[0001] La présente invention concerne le domaine des nanoparticules chargées en agents cytotoxiques. Plus particulièrement, l'invention vise des nanoparticules comprenant un copolymère dibloc acide hyaluronique (HA) et acide polylactique (PLA) et au moins un agent cytotoxique, ainsi qu'une composition les comprenant. L'invention vise encore un procédé de préparation de telles nanoparticules. Les nanoparticules et les compositions les comprenant étant en particulier destinées à être utilisées en tant que médicament, notamment dans le traitement du cancer.

Les systèmes permettant la délivrance de certains principes actifs à un patient ou de contrôler la libération de principes actifs sont depuis longtemps reconnus comme étant d'une grande utilité. Par exemple, la doxorubicine, agent cytotoxique employé dans le traitement de nombreux cancers, est connue pour présenter une grande toxicité cardiaque. Or, des formes liposomales de cette molécule (Doxil®, Janssen Products LP ou Myocet®, Cephalon) ont été approuvées pour le traitement de nombreux cancers car ces nanoparticules permettent de réduire cette toxicité cardiaque. Il reste néanmoins un réel besoin d'améliorer encore le profil de sécurité des agents cytotoxiques et aussi d'augmenter leur efficacité, en particulier en ciblant plus efficacement les cellules cancéreuses.

[0002] A ce sujet, la demande WO2013/044219 décrit des nanoparticules PEG-PLA présentant un diamètre hydrodynamique de 60 à 130 nm, et comprenant un agent chemothérapeutique et de 10 à 97 % en poids d'un copolymère dibloc PEG-PLA, ledit bloc PLA ayant un Mn allant de 15 à 20 kDa et ledit bloc PEG un Mn allant de 4 à 6 kDa.

[0003] Les nanoparticules décrites dans le document ci-dessus et dans l'art antérieur peuvent se révéler insatisfaisantes en termes de taux d'incorporation de l'agent cytotoxique, d'efficacité d'incorporation de l'agent cytotoxique, d'effet « burst » (vitesse initiale de libération du principe actif), de stabilité dans les fluides biologiques, de ciblage de cibles spécifiques, de taille, de capacité de relargage du principe actif, notamment dans le temps, de stabilité, de concentration micellaire critique, d'effets secondaires, de furtivité, ou d'effet « stealth », et/ou d'efficacité de délivrance intracellulaire.

[0004] Par ailleurs, les procédés décrits peuvent également se révéler insatisfaisants, notamment en termes d'efficacité d'incorporation, de reproductibilité, de taille des nanoparticules formées, de stabilité des nanoparticules ou encore pas assez adaptés à la préparation à l'échelle industrielle de telles nanoparticules.

[0005] La présente invention vise donc à résoudre en tout ou partie les problèmes évoqués ci-dessus, et notamment à fournir une solution permettant d'obtenir des nanoparticules présentant un taux d'incorporation d'agent cytotoxique amélioré, un effet « burst » minimum (c'est-à-dire une libération prolongée progressive des agents cytotoxiques au cours du temps, sans « pic » de libération), un excellent ciblage des cellules tumorales, une petite taille et/ou une taille bien définie, un relargage du principe actif amélioré, notamment dans le temps, et/ou une meilleure stabilité.

[0006] L'invention vise également à proposer un procédé adapté à la préparation à l'échelle industrielle de telles nanoparticules, particulièrement satisfaisant en termes de reproductibilité, de taille des nanoparticules formées, de stabilité des nanoparticules, et/ou permettant d'obtenir une bonne efficacité d'incorporation des agents cytotoxiques au sein des nanoparticules.

[0007] Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet des nanoparticules ayant un diamètre hydrodynamique moyen inférieur ou égal à 150 nm, comprenant:

au moins un agent cytotoxique, la teneur totale en agent cytotoxique étant supérieure ou égale à 1 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules,

au moins un copolymère dibloc comprenant un bloc acide hyaluronique et un bloc acide polylactique, ces blocs étant liés de manière covalente, éventuellement par l'intermédiaire d'un espaceur, la teneur totale en copolymère dibloc étant supérieure ou égale à 40 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules.

[0008] Par « agent cytotoxique », on entend également les agents anti- néoplasiques.

[0009] Selon un mode de réalisation avantageux, les nanoparticules selon l'invention peuvent comprendre en outre au moins un polyester et/ou un polyamino- acide, en une teneur totale pouvant aller de 1 à 50 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules. Le polyester peut être choisi parmi les acides polylactique ou PLA, les acides poly(lactique-co-glycolique) ou PLGA, les polycaprolactones ou PCL, les poly(triméthylène carbonate) ou PTMC, ou leurs copolymères, statistiques ou en blocs.

[00010] Selon un mode de réalisation avantageux, les nanoparticules selon l'invention peuvent comprendre en outre un adjuvant hydrophobe, en une teneur pouvant aller de 0, 1 à 20 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules.

[00011] Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet une poudre de nanoparticules telles que définies dans la présente description comprenant une teneur en eau inférieure ou égale à 5 % en poids par rapport au poids total de la poudre.

