d'acides aminés X^ peut, le cas échéant, être supprimé.

D'autres matrices peptidiques intéressantes pour la réalisation des molécules de l'invention, comprennent un enchaînement d'acides aminés choisi parmi les séquences suivantes

K X, K G P

K *1 K K G P

K Xi K G P K X ₄ K

K Xi K G P K X* K G c,

K Xi K G G K X ₄ K G c,

K K K Xi K G P

K Xi K P G

K Xi K K P G

K Xi K K G C

K Xi K P G K X ₄ K

K Xi K P G K X ₄ K G C

K K

K X, K X ₄ K X, K G C dans lesquels X ₁ est facultatif et peut être la lysine, la valine, l'alanine, l'acide glutamique ou 1'isoleucine et X_, est facultatif et peut être l'acide glutamique, la valine, l'alanine ou l'isoleucine.

Ces matrices permettent la présentation de l'espace selon des configurations variées des motifs répétés.

La présence d'un résidu C à l'extrémité COOH- terminale, et/ou de résidus G et C au niveau de la matrice permet le couplage spécifique éventuel à une structure de type "carrier" ou à des liposomes.

Ainsi les motifs répétés peuvent être liés au résidu lysine suivant un plan, certains se trouvant le cas échéant perpendiculaires les uns par rapport aux autres ou de chaque côté de la matrice.

De préférence, les acides aminés contenus dans la matrice peptidique sont sous la forme dextrogyre.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les liaisons peptidiques entre les acides aminés de la matrice sont modifiées notamment pour améliorer leur résistance à l'hydrolyse par les protéases in vivo.

Le nombre de motifs répétés liés au résidus lysine de la matrice peut varier considérablement.

Ce nombre peut être déterminé en fonction du nombre de résidus lysine présents sur la matrice peptidique et peut être adapté de façon à optimiser leur capacité à inhiber l'entrée du virus dans les lymphocytes in vivo, et en tenant compte de l'influence de la présence d'un nombre accru de motifs sur l'éventuelle toxicité in vivo des molécules ainsi obtenues. Avantageusement, le nombre de motifs répétés présentés par la matrice est compris entre 2 et 8, de préférence entre 4 et 6 motifs, par exemple 5 motifs.

Le cas échéant, il sera tenu compte du nombre d'acides aminés contenus dans le motif répété pour déterminer le nombre de motifs liés à la matrice peptidique.

Les modifications des liaisons entre les acides aminés des motifs répétés et/ou de la matrice peptidique peuvent être de différentes natures. Une modification appropriée peut être réalisée au niveau de la liaison peptidique, afin d'empêcher le clivage de cette liaison et donc afin de diminuer ou de supprimer la sensibilité aux peptidases.

Les techniques habituelles de modification des liaisons peptidiques peuvent être mises en oeuvre.

On citera notamment sans caractère limitatif les modifications de la liaison peptidique -CONH- conduisant à la formation d'une liaison réduite (CH NH) , rétro inverso (NHCO) , méthylène-oxy (CH ₂ -0) , thiométylène (CH ₂ -S) , carba (CH ₂ CH ₂ ) , cétométhylène (CO-CH ₂ ) , hydroxyéthylène (CHOH-CH ₂ ) ou Aza (N-N) .

Le cas échéant on pourra préférer l'utilisation dans le cadre de l'invention des énantiomères D plutôt que des molécules ayant une configuration L.

Les motifs répétés préférés utilisés pour réaliser les molécules de l'invention devront renfermer au moins deux et avantageusement trois charges positives que l'on pourra choisir parmi les possibilités suivantes :

- le groupement α, NH ₂ du motif

- le groupement α, NH ₂ de l'a aminohexanoic acid

- le groupement e aminé de la lysine et le groupement «5 aminé de l'ornithine et plus généralement les groupements a , β , -y, δ et e aminés (acide a , ₇ diaminobutyrique ; acide ₇ , β diamino propionique)

- le groupement guanidino de l'arginine.

Avantageusement ces deux charges seront séparées par au moins un résidu acide aminé neutre tel que Gly, Pro, Ala. Les motifs auront par exemple pour séquence, RP, KP, PK, PR, RK, KR, KPR, RPK, PKR, PRK, KER, KGQ, KGR, RPR, RPG, AHxPR, pyrKR, RPGR, KPGR, KPRG, GPGR, IPIG, GPGRAF, KRPGNK, RPGNK, KRPRQ, KPRQAG

Les séquences ci-après désignées sont décrites au moyen du code dit à une lettre utilisé pour désigner les acides aminés selon le tableau suivant :

Code à une lettre Acide Aminé

A Alanine

R Arginine

N Asparagine

D Acide Aspartique

C Cystéine

Q Glutamine

E Acide Glutamique

G Glycine

H Histidine

I Isoleucine

L Leucine

K Lysine

M Méthionine

F Phényalanine

P Proline

S Serine

T Thréonine

W Thryptophane

Y Tyrosine

V Valine

AHx Acide aminohexanoique pyr Acide pyroglutamique Pour les besoins de cette description on a eu (ou aura encore) recours au "code" suivant :

X N•importe quel acide aminé ou un acide aminé variable

Une molécule particulièrement préférée (ne faisant intervenir que des "vraies" liaisons peptidiques) pour la réalisation de l'invention répond à la formule suivante :

R R R R

P P P P

K K K K 5 (KPR) TASS

R P K - K K K G P K E K G C

Selon une variante, les motifs répétés liés aux résidus lysine de la matrice peptidique peuvent être semblables ou de nature différente.

