N-Al yl-Peptidchelatbildner, deren Metallkomplexe mit Radionukliden, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende radiopharmazeutische Zusammen¬ setzungen

Die Erfindung betrifft N-Alkyl-Peptid-Chelatbildner, deren Metallkomplexe mit Radionukliden, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende radiopharmazeutische Zusammensetzungen.

Die Erfindung betrifft ferner Radiopharmazeutika, welche diese Chelate in mit Metallen komplexierter Form enthal¬ ten, deren diagnostische Kits, in denen das Chelat in nicht komplexierter Form vorliegen kann und entweder durch Zusatz von Technetium- oder Rhenium-Ionen komple¬ xiert wird und auch über die Anwendung solcher Präparate für diagnostische und therapeutische Zwecke.

Radioaktiv markierte Substanzen werden vor allem in der medizinischen Diagnostik angewandt, um Verformungen und

Funktionsänderungen innerer Organe oder Änderungen patho¬ logischer Prozesse im Körper festzustellen. Für diese Anwendung wird dem Patienten eine Formulierung verab¬ reicht, z.B. in Form einer Injektionslösung, welche die radioaktive Substanz enthält. Mit geeigneten Detektoren (z.B. einer Gamma-Kamera) können durch Aufzeichnen der emittierten Strahlung Bilder von Organen, pathologischen Prozessen und deren Veränderungen im Körper erhalten werden; bei besonders hohen Anreicherungen in Organen oder Gefäßen dienen sie als Therapeutika.

In den vergangenen Jahren wuchs das Verlangen nach spezi¬ fischen, radioaktiv markierten, chemischen Verbindungen, die an sogenannte Trägermoleküle (z.B. Steroide, Antikör- per, Lipide, Proteohormone etc.) gekoppelt werden können ^' und nach dem Prinzip des "Drug Targeting" wirken. Von besonderem Interesse für die Tumordiagnose und Therapie sowie zur Rezeptordarstellung (z.B. Steroidkonjugate,

ERSATZBLATT

Antikörper, etc.), sind solche Substanzen, die befähigt sind, die Zellwand und die Blut-Hirn-Schranke zu passie¬ ren sowie Substanzen zur Überprüfung von Organfunktionen, z.B. vor und nach erfolgten Transplantationen und zum Auffinden von Gefäßläsionen. Mit dem Ziel, eine höhere Selektivität des Radiopharmazeutikums und eine damit verbundene signifikante Anreicherung eines Radionuklids im Zielorgan zu erhalten, werden verstärkt Komplexbildner für eine Vielzahl von Radionukliden entwickelt und an gewebe- oder stoffwechselspezifische Trägermoleküle gekoppelt. Für die Therapie sucht man nach Möglichkeiten, ein radioaktives Isotop des Rhenium anzuwenden.

Das am häufigsten verwendete Radionuklid ist Technetium- 99m, das sich aufgrund seiner günstigen physikalischen Eigenschaften (keine Korpuskularstrahlung, günstige physikalische Halbwertzeit, 140 KeV γ-Strahlung) und der damit verbundenen geringen Strahlenbelastung besonders gut als Isotop für die in-vivo-Diagnostik eignet. Techne- tium-99m läßt sich ohne Aufwand aus Nuklidgeneratoren als [99m_ _c _ -Pertechnetat gewinnen. Zur Gewinnung von Techne¬ tium-99m-Chelaten wird das Pertechnetat durch geeignete Reduktionsmittel (z.B. SnCl2, S2O4 ² ", etc.) in eine niedrigere Oxidationsstufe überführt, in welcher das Technetium-99m mit Chelatbildnern oder Proteinen Komplexe bildet. Zur Markierung potentieller Chelatbildner mit Technetium-99m und zur Herstellung von Kits für den klinischen Routinebedarf wurden spezielle Verfahren entwickelt und beschrieben. So lassen sich Proteine direkt über Donor-Gruppen (Amino-, Amid-, Thiol-, etc.) des Proteins (J. Nucl . Med. 1986, 27, 685) oder durch Einführen von Komplexbildnern (US-Patent 4 479 930 und Fritzberg, A. R. et al. , J. Nucl. Med. 1986, 27, 957) mit Technetium-99m markieren.

ERSATZBLATT

Auch aus der Gruppe zyklischer Amine wurden Komplexbild¬ ner entwickelt (Troutner, D. E. et al. ; J. Nucl. Med. 1980, 21, 443 und Mäcke, H. ; DE-3 911 816), Cyclame (Ketring, A. R. ; Troutner, D. E. et al . ; J. Nucl. Med., 1980, 21, 443-448, Int. J. Nucl. Med. Biol. 1984, 11, 113, Volkert et al. , Applied Radiat. Isot., 1982, 33, 891-896), N 0 ₂ -Systeme (Pillai, M. R. A. ; Troutner, D. E. et al.; Inorg. Chem. 1990, 29, 1850) und ebenso wurden N2S2-Systeme (Bormans, G. et al . ; Nucl. Med. Biol. 1990, 17, 499) und N ₃ S-Systeme (Fritzburg, A. ; EP-A-0 173 424 und EP-A-0 250 013) beschrieben.

Alle diese Komplexbildner haben jedoch erhebliche Nach¬ teile. So sind für die Markierung der Cyclame als auch literaturbekannter N2θ2*-Systeme (Pillai, M. R. A. et al; Inorg. Chem. 1990, 29, 1850-1856) pH-Werte von 10-13 erforderlich. Ferner verfügen diese System nicht über reaktive Gruppen, die eine Verknüpfung mit Biomolekülen bzw. Proteohormonen ermöglichen. N2S2- und N3S-Systeme haben zwar in einzelnen Fällen eine hinreichende Stabili¬ tät, sind aber lediglich für einfache Ausscheidungs- studien, wie der Harnausscheidung, EP-A-0 250 013, geeig¬ net. Bemühungen, die Herstellung des literaturbekannten MAG3 (EP-A-0 250 013) , welches zur Markierung ein Erhit- zen auf 100°C verlangt (Bannister, K. M. et al. ; J. Nucl. Med. 1990, 31, 1568-1573) zu vereinfachen, sind zwar im Gange (WO-91-16076) , aber bis heute ohne klinischen Zugang geblieben.

Für N2S2-Komplexe (Bormans, G. et al. ; Nucl. Med. Biol. 1990, 17, 499) ist die Haltbarkeit zwischen Zubereitung und Verabreichung geringer als 1 h und bedeutet so einen empfindlichen Nachteil. Auch hier sind daher - bisher ohne klinische Relevanz - Bemühungen im Gange, Mängel zu beheben (Merryn, W. et al. , Applied. Radiat. Isot. Vol. 42 (7) , 607-612) .

ERSATZBLATT

Die bisher bekannt gewordenen Komplexbildner haben je¬ weils eine einheitliche Struktur und sind daher auch diagnostisch nur für einen Zweck anwendbar. Die Molekül- Variationen sind auf Substituenten des Grundgerüstes beschränkt und ermöglichen daher keine breite medizini¬ sche Anwendung, wie sie bei einer Komplexvariation mög¬ lich wäre. Sie sind daher kostenträchtig in Herstellung und wissenschaftlicher Durchdringung der einzelnen Kom- plexe.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, kurzkettige N- Alkyl-Peptid-Chelatbildner, die in einem breiten pH- Bereich bei Raumtemperatur mit Technetium und Rhenium komplexieren, wobei sowohl ionische als auch nicht ioni¬ sche Komplexe gebildet werden und somit Verbindungen bereitzustellen, welche die Nachteile bekannter ^99m Tc- und ¹⁸⁰ ' ¹⁸⁸ Re-Komplexe nicht aufweisen.

Dabei müssen gleichzeitig die Voraussetzungen für die Anwendung dieser Verbindungen am Menschen im Hinblick auf Strahlendosis, Stabilität und Löslichkeit erfüllt sein; es muß gleichzeitig ein möglichst einfaches Verfahren zu deren Darstellung geschaffen werden und eine Kit-Formulierung dieser erfindungsgemäßen

Verbindungen/Konjugate und ihrer Metallkomplexe für ihre klinische Anwendung bereitgestellt werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Verbindungen der allgemeinen Formel I

R ³ -S-CH ₂ -CO-NR ¹ - [CH ₂ -CO-NH] _n -CH ₂ -CO-R ² (I)

worin

n eine Zahl 0 , 1 oder 2 bedeutet ,

ERSATZBLATT

R ¹ einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, welcher gegebenenfalls durch ein bis drei Sauerstoffatome unterbrochen oder substitu- iert ist, und welcher gegebenenfalls eine endständige -

COOH-, -OH- oder -NH -Gruppe trägt, welche gegebenenfalls mit Glykolsäure oder Glykolsäureestern oder -ethern verestert oder verethert ist, wobei die Ester oder Ether mit Carbonsäuren oder Alkoholen mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen gebildet werden, oder einen Phenyl- oder Cyclohexylrest darstellt, welcher gegebenenfalls in der 4-Position mit einer COOH-, NH2- oder OH-Gruppe, welche gegebenenfalls mit Carbonsäuren oder Alkoholen mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen verestert, verethert oder amidiert ist oder einem Halogenatom substituiert ist,

R ² ein Halogenatom, eine Halogenmethyl-, Methyl-carb- oxyl-, Trifluor ethylcarboxyl-, eine NH2*- oder eine OH- Gruppe darstellt, wobei die im Falle von R ² = OH gebildete Carboxyl- Gruppe entweder unmittelbar oder nach Veresterung mit einer α,ω-Hydroxycarbonsäure mit bis zu 8 Kohlen- stoffatomen über deren endständige Carboxyl-Gruppe mit einem Biomolekül, einem Steroid, einem Ergolinderiva , einem Benzodiazepinderivat, einem Cholecystokinin, einem Peptid, einem Protein, einem Proteohormon, einem Aminozucker, einem Endothelin, einem Endothelin-Deri- vat, einem Endothelin-Antagonisten oder einem Endothe- linfragment verestert oder amidiert ist,

in Rest der allgemeinen Formel II

ERSATZBLATT

oder der allgemeinen Formel II a

ist, wobei

R ⁴ eine Methylen-, Propenylenamino-, Propinylen- amino- , Methylenamino- oder Methylenoxygruppe und

R ⁸ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeu¬ tet,

einen Rest der allgemeinen Formel III

oder der allgemeinen Formel III a

ERSATZBLATT

darstellt, worin

R ⁵ eine -NH-, -NH-CO-N<, -NH-CO-NH- oder Methylenoxy¬ gruppe,

R ⁶ ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Methylgruppe und

R ⁷ ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,

R-*- ein Wasserstoffatom, eine Acetyl-, Benzoyl-, p- Methoxybenzyl-, Ace amidomethyl-, Benzamidornethyl-, Trimethylacetamidomethyl-, Hydroxyacetyl-, Ethoxyethyl-, Ethylthio-, Trityl- oder eine leicht abspaltbare Schwe¬ felschutzgruppe bedeutet

und deren Salze mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren oder Basen zur Verfügung gestellt werden.