[00012] Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant des nanoparticules.

[00013] Selon un autre de ses aspects, l'invention a encore pour objet une méthode de traitement thérapeutique comprenant l'administration de nanoparticules ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention.

[00014] Les différents modes de réalisation de T'invention seront plus particulièrement exposés dans le description et les exemples qui suivent.

En particulier, la Figure I présente l'analyse RMN-DOSY (DMSO-d ₆ , 298 K, 500 Mhz) du composé Al décrit dans l'exemple 4 ci-après.

COPOLYMERE DIBLOC ACIDE HYALURONIOUE - ACIDE POLYLACTIOUE

[00015] Dans le cadre de la présente invention, on peut employer tout copolymère dibloc comprenant un bloc acide hyaluronique (HA) et un bloc acide polylactique (PLA) dans lequel le bloc HA est lié de manière covalente au bloc PLA, éventuellement via un espaceur. Ce copolymère peut encore être appelé « copolymère dibloc HA-PLA ».

[00016] Tout particulièrement le bloc HA et le bloc PLA du copolymère dibloc HA- PLA sont liés de manière covalente via leurs extrémités terminales, éventuellement par l'intermédiaire d'un espaceur.

[00017] Comme copolymères dibloc HA-PLA, peuvent être avantageusement employés ceux répondant à la Formule I suivante :

HA-Cy-(A-Spaceri)a-L-(Spacer ₂ -B)b-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule I dans laquelle

- HA représente un bloc acide hyaluronique,

- PLA représente un bloc acide polylactique,

- Cy représente :

- un cycle ouvert : l'acide D-glucuronique ouvert et/ou la D-N-acétyl glucosamine ouverte, ou

- un cycle fermé : l'acide D-glucuronique fermé et/ou la D-N-acétyl glucosamine fermée, tels que respectivement représentés ci-après :

X représente CH ₂ ou CO quand Cy représente un cycle ouvert et CH quand Cy représente un cycle fermé,

A représente O ou NR, avec R=H ou alkyle linéaire ou branché en Cl à C6

Spaceri et Spacer ₂ représentent, indépendamment l'un de l'autre, un radical comprenant de 1 à 16 atomes de carbone, ledit radical peut être linéaire, ramifié ou cyclique, et saturé ou insaturé, en particulier le radical comprend :

- au moins un hétéroatome, en particulier choisi parmi O, N et S, éventuellement compris dans la chaîne du Spaceri et/ou du Spacer ₂ ,

- au moins un cycle carboné, notamment aromatique, et/ou

- au moins un hétérocycle, notamment comprenant un hétéroatome choisi parmi O, N et S,

B représente O ou NR", avec R"=H ou alkyle linéaire ou branché en Cl à C6,

L représente O, NR', avec R'=H ou alkyle linéaire ou branché en Cl à C6, amide, ester, carbamate, urée, triazole, thiolmaléimide, S-S, SCH2-CH2 ou SCH =CH, et a=0 ou 1 et b=0 ou 1.

[00018] Tout particulièrement lorsque L=NR', alors a+b= l. [00019] Avantageusement, le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule I dans laquelle a+b= l ou 2.

[00020] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule I dans laquelle i) lorsque L=NR', a= l, A représente NR et b= l alors B est différent de NR", et ii) lorsque L=NR', b= l, B représente NR" et a= l alors A est différent de NR.

[00021] Le copolymère dibloc HA-PLA comprend donc une partie acide hyaluronique, ou HA. L'acide hyaluronique est un polymère comportant comme motif de répétition un disaccharide composé d'une unité acide D-glucuronique et d'une unité D-N-acétylglucosamine, liées entre elles par des liaisons glycosidiques alternées : D- N-acétylglucosamine béta-1,4 acide D-glucuronique et acide D-glucuronique béta-1,3 D-N-acétylglucosamine. Le motif Cy de la Formule I provient d'un acide D- glucuronique et/ou d'une D-N-acétylglucosamine constituant l'extrémité réductrice de l'acide hyaluronique. Le motif Cy provenant d'un acide D-glucuronique est lié à une unité D-N-acétylglucosamine portée par le HA par une liaison glycosidique béta-1,4, tandis que le motif Cy provenant d'une unité D-N-acétylglucosamine est lié à une unité acide D-glucuronique portée par le HA par une liaison glycosidique béta-1,3.

[00022] Selon un mode de réalisation, l'acide hyaluronique est d'origine naturelle.

[00023] Selon un mode de réalisation, l'acide hyaluronique est synthétique. Il peut par exemple être produit par fermentation microbienne. L'acide hyaluronique peut aussi être issu de la dégradation d'un acide hyaluronique de plus haut poids moléculaire d'origine naturelle ou synthétique. Cette dégradation peut être chimique et/ou enzymatique. La dégradation chimique peut consister par exemple en une hydrolyse acide et/ou une utilisation de peroxyde d'hydrogène. La dégradation enzymatique peut consister en l'utilisation d'enzyme d'origine bactérienne et/ou mammifère.