Ainsi on pourra tenir compte dans le choix des motifs répétés liés à la matrice peptidique des variations de la séquence de la boucle V3 de différents isolats du rétrovirus HIV.

De plus, ces motifs répétés peuvent être choisis de façon telle qu'ils comprennent à la fois un épitope B et un épitope T de la glycoprotéine externe d'enveloppe d'un rétrovirus HIV.

Selon une autre variante de réalisation de l'invention, la molécule est caractérisée en ce que la matrice peptidique est remplacée par une molécule fonctionnellement équivalente choisie parmi les polyamines, par exemple le Tris (2-aminoethyle) aminé ou des dendrimères (R. olf, Fréquence Chimie p. 13-17, Molécules de grande taille) .

L'invention a par ailleurs pour objet une composition susceptible d'inhiber l'infection due à un rétrovirus humain de type HIV, notamment de type HIV-1 ou HIV-2, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, une molécule ci-dessus définie.

Une telle composition est en particulier définie par sa capacité à inhiber l'interaction entre le récepteur cellulaire CD26 (DPPIV) et la glycoprotéine externe d'enveloppe d'un rétrovirus du type HIV, cette interaction manifestant l'incapacité alors acquise par le rétrovirus à pénétrer dans les lymphocytes CD4, comme l'atteste l'absence de formation de syncitia et d'induction de l'apoptose, comme on l'observe dans des cultures témoins. Il y lieu de noter que le mécanisme

d'action des inhibiteurs selon l'invention ne fait normalement pas intervenir une inhibition de l'activité enzymatique de la DDPIV, laquelle n'est normalement pas affectée.

L'invention vise également l'utilisation d'une molécule telle que définie précédemment pour la préparation d'un médicament pour le traitement d'une infection due à un rétrovirus humain de type HIV, notamment en empêchant la fusion de membranes cellulaires.

D'une façon générale, entrent dans le cadre de l'invention une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif une molécule telle que définie ci-dessus.

Cette composition pharmaceutique peut être utilisée pour le traitement ou la prévention de l'infection par le rétrovirus HIV, notamment en tant que composition i munogène notamment en tant que vaccin.

D'autres caractéristiques et avantages de 1'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent.

Exemples :

On connait dans l'état de la technique les molécules du type TASP (template assembled synthetic protein) développées pour transférer les caractéristiques spécifiques d'une enzyme à des molécules facilement accessibles et ainsi pour construire de nouvelles protéines et enzymes (Mutter M. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 24 (1985) 639-653).

Sur cette base, une construction a été définie et synthétisée, que l'on a appelée molécule TASS (en anglais, "template assembled synthetic substrate") .

Dans une molécule de ce type, la matrice est utilisée pour former une région d'ancrage covalent d'un peptide (par exemple le peptide K-P-R) qui inhibe, en

temps que monomère à une molarité relativement forte (10 M) , l'entrée de HIV dans les cellules CD4+. a) Structure de la molécule R R R R

P P P P K K K K

M M

RPK-KKKGPKEKGC b) Réactifs chimiques

Le dichlorométhane (DCM) et l'acide trifluoroacétique (TFA) ont été obtenus sous forme redistillée auprès de Neosystem (Strasbourg, France) . Le N,N-diméthylformamide (DMF) et le diisopropyléthylamine (DIEA) ont été achetés auprès de SDS (Peypin, France) .

Le tert-butyl-methyl-ether (MTBE) , le benzotriasolyl-oxy-tris (diméthylamino) -phosphonium hexafluorophosphate (réactif BOP) et le hydroxybenzotriazole (HOBt) proviennent de Fluka (Mulhouse, France) . Les acides aminés protégés proviennent de Neosystem (Strasbourg, France) . La résine PAM Boc Cys (4 Me Bzl) vient de A.B.I. (Roissy, France) . Le fluorure d'hydrogène provient de Prodair (Strasbourg, France) .

c) Assemblage de la matrice

Boc Boc Boc Boc

I l I I

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Boc K K K G P K E K G C - PAM Résine

I I I

Clz 0-CHX 4-MeBzl

L'assemblage de la chaîne peptidique protégée a été réalisé en utilisant la méthode de synthèse en phase solide selon Merrifield (1963, J. A . Chem. Soc.