Überraschenderweise wurde eine Verbindungsklasse gefun¬ den, welche nicht nur die genannten Nachteile vermeidet, sondern als ^99m Tc ⁺⁵ -Komplexe einen Übergang vom N ₃ S -> N S0 -> S 0 ₂ -> N ₂ S2-N-Alkyl-Peptid-Komplex- system aufweist und daher in großer Breite als Kom¬ plexbildner eingesetzt werden kann.

ERSATZBLATT

Die Formel IV zeigt einen N3S-N-Alkyl-Peptid-Komplex im 99m _Tc _ _Core (neutral) aus

R ³ S- CH2-CO-NR ¹ [CH ₂ -CO-NH] ₂ -CH ₂ -CO-R ² '

die Formel V einen N2θS-N-Alkyl-Peptid-Komplex im ^99m Tc- Core (neutral) aus

R ³ S-CH ₂ -CO-NR ¹ [CH ² -CO-NH] i-C^-COOH,

die Formel VI einen 02S2_N-Alkyl-Peptid-Komplex im ^99m Tc- Core (mit negativer Ladung) aus

R ³ S-CH ₂ -CO-NR ¹ [CH ₂ -CO-NH] ₀ -CH ₂ -COOH,

ERSATZBLATT

und die Formel VII zeigt schließlich einen N2S2*-N-Alkyl* Peptid-Komplex in ^99m Tc-Core (mit positiver Ladung) aus R ³ S-CH ₂ -CO-NR ¹ [CH2-CO-NH] ₀ -CH ₂ -CO-R ² .

Die bei der Molekülvariation entstehenden Komplexe zeigen eine überraschende Breite und Übereinstimmung im Hinblick auf ihr biologisches Verhalten. So sind Verbindungen dieses Typs, gekoppelt an einen Bioliganden, verwendbar zur Rezeptordarstellung, was bisher für

99m-p _c -Verbindungen nicht beschrieben wurde und hervorra¬ gend geeignet zur Darstellung von Plaques bei Gefä߬ läsionen und der Messung der Nierenfunktion, wobei die Verbindungen jeweils an bioaktive Liganden gekoppelt sein können.

Bevorzugt sind Verbindungen, bei denen R ¹ eine -CH ₂ - (CH ₂ ) _m -CH ₃ -Gruppe mit m = 1 - 14 darstellt

ERSATZBLATT

oder Rl eine Phenyl-, eine p-Phenylamin-, eine Cyclo- hexylamin-, p-Hydroxyphenyl-, 4-Hydroxycyclohexyl, p- Halogenphenyl- oder 4-Halogencyclohexyl-Gruppe ist.

Bevorzugt sind außerdem Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin

R ¹ gleich - (__H ₂ ) _q -00C-CH ₂ -00C- (CH ₂ ) r" ^CH 3 ist,

wobei q und r jeweils ganze Zahlen von 1 bis 16 bedeuten.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin R ¹ ein geradkettiger oder verzweigter Akylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein P- Bromphenylrest ist.

Ferner sind Verbindungen der allgemeinen Formel I bevor¬ zugt, bei denen R ² ein Rest der allgemeinen Formel II

oder der allgemeinen Formel II a

ist, wobei

ERSATZBLATT

R ⁴ eine Methylen-, Propenylamino- , Propinylamino-, Methylenamino- oder Methylenoxygruppe und

R ⁸ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeu- tet.

Von diesen Steroiden sind 17α-Ethinyl-Estradiole oder deren 3-Methyl-Ether bevorzugt.

Eine 17α-Ethinylgruppe des Estradiols kann auch gekoppelt sein mit einem Ethen. Die Reihenfolge der Ethin- und Ethengruppen ist austauschbar; auch eine Verdopplung der Ethin- oder Ethengruppe ist zweckmäßig. Wichtig ist ein Mindestabstand zwischen Chelator und Estradiolmolekül, bevorzugt eine starre Ethin- oder Ethen-Gruppe, so daß keine Faltung der Seitenkette eintreten kann.

Erfolgt die Bindung von I in dieser bevorzugten 17α-Posi- tion des Estradiolgerüstes, ist bei den erhaltenen Che- lat-Komplex-Bioligand-Verbindungen keine oder nur eine geringe Abnahme der biologischen Aktivität zu erwarten, wie es z. B. in Epperly, M. W. et al [J. Steriod Biochem. Molec. Biol. Vol. 39, No. 5A, 729-734, 1991] belegt wird.

Die hervorragende Bedeutung dieser Estrogen-Chelat-Kom¬ plexe liegt in ihrer Eigenart, die Zellwand zu durchdrin¬ gen und sich an den Estrogen-Rezeptor anzulagern. Dies gilt insbesondere für Komplexbildner gemäß der allgemei¬ nen Formel I, bei denen n = 2 ist. Bei 99m ^* p _c +5 _s ± _nc \ diese N3S-Komplexe als Folge der N ¹ -Alkylierung im Tc-Core neutral (vgl . Formel IV) . Während geladene Komplexe die Zellwand nicht zu durchdringen vermögen, z. B. N3S-K01T1- plex als Steroid 17α-ethinyl-Chelat, vom Typ Thioacetyl- glycyl-glycyl-glycyl-O-Ester (eigene Versuche) , durch- dringen die erfindungsgemäßen N-*--alkylierten Komplexe (N ¹ = methyl) die Zellwand und reichern sich nach i. v.

ERSATZBLATT

Injektion im Uterus an. Die Anreicherung beträgt, ausge¬ drückt als Quotient zwischen Blut/Uterus, 0,2 und läßt sich in Abhängigkeit von der N**--Alkyl-Kettenlänge bzw. Substituenten variieren. Damit wird eine Mamma-ca Früher¬ kennung nach dem SPECT-Verfahren möglich. Besonders bevorzugt ist hier die Verbindung gemäß Beispiel 10.

Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei denen R ² ein Rest der

allgemeinen Formel III

oder der allgemeinen Formel III a

ist, wobei

R ⁵ eine -NH-, -NH-C0-N<, -NH-CO-NH- oder Methylen¬ oxygruppe,

ERSATZBLATT

R ⁶ ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Methylgruppe und

R ⁷ einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen darstellen.

Diese Verbindungen der allgemeinen Formeln III und III a sind Ergolin-Derivate.

Von diesen Ergolinen wird das 8α-Amino-6-Methyl-Ergolin ggf. mit Alkyl-Substituenten in 2- und/oder 6-Position mit einer Kettenlänge von C*j_ in 2 Position oder Cι_3 in Position 6 und/oder einem Methyl- bzw. Halogensubstituen- ten in Position 2 bevorzugt. Der Substituent in 8-Positi- on des Ergolins kann außer αNH ₂ auch ß-CH ₂ 0- oder αNH-CO- N< oder αNH-CO-NH- sein.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I tragen am endständigen Schwefelatom einen Rest R ³ . Dieser Rest R ³ stellt eine Schwefelschutzgruppe dar, welche während der Synthese der erfindungsgemäßen Verbin¬ dungen der allgemeinen Formel I erforderlich ist. Eine solche Schutzgruppe muß leicht abspaltbar sein. Geeignete

Rest R ³ sind beispielsweise Acetyl-, Benzoyl-, p-Methoxy- benzyl-, Acetamidomethyl-, Benzamidomethyl-, Trime- thylacetamidomethyl-, Hydroxyacetyl-, Ethoxyethyl- oder Trityl-Gruppen. Besonders bevorzugt ist die Benzyol- gruppe.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner die Metallchelatkomplexe radioaktiver Metallionen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin R ¹ , R ² und R ³ die oben angegebene Bedeutung haben.

ERSATZBLATT

Geeignete radioaktive Metallionen sind beispielsweise Ionen der Radioisotope der Elemente Tc, Re, Cu, Ga, Gd, Y und In. Die Auswahl des Radionuklids richtet sich nach der gewünschten Art der Anwendung der erfindungsgemäßen Metallchelatkomplexe der allgemeinen Formel I.

Dabei werden für die Radiodiagnostik oder Radiotherapie unterschiedliche Radionuklide verwendet.

Bevorzugt werden dabei radioaktive Metallionen der Iso¬ tope der Elemente Tc und Re.

Besonders bevorzugt ist das Radioisotop Technetium-99m.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind

Konjugate, enthaltend Verbindungen der allgemeinen Formel I oder Metallchelatkomplexe radioaktiver Metallionen der Elemente Tc, Re, Cu, Ga, Gd, Y und In mit Verbindungen der allgemeinen Formel I und sich selektiv in erkrankten Geweben oder in Tumoren anreichernde Substanzen, wobei zwischen diesen eine kovalente Bindung besteht und diese im Falle von Carboxy- oder Aminogruppen enthaltenden Substanzen wie Peptiden, Proteinen, Antikörpern oder deren Fragmenten, amidisch oder im Falle von Hydroxygrup- pen enthaltenden Substanzen wie Fettalkoholen, esterartig oder im Falle von Aldehydgruppen enthaltenden Substanzen imidisch vorliegt.

Bevorzugt sind Konjugate mit sich in erkranktem Gewebe anreichernden Peptiden wie Endotheline, Teilsequenzen von

Endothelinen, Endothelin-Analoga, Endothelin-Derivate oder Endothelin-Antagonisten.