[00024] Le bloc HA peut présenter une masse molaire moyenne en nombre, Mn, allant de 2 à 500 kg/mol, notamment de 2 à 400 kg/mol, en particulier de 2 à 300, voire de 2 à 200 kg/mol. La masse molaire moyenne en nombre du HA, Mn, est estimée par RMN *H selon le protocole présenté dans l'exemple 3.

[00025] Tout particulièrement le bloc HA présente un indice de dispersité (Θ), correspondant au ratio entre la masse molaire moyenne en poids (Mw) et la masse molaire moyenne en nombre (Mn), allant de 1,1 à 4, notamment de 1, 1 à 3, en particulier de 1, 1 à 2,5. Cet indice de dispersité peut être déterminée par chromatographie d'exclusion stérique.

[00026] En particulier, le bloc HA est dépourvu de groupements autres que ceux qu'il porte à l'état natif, c'est-à-dire que les monosaccharides qu'il comprend, hormi le motif à l'extrémité réductrice, sont l'acide D-glucuronique et la D-N-acétyl glucosamine.

[00027] L'acide polylactique peut être obtenu par polycondensation de l'acide lactique. En particulier, l'acide polylactique obtenu par polycondensation porte une fonction acide carboxylique à une de ses extrémités. L'acide polylactique peut aussi être obtenu par polymérisation par ouverture de cycle (ROP, « Ring Opening Polymerization») du lactide. La polymérisation par ouverture de cycle peut être effectuée directement à partir du lactide ou à partir de lactide provenant d'une première étape de polymérisation de l'acide lactique conduisant à un PLA prépolymère suivie d'une étape de dépolymérisation du prépolymère.

[00028] Dans un mode préféré, le PLA est obtenu directement par polymérisation par ouverture de cycle du lactide. Le PLA peut être obtenu par polymérisation de l'isomère (S, S), de l'isomère (R,R) ou de l'isomère méso du lactide, seuls ou en mélange. Le PLA peut être obtenu par polymérisation du rac-lactide qui est un mélange équimolaire des isomères (R,R) et (S, S) du lactide. Dans un mode préféré, le PLA est obtenu par polymérisation du rac-lactide.

[00029] Dans un mode préféré, le PLA est obtenu directement par polymérisation du lactide en utilisant un précurseur de (Spacer ₂ -B) ou un précurseur du (A-Spaceri) (b=0) portant une fonction alcool à une de ses extrémités.

[00030] Le bloc acide polylactique peut présenter une masse molaire moyenne en nombre, Mn, allant de 3 à 200 kg/mol, notamment de 3 à 150 kg/mol, en particulier de 3 à 100 kg/mol. La masse moléculaire moyenne en nombre, Mn, du PLA est estimée par RMN ^ par comparaison de l'intégration des signaux du boût de chaine du PLA à l'intégration des signaux du motif répété.

[00031] A noter que d'une manière générale, dans le cadre de la présente invention, lorsque la masse moléculaire moyenne en nombre, Mn, des différents blocs ne peut être déterminée par RMN, elle est alors mesurée par chromatographie d'exclusion stérique ou SEC. [00032] Tout particulièrement le bloc PLA présente un indice de dispersité allant de 1,02 à 3, en particulier allant de 1,02 à 2,5, notamment allant de 1,02 à 2, voire allant de 1,02 à 1,6.

[00033] Le bloc PLA peut présenter un indice de dispersité particulièrement bas lorsqu'il est produit directement par polymérisation par ouverture de cycle du lactide. Il peut alors présenter un indice de dispersité allant de 1,02 à 1,3. Ledit indice de dispersité peut être déterminé par chromatographie d'exclusion stérique.

[00034] Le Spaceri et le Spacer ₂ peuvent représenter, indépendamment l'un de l'autre :

- un radical alkylène en C2-C16, notamment en C2, C4, C6 ou C8, notamment linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé,

- un polyoxyalkylène de type CH2CH2(OCH2CH ₂ )m, avec m étant un nombre entier allant de 1 à 6, ou CH2CHCH3(OCH2CHCH ₃ )n, avec n étant un nombre entier allant de 1 à 4, ou

- une chaîne carbonée comprenant au moins un cycle aromatique.

[00035] Tout particulièrement, quand le radical du Spaceri ou du Spacer ₂ comprend au moins 2 atomes de carbone, il présente un atome de carbone à chacune de ces extrémités.

[00036] Ledit radical alkylène peut comprendre au moins un hétéroatome, en particulier choisi parmi O, N et S, ledit hétéroatome peut être porté sur la chaîne, par exemple pour former une fonction alcool, aminé, ou thiol, ou encore ledit hétéroatome peut être compris dans la chaîne du Spaceri et/ou du Spacer ₂ .