85, 2149-2153) avec un synthétiseur peptidique à canon

multiple travaillant en mode semi-automatique (Neimark, J. et Briand J.P. (1993) Peptide Res., 6,219-228). Cent soixante mg (0,1 mmole) de résine PAM Boc Cys (4-MeBzl) (substitution 0,6 meq/g) ont été placés dans un récipient de réaction de 20 ml. La déprotection du groupe protecteur Boc a été réalisée dans 60% de TFA dans du DCM pendant 30 min, puis la résine a été lavée deux fois avec du DCM et trois fois avec 5 ml de DMF. Les acides aminés 2 à 9 utilisés pour construire la matrice ont été protégés en position α-amino avec un groupe Fmoc. Les groupements protecteurs de chaîne latérale utilisés étaient : le cyclohéxyle ester (Glu 4) , le chlorobenzyloxycarbonyle (Lys 9) , le t- butyloxycarbonyle (Lys 3, 5, 8). La lysine en position 10 a été introduite sous forme d'un dérivé Boc Lys Boc. Le cycle utilisé pour l'incorporation de chaque dérivé d'acide aminé est le suivant :

Etape Réactif Durée de l'étape Volume

Déprotection 25% pipéridine 3 x 4 min 5 ml / DMF

Rinçage 5 x DMF 5 x 15 sec 5 ml

Couplage Fmoc acide amme 20 min 2 ml

5 eq

BOP 5 eq

HoBt 5 eq

DIEA 10 eq

Rinçage 3 x DMF 3 x 15 5 ml

Le contrôle avec le test à la ninhydrine a montré que tous les couplages étaient complets en 20 min et aucun recouplage n'a été nécessaire. d) Assemblage multiple du tripeptide KPR sur la matrice

Les groupes protecteurs Boc de la résine PAM de la matrice ont été clivés dans 60% de TFA/DCM pendant 1 min (prélavage) et 30 min, puis la résine a été lavée

avec du DCM et du DMF. La nouvelle substitution de la résine était de 3 meq/g (0,5 mmole de groupes aminés dans le récipient de réaction) . L'élongation des chaînes peptidiques a été obtenue en utilisant 4 eq en excès de Fmoc Arg (Pmc) , Fmoc Gly et Fmoc Lys (Boc) . Le temps de déprotection des groupes de protection Fmoc a été élevé à 3 x 7 min dans 25% d'un mélange pipéridine/DMF. A la fin de la synthèse et après la dernière étape de déprotection, la résine a été lavée avec du DCM et séchée sous azote. Les groupes protecteurs Pmc et Boc des dérivés de l'arginine et de la lysine ont ensuite été clivés avec le réactif de King (King, D. Field, C. et Fields, G. (1990) . Int. J. Pept. Protein Res. 36, 255-266) pendant 2h30 et la résine a été lavée à nouveau avec du DCM et séchée sous un flux d'azote. e) Clivage final en présence de fluorure d'hydrogène

Le peptide fixé à la résine (620 mg) finalement obtenu a été testé avec 10 ml de HF et 1 ml d'anisol à 0°C pendant 45 min. Après le retrait du fluorure d'hydrogène sous vide, la résine a été lavée avec de 1•éther et le peptide a été élue avec 8 ml de TFA pur et précipité à nouveau avec du MTBE. Après centrifugation, le culot de centrifugation a été dissous dans 10 ml d'eau et lyophylisé. f) Analyse et purification de la molécule L'homogénéité du produit final a été vérifiée au moyen d'une étape analytique sur une colonne en phase inverse du type C18 nucléoside (150 x 4,6 mm) en utilisant un système tampon TEAP. Le gradient linéaire détecté à 201 nm était de 1 à 21% en 20 min.

Après lyophilisation, 190 mg de la molécule ont été obtenus. 100 mg ont été utilisés pour les expériences d'inhibition, 20 mg ont été utilisés pour être couplés à des liposomes et 70 mg ont été fortement purifiés sur une colonne Delta pak C18.

Activité biologique de la molécule 5(KPR)TASS

a) Effet de la molécule 5(KPR)TASS sur l'activité DPP IV

Dans cet essai, l'activité mettant en jeu l'affinité de cette molécule pour que l'enzyme DPPIV n'interfère pas sensiblement avec l'activité enzymatique de la DDPIV, contrairement à l'inhibiteur (ALBA 2) connu pour inhiber cette activité et utilisé à des fins de comparaison, comme en témoignent les résultats des essais comparatifs qui suivent et qui permettent l'appréciation de leurs effets respectifs sur cette activité. Ces effets ont été mesurés par étude du clivage de GP-pNA dans un tampon peptidase, dans les conditions expérimentales décrites par Callebaut et al, 1993, Science, 24 Dec. 1993, appliquées à une lignée de cellules T humaines, CEM, infectée par le virus HIV-1 LAI, et ce en présence de la molécule 5(KPR)TASS et de l'inhibiteur ALBA 2. Les résultats de ces essais apparaissent dans le tableau suivant, relatif aux Valeurs de IC ₅₀ des inhibiteurs peptidiques testés, sur l'activité DPP IV