Insbesondere bevorzugt sind solche Konjugate mit den Verbindungen der allgemeinen Formel I und sich selektiv

ERSATZBLATT

in erkranktem Gewebe anreichernden Peptiden, wobei die Peptide die folgenden Sequenzen

Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr-

Phe-Cys-His-Le -Asp-Ile-Ile-Trp,

Cys-Ser-Cys-Asn-Ser-Trp-Leu-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr- i

Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,

-Leu-Asn-

I I

Ala-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-

Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,

Ala-Ser-Ala-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr- Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,

Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Trp-Leu-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr- Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,

ERSATZBLATT

1 I

Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,

N-Acetyl-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Ala-Val-Tyr-Phe-Ala-His- Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,

oder die Teilsequenz

His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp

oder die cyclischen Aminosäuresequenzen

Cyclo- (DTrp-DAsp-Pro-DVal-Leu) ,

Cyclo- (DGlu-Ala-alloDIle-Leu-DTrp)

aufweisen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I

R ³ -S-CH ₂ -CO-NR-*-- [CH ₂ -CO-NH] _n -CH ₂ -CO-R ² (I)

worin

n eine Zahl 0,1 oder 2 bedeutet,

R ¹ einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, welcher gegebenenfalls durch ein bis drei Sauerstof atome unterbrochen oder substituiert ist, und welcher gegebenenfalls eine end- ständige -COOH-, -OH- oder -NH ₂ -Gruppe trägt, welche

ERSATZBLATT

gegebenenfalls mit Glykolsaure oder Glykolsäureestern oder -ethern verestert oder verethert ist, wobei die Ester oder Ether mit Carbonsäuren oder Alkoholen mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen gebil¬ det werden, oder einen Phenyl- oder Cyclohexylrest darstellt, wel¬ cher gegebenenfalls in der 4-Position mit einer COOH-, NH ₂ - oder OH-Gruppe, welche gegebenenfalls mit Carbon¬ säuren oder Alkoholen mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen verestert, verethert oder amidiert ist oder einem Ha¬ logenatom substituiert ist,

R ² ein Halogenatom, eine Halogenmethyl-, Methyl- carboxyl-, Trifluormethylcarboxylgruppe, eine NH - oder eine OH-Gruppe darstellt, wobei die im Falle von R ² = OH gebildete Carboxyl-Gruppe entweder unmittelbar oder nach Veresterung mit einer α,ω-Hydroxycarbonsäure mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen über deren endständi¬ ge Carboxyl-Gruppe mit einem Biomolekül, einem Steroid, einem Ergolinderivat, einem Benzodia- zepinderivat, einem Cholecystokinin, einem Pep- tid, einem Protein, einem Proteohormon, einem Aminozucker, einem Endothelin, einem Endothelin- Derivat, einem Endothelin-Antagonisten oder ei¬ nem Endothelinfragment verestert oder amidiert ist,

in Rest der allgemeinen Formel II

ERSATZBLATT

oder der allgemeinen Formel II a

ist, wobei

R ⁴ eine Methylen-, Propenylenamino-, Propinylen- amino-, Methylenamino- oder Methylenoxygruppe und

R ⁸ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe be¬ deutet,

einen Rest der allgemeinen Formel III

oder der allgemeinen Formel III a

ERSATZBLATT

darstellt, worin

R ⁵ eine -NH-, -NH-CO-N<, -NH-CO-NH- oder Methylen¬ oxygruppe,

R ⁶ ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Methylgruppe und

R ⁷ ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit bis zu 6 Kohlen¬ stoffatomen bedeuten,

R ³ ein Wasserstoffatom, eine Acetyl-, Benzoyl-, p- Methoxybenzyl- , Acetamidomethyl-, Benzamidomethyl-, Trimethylacetamidomethyl-, Hydroxyacetyl-, Ethoxy- ethyl-, Ethylthio-, Trityl- oder eine leicht abspalt¬ bare Schwefelschutzgruppe bedeutet

und deren Salze mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren oder Basen

welches sich dadurch auszeichnet, daß man

a) ein Diketopiperazinderivat des Glycins oder b) Glycin

mit einem Halogencarbonsäurehalogenid und anschließend mit einem Alkylamin oder Arylamin der allgemeinen Formel VI

R ¹ - NH ₂ (VI)

wobei R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, umsetzt, erneut mit einem Halogencarbonsäurehalogenid umsetzt und anschließend mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IV

ERSATZBLATT

R ³ - SH ( IV)

wobei R ³ die oben angegebene Bedeutung hat,

umsetzt

oder eine Verbindung der allgemeinen Formel V

R**--NH-CH ₂ -CO-R ² (V)

wobei R ² die oben angegebene Bedeutung hat, mit einem Halogencarbonsäurehalogenid und anschließend mit einem Alkylamin oder Arylamin der allgemeinen Formel VI

R ¹ - NH ₂ (VI]

wobei R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, umsetzt, erneut mit einem Halogencarbonsäurehalogenid umsetzt und anschließend mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IV

R ³ - SH (IV) ,

wobei R ³ die in oben angegebene Bedeutung hat, umsetzt und diese Verbindungen gegebenenfalls mit einer pharma¬ zeutisch annehmbaren Säure oder Base in deren Salz über¬ führt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I lassen sich auch derart herstellen, daß man ausgehend von einer erfindungsgemäßen Verbindung der allgemeinen Formel I, wobei n 0 oder 1 ist, diese mit einer Verbin¬ dung umsetzt, welche endständige Gruppen aufweist, und dadurch nach der Kopplung an die oben genannte Verbindung einen Rest R ² bildet. Dabei werden erfindungsgemäße

ERSATZBLATT

Verbindungen der allgemeinen Formel I gebildet, bei denen n 1 oder 2 ist. Dies bedeutet, daß ein Teil der Kette der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I durch den angekoppelten Rest R ² zur Verfügung gestellt wird.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Metallchelatkom¬ plexe radioaktiver Metallionen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die Umsetzung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, gegebenenfalls unter vorheriger oder gleichzeitiger Abspaltung des Restes R ³ erfolgt in an sich bekannter Weise.

Die Herstellung von Metallchelatkomplexen radioaktiver Metallionen der Elemente Tc und Re mit Verbindungen der allgemeinen Formel I erfolgt dadurch, daß man Technetium- 99m oder Re in Form von Pertechnetat oder Perrhenat in Gegenwart eines Reduktionsmittels und gegebenenfalls eines Hilfsliganden mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I

R ³ -S~CH ₂ -CO-NR*--- [CH ₂ -CO-NH] _n -CH ₂ -CO-R ² (I)

worin R ¹ , R ² und R ³ die oben angegebene Bedeutung haben, umsetzt.

Von besonderer erfinderischer Bedeutung ist nun die überraschende Variablität der Verbindungen und ihrer Komplexe. Für Verbindungen mit n = 2 gemäß der allgemei¬ nen Formel I erhält man ein N3S-System. Geht man von n = 2 auf n = 1 über, so kann sich ein N SO-N-Alkyl-System mit einer überraschend hohen Komplexstabilität bilden. Schließlich kann sich bei n = 0 aus dem N-^Sx-N-Alkyl-

ERSATZBLATT

System beim Komplexieren ein Chelatkomplex, der sowohl ein N ₂ S -N-Alkyl-System aufzeigt oder aber als weiteres Dimeres ein 0 S ₂ -N-Alkyl-Komplex ist, bilden ohne daß eine chemische kovalente Brückenfunktion den Komplex verbindet.

Die neuen Verbindungen haben wegen ihrer chemischen Variabilität und ihrer Varianten in der Komplexbildung auch eine außerordentliche Breite der klinischen Anwen- düng.

Bis heute gibt es keine Methode, die - in vivo - die Bildung von Plaques als Beginn einer Atherosklerose bildlich darstellt. Die Atherosklerose ist eine Volks- krankheit und eine Vorstufe einer koronaren Herzerkran¬ kung, an deren Folgen etwa 40 % der Bevölkerung der Industriestaaten sterben. Es ist daher von besonderem Wert, mit einem einfachen Mittel zu einer bildhaften Darstellung der Gefäßläsionen zu gelangen. So können die erfindungsgemäßen N-Alkyl-Chelate zur Früherkennung atherosklerotischer Gefäßerkrankungen verwendet werden.

Der im Tiermodell (Kaninchen der Art WHHL mit künstlich erzeugten atherosklerotischen Gefäßveränderungen: WHHL- Kaninchen weisen aufgrund eines fehlenden oder defekten LDL Rezeptors hohe LDL Spiegel im Blut auf und bilden daher atherosklerotische Gefäßveränderungen aus) erreichte Quotient nach i.v. Gabe von Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel I, wobei R ² ein Endothelin, eine Teilsequenz von Endothelin, ein Endothelin-Analoga, ein Endothelin-Derivat oder ein Endothelin-Antagonist ist, aus Aktivität im Plaque und unbeschädigten Gefäß, lag bei 1 : 5 (vgl. hierzu Abbildungen 1 und 2) .

Es war in hohem Maße überraschend, daß trotz der Lipho- philie des Komplexes, als Folge der R ¹ -Alkylkette mit

ERSATZBLATT

einer Kettenlänge von Cg bereits nach 3 Stunden die Ausscheidung soweit erfolgt war. Die Läsionen im Bereich der Aorta sind autoradiographisch überraschend gut dar¬ stellbar. Hier liegt eine durch die Fettähnlichkeit der Moleküle gegebene Affinität zu den Plaques oder deren Rezeptoren vor, die so hoch ist, daß trotz abfallender Konzentration der Verbindung im Blut - als Folge der Ausscheidung via Leber - die Haftung an den Plaques erhalten bleibt.

Die Affinität zu Plaques bei atherosklerotischen Verände¬ rungen der Gefäße läßt sich durch die Variation der R ¹ - Alkyl-Gruppe beeinflussen. So läßt sich über die Eigenart des in R ¹ befindlichen Restes die Lipophilie steuern, und gleichzeitig bietet R ² als freie Carboxylgruppe die notwendige Voraussetzung für eine gute Wasserlöslichkeit. Anstelle von R ² als freie Carbonsäure kann aber auch eine Amidierung dieser Carboxylgruppe mit einem Aminokohlen- wasserstoff zur Wasserlöslichkeit beitragen.

Es ist bekannt, daß Proteine, insbesonders kurzkettige Proteohormone wie Endotheline, beim Ankoppeln eines Chelators über eine kovalente Bindung ihre Wirksamkeit verlieren. Völlig unerwartet war daher das Verhalten der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der kovalenten Bindung an Endotheline, deren Antagonisten oder Fragmente (Beispiel 11, 12) .

Die hier gezeigte Art der Generierung der erfindungsge- mäßen N-Alkyl-Komplexbildner der allgemeinen Formel I mit Endothelinen (Beispiel 11 und 12) aus Chelatbildungs- vorstufen ist eine neue Methode zur Generierung von solchen Komplexbildungsstellen. Die Stabilität der neuen N-Alkyl-Komplexe der allgemeinen Formel I entspricht den bekannten N3S-Komplexen.