[00037] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule II suivante :

HA-Cy-(A-Spaceri)-L-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule II

dans laquelle L représente NR' ou O et A représente NR ou O, et HA, Cy, Spaceri et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00038] Selon un mode de réalisation plus particulier le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule III suivante : HA-Cy-(NR-Spaceri)-NR'-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule III

dans laquelle HA, Cy, R, Spaceri, R' et PLA sont tels que définis en Formule I. En particulier Cy représente un cycle ouvert.

[00039] Selon un mode de réalisation plus particulier le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule IV suivante :

HA-Cy-(0-Spaceri)-NR'-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule IV

dans laquelle HA, Cy, Spaceri, R' et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00040] Selon un mode de réalisation plus particulier le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule V suivante :

HA-Cy-(NR-Spaceri)-0-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule V

dans laquelle HA, Cy, R, Spaceri et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00041] Selon un mode de réalisation plus particulier le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule VI suivante :

HA-Cy-(0-Spaceri)-0-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule VI

dans laquelle HA, Cy, Spaceri et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00042] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule VII suivante :

Formule VII

dans laquelle Cy est un cycle fermé, X = CH et HA, Spacer ₂ , B et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00043] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule VIII ou à la Formule IX suivantes :

Formule VIII

N = N

HA-Cy-tA-Spacer (Spacer ₂ -B)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule IX

dans lesquelles Cy représente un cycle fermé et X=CH ou Cy représente un cycle ouvert et X=CH ₂ ou CO, et HA, A, Spaceri, Spacer ₂ , B et PLA sont tels que définis en Formule I. En particulier A représente NR ou O et B représente O.

[00044] Selon un mode de réalisation plus particulier le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule X ou à la Formule XI suivantes :

Formule X

Formule XI

dans lesquelles Cy représente un cycle ouvert, X=CH ₂ , A représente NR ou O, et HA, Spaceri, Spacer ₂ , et PLA sont tels que définis en Formule I. En particulier A représente NR.

[00045] Selon un mode de réalisation plus particulier le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule X ou à la Formule XI suivantes :

N = N

HA-Cy-CA-Space^ (Spacer ₂ -0)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule X

N = N

HA-Cy-CA-Space^ (Spacer ₂ -0)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA Formule XI

dans lesquelles Cy représente un cycle ouvert, X=CO, A représente NR ou O, et HA, Spaceri, Spacer ₂ , et PLA sont tels que définis en Formule I. En particulier A représente NR.

[00046] Selon un mode de réalisation plus particulier le copolymère dibloc HA-PLA répond aux Formule X ou à la Formule XI suivantes :

Formule X

Formule XI

dans lesquelles Cy représente un cycle fermé, X=CH et A représente NR ou O, et HA, Spaceri, Spacer ₂ , et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00047] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à une des Formules XII, XIII, XIV et XV suivantes :

HA-Cy-(A-Spacer ₁ )- ^/S ~^^ \ (Spacer ₂ -B)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule XII

HA-Cy-(A-Spacer ₁ )/^ ^/S \ (Spacer ₂ -B)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule XIII

(Spacer ₂ -B)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule XIV

HA-Cy-(A-Spacer ₁ )^ ^{/ :;::} ^ ^rS \ (Spacer ₂ -B)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule XV

dans lesquelles HA, Cy, A, Spaceri, Spacer ₂ , B et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00048] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule XVI ou à la Formule XVII suivantes :

Formule XVI

Formule XVII

dans lesquelles HA, Cy, A, Spaceri, Spacer ₂ , B et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00049] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à la

Formule XVIII ou à la Formule XIX suivantes :

O

HA-Cy-tA-SpacerJ— s "-Yn-(Spacer ₂ -B)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule XVIII

O

HA-Cy-CA-Spacer — Yn S— (Spacer ₂ -B)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule XIX

dans lesquelles Y représente O ou NH, et n=0 ou 1, et HA, Cy, A, Spaceri, Spacer ₂ , B et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00050] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à la

Formule XX ou à la Formule XXI suivantes :

O

-(A-Spacer, )— N ^(Spacer ₂ -B)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

H

Formule XX

Formule XXI

dans lesquelles HA, Cy, A, Spaceri, Spacer ₂ , B et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00051] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule XXII ou à la Formule XXIII suivante : 0

U

HA-Cy-(A-Spacer ₁ ) -o^^(Spacer ₂ -B)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule XXII

Formule XXIII

dans lesquelles HA, Cy, A, Spaceri, Spacer ₂ , B et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00052] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à la

Formule XXIV ou à la Formule XXV suivantes :

Formule XXIV

Formule XXV

dans lesquelles HA, Cy, A, Spaceri, Spacer ₂ , B et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00053] Selon un mode de réalisation le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule XXVI suivante :

Formule XXVI

dans lesquelles HA, Cy, A, Spaceri, Spacer ₂ , B et PLA sont tels que définis en Formule I.