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Peptide Concentration inhibitrice à 50%

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Enzyme solubilisée Enzyme à la surface des cellules ************************************************************ ********

KPR 0,2 mM 10 mM

5(KPR)TASS 1 mM 5 - 10 mM

ALBA 2 0,2 M 1 M

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ALBA 2 : Lys(Z(N0 ₂ )-pyrrolidid HCL K: Lys; P: Pro; R: Arg

Comparé à ALBA 2, la molécule 5(KPR)TASS est 5 000 à 10 000 fois moins active pour l'inhibition de l'activité DPP IV.

b) Inhibition de l'entrée de HIV-1 par la molécule 5(KPR)TASS

L'entrée de HIV-1 LAI a été testée par infection de cellules CEM pendant 1 h. Le virus extracellulaire a été éliminé par traitement avec la trypsine et l'internaiisation de HIV a été suivie en testant la concentration de p25 (Callebaut et al, 1993, précité).

Inhibition de l'entrée de HIV par 5 (KPR)TASS

Peptide p25 internalisée % Inhibition pg/10 ⁵ cellules

Aucun 280

KPR 5 mM 156 44

KPR lOmM 45 84

5 (KPR)TASS 10 μM 175 38

5 (KPR)TASS 25 μM 111 60

5 (KPR)TASS 50 μM 53 81

5 (KPR)TASS 100 μM 27 90

5 (KPR)TASS 200 μM < 1 > 99

Héparine 100 μg/ml < 1 > 99

Conclusion : la molécule 5 (KPR)TASS est un inhibiteur puissant de l'entrée de HIV. La valeur de la IC ₅₀ est d'environ 10 μM. Ainsi comparé au monomère KPR, 5(KPR)TASS est 500 fois plus actif. On notera que à 200 μM de 5 (KPR)TASS, l'activité enzymatique DPP IV n'est pas affectée du tout.

Ces résultats sont à rapprocher de ceux qui ont été rapportés par Schôn et coll. 1991, qui ont

constatés que le puissant inhibiteur de l'activité enzymatique de la DDP-IV que représente l'ALBA-2 n'inhibe pas la fonction de la CD26 au cours de 1'activation des cellules T. c) Inhibition de l'infection par HIV-1 par 5 (KPR)TASS

Des cellules CEM ont été incubées (37°C, 30 min) avec différentes concentrations (200, 100, 50, 25 et 5 μM) de 5 (KPR)TASS avant l'infection avec HIV-1 LAI. Les cellules infectées en présence de l'inhibiteur ont ensuite été cultivées pendant 4 jours et la production de virus a été testée en suivant la concentration de p25 dans le surnageant de culture. La production de HIV a été inhibée de façon considérable par la molécule 5 (KPR)TASS et cette inhibition était dépendante de la dose : plus de 90 % d'inhibition à 20 μM et autour de 50 % d'inhibition à 5 à 10 μM. Comme la production du virus était inhibée par 5 (KPR)TASS, la formation de syncytia était également inhibée.

d) 5 (KPR)TASS inhibe la formation de syncytia

Pour démontrer l'effet de 5(KPR) TASS sur la formation syncytia, les cellules CEM ont été d'abord infectées avec HIV-1 LAI avant l'addition de différentes concentrations de 5 (KPR)TASS. La production de virus et la formation de syncytia ont été suivies à 4 jours après l'infection. Comme la molécule 5 (KPR)TASS était ajoutée après l'infection (c'est à dire après l'entrée de HIV dans les cellules), la production de virus n'était pas affectée. Cependant la formation de syncytia était complètement inhibée à 200 μM, était inhibée à 75% à 100 μM et à 50% avec 50 μM de 5 (KPR)TASS.

Ces résultats confirment que 5(KPR)TASS est un inhibiteur de l'entrée, comme cela a été démontré dans la section c (c'est-à-dire en inhibant la fusion des

membranes virales et cellulaires) et montrent de plus que 5(KPR)TASS est aussi un inhibiteur de la formation de syncytia en empêchant la fusion des membranes des cellules infectées avec des cellules voisines.

e) La molécule 5 (KPR)TASS n'a pas d'effet toxique sur la croissance cellulaire

Le nombre de cellules, CEM ayant poussé en l'absence ou en présence de 100 μM de 5 (KPR)TASS était comparable après 3 trois jours de culture.