ERSATZBLATT

Nich -invasive Techniken zur Diagnose der Atherosklerose wurden beschrieben, insbesonders mit einer Radio-Jod- Markierung. So wurden mit Radioisotopen markierte Anti¬ körper oder auch markierte "Low Density Lipoproteine" (LDL) vorgestellt, die an atherosklerotische Wandbereiche binden (Lees et al . 1983, J. Nucl. Med. 24, 154 -156, Kaliman et al . 1985, Circulation, 72, 300; Virgolini et al. 1991, Eur. J. Nucl. Med., 18, 944-947) . Diese Metho¬ den beinhalten jedoch entscheidende Nachteile, wie z.B. die antigene Wirkung der Antikörper auf den Organismus und die lange Zeitdauer (mehrere Tage) , die zur Isolie¬ rung, Reinigung und Markierung des LDL aus dem Blut des Patienten benötigt wird. Vor allem aber sind diese großen Moleküle durch eine lange Halbwertzeit im Blut ausge- zeichnet, die zusammen mit einer hohen Hintergrundstrah¬ lung im gesamten Körper eine Lokalisation der atheros- klerotischen Läsionen erschwert, wenn nicht gar unmöglich macht (Shih et al . 1990 Proc. Natl . Acad. Sei., 87, 1436 - 1440) , synthetisierten Teilsequenzen des LDL-Proteinan- teils (apo-B-100) , die zwar noch an die atheroskleroti- schen Plaques binden, aber sich durch eine weitaus kürze¬ re Halbwertzeit im Blut und ein verbessertes Si¬ gnal/Rausch-Verhältnis hervorheben. Aufgrund einer zu geringen Affinität zum Plaque und/oder der geringen Dichte der Bindungsstellen dieser Peptide im Plaque, konnte auch mit diesen apo-B-Peptiden keine erfolgreiche in vivo Diagnose der Atherosklerose gezeigt werden.

Allgemein ist diesen Verbindungen der Nachteil des radio- aktiven Iod-123 zu eigen. Die schlechte Verfügbarkeit wegen der Herstellung im Cyclotron und der physikalischen Halbwertzeit von 13 Stunden, verbunden mit der leichten Abspaltbarkeit im Organismus. So war es überraschend, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen nach Formel I nach kovalenter Bindung an NH-Gruppen des Endothelins und

Komplexierung mit 99m-p _{c e} -j_ _ne gute Anreicherung in athero-

skierotischen Plaques zeigten. Insbesonders auffallend ist der Vorteil, daß die n = 1 und n = 0 Verbindungen nach kovalenter Bindung an Endotheline über eine Amidbil- dung neue N-Alkyl-Peptid-Komplexbildner generieren, ggf. unter Einbeziehung der in geeigneter Position befindli¬ chen NH- und SH-Gruppen des jeweiligen Endothelins.

Bei der Umsetzung der erfindungsgemäßen Verbindungen mit dopaminergen bioaktiven Molekülen geht überraschend die Rezeptoraffinität dieser aus der Ergolinreihe stammenden Verbindungen nicht verloren, sondern es gelang sogar bei Vorstufen - mit oder ohne Affinität zum D2-Rezeptor - eine hinreichende Gehirngängigkeit zu erreichen, die eine Darstellung der D2*-Rezeptoren ermöglicht. Bemühungen, mit ^99m Tc ⁺⁵ -Komplexen Rezeptoren im Gehirn darzustellen, sind bis heute ohne Erfolg geblieben. So findet man bei der Umsetzung von 8α-Amino-6-Methyl-Ergolin mit Mercapto- Acetyl-Glycyl-Glycyl-Glycin zum 8α-Amid und Komplexierung mit 99mτ _c +5 _nac h i.v. Injektion an der Ratte (Wistar) keine Aufnahme im Gehirn.

Führt man hingegen die Umsetzung mit den erfindungsgemä¬ ßen Verbindungen nach Formel I durch, wobei R ¹ = Methyl ist und die Amidierung oder Veresterung über R ² erfolgt, so erhält man unter analogen Bedingungen eine Anreiche¬ rung im Gehirn von 0,1 bis 0,5 % der Dosis.

ERSATZBLATT

Bei n = 1 und n = 0 Komplexen bilden sich neue N-Alkyl- Peptid-Komplexstrukturen heraus, die im Zusammenwirken mit dem bioaktiven Molekül, überraschenderweise Struktu¬ ren dopaminerger Verbindungen nachahmen und eine hohe Anreicherung im Gehirn zeigen, die zur Sichtbarmachung der D-Rezeptoren genutzt werden kann (Formel IX) .

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen er¬ folgt nach den dem Fachmann bekannten Verfahren [A Spe¬ cialist Periodical Report; Amino-acids, Peptides and Proteins;

The Chemical Society, Burlington House, London, W1VOBN]. Zur Herstellung der Verbindungen mit R ¹ = CH3 und R ² = OH geht man vom Sarcosin aus und setzt dieses mit Chloracetylchlorid um. Das entstehende Chloracetylsarco- sin wird mit Thiobenzoesaure in üblicher Weise umgesetzt und man gelangt zu Strukturen mit n = 0

R ³ S-CH ₂ -CO-N- (CH ₂ -CO-NH) ₀ -CH ₂ -COR ²

/ CH ₃

Verbindung A

Die Herstellung der Verbindungen mit n = 2 erfolgt durch Umsetzung des Diketopiperazins des Glycins mit Chloracetylchlorid. Das entstehende Chloracetylglycyl-

ERSATZBLATT

glycin wird anschließend mit N-Methylamin oder zur Ein¬ führung längerer Reste mit N-Alkylaminen, Phenylaminen, Alkyl-oxa-alkylaminen, Cycloalkylaminen oder Glycinglycolsäureester umgesetzt. Durch erneutes Umsetzen mit Chloracetylchlorid und anschließende Thiobenzoylie- rung werden Verbindungen der Formel n = 2 erhalten.

R ³ S-CH ₂ -CO-N- (CH ₂ -CO-NH) ₂ -CH ₂ -COR ² / R ¹

Verbindung B

R ¹ steht dabei für die Variationen am Sarcosylstick- stoffatom

Die entsprechenden Verbindungen mit n = 1 erhält man durch Umsetzung von Salzen des Glycins mit N - geschütz¬ ten SarcosylVerbindungen oder durch Umsetzung von Glycin mit Chloracetylchlorid mit nachfolgender Aminolyse der Chlormethylgruppe. Erneute Reaktion mit Chloracetylchlo¬ rid und anschließender Thiobenzylierung liefert die Titelverbindungen mit n = 1.

R3S-CH ₂ -C0-N- (CH ₂ -CO-NH) -L-CH ₂ -COR ² /

Rl

Verbindung C

Die Verbindungen A, B, C reagieren in üblicher Weise mit Aminogruppen- oder Hydroxylgruppentragenden Reaktions- partnern. Zu diesem Zweck werden A bis C in N-Methyl- pyrrolidon gelöst, mit BOP (B. Castro et al. Tetrahedron Letters 14 (1975) 1219) oder TBTU (Knorr et al . Tetrahe- ■ dron Letters 30 (1989) , 1927) voraktiviert und anschlie- ßend mit der Aminokomponente umgesetzt. Veresterungen

ERSATZBLATT

werden vorzugsweise mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegen¬ wart von Dimethylaminopyridin durchgeführt. Für die Synthese von Verbindungen mit einem Estrogen als Bioli- gand geht man von einem Estrogen aus, das bereits einen ungesättigten Substituenten in 17α wie Propargylamin- oder Propargylyalkolholrest trägt und setzt diesen mit einer der Verbindungen A bis C in der beschriebenen Weise um.

Die Umsetzung der Verbindungen A bis C mit Peptiden, insbesondere mit Endothelinbausteinen erfolgt nach in der Peptidchemie gebräuchlichen Methoden entweder konventio¬ nell in Lösung, vorzugsweise in Dimethylformamid, Dime- thylacetamid, N-Methylpyrrolidon, Dimethylsulfoxid oder Gemischen aus diesen Komponenten. Bei Verwendung der

Solid-Phase-Methode kann die Acylierung der Aminokompo- nente auch unter üblichen Bedingungen am Syntheseharz erfolgen. Abspaltung vom Syntheseharz liefert die ge¬ wünschten Verbindungen. Eine präparative Reinigung, falls erforderlich, erfolgt chromatographisch an einer RP 18

Säule in einem Wasser / Acetonitrilgradienten, der 0,1 % Trifluoressigsäure enthält.

Für die Umsetzung mit Aminogruppen- oder Hydroxylgruppen- tragenden Ergolinen wurde anlog zu den Umsetzungen mit Peptiden in Lösung verfahren. Die Umsetzungen wurden in N-Methylpyrrolidon durchgeführt. Die präparative Reini¬ gung erfolgt ebenfalls wie für Peptide angegeben.

Die anderen R ⁴ -Reste werden nach Aufbau der geschützten Dipeptide A - C erhalten in dem R ¹ , wobei R ² = OH ist, nach Aktivierung mit

NH ₂ -CH ₂ C1,

NH ₂ -CH ₂ -CH=CHJ oder

ERSATZBLATT

NH ₂ -CH ₂ - C=CJ

umgesetzt wird und nach der Palladium-O-Reaktion das 17α- Ethinylsteroid mit dem gewünschten Komplexbildner über eine C-C-Bindung kovalent gebunden wird.

Die Komplexbildung wird bevorzugt in wässrigem Medium, bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 und bei Raumtempera- tur, durch Reduktion von Na-Pertechnetat mit z.B.

Zinn(II) chlorid oder Dithionid, ggf. über einen Hilfsli- ganden wie Natriumeitrat oder Natriumtartrat ausgeführt, wobei die Schutzgruppe R ³ bereits zuvor oder in situ abgespalten wird.

Eine Aktivierung der im Falle von R ² = OH entstehenden R ² Carboxylgruppe oder der Ersatz der Carboxylgruppe durch eine NCS- oder ähnlich reaktive Gruppe führen dazu, Peptidchelate kovalent an ein größeres Protein oder Proteohormone, Endotheline, Endothelinanaloge, Endothe- lin-Antagonisten, Endothelinderivate, Teilsequenzen von Endothelinen zu binden und nachträglich eine Komplexie- rung durchzuführen.

Wie in der Herstellungsvorschrift ausgewiesen, lassen sich die erfindungsgemäßen ^99m Tc-und ¹⁸⁶ ' ¹⁸⁸ Re-Komplexe bei Raumtemperatur, neutralem bis schwach alkalischem pH und mit oder ohne Umchelatisierung (z.B. über ein Heptagluconat- ^99m Tc-Komplex) in Ausbeuten zu 95 % als Komplexe herstellen. Ihre leichte Salzbildung über ein freies Kation führen zu einer guten Wasserlöslichkeit.