[00054] Tout particulièrement le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule XXVII suivante :

HA-Cy-(NR-Spaceri)-L-(Spacer ₂ -0)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule XXVII

dans laquelle HA, Cy, Spaceri, Spacer ₂ , et PLA sont tels que définis en Formule I. [00055] Selon un mode de réalisation plus particulier, le copolymère dibloc HA-PLA répond à la Formule XXVIII suivante:

HA-Cy-(A-Spaceri)-S-S-(Spacer ₂ -B)-(COCH(CH ₃ )0)-PLA

Formule XXVIII

dans laquelle HA, Cy, A, Spaceri, Spacer ₂ , B et PLA sont tels que définis en Formule I. PROCEDES DE SYNTHESE DES HAbPLA

[00056] Les copolymères blocs HA-PLA peuvent être en particulier obtenus par couplage entre un bloc acide hyaluronique et un bloc acide polylactique. Le couplage entre les deux blocs peut être effectué par un procédé chimique et/ou un procédé enzymatique.

[00057] Le couplage du bloc acide polylactique sur l'acide hyaluronique peut être effectué par une réaction directe entre une fonction réactive portée par une extrémité de la chaine d'acide polylactique et le bout de chaine réducteur naturel de l'acide hyaluronique. La fonction réactive portée par une extrémité de la chaine d'acide polylactique peut provenir de l'initiateur utilisé pour la polymérisation du lactide ou d'une étape de fonctionnalisation post-polymerisation d'une des extrémités de la chaine d'acide polylactique.

[00058] Ce mode de réalisation peut conduire à un copolymère de Formule I dans laquelle a=b=0 et L représente O ou NR', ou à un copolymère de Formule II, Formule III, Formule IV, Formule V ou Formule VI.

[00059] Le couplage du bloc acide polylactique sur l'acide hyaluronique peut être effectué par une réaction entre une fonction réactive portée par une extrémité de la chaine d'acide polylactique et une fonction réactive portée par le bout de chaine réducteur de l'acide hyaluronique. Cette fonction réactive portée par le bout de chaine réducteur de l'acide hyaluronique peut être issue d'une réaction d'amination réductrice ou d'une séquence impliquant successivement une réaction d'oxydation, lactonisation et ouverture de cycle sur le bout de chaine réducteur de l'acide hyaluronique. Ainsi, le copolymère dibloc HA-PLA peut être obtenu par réaction de couplage entre une extrémité d'un bloc acide polylactique et une extrémité d'un bloc acide hyaluronique, le bloc acide hyaluronique ayant subi une modification chimique à son extrémité réductrice. La fonction réactive introduite sur l'extrémité réductrice du bloc acide hyaluronique réagit avec une fonction réactive portée par une extrémité de la chaine d'acide polylactique, cette fonction réactive pouvant provenir de l'initiateur utilisé pour la polymérisation directe du lactide ou provenir d'une étape de fonctionnalisation post- polymerisation d'une des extrémités de la chaîne d'acide polylactique.

[00060] Ce mode de réalisation peut conduire à un copolymère de Formule I dans laquelle a= l, b=0, Cy est un cycle ouvert, X représente CH ₂ ou CO, A représente NR, et L représente NR' ou O, en particulier NR'. En particulier, ce mode de réalisation peut conduire à un copolymère répondant à une des Formules VII à XXVIII.

[00061] Le procédé d'obtention du copolymère dibloc HA-PLA peut comprendre la formation d'un lien chimique entre un bloc acide polylactique et un bloc acide hyaluronique.

[00062] Le lien chimique peut consister en une liaison choisie parmi les liaisons ester, amide, carbamate et urée entre les deux blocs. En particulier, une liaison amide entre les deux blocs peut être obtenue par réaction entre un bloc acide hyaluronique portant une fonction aminé à son extrémité réductrice et un acide polylactique portant une fonction acide carboxylique à une de ses extrémités. En particulier, la formation d'une liaison amide entre les deux blocs peut nécessiter une étape d'activation de la fonction acide portée par l'acide polylactique à une de ses extrémités. En particulier, un acide polylactique portant une fonction acide activée à une de ses extrémités peut être utilisé. En particulier, un acide polylactique commercial portant une fonction acide carboxylique à une de ses extrémités peut être utilisé.

[00063] Le lien chimique entre l'acide hyaluronique et l'acide polylactique peut être un groupement triazole. Ce groupement est formé par une réaction « click » de Huisgen entre les deux blocs. Ce groupement peut provenir d'une réaction entre un bloc acide hyaluronique portant un azoture à son extrémité réductrice et un bloc acide polylactique portant un alcyne à une de ses extrémités. Ce groupement peut aussi provenir d'une réaction entre un bloc acide hyaluronique portant un alcyne à son extrémité réductrice et un bloc acide polylactique portant un azoture à une de ses extrémités. Ce mode de réalisation peut conduire à un copolymère répondant à une des Formules VII, VIII, IX, X ou XI.