f) Inhibition de l'infection par HIV-2 et SIV

Les cellules (CEM clone 13 ; CEM 174, HUT 78) ont été incubées (37"C, 30mn) avec différentes concentrations (80, 40, 20 et 10 μM) de 5 (KPR)TASS avant l'infection avec HIV-2 ROD, HIV-2 EHO ou SIV mac. Les cellules infectées en présence de l'inhibiteur ont ensuite été cultivées pendant 4 jours et la production de virus a été testée en observant 1 ^• activité de la transcriptase inverse dans le surnageant de culture. La production de HIV-2 et SIV a été inhibée de façon considérable par la 5 (KPR)TASS. Les doses d'inhibition à 50 % ont été estimées environ à 10-20 μM de la 5(KPR)TASS.

g) 5(KPR)TASS inhibe l'induction de la mort cellulaire ou l'apoptose

Des cellules chroniquement infectées par le HIV-1 (par exemple, les cellules H9/IIIB ; Resnick et al., 1986, K. Infect. Dis. 154, 1027-1030) à cause de l'expression du complexe gpl20/gp41 des glycoprotéines d'enveloppe de HIV, peuvent être utilisées en tant que cellules effectrices pour induire l'apoptose dans des lymphocytes CD4+ (par exemple, les cellules MOLT-4 T4) . En l'espace d'une vingtaine d'heures, de la coculture des cellules H9/IIIB dans MOLT-4-T4,

1'apoptose est détectée dans les cellules M0LT-4 (Laurent-Crawford et al. 1992, in "Rétrovirus of Human AIDS and Related Diseases, pp.35-41, Vllè Colloque des Cent Gardes). 5(KPR)TASS à une concentration de 50-100 μM est capable d'inhiber complètement l'induction de la mort cellulaire ou l'apoptose dans les cellules MOLT-4.

h) Des inhibiteurs de l'activité DPP IV ne sont pas nécessairement inhibiteurs de l'entrée du VIH

ALBA 2 (H-Lys-[Z(N0 ₂ ) ]-pyrrolidide) est un inhibiteur puissant de l'activité DPP IV (Schôn et coll., 1991, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 372, 305-311). L'activité de la DPP IV à la surface des cellules est inhibée à 90 % à 20 μM et à 50 % à 1 μM. Contrairement à cette inhibition de l'activité enzymatique de la DPP IV, ALBA 2 n'exerce un effet ni sur l'entrée du VIH, ni sur la. formation de syncytia, ni sur l'induction de l'apoptose, même à une concentration de 50 μM. La concentration de 100 μM est toxique pour les cellules. Au contraire, la molécule 5(KPR)TASS, qui n'exerce qu'un faible effet sur l'activité DPP IV, bloque considérablement l'infection des cellules par le VIH.

Inhibiteur (IC ₅₀ ) (IC ₅₀ )

Activité DPP IV Inhibition de l'entrée

ALBA 2 lμM pas d'effet à 50μM

5(KPR)TASS 5mM 5μM

IC ₅₀ : dose de l'inhibiteur nécessaire pour une inhibition égale à 50 %

Ces résultats suggèrent que 1•activité catalytique de DPP IV/CD26 n'est pas nécessaire pour son fonctionnement dans l'infection des cellules par le VIH. Par ailleurs, la molécule 5(KPR)TASS qui n'affecte pas l'activité à des concentrations inférieures à 1 M inhibe 1•infection virale à plus de 95 % à une dose de 100 μM et à 50 % à une dose d'environ 5 μM. Une explication logique de ces résultats est que la molécule 5(KPR)TASS a une forte affinité pour un site dans la DPPIV/CD26 (site d'accrochage) qui devrait être indépendant du site catalytique impliqué dans l'activité enzymatique. Du fait que KPR pourrait servir de substrat suggère aussi que le site catalytique et le site d'accrochage interagissent avec des structures peptidiques similaires. i) exemple de différents inhibiteurs pour l'infection par le HIV de type 5(KPR)TASS Les cellules CEM ont été incubées (37°C, 30 min) avant 1•infection avec HIV-1 LAI avec différentes concentrations (de 50 à 0,5 μM) . Les cellules infectées en présence de 1*inhibiteur ont ensuite été cultivées pendant 4 jours et le production de virus a été évaluée en mesurant la concentration de p25 dans

le surnageant de culture. Le tableau ci-dessous indique la concentration du peptide qui donne une inhibition d'au moins 90% et 50% de la production du virus.

Concentration du peptide inhibant la production du HIV

Peptide 90% 50%

5(KPR)TASS 20 μM 10 μM

5(KGR)TASS 50 μM N.T.

5(PKR)TASS 50 μM N.T.

5(RPK)TASS 10 μM 1 μM

5(KΦCH ₂ -N-PR) TASS ^* 1 μM 0,5 μM

La liaison peptidique entre KP est réduite. N.T. non testé h) le site de reconnaissance du peptide

5(KPR)TASS dans CD26

Les anticorps 1F7 contre la CD26 (C. Morimoto, DanaFarber Cancer Institute, Boston USA) bloquent l'entrée du virus HIV (Callebaut et al.. Science, 262, 2045-2050) sans inhiber l'activité enzymatique de la CD26. Ces résultats ont suggéré que le site d'interaction de la CD26 avec l'enveloppe du HIV se situe en dehors du site de reconnaissance du substrat de l'activité peptidase de CD26. Cette suggestion est en accord avec l'action de la peptide 5(KPR)TASS gui à la concentration de 50 μM inhibe plus de 90 % de l'entrée du virus sans affecter l'activité enzymatique.