Herstellung der Metallkomplexe: Die Abspaltung der Schutzgruppe erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden (s. "Protective groups in organic synthesis" T.N. Greene, John; Wiley and Sons 1981) .

ERSATZBLATT

Für die Anwendung im humandiagnostischen Bereich werden üblicherweise zwischen 370 MBq und 1850 MBq eingesetzt, bevorzugt 740 bis 1480 MBq. Zur Anwendung am Menschen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form eines Kit ' s bereitgestellt. Der Kit enthält mindestens einen Chelator nach der allgemeinen Formel I in freier oder an Liganden gebundener Form.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Cold-Kit, welches einen Chelatbildner nach der allgemeinen Formel I in freier Form oder an ein bioaktives Molekül, wie z.B. eine Ergolin-, Estradiol- oder Endothelin-Derivat gebun¬ den, enthält und welches in der Lage ist, Metallatome zu binden.

Erhebliche Schwierigkeiten bereitet oft die Abspaltung der intermediär zur Ausführung der Synthese eingeführten Schutzgruppen. Gerade Chelatbildner mit Peptid-Verknüp- fungen werden bei der Abspaltung der -S-Schutzgruppe (R ³ ) durch gleichzeitig ablaufende Spaltung der Peptidkette stark in Mitleidenschaft gezogen bzw. führen zu nicht mehr verwertbaren Bruchstücken, umso überraschender war es, daß bei gleichzeitiger Anwesenheit von Wasser- stoff/Pd/CaC03, also einer Schutzgruppenabspaltung unter hydrierenden Bedingungen, in Gegenwart von dem üblich angewendeten Alkali, eine hohe, bis zu 80 % reichende Abspaltung eintritt.

Diese entscheidende Verbesserung in der Synthese der freien Chelat-Komplexe ist insofern von hoher Bedeutung, als damit eine Schutzgruppenabspaltung vor der Kit-Formu¬ lierung erfolgen kann und die Gewinnung des schutzgrup- penfreien Chelators technisch erheblich verbessert wird.

ERSATZBLATT

Am Beispiel 3 wird die erfindungsgemäße Abspaltungsmetho¬ de beschrieben. Während bei der üblichen Abspaltung mit Alkali ein nur schwer zu trennendes Gemisch erhalten wurde, erhielt man bei der Schutzgruppenabspaltung mit Alkali in Gegenwart von Wasserstoff/Pd/CaC03 eine ~ 100

%ige Stoffausbeute mit über 80 % an gewünschtem Material.

Beispielhaft sei genannt, daß die Umsetzung mit Aminen bzw. Alkoholen über eine Aktivierung der Carbonsäure R2 = OH verläuft, wobei dem Fachmann bekannte Methoden ange¬ wendet werden.

Als aktivierte Gruppen seien beispielhaft genannt: Säu¬ rechloride, gemischte Anhydride [Org. Prep. Proc. Int. 1975, 7, 215], aktivierte Ester [Adv. Org. Chem. Part B, 472] . Die Verknüpfung mit Biomolekülen kann direkt oder auch über Linker erfolgen, hier sei die Carbodiimidmetho- de (Fieser, Reagents for Organic Synthesis 10, 142) genannt. Die Verknüpfung erfolgt derartig, daß zwischen Chelat und Biomolekül eine kovalente Bindung gebildet wird.

Bei Verwendung von Steroiden als Biomoleküle werden bevorzugt Estradiol Derivate mit Substituenten in 17α- Position verwendet. Die Synthese solcher Verbindungen wird z.B. von Blickenstaff für 17α-Ethinyl-Derivate des Estradiols beschrieben. (Blickenstaff A. ; Steroids 46, 889 (1985); USP 462.426) . Für Estradiol-Derivate mit 17α- Propargyl-Substituenten mit endständiger NH2 oder OH-Funktion wird die Synthese von Blickenstaff, Brandes und Poirier beschrieben. (Blickenstaff et al . ; Steroids 48, 223 (86) ; Brandes, A. et al . Dissertation 87-01441, 1986, University of Illinois, D. Poirier et al . J. Steroids. Biochem. Molec. Biol. 38, No. 6, 759-774, 1991) .

ERSATZBLATT

Eine Übersicht über die Verknüpfung von Dreifach- mit Zweifach-Bindungen, z.B. nach der Palladium-0-Reaktion sind in Aldrichchimica Acta, Vol. 15, No. 1, 1982; Shun- ichi Murahashi et al. , Stephen A. Godleski, Tetrahedron Letters, Vol. 22, No. 24, pp 2247-2250, 1981; Tetrahedron Letters, Vol. 29, No. 24, 2973-2976, 1988; beschrieben. Hierbei wird z.B. I mit R ² = - NH-CH ₂ -C≡CH bei der Kopp¬ lung mit z.B. 17α[2-Halogen-ethenyl] -estradiol gemäß genannter Literaturstellen umgesetzt.

Aus der Literatur ist bekannt, daß Ergotalkaloide vom Typ der 6-Methyl-8-substituierter Ergoline über ein breites Spektrum an chemischer Variation verfügen, ohne daß bis heute ein Zusammenhang zwischen Wirkung und Substituenten in Position 8 eindeutig erkennbar wäre [Ergot Alkaloids and Related Compounds, Editors: B. Berde and H.O. Schild, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1978] .

Ein bevorzugter dopaminerger Ligand ist Ergolin. Eine Übersicht über Synthesewege zu 8-substituierten Ergolinen findet man bei Ergot Alkaloids and Related Compounds, Editors B. Berde and H.O. Schild, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1978, Chapter II Chemical Back- ground, J. Ruisemmann and P.A. Stadler.

Bevorzugt ist die Umsetzung mit dem 8α-Amino- bzw. 8ß- Hydroxy-Methyl-Ergolin. Sie erfolgt über eine aktivierte Gruppe in R ² , beispielsweise das mit Benzotriazol-1-yl- tetra-methyl-uronium-tetrafluoroborat oder nach der bekannten Carbodiimidmethode.

Bei der erfindungsgemäßen Anwendung der n = 1 und n = 0 Komplex- bzw. Partialkomplexbildner werden unter Einbe¬ ziehung des Stickstoffs in der 8α-Amino und 6-N-Methyl Gruppe des Ergolins neue Komplexe generiert.

ERSATZBLATT

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Metallchelate für diagnostische und/oder therapeuti¬ sche Zwecke sowie pharmazeutische Mittel, die mindestens ein erfindungsgemäßes Chelat der allgemeinen Formel I, gegebenenfalls mit den in der Galenik üblichen Zusätzen, enthalten.

Zur Anwendung am Menschen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form eines Cold- oder Hot-Kit's bereit- gestellt. Der Kit enthält mindestens einen Chelator nach Formel I in freier oder gebundener Form, wobei die Ligan¬ den bevorzugt aus der Stoffklasse der Ergoline, Estra¬ diole, Endotheline, kurzkettige synthetische Peptide, Cholecystokinine gewonnen werden.

Beispiele

Allgemeine Komplexbildung mit Natrium-Gluconat

^99m Tc-Gluconat :

2 ml ^99m Tc-Generatoreluat werden zu 2 ml 0,1 M Natrium- gluconatlösung gegeben und mit 10 μl 0.01 M SnCl ₂ (in

0,01 M HC1) versetzt. Danach erfolgt dünnschichtchromatographische Prüfung der quantitativen Pertechnetatreduktion.

DC (Kieselgel/Aceton) : ^99m Tc-Gluconat Rf: 0-0.1;

99m _Tc0 4- _{Rf: 0 9}

Beispiel 1

[ ^99m Tc] -Mercaptoacetyl-Sarkosin

1. Stufe: Chloracetyl-sarkosin:

0,07 mol Sarkosin werden in 50 ml IN Natronlauge gelöst und bei 0°C portionsweise mit 0,08 mol Chloracetylchlorid

ERSATZBLATT

und 110 ml IN Natronlauge versetzt. Nach 45 min ist die Zugabe beendet und die Reaktionslösung wird mit 20 ml 5N Salzsäure angesäuert.

Das Produkt wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der Rückstand mit dreimal je 50 ml kaltem Aceton extrahiert. Das Aceton wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit 100 ml Ether extra¬ hiert . Der Ether wird abgedampft und das zurückbleibende Öl mit etwas Ether aufgenommen und unter starkem Rühren zur Kristallisation gebracht. Ausbeute: 77 % d.Th. DC: Kieselgel// Butanol/ Eisessig/ Wasser 2:1:1 Rf: 0,65 (Jodbedampfung)

2. Stufe: Benzoylmercaptoacetyl-sarkosin:

0,02 mol Chloracetyl-sarkosin werden in 750 ml Methanol unter Rühren in einer Schutzgas-Atmosphäre bei Raumtempe¬ ratur gelöst. Dazu wird langsam eine Lösung von 0,041 mol Thiobenzoesaure, gelöst in 20 ml Methanol und neutrali¬ siert mit Natriummethylat, zugetropft und weitere 12 h gerührt .

Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit 2N Salzsäure aufgenommen. Das Reaktionsprodukt fällt als braunes Öl aus, das von der überstehenden Lösung abgetrennt und mit Chloroform extra- hiert wird. Das Chloroform wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Ether versetzt. Durch Kühlen und intensives Rühren wird das Reaktionsprodukt ausgefällt, abfiltriert und auf dem Tonteller getrocknet.

ERSATZBLATT

pH-Titration und IR-Spektrum zeigten, daß das Reaktions¬ produkt aus einem Gemisch von 60 % Methylester und 40 % freier Aminosäure bestand.

3. Stufe: Abspaltung der Schutzgruppe:

0,08 mmol des erhaltenen Gemisches werden in 2 ml absolu¬ tem Methanol suspendiert, mit 2 mg Pd/CaC03 (5 %) ver¬ setzt und bei einem Wasserstoffdruck von 66 kPa unter Rühren mit einer Lösung von 0,13 mmol Natriummethylat in 1 ml absolutem Methanol umgesetzt. Man rührt noch 15 min und neutralisiert danach die Lösung mit methanolischem Dowex 50WX8. Der Katalysator und das Harz werden abfil¬ triert, die Substanz lyophilisiert und die Verunreini- gungen mit 2 ml Benzol extrahiert. Anschließend wird das Benzol abgetrennt und die Substanz aus Ethanol lyophili¬ siert.

Das erhaltene Produktgemisch aus Ester und freier Säure wird über Sephadex G10 getrennt. (Säule 14 x 1000, 20 ml/h, RI-Detektor) Mercapto-acetyl-sarkosin-methylester wird als zweite Fraktion abgetrennt, vgl. Beispiel 1 a) .