[00064] Le lien chimique entre l'acide hyaluronique et l'acide polylactique peut être un groupement thiolmaléimide, ou thiol activé. Ce groupement peut provenir d'une réaction entre un bloc acide hyaluronique portant un thiol à son extrémité réductrice et un bloc acide polylactique portant un maléimide ou une double liaison activée, par exemple ester alpha-béta insaturé, à une de ses extrémités. Ce groupement peut aussi provenir d'une réaction entre un bloc acide hyaluronique portant un maléimide à son extrémité réductrice et un bloc acide polylactique portant un thiol à une de ses extrémités. Ce mode de réalisation peut conduire à un copolymère répondant à une des Formules XVI, XVII, XVIII ou XIX

[00065] Le lien chimique entre l'acide hyaluronique et l'acide polylactique peut être une liaison C-S. Cette liaison peut provenir d'une réaction « click » thiol-ène entre les deux blocs. Ce groupement peut provenir d'une réaction entre un bloc acide hyaluronique portant un thiol à son extrémité réductrice et un bloc acide polylactique portant un alcène ou un alcène conjugué à un carbonyle à une de ses extrémités. Ce groupement peut aussi provenir d'une réaction entre un bloc acide hyaluronique portant un alcène ou un alcène conjugué à un carbonyle à son extrémité réductrice et un bloc acide polylactique portant un thiol à une de ses extrémités.

[00066] Ce mode de réalisation peut conduire à un copolymère répondant à une des Formules XII, XIII, XIV ou XV.

[00067] Le lien chimique entre l'acide hyaluronique et l'acide polylactique peut être un pont disulfure (liaison S-S). Ce groupement peut provenir d'une réaction entre un bloc acide hyaluronique portant un thiol à son extrémité réductrice et un bloc acide polylactique portant un thiol activé à une de ses extrémités. Ce groupement peut aussi provenir d'une réaction entre un bloc acide hyaluronique portant un thiol activé à son extrémité réductrice et un bloc acide polylactique portant un thiol à une de ses extrémités.

[00068] Ce mode de réalisation peut conduire à un copolymère répondant à la Formule XXVIII.

[00069] Le copolymère dibloc HA-PLA peut être obtenu par une réaction de couplage entre un bloc acide polylactique et un bloc acide hyaluronique selon les stratégies décrites dans la publication Thorson et al. (Current Organic Synthesis 2005, 2, 59-81). En particulier, la réaction de couplage entre les deux blocs est une réaction de « chimie click ».

[00070] Pour des raisons de solubilité ou compatibilité entre groupements fonctionnels, il peut être nécessaire de protéger les fonctions alcool et/ou fonction acide naturellement portées par l'acide hyaluronique durant les étapes de préparation du copolymère dibloc HA-PLA. En particulier, des groupements protecteurs peuvent être introduits avant la réaction de couplage entre les deux blocs et enlevés une fois le copolymère dibloc obtenu. Avantageusement, les fonctions alcools et acides originels du HA sont rétablies suite à une ou plusieurs étapes de déprotection.

NANOPARTICULES

[00071] Les nanoparticules présentent un diamètre hydrodynamique moyen inférieur ou égal à 150 nm, en particulier inférieur ou égale à 100 nm, voire inférieur ou égale à 80 nm, et tout particulièrement inférieur ou égale à 70 nm. En particulier, les nanoparticules présentent un diamètre hydrodynamique moyen allant de 40 à 100 nm, notamment de 40 à 80 nm.

[00072] Tout particulièrement les nanoparticules sont monodisperses, c'est-à-dire qu'elles forment une seule population.

[00073] Par « une population de nanoparticules » on entend que l'ensemble des nanoparticules sont présentes sous un pic centré autour du diamètre hydrodynamique moyen.

[00074] Le diamètre hydrodynamique moyen peut plus particulièrement être le diamètre hydrodynamique en volume. Il peut être mesuré par diffusion dynamique de la lumière (DLS), dans le cas présent avec un appareil Malvern NanoZS.

[00075] Les nanoparticules selon l'invention se présentent sous forme de nanoparticules à base dudit copolymère dibloc HA-PLA, dans lesquels les agents cytotoxiques sont encapsulés.

[00076] Les nanoparticules présentent de préférence un indice de polydispersité inférieur ou égal à 0,5. Cet indice de polydispersité est obtenu avec l'appareil Malvern NanoZS.

[00077] Les nanoparticules peuvent comprendre une teneur en copolymère dibloc HA-PLA supérieure ou égale à 50 % en poids, notamment supérieure ou égale à 60 % en poids, en particulier supérieure ou égale à 70 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules. Les nanoparticules peuvent comprendre une teneur copolymère dibloc HA-PLA inférieure ou égale à 90 % en poids, notamment inférieure ou égale à 80 % en poids, en particulier inférieure ou égale à 75 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules.

[00078] Les nanoparticules selon l'invention peuvent comprendre une seule population de copolymère dibloc HA-PLA. Elles peuvent également comprendre plusieurs populations de copolymères diblocs HA-PLA, notamment deux ou trois populations de tels copolymères. En particulier, ces différentes populations peuvent provenir de blocs HA et/ou PLA appartenant eux-mêmes à différentes populations, notamment deux ou trois populations.