Pour démontrer si le site d'action de la 5(KPR)TASS est le même que celui de l'anticorps 1F7, nous avons effectué l'expérience suivante : les cellules MOLT une lignée de lymphocytes T humain (CD4+

et CD26+) ont été incubées (5 min à température ambiante) avec ou sans addition de 50 μM de 5(KPR)TASS ou 50 μM de ALBA 2 (qui inhibe l'activité enzymatique mais pas l'entrée du virus). Les anticorps ont été ajoutés ensuite tels que MAb 1F7 anti CD26, MAb BA5 un autre anticorps anti CD26 (Immunotech) qui n'affecte pas l'entrée du HIV, MAb OKT4 anti-CD4 (Ortho Diagnostics Systems) , MAb ALBl anti CD45 (Immunotech) (tyrosine kinase associée avec CD26) et les cellules sont incubées à 4°C pendant 1 h. Les cellules sont ensuite lavées et analysées par FACS (abréviation de l'expression anglaise "Fluorescence- activated cell sorting analysis" ou "analyse par fluorescence de catégories de cellules activées") : voir la figure fournissant les spectres caractéristiques résultant de l'analyse par FACS de la reconnaissance du CD26 (par MAb 1F7 et MAb BA5) , CD4 (par MAb OKT4) et CD45 (par MAb ALBl) à la surface des cellules MOLT en l'absence ou en présence de 5 (KPR)TASS (cité comme S13) et ALBA2. Les résultats montrent que 5(KPR)TASS (cité sous le nom S13) inhibe la reconnaissance de CD26 par MAb 1F7 tandis que la reconnaissance de CD26 par MAb BA5 n'est pas affectée, indiquant ainsi que l'épitope de MAb 1F7 "est bien le site d'interaction de 5(KPR)TASS. Il est intéressant de noter que ALBA 2 qui n'affecte pas l'entrée du virus ne modifie pas la reconnaissance de la CD26 par l'anticorps 1F7 ou par BA5.

L'effet de 5(KPR)TASS sur 1 ^» épitope de MAb 1F7 c'est à dire CD26 est spécifique car la reconnaissance des autres antigènes de surface tels que CD4 et CD26 ne sont pas modifiés par 5(KPR)TASS.

Conclusion

Le complexe glycoprotéine formant l'enveloppe du virus et comportant la protéine de surface SU (gpl20) et la protéine transmembranaire TM (gp41) , joue un rôle important dans l'infection par le VIH ; la gpl20 contient le site de fixation au CD4, et la gp41 le motif peptidique nécessaire au processus de fusion membranaire. L'association non-covalente de la gpl20 et la gp41 forme un complexe conformationnel qui est essentiel pour les deux fonctions principales du complexe gpl20/41 ; l'entrée du noyau (core) du virus dans les cellules par fusion des membranes virale et cellulaire, et l'induction de l'effet cytopathogène par fusion des membranes des cellules infectées (exprimant le complexe gpl20/gp41 à la surface) avec celles des cellules voisines.

L'expression du complexe gpl20/gp41 à la surface des cellules infectées conduit à une interaction avec les molécules CD4 des cellules voisines non infectées, qui entraîne un effet cytopathogène caractéristigue du VIH (Laurent-Crawford et al., 1993, AIDS Res. Hum. Retroviruses _, 761-773) : formation de syncytia (cellules multinucléées générées par la fusion des cellules infectées avec les cellules non infectées) et/ou la mort cellulaire par apoptose (fragmentation de la chromatine au niveau des liens internucléosomiques) .

Le fait que les différentes fonctions du complexe d'enveloppe gpl20/gp41 : 1) l'entrée virale ; 2) la formation des syncytia ; 3) l'induction de l'apoptose sont inhibées par la molécule 5(KPR)TASS suggère que dans ces différentes fonctions du complexe gpl20/gp41, cette molécule inhibe l'interaction de la boucle V3 avec une protéine de surface, par exemple, la DPPIV/CD26.

5 (KPR)TASS est un inhibiteur potentiel de l'entrée de HIV et de l'infection. Il présente très

peu d'effet, à supposer qu'il puisse même être constaté, sur l'activité enzymatique DPP IV. Ainsi on peut penser que 5 (KPR)TASS agit principalement sur le site de reconnaissance du substrat (c'est-à-dire la boucle V3 de la gpl20) sans affecter le site catalytique de la molécule CD26. Une des explications de l'activité plus importante de 5 (KPR)TASS par rapport au monomère KPR pourrait être trouvée dans le fait que la molécule CD26 existerait sous forme d'un multimère d'où également une présentation également plus efficace d'un multimère de type KPR plus efficace.