Mercaptoacetyl-sarkosin : DC:

Kieselgel//Butanol/Eisessig/Wasser 2:1:1

Rf: 0,7 (Ninhydrin)

RP 18/Methanol Rf: 0,85 (Ninhydrin)

^• --H-NMR (DMSO) TMS δ2, 9 (SH, 1H) , δ3, 1 (N-CH3, 3H) , δ3, 9 (-CH2, 2H)

Markierung von N-Methyl-MAGl

Zu 2 ml ^99m Tc-gluconatlösung werden ca. 1 mg N-Methyl- MAG1, gelöst in 200 μl Wasser, gegeben. Nach einer Reak-

ERSATZBLATT

tionszeit von 15-20 min erfolgt die Reinheitskontrolle mittels DC auf Kieselgel 60/95 % Ethanol .

Die Hauptmenge der Aktivität läuft mit Rf = 0.1 (ca.80%) ; weitere Peaks bei Rf = 0.2 (ca.10%) und Rf = 0.4(ca.l0%) . Im Elektropherogramm wird ein anionischer Tc-MAGl-Komplex nachgewiesen mit einer relativen Beweglichkeit ^u Pertechn. / ^u TcMAGl ^von °' ² -

Beispiel 1 a:

Bei der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus Beispiel 1, Stufe 3 erhält man 20 % Mercapto-acetyl-sarkosin- methylester als farbloses Öl.

Beispiel 2

Mercapto-acetyl-hexylaminoessigsäure

1. Stufe: Hexylaminoessigsäure

0,021 mol Chloressigsäure werden mit 0,1 mol Hexylamin versetzt und 5 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird der dicke Sirup in 500 ml Aceton eingerührt und kristallisiert in Form von weißen Blättchen aus. Ausbeute 2,1 g (63 % d.Th.)

DC:

Kieselgel//Butanol/Eisessig/Wasser 2:1:1 Rf: 0,6 (Ninhydrin)

2. Stufe: Chloracetyl-hexylaminoessigsäure:

0,01 mol Hexylaminoessigsäure werden in 10 ml IN Natron- lauge gelöst, gekühlt und bei 0°C abwechselnd mit 1,5 ml (1 ml = 0,012 mol) Chloracetylchlorid und 20 ml IN Na-

ERSATZBLATT

tronlauge versetzt. Nach 30 min ist die Reaktion beendet und es wird noch 30 min unter leichter Erwärmung nachge¬ rührt. Mit 3 ml 5N Salzsäure wird angesäuert und das ausfallende braune Öl abgetrennt.

Das Öl wird mehrfach mit heißem Wasser extrahiert und als farbloses Öl ohne weitere Reinigung für die nächste Synthesestufe eingesetzt.

DC:

Kieselgel//Butanol/Eisessig/Wasser 2:1:1 Rf: 0,75 ( odbedampfung)

3. Stufe: Benzoylmercaptoacetyl-hexylaminoessigsäure:

0,018 mol Chloracetyl-hexylaminosäure werden in 500 ml Methanol unter Stickstoff gerührt. 0,036 mol Thiobenzoe¬ saure werden mit Natriummethylat neutralisiert und inner¬ halb von 30 min zu der Lösung gegeben. Es wird noch weitere 12 h unter Schutzgas gerührt. Das Methanol wird unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand mit 2N Salzsäure angesäuert und das ausfallende gelbe Öl abge¬ trennt. Ausbeute: 370 mg DC:

Kieselgel//Butanol/Eisessig/Wasser 2:1:1 Rf: 0,5

Beispiel 3

[99m-p _c ] Mercaptoacetyl-sarkosyl-diglycin

1. Stufe: Chloracetyldiglycin:

10 g Glycinanhydrid werden in einem 250 ml Dreihalskolben in 50 ml 2N Natronlauge bei Raumtemperatur gelöst. Nach

ERSATZBLATT

45 min wird die Lösung auf 0 °C abgekühlt und 11,1 g Chloracetylchlorid und 24 ml 5N Natronlauge abwechselnd unter fortgesetztem Rühren und Kühlen zugetropft. Nach 45 min ist die Zugabe beendet. Anschließend werden 40 ml 5N Salzsäure zugegeben, wobei sich die Lösung entfärbt und die Substanz zu kristallisieren beginnt. Man läßt sie noch ca. 1 h bei 0 °C stehen und saugt ab. Er wird mehr¬ mals mit kaltem Wasser gewaschen und aus heißem Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 5 g

Die Mutterlauge wird unter vermindertem Druck eingeengt. Der Niederschlag wird aus Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 2,5 g Schmp. : 173 °C

DC: Kieselgel//n-Butanol/Eisessig/Wasser/ 4:1:1

Rf: 0,75 (Jodbedampfung)

IR (fest in KBr) : v _c=0 1636, 1676; 6 ^** ^ 1550; v ₀ 0H 1708 cm ^"1

2. Stufe: Sarkosyl-diglycin

5 g Chloracetyldiglycin werden mit 15 ml 33 %iger wäßri¬ ger Methylaminlösung versetzt und 2 Tage bei Raumtempera- tur stehen gelassen. Danach wird die Lösung auf Sirup¬ dicke unter vermindertem Druck eingeengt, der Sirup auf dem Wasserbad erwärmt und mit 50 ml heißem Ethanol ver¬ setzt. Den Niederschlag läßt man in der Kälte absetzen und saugt über eine G4-Fritte ab. Er wird in 43 ml heißem Wasser gelöst und 43 ml heißes Ethanol zugegeben. Das Produkt kristallisiert aus, man saugt ab und lyophili- siert .

Ausbeute: 3 g = 60 % d. Th. Schmp. : 237 °C DC: Silufol//n-Butanol/Eisessig/Wasser/ 4:1:1 Rf: 0,3 (Ninhydrin)

ERSATZBLATT

IR ( fest in KBr) : v _c=0 1620, 1650, 6-^1540; v _C QOH ^{1672 cm_1 •} J-H-NMR (DMSO) TMS δ2, 8 (N-CH ₃ , 3H) , δ3, 8-4,1 (-CH ₂ -,6H)

3. Stufe: Chloracetyl-sarkosyl-diglycin:

2 g Sarkosyl-diglycin werden in 10 ml IN NaOH bei Raum¬ temperatur gelöst und dann bei 0°C unter Rühren abwech¬ selnd mit 1 ml Chloracetylchlorid und 16 ml IN NaOH innerhalb von 30 min versetzt. Man läßt weitere 30 min rühren, säuert mit 3 g 5N HCl an und engt das Produkt unter vermindertem Druck bis zur Trockne ein. Die dabei anfallenden Kristalle werden in heißem Wasser gelöst und die Lösung mit Ethanol versetzt. Vom ausgefallenen Natri- umchlorid wird abfiltriert und das Filtrat unter vermin¬ dertem Druck eingeengt. Durch mehrmaliges Behandeln mit jeweils 30 ml heißem Aceton wird das gewünschte Produkt extrahiert, das Aceton unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit wenig Wasser aufgenommen und lyo- philisiert.

Ausbeute: 1,1 g = 53 % d. Th.

Schmp. : 74 °C

DC: Silufol//n-Butanol/Eisessig/Wasser 4:1:1

Rf : 0,7 (Jodbedampfung) IR (fest in KBr) : v _c=0 1655; 0 ^* ^1550; V _C00 H ¹⁷ 0 cm ^"1

4. Stufe: Benzoylmercaptoacetyl-sarkosyl-diglycin:

1 g Chloracetyl-sarkosyl-diglycin wird in 140 ml Met¬ hanol, p.a., unter Rühren und unter Schutzgas bei Raum¬ temperatur gelöst.

In einem Erlenmeyerkolben werden 0,8 g Thiobenzoesaure in 3 ml Methanol gelöst und mit Natriummethylat neutrali-

ERSATZBLATT

siert. Diese Lösung wird unter Rühren und unter Schutz¬ gas-Atmosphäre langsam zur Ausgangslösung zugetropft und noch weitere 12 Stunden gerührt. Man entfernt unter vermindertem Druck das Lösungsmittel und nimmt den Rück- stand mit 2N HC1 auf. Es wird abgesaugt und mit warmen Wasser neutral gewaschen. Anschließend wäscht man noch mit 20 ml Chloroform, 20 ml Acetonitril und 20 ml Ether und trocknet den Rückstand unter vermindertem Druck. Ausbeute: 0,83 g = 61 % d.Th. Schmp. : 134 °C

DC: Silufol//n-Butanol/Eisessig/Wasser 4:1:1

Rf: 0,8 (Jodbedampfung)

IR (fest in KBr) : v _c=o 1620,-6-^1550 cm" ¹ ,V _COO H1720 cm ^-1

5. Stufe: Mercaptoacetyl-sarkosyl-diglycin

Alkalische Abspaltung der Schutzgruppe:

Die Abspaltung der Schutzgruppe nach dem üblichen Verfah¬ ren mit Natriummethylat führte zu einem stark verunrei- nigten Endprodukt. Das Mercaptoacetyl-sarkosyl-diglycin ist nur zu etwa 25 % enthalten. Neben einem nicht identi¬ fizierten Nebenprodukt entstehen bei dieser Verseifung in der Hauptsache Mercaptoacetyl-sarkosin und Diglycin. Das gewünschte Produkt wird nur in geringer Ausbeute erhal- ten.

Alkalische Abspaltung unter Hydrierbedingungen:

0,08 mmol Substanz werden in 2 ml wasserfreiem Methanol suspendiert, mit 2 mg Pd/CaCθ3 (5 %) versetzt und bei einem Wasserstoffdruck von 60 kPa unter Rühren mit einer Lösung von 0,13 mmol Natriummethylat in 1 ml wasserfreiem Methanol umgesetzt. Man rührt noch 15 min und neutrali¬ siert danach die Lösung mit methanolischem Dowex 50WX8. Der Katalysator und das Harz werden abfiltriert, die

Substanz lyophilisiert und mit 2 ml Benzol extrahiert.

ERSATZBLATT

Anschließend wird das Benzol abgetrennt und die Substanz aus Ethanol lyophilisiert.