[00079] Par « une population de polymères », on entend l'ensemble de polymères sous un pic centré autour d'une masse moléculaire moyenne en nombre.

[00080] En outre, selon un mode de réalisation préféré, les nanoparticules selon l'invention comprennent moins de 5 % en poids, notamment moins de 1 % en poids, tout particulièrement moins de 0,5 % en poids par rapport au poids des nanoparticules, voire sont dépourvues (moins de 0, 1 % en poids) d'homopolymère de HA et/ou d'homopolymère de PLA.

[00081] Les nanoparticules peuvent comprendre un, deux ou trois agents cytotoxiques, tout particulièrement elles comprennent un seul agent cytotoxique.

[00082] Les nanoparticules peuvent comprendre une teneur en agent cytotoxique supérieure ou égale à 10 % en poids, notamment supérieure ou égale à 15 % en poids, voire supérieure ou égale à 18 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules.

[00083] Les nanoparticules peuvent comprendre une teneur en agent cytotoxique allant de 2 à 50 % en poids, notamment de 3 à 40 % en poids, en particulier allant de 4 à 30 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules.

[00084] Selon un mode de réalisation préféré, le ou les agents cytotoxiques employés dans la présente invention sont des composés lipophiles, c'est-à-dire des composés dont la solubilité dans l'eau à température ambiante (25°C) et pression atmosphérique est inférieure ou égale à 20 mg/ml. [00085] Les agents cytotoxiques peuvent être choisis parmi les composés suivants doxorubicine (adriamycine), gemcitabine (gemzar), daunorubicin, procarbazine, mitomycine, cytarabine, étoposide, méthotrexate, vinorelbine, 5-fluorouracil (5-FU), vinca alcaloïdes tels que vinblastine ou vincristine; bléomycine, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotère), cisplatine, aldesleukine, asparaginase, carboplatine, cladribine, camptothécine, 10-hydroxy-7-éthylcamptothécine (SN38 ou Irinotecan), Topotecan, dacarbazine, S-I capécitabine, 5'deoxyflurouridine, éniluracil, désoxycytidine, 5- azacytosine, 5-azadésoxycytosine, allopurinol, 2-chloroadénosine, trimétrexate, aminoptérine, méthylène-10-déazaaminoptérine (MDAM), oxaplatine, picoplatine, ormaplatine, épirubicine, étoposide phosphate, 9-aminocamptothécine, 10,11- méthylènedioxycamptothécine, karénitecine, 9-nitrocamptothécine, vindésine, melphalan (L-phénylalanine mustard), ifosphamidemefosphamide, perfosfamide, cyclophosphamide, trophosphamide carmustine, semustine, épothilones A-E, tomudex, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, amsacrine, étoposide phosphate, karénitecine, acyclovir, valacyclovir, ganciclovir, amantadine, rimantadine, lamivudine, zidovudine, et leurs mélanges.

[00086] Tout particulièrement, les agents cytotoxiques peuvent être choisis parmi les composés suivants : doxorubicine, étoposide, méthotrexate, vinorelbine, 5- fluorouracil (5-FU), paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotère), cisplatine, 10-hydroxy-7- éthylcamptothécin (SN38 ou Irinotecan), Topotecan, cyclophosphamide, et leurs mélanges.

[00087] Lorsque les agent cytotoxiques présentent un groupement ionisable, ils peuvent comprendre un contre-ion permettant d'augmenter leur hydrophobie. Parmi les contre-ions anioniques de ce type on peut citer les acides gras comprenant de 4 à 18 atomes de carbones et l'acide benzoïque. Parmi les contre-ions cationiques de ce type on peut citer les ammonium quaternaires substitués par quatres chaînes alkyles dont au moins une comprend au moins 6 atomes de carbones, par exemple le CTA ou cétyl triméthyl ammonium.

[00088] Selon un mode de réalisation les nanoparticules comprennent en outre au moins un polyester et/ou un polyamino-acide. Le polyester peut être choisi parmi les acides polylactiques ou PLA, les acides poly(lactique-co-glycolique) ou PLGA, les polycaprolactones ou PCL, les poly(triméthylène carbonate) ou PTMC, ou leurs copolymères, statistiques ou blocs. La teneur totale en polyester et/ou un polyamino- acide peut aller de 1 à 50 % en poids, notamment de 5 à 40 % en poids, en particulier de 10 à 30 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules. Par « polyester » et « polyamino-acide » on entend au sens de la présente invention des entités composées uniquement d'unités de répétition liées par des liaisons esters ou des liaisons amides.

[00089] Selon un mode de réalisation les nanoparticules peuvent comprendre en outre au moins un adjuvant hydrophobe. Ledit adjuvant hydrophobe peut permettre d'améliorer le taux d'incoporation d'agent cytotoxique dans les nanoparticules. Tout particulièrement, cet adjuvant hydrophobe peut comprendre au moins un cycle aromatique.