Le résidu KPR dans la molécule TASS peut également être remplacé par d'autres peptides pour former des variants de cet inhibiteur, par exemple : RPK, RPR, PKR, KGR.

Le tripeptide KPR est un des motifs conservés dans la boucle V3, précisément trouvé dans la partie C-terminale de la boucle V3 de certains VIH-2. En raison de la présence du dipeptide KP, KPR pourrait servir comme un substrat de l'enzyme DPPIV/CD26. Par ailleurs, nous avons démontré que le tripeptide KPR monomère à 10 mM inhibe l'entrée de VIH et aussi inhibe l'activité de la DPPIV. Sur ces données, nous avons ici démontré que la présentation multimérique de ce tripeptide KPR (par exemple 5(KPR-TASS) augmente considérablement l'efficacité de cette molécule pour inhiber l'entrée de VIH, la formation de syncytia et l'induction de l'apoptose. Mais à la concentration (10-200μM) de 5(KPR)TASS quand l'infection virale est inhibée, l'activité enzymatique n'est pas affectée. Ce n'est qu'à une concentration de 1-lOmM de 5(KPR)TASS, que l'activité de la DPPIV est inhibée.

Enfin, les peptides de type 5(KPR)TASS semblent interagir avec CD26 dans une région qui constitue l ¹ épitope de l'anticorps onoclonal anti-CD26, MAb 1F7.

Exemple de l'effet inhibiteur de différents peptides synthétiques multimeres (correspondant à la molécule TASS ou à des formes modifiées de la molécule TASS), sur l'infection par HIV-1 LAI dans des cellules CEM.

Des cellules CEM ont été incubées (15-30 minutes, 37°C) avec les différents peptides avant l'infection avec la souche HIV-1 LAI (60 minutes, 37 ^β C). Les cellules ont ensuite été centrifugées et suspendues dans un milieu de culture frais contenant les différents inhibiteurs. La formation de syncytia a été suivie au jours 3 et 4 après l'infection (post¬ infection (p.i)) et les surnageants de cultures ont été testés pour déterminer leur concentration en protéine majeure du noyau (core) de HIV, p24/p25. On a remarqué une très bonne corrélation entre l'inhibition de la formation des syncytia et la production de HIV (c'est-à-dire la concentration de p24/p25) .

La matrice de TASS est composée des résidus suivants : KKKGPKEKGC. Comme contrôle, on a utilisé une matrice TASS modifiée dans laquelle le résidu proline (P) avait été modifié par un résidu G conformément à la séquence suivante : KKKGGKEKGC. Cette dernière séquence est dénommée TASS(GG). Une autre molécule TASS modifiée répondant à la séquence KKKKGC a également été utilisée. Dans certains cas, la matrice MAP a été utilisée dans un but de comparaison.

01 5(KPR)-TASS

99% inhibition à 100 μ 85% inhibition à 25 μM 25-50% inhibition à 10 μM.

03 8( PRG)-MAP

93% inhibition à 50 μM 58% inhibition à 25 μM 18% inhibition à 10 μ

8(RPG)-MAP

50% inhibition à 100 μM 8% inhibition à 50 μM

4 X 2(KPRG)-TASS

99% inhibition à 50 μM 50% inhibition à 10-25 μM

4 X 2(IPIG)-TASS

Pas d'effet à 100 μM

8(GPGRAF)-MAP

98% inhibition à 100 μM 86% inhibition à 50 μM

5(KGR)-TASS

86-99% inhibition à 50 μM

8(KPRG)-TASS

85% inhibition à 50 μM

70% inhibition à 25 μM

50% inhibition à 10 μM

5(KPRQAG)-TASS

Toxique à 100 et 50 μM Pas d'effet à 25 μM

5(IPIG)-TASS

Pas d'effet à 100 μM

2(KGR)-TASS

Pas d'effet à 100 μM

5( GR)-TASS(GG)

Toxique à 100 μM

90-99% inhibition à 50 μM

70% inhibition à 25 μM

5(PKR)-TASε(GG)

99% inhibition à 50 μM 75% inhibition à 25 μM

5(KGQ)-TASS

45% inhibition à 100 μM Pas d'effet à 50 μM

5(KΨCH ₂ -N-PR)-TASS

Cytostatique à 50 μM (35% de cellules en moins) 99% inhibition à 25 μM 99% inhibition à 10 μM 65% inhibition à 1 μM 50% inhibition à 0.5 μM