Ausbeute: 10,2 mg = 61 % d. Th. , farbloses Öl DC: Silufol//n-Butanol/Eisessig/Wasser 4:1:1 Rf: 0,4 (Ninhydrin) RP 18 // Methanol Rf = 0,8 (Ninhydrin) IR (fest in KBr) : v _c=0 1650, 1680; δjjjjl550, v _C0 0H ^{1745 c _1} -LH-NMR (DMSO) TMS δ 2,8 (SH, 1H) , δ3,0 (N-CH ₃ , 3H),δ 3,5- 4,1 (-CH ₂ ,8H), 58,1-8,2 (CO-NH-,2H)

[99m ^> p _c ] Mercaptoacetyl-Sarkosyl-Diglycin

1 ml ^99m Tc-Gluconatlösung wird mit einer Lösung von 0,4 mg Reinsubstanz aus Vorstufe 4, in 0,5 ml Wasser, ver¬ setzt. Nach 30 min ist die Umsetzung vollständig. DC: (Kieselgel 60, 95 % Ethanol) : Zwei Komponenten Rf 0-0,1 (40 %) , Rf 0,8 (60 %) Elektrophorese (pH 7,0) : Beide Komponenten wandern als Anionen.

Beispiel 4

Synthese von [ ^99m Tc] -Mercaptoacetyl-Hexylglycyl-Diglycin

1. Stufe: Hexylglycyl-diglycin

0,0048 mol Chloracetyl-diglycin werden mit 0,05 mol Hexylamin und 5 ml Ethanol versetzt und stehen gelassen. Nach 6 Tagen wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der ölige Rückstand wird in 50 ml Aceton gegeben und erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die gelbe

ERSATZBLATT

Lösung abgetrennt und der weiße Rückstand nochmals mit ca. 5 ml Aceton gewaschen. Das Produkt wird auf dem Tonteller getrocknet. Ausbeute: 610,5 mg (47 % d. Th.) DC:

Silufol//n-Butanol/Eisessig/Wasser 2:1:1

Rf: 0,3 (Ninhydrin)

RP 18//Methanol, Rf : 0,7 (Ninhydrin)

2. Stufe: Chloracetyl-hexylglycyl-diglycin

0,0022 mol Hexylglycyl-diglycin werden in 5 ml IN Natron¬ lauge gelöst und 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Lösung gekühlt. Bei 0°C werden abwechselnd innerhalb von 30 min 0,3 ml Chloracetylchlo¬ rid und 4 ml IN Natronlauge zugegeben. Dann wird noch 30 min ohne Kühlung gerührt.

Nach dem Ansäuern mit 5N Salzsäure wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt als gelbes Öl gewonnen. Nach mehrmaligem Extrahieren mit jeweils 100 ml heißem Aceton wird das Aceton unter ver¬ mindertem Druck entfernt und der Rückstand mit 30 ml Aceton aufgeschlämmt. Der weiße Bodensatz wird auf dem Tonteller getrocknet.

Ausbeute: 311 mg (40 % d.Th.)

DC: Silufol//n-Butanol/Eisessig/Wasser 2:1:1

Rf: 0,75 (Jodbedampfung)

3. Stufe: Benzoylmercaptoacetyl-hexylglycyl-diglycin

0,00089 mol Chloracetyl-hexylglycyl-diglycin werden in 70 ml Methanol (spezialrein für Mikroelektronik) gelöst und unter Schutzgas (N ) gerührt. 0,002 mol Thiobenzoesaure werden in 5 ml Methanol gelöst und mit 0,4 ml Na-Methano- lat neutralisiert. Diese Lösung wird unter Schutzgas

ERSATZBLATT

langsam zugegeben und noch 12 Stunden weitergerührt. Das Methanol wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit 2N HCl aufgenommen. Die Salzsäure wird ebenfalls unter vermindertem Druck entfernt, der Rück- stand mit Wasser gewaschen und das Waschwasser durch

Abdekantieren entfernt. Der zähflüssige Rückstand wird mit wenig Methanol versetzt und das Produkt fällt aus. Es wird mit Acetronitril gewaschen und auf dem Tonteller getrocknet. Ausbeute: 253, 3 mg (67 % d. Th.)

DC: Silufol//Butanol/Eisessig/Wasser 2:1:1 Rf: 0,8 (UV)

4. Stufe: Mercaptoacetyl-hexylglycyl-diglycin

0,064 (28,8 mg) mmol Benzoylmercaptoacetyl-hexylglycyl- diglycin werden in 2 ml Methanol suspendiert, 2,7 mg 5 % Pd/CaC03 zugegeben und an der Hydrierapparatur ange¬ bracht. In einem Winkelkolben werden 0,04 ml Na-Methano- lat und 1 ml Methanol gegeben. Die Apparatur wird evaku¬ iert und anschließend mit Wasserstoff gespült.

Das Methanolat wird zugegeben und bei einem Wasserstoff- druck von 60 kPa noch 15 min gerührt. Die Lösung wird mit methanolischem Dowex 50WX8 angesäuert, das Harz über einen Faltenfilter abfiltriert (Argonglocke) , mit Methanol gewaschen und anschließend lyophilisiert. Der Rückstand wird dreimal mit jeweils 4 ml Benzol extra¬ hiert, das Benzol durch Dekantieren entfernt, der Rück- stand erneut in Methanol aufgenommen und lyophilisiert. Das Produkt wurde über eine Sephadex-Säule gereinigt. Ausbeute: 9,8 mg (42 % d. Th.) DC: Silufol//Butanol/Eisessig/Wasser 2:1:1 Rf.0,5 (Ninhydrin)

ERSATZBLATT

!H-NMR (DMSO) TMS δl , 2 ( - CH3 , 3H ) , δ3 , 1 ( SH , 1H) , δ3 , 2 (N-CH2 , 10H) , δ3 , 7 ( -CH2 , 6H) , δ3 , 8 ( CH2 - SH , 2H) δ8 , 2 - 8 , 5 ( -NH , 2H)

[99m-p _c ] -Mercaptoacetyl-hexyl-glycyl-diglycin:

1 ml ^99m Tc-Gluconatlösung wird mit 400 μl 0,1 N NaOH und 30 μl Vorstufe 4 Lösung - 1,63 mg/100 μl Wasser - ver¬ setzt. Nach 40minütigem Stehenlassen wird der Reaktions- ansatz mit 2 ml einer 0,1 M Natriumphosphatpufferlösung (pH 7,0) neutralisiert. Die Reaktionsmischung ist mindestens 2 Stunden lang stabil. DC (Kieselgel 60; 95 % Ethanol) : Rf 0,7 (95 %) Elektrophorese (pH 7,0) : Wanderung als Anion

Beispiel 4 a

Anreicherung von [99mTc] -Mercaptoacetyl-Hexyl-glycin-

Diglycin in atherosklerotischen Plaques von Aorten an WHHL-Kaninchen.

99,9 GBq (2,7 mCi) der nach Beispiel 4 markierten Sub¬ stanz wurde mit phosphatgepufferter Saline auf 1 ml verdünnt und einem narkotisierten WHHL-Kaninchen Rom- pun/Ketavet (1:2) über eine Ohrvene appliziert. 5 Stunden nach Applikation wurde das Kaninchen getötet und sowohl eine Autoradiographie der Aorta als auch eine Sudan III- Färbung zur Darstellung der atherosklerotischen Plaques durchgeführt (Abbildung 1) . Der Anreicherungsfaktor zwischen normalen und atherosklerotischen Wandbereichen betrug je nach Ausbildung der Plaques (Sudan III-Färbung) zwischen 3 und 5. Die In-vivo-Darstellung eines WHHL- Kaninchens ist in Abbildung 2 dargestellt.

ERSATZBLATT

Beispiel 5

S-Bzl-acetyl-Sar-Gly-Gly- [8α-Ergolinylamid]

200 mg S-Bzl-acetyl-Sar-Gly-Gly-OH und 161 mg Benzotria- zol-1-yl-tetramethyl-uronium-tetrafluoroborat wurden in 1 ml N-Methylpyrrolidon gelöst und 172 μl Diisopropyl- ethylamin addiert. Nach 3 min wird die farblose Lösung zu einer gerührten Lösung von 120 mg 8c_-Amino-ergolin getropft. Die rotbraune Lösung wird bei Raumtemperatur noch 4 Stunden gerührt, wobei der Fortgang der Reaktion HPLC-chromatographisch an einer VYDAC C18 Säule (4,6 x 250 mm) unter Anlegung eines Gradienten von 10 % auf 60 % B in 25 min verfolgt wurde (Laufmittel A 1000 ml Wasser/2 ml Trifluoressigsäureanhydrid, Laufmittel B 500 ml

Acetonitril/100 ml Wasser/l ml Trifluoressigsäureanhy¬ drid) .

Der Reaktionsansatz wird ohne weitere Vorbehandlung präparativ an einer VYDAc-Säule (40 x 300 mm) unter

Anlegung eines Gradienten von 20 % auf 30 % B in 20 min getrennt (Laufmittelzusammensetzung wie oben angegeben) .

Anschließend wird lyophilisiert.

Ausbeute: 75 mg Ein Massenspektrum zeigte das erwartete Molekulargewicht.

Beispiel 6

S-Bzl-acetyl - [Nl -Hexyl] -Gly-Gy-Gly- [8α-Ergolinylamid]

60 mg S-Bzl-acetyl- [N*---Hexyl] -Gly-Gy-Gly-OH und 40 mg Benzotriazol-1-yl-tetramethyl-uronium-tetrafluoroborat wurden in 0,6 ml N-Methylpyrrolidon suspendiert und durch Zugabe von 17,2 μl Diisopropylethylamin in Lösung ge- bracht. Diese Lösung wurde zu einer Lösung von 30 mg 8α- Amino-ergolin in 0,4 ml N-Methylpyrrolidon getropft. Nach

ERSATZBLATT

4 Stunden wurde die Reaktionslösung aufgearbeitet. Die rohe Reaktionsmischung wurde präparativ chromatographiert (wie für Beispiel 5 beschrieben) . Anschließende Lyophili- sierung ergab das gewünschte Produkt. Ausbeute: 30 mg eines pseudokristallinen Produktes.

Das Massenspektrum zeigte das erwartete Molekulargewicht.

Beispiel 7

S-Bzl-acetyl-Sar-Gly- [8α-Ergolinylamid]

180 mg S-Bzl-acetyl-Sar-Gly-OH und 161 mg Benzotriazol-1- yl-tetramethyl-uronium-tetrafluoroborat wurden in 1 ml N- methyl-pyrrolidon gelöst und 172 μl Diisopropylethylamin addiert. Nach 3 min wird die farblose Lösung unter Rühren zu einer Lösung von 120 mg 8α-Amino-ergolin getropft. Die rotbraune Lösung wird bei Raumtemperatur noch 4 Stunden gerührt und - wie bei Beispiel 5 beschrieben - aufgearbeitet und chromatographiert. Ausbeute: 70 mg (Pseudokristallin) Ein MS zeigte den erwarteten Peak.