5(eacetyleKPR)-TASS

Peut être inhibé de 50% à 10 μM

5(PKR)-TASS

95% inhibition à 100 μM

75% ; 60% inhibition à 25 μM

50% inhibition à 10 μM

5(G)-TASS

8% inhibition à 100 μM Pas d'effet à 50 μM

3 (KPR)-TASS

24% inhibition à 100 μM Pas d'effet à 50 μM

99% inhibition à 50 μM 97% inhibition à 25 μM 97% inhibition à 10 μM 50% ; 65% inhibition à 1 μM Pas d'effet à 0.5 μM

5(pyrKR)-TASS

95% inhibition à 50 μM

86% inhibition à 25 μM

66% inhibition à 10 μM

5(cAminohexanoylePR)-TASS 90% inhibition à 50 μM

67% inhibition à 25 μM

66% inhibition à 10 μM

5(KER)-TASS

67% inhibition à 50 μM

50% inhibition à 25 μM

34% inhibition à 10 μM

5(RK)-TASS

96% inhibition à 50 μM

77% inhibition à 25 μM

58% inhibition à 10 μM

Hexanoyl 4(RPK)-TASS

Pas d'effet à 50 μM

5((D)R(D)P(D)K)-TASS 98% inhibition à 50 μM 98% inhibition à 25 μM 98% inhibition à 10 μM 82% inhibition à 5 μM 20% inhibition à 1 μM

5(RPR)-TASS

96% inhibition à 50 μM

95% inhibition à 25 μM

95% inhibition à 10 μM

85% inhibition à 5 μM

10% inhibition à 1 μM

4(RPK)-TASS

71% inhibition à 50 μM

40% inhibition à 25 μM

24% inhibition à 10 μM

035 5(ACRPK)-TASS ( Ac: Acetyl CH3...)

90% inhibition à 50 μM

59% inhibition à 25 μM

20% inhibition à 10 μM

036 5(RPK)-KKKKGC

98% inhibition à 50 μM

98% inhibition à 25 μM

98% inhibition à 10 μM

60% inhibition à 5 μM

35% inhibition à 1 μM

037 5(R-ΦCH ₂ N-PK)-KKKKGC

99% inhibition à 20 μM 99% inhibition à 10 μM 99% inhibition à 5 μM 65% inhibition à 1 μM 50% inhibition à 0.5 μM

038 5((D)R-ΨCH ₂ N-(D)P(D)K)-KKKKGC

99% inhibition à 20 μM 99% inhibition à 10 μM 99% inhibition à 5 μM 82% inhibition à 1 μM 50% inhibition à 0.5 μM

Conclusions :

Ces études structure-fonction suggèrent que la présentation pentavalente des motifs KPR ou RPK correspond à la présentation optimale. La présentation octavalente (voir N° 6 et 10) n'augmente pas 1'activité inhibitrice et la présentation trivalente ou tétravalente conduit à une activité d'inhibition faible (voir N" 23 et 24).

Les différentes molécules peptides-TASS sont actives à des concentrations en microgrammes pour bloquer l'entrer de HIV, l'infection et la formation

de syncytium. Avec une infection par HIV-1 LAI à haute dose sur des cellules T de type CEM, la valeur de la concentration inhibitirice à 50% (IC ₅₀ ) pour certaines des molécules (N° 19, 25, 32, 33, 36, 37, 38) est comprise entre 0.5 et 2 μM.

Caractéristiques du motif inhibiteur :

K - P - R ^' (D (2) (3)

D'après les exemples précédents, une formule préférée du motif inhibiteur comporterait les résidus suivants :

Deux acides aminés devraient être des résidus basiques, par exemple K ou R ; K pouvant être remplacé par R et vice-versa. Ces deux résidus basiques pourraient occuper l'une quelconque des positions l, 2 ou 3 (voir exemple N ^β l, 16, 21, 25 et 33).

- Le résidu P pourrait être délété ou remplacé par un résidu G pour obtenir un motif actif (N°15 et 30) mais le remplacement par un résidu de type E diminuerait l'action inhibitrice (voir N°16).

- Le remplacement d'un résidu basique par un autre résidu hydrophile tel que le résidu Q réduit considérablement l'activité inhibitrice (voir N°18 ; 5(KGQ)-TASS) .

- Le groupe _ amino du résidu K est important puisque l'acétylation de ce groupe réduit considérablement l'action inhibitrice de la molécule (N°20) .

- Le groupe α-amino du motif ne joue pas un rôle crucial puisque qu'il peut être acétylé (voir N°35) sans que l'activité inhibitrice soit réduite considérablement. De même l'introduction d'un acide

pyroglutamigue à la position 1 n'affecte pas l'activité inhibitrice (voir N°27) .

- L'introduction du «aminohexanoyl à la position 1 ne réduit pas l'activité de la molécule (voir 28).

- La construction faite avec l'enantiomère D du motif d'inhibition est aussi active que la construction correspondant à la configuration L du motif inhibiteur (voir N ^β 32) .

- La réduction de la liaison peptidique entre l'acide aminé 1 et l'acide aminé 2, accroît considérablement l'action inhibitrice de la molécule (N°19, 37, 38).