Beispiel 8

S-Bzl-acetyl-Sar- [8α-Ergolinyl-amid]

120 mg S-Bzl-acetyl-Sar-OH und 161 mg Benzotriazol-1-yl- tetramethyl-uronium-tetrafluoroborat wurden in 1 ml N- methyl-pyrrolidon gelöst und 172 μl Diisopropylethylamin addiert.

Man setzt dann analog Beispiel 5 um und erhält nach Aufarbeiten und Trennen 52 mg einer pseudokristallinen Verbindung. Ein MS zeigt den erwarteten Massenpeak.

Beispiel 9

ERSATZBLATT

3,17ß-Dihydroxy-17α- [5 (S-benzoylthio-acetyl-sarkosyl- glycyl-) amino-pent-l-en-3-in] -1,3, 5-estratrien

Man fügt zu einer Suspension von 130,0 mg 17ß-Hydroxy- 17α-iodvinyl-l, 3, 5-estratrien-3-tetrahydropyranyl- ether,0,35 g [S-Benzoyl-thioacetyl-sarkosyl-glycyl- propargylamid] , 11,0 mg Benzyl-triethyl-ammoniumchlorid, 11,5 mg Tetrakis- (triphenylphosphin) palladium (0), 9 mg Kupfer- (I) -iodid, in 5 ml Toluol suspendiert und rührt 90 Stunden bei Raumtemperatur. Man versetzt mit Wasser, extrahiert mit Toluol und trocknet. Das Lösemittel wird unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand in 10 ml Tetrahydrofuran aufgenommen, mit 190 mg Pyridinium- paratoluolsulfonsäure in 5 ml Ethanol versetzt und 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und man reinigt mit Methylenchlorid/Methanol (8:1) an einer Silicagelsäule. Ausbeute: 30 % d. Th.

Die Substanz zeigt im DC (CH Cl ₂ /MeOH] 5 : 5 einen Rf von 0,4.

Beispiel 10

3, 17ß-Dihydroxy-17α- [N- (benzoyl-thio-acetyl-sarkosyl- glycyl) -amino-propin-1] -1,3,5 estratrien

Man fügt zu einer Suspension von 110 mg 17ß-Hydroxy-17α- propargyl-amino-1, 3, 5-estratrien-3-tetrahydropyranyl- ether, in 3 ml DMF 350 mg S-Benzoyl-thioacetyl-sarkosyl- glycin in 3 ml DMF. Man rührt bei 100°C 24 Stunden unter Schutzgas.

ERSATZBLATT

Nach Zugabe von 10 ml Tetrahydrofuran, saugt man vom Kristallisat ab und engt unter vermindertem Druck ein. Der Rückstand wird in 20 ml Tetrahydrofuran aufgenommen, mit 100 mg Pyridinium-para-toluolsulfonsäure in 3 ml Ethanol gelöst, versetzt und 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt. Nach Entfernen des Lösemittels wird an Silica- gel-Niederdrucksäule im System Methanol/Methylenchlorid (1:8) gereinigt.

Die Substanz zeigte im DC (CH ₂ Cl ₂ /MeOH) 5 : 5 einen Rf von 0,6.

Ausbeute: 71 mg

Beispiel 11

0,001 mol S-Bzl-acetyl-Sar-Gly-OH und 322 mg Benzotria- zol-1-yl-tetramethyl-uroniumtetrafluoroborat werden in 3 ml DMF gelöst unter Zugabe von 344 μl Diisopropylethyla- min. Es wird zur Bildung des Benzotriazolylesters 5

Minuten voraktiviert und anschließend die klare Lösung zu 33 mmol geschütztem His (Trt) -Leu-Asp (OBut) -Ile-Ile-Trp- Harz addiert. Die Suspension wird eine Stunde gerührt, anschließend mehrfach mit DMF gewaschen, abgesaugt und getrocknet. Das getrocknete Harz wird dann wie üblich mit TFA/Scavanger behandelt, um das Produkt von den Schutz¬ gruppen zu befreien. Die Reinigung wird wie für Beispiel 5 beschrieben ausgeführt.

Die nach Beispiel 10 erhaltene Verbindung wird nach dem als allgemeine Methode (Beispiel 1) angegebenem Verfahren mit ^99m Tc komplexiert.

Beispiel 12

ERSATZBLATT

0,010 mol His (Trt) -Leu-Asp (OBut) -Ile-Ile-Trp-OH, herge¬ stellt am Sasrin-Harz, werden in einem Gemisch aus DMF/NMP unter Zugabe von 0,010 mol Diisopropylethylamin gelöst und unter Rühren mit 0,010 mol S-Bzl-acetyl-Sar- OH, vorbereitet wie unter Beispiel 11, gelöst in 3 ml DMF versetzt. Es wird 2 Stunden gerührt und anschließend das Lösungsmittel entfernt. Der verbleibende Rückstand wird mit Wasser verrührt und abgesaugt, gewaschen und getrock¬ net. Die Schutzgruppen werden wie üblich entfernt und das Produkt durch Eingießen in Ether erhalten. Die Reinigung wird wie für Beispiel 5 beschrieben ausgeführt.

S-Bzl-acetyl- [N14-Bromphenyl] -Gly-Gly-Gly-OH

1.Stufe: Chloracetyldiglycin

10 g Glycinanhydrid werden in einem 250 ml Dreihalskolben in 50 ml 2N Natronlauge bei Raumtemperatur gelöst. Nach 45 min wird die noch etwas trübe Lösung auf etwa 0 °C abgekühlt und 11,1 g (7,8 ml) Chloracetylchlorid und 24 ml 5N Natronlauge im Wechsel unter Rühren zugetropft. Nach 45 min ist die Zugabe beendet. Die Lösung färbt sich leicht rosa. Anschließend werden 40 ml 5N Salzsäure zugegeben, wobei sich die Lösung entfärbt und die Sub- stanz zu kristallisieren beginnt. Man läßt noch ca.

1 Stunde bei 0 °C stehen und saugt den Niederschlag ab. Er wird mehrmals mit kaltem Wasser gewaschen und aus heißem Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 5 g Schmp. : 173-174 °C

Die Mutterlauge wird unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand wird ebenfalls aus Wasser umkristalli¬ siert. Ausbeute: 2,5 g Schmp. : 173 °C

ERSATZBLATT

Gesamtausbeute : 7,5 g = 41 % d.Th.

DC:

Silufol//n-Butanol/Eisessig/Wasser 4:1:1

2.Stufe: 4-Bromphenyl-triglycin

0,0144 mol Chloracetyldiglycin werden mit 0,029 mol 4- Bromanilin in 20 ml Ethanol und 20 ml IN NaOH 7 Stunden am Rückfluß erhitzt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird der verbleibende Rückstand dreimal mit je 50 ml warmen Aceton extrahiert. Das zu¬ rückbleibende Produkt wird aus heißem Wasser umkristalli¬ siert. Das Rohprodukt wird in Stufe 3 eingesetzt. Ausbeute: ca. 60 %.

3.Stufe: Chloracetylierung von 4-Bromphenyl-triglycin

0,01 mol 4-Bromphenyl-triglycin werden in 10 ml IN NaOH bei Raumtemperatur gelöst und dann bei 0°C unter Rühren abwechselnd mit 0,012 mol Chloracetylchlorid und 20 ml IN NaOH innerhalb von 30 min versetzt. Man läßt weitere 30 min rühren, säuert mit 5N HC1 an und engt das Produkt unter vermindertem Druck zur Trockne ein. Die dabei anfallenden Kristalle werden in heißem Wasser gelöst und die Lösung mit Ethanol versetzt. Das ausfallende Natrium¬ chlorid wird abfiltriert und das Filtrat am Rotationsver¬ dampfer eingeengt. Durch mehrmaliges Behandeln mit jeweils 30 ml heißem Aceton wird das gewünschte Produkt extrahiert, das Aceton unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit wenig Wasser aufgenommen und lyo¬ philisiert . Ausbeute: 50% d.Th. DC: Silufol//n-Butanol/Eisessig/Wasser 2:1:1 Rf: 0,6

ERSATZBLATT

4.Stufe: S-Bzl-acetyl- [N ¹ -Bromphenyl] -Gly-Gly-Gly-OH

0,01 mol des Chloracetylproduktes werden in 140 ml Methanol unter Rühren und Schutzgas bei Raumtemperatur gelöst. Hierzu werden 0,02 mol Thiobenzoesaure in 20 ml Methanol gelöst und mit Natriummethylat neutralisiert, unter Rühren und unter Schutzgas langsam zugetropft und noch weitere 12 Stunden gerührt. Man entfernt das Lδ- sungsmittel unter vermindertem Druck und nimmt den Rück¬ stand mit 2N HCl auf. Die dabei anfallenden Kristalle werden abgesaugt und mit warmem Wasser neutral gewaschen. Anschließend wäscht man noch mit 20 ml Chloroform, 20 ml Acetonitril und 20 ml Ether und trocknet den Rückstand unter vermindertem Druck. Ausbeute: 60% d.Th.

5.Stufe: Thio-acetyl- [N ¹ -Bromphenyl] -Gly-Gly-Gly-OH

0,08 mmol Substanz von Stufe 4 werden mit 2 ml wasser¬ freiem Methanol suspendiert, mit 2 mg Pd/CaC03 (5%) ver¬ setzt und bei einem Wasserstoffdruck von 66 kPa unter Rühren mit einer Lösung von 0,13 mmol Natriummethylat in 1 ml absolutem Methanol umgesetzt. Man rührt noch 15 Min und neutralisiert danach die Lösung mit methanolischem Dowex 50WX8. Der Katalysator und das Harz werden abfil¬ triert, die Substanz lyophilisiert und mit 2 ml Benzol extrahiert. Anschließend wird das Benzol abgetrennt und die Substanz aus Ethanol lyophilisiert. Die Reinigung erfolgt mittels präparativer HPLC.

DC: Silufol//Butanol/Eisessig/Wasser 2:1:1

Rf: 0,8

Ausbeute: 40% d.Th.

99m _Tc [Thioacetyl- [N ¹ ^-Bromphenyl] -Gly-Gly-Gly-OH

ERSATZBLATT

Wie zur allgemeinen Komplexierung vor Beispiel 1 be¬ schrieben, wird Thio-acetyl- [N ¹ -Bromphenyl] -Gly-Gly-Gly- OH mit einem [ ^99m Tc] -Gluconat-Präparation umgesetzt.

ERSATZBLATT