[00090] En particulier, l'adjuvant hydrophobe est choisi parmi la vitamine E, encore appelée alpha-tocophérol ; l'alcool benzylique ; les stéroïdes, comme le cholestérol ou l'acide biliaire ; et les lipides. Les nanoparticules peuvent comprendre une teneur en adjuvant hydrophobe allant de 0, 1 à 20 % en poids, notamment de 0,5 à 15 % en poids, voire de 1 à 10 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules.

PROCEDE DE PREPARATION DES NANOPARTICULES

[00091] La présente invention concerne également un procédé de préparation de nanoparticules comprenant les étapes suivantes :

a) préparation d'une phase organique comprenant i) au moins un copolymère dibloc HA-PLA, en particulier un copolymère dibloc HA-PLA, ii) au moins un agent cytotoxique, dans un solvant organique, ainsi qu'éventuellement iii) au moins un polyester et/ou un polyamino-acide, iv) au moins un adjuvant hydrophobe et/ou v) une base,

b) préparation d'une phase aqueuse,

c) addition de la phase aqueuse à la phase organique ou de la phase organique à la phase aqueuse,

d) purification de la dispersion comprenant les nanoparticules obtenue à l'issue de l'étape c), ladite purification pouvant être effectuée par dialyse et/ou diafiltration de la dispersion de l'étape c),

e) récupération de la dispersion comprenant les nanoparticules, et

f) éventuellement traitement de cette dispersion pour obtenir des nanoparticules sous forme solide, notamment par lyophylisation.

[00092] Tout particulièrement, le copolymère dibloc HA-PLA est tel que défini ci- dessus. [00093] En particulier, le polyester et/ou le polyamino-acide sont tels que définis ci- dessus.

[00094] L'étape c) conduit à la formation des nanoparticules incorporant l'agent cytotoxique. Cette étape peut tout particulièrement être effectuée par addition de la phase aqueuse à la phase organique.

[00095] Le solvant organique peut comprendre du DMSO, en particulier comprendre au moins 90 % en volume de DMSO par rapport au volume total de solvant organique. De manière particulièrement préférée, le solvant organique est constitué uniquement de DMSO.

[00096] Le polymère dibloc HA-PLA peut être présent dans la phase organique à une concentration allant de 2 à 100 mg/ml, notamment de 5 à 50 mg/ml.

[00097] L'agent cytotoxique peut être présent dans la solution organique en une teneur allant de 5 à 80 % en poids, notamment de 8 à 60 % en poids, en particulier de 10 à 50 % en poids par rapport au poids total de polymère dibloc de Formule I et d'acide polylactique.

[00098] Selon un mode de réalisation, la phase organique comprend au moins un adjuvant hydrophobe, notamment la vitamine E, ou alpha-tocophérol. En particulier, cet adjuvant présente une solubilité supérieure ou égale à 1 mg/ml dans le DMSO à 25°C. Cet adjuvant peut être présent en une teneur allant de 1 à 20 % en mole par rapport au nombre de mole de polymère comprenant un bloc PLA.

[00099] Selon un mode de réalisation la phase organique comprend au moins une base, en particulier cette base présente une solubilité supérieure ou égale à 1 mg/ml dans le DMSO à 25°C. Tout particulièrement, la base peut être choisie parmi la triéthylamine, le DBU, ou l,8-diazadiazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène, ou la guanidine.

[000100] En particulier, la base est présente en une quantité allant de 1 à 5 équivalents, notamment de 1,2 à 3 équivalents, par rapport à l'agent cytotoxique. Cette base peut en particulier être utilisée dans le cas où l'agent cytotoxique comprend une charge positive, liée à la protonation d'une fonction, comme par exemple une fonction ammonium pour la doxorubicine. [000101] Selon un mode de réalisation, la phase organique comprend au moins un acide, en particulier cet acide présente une solubilité supérieure ou égale à 1 mg/ml dans le DMSO à 25°C. Tout particulièrement, l'acide peut être choisi parmi les acides organiques dont le pKa est inférieur à 5, en particulier, en particulier l'acide acétique, les acides gras, et l'acide para-toluène sulfonique.

[000102] En particulier, l'acide est présent en une quantité allant de 1 à 5 équivalents, notamment de 1,2 à 3 équivalents, par rapport à l'agent cytotoxique. Cet acide peut en particulier être utilisé dans le cas où l'agent cytotoxique comprend une charge négative, notamment liée à la déprotonation d'une fonction, comme par exemple une fonction acide carboxylique.

[000103] La phase aqueuse comprend, voire consiste en, de l'eau ou la phase aqueuse est tamponnée, en particulier elle peut être tamponnée dans une gamme de pH allant de 5 à 8,5.

[000104] Selon un mode de réalisation, la phase aqueuse est tamponnée à un pH supérieur ou égal à 7, notamment supérieur ou égal à 7,2, par exemple un tampon phosphate à 10 mM et pH 7,4. Ce mode de réalisation peut en particulier être utilisé dans le cas où l'agent cytotoxique est cationique, notamment via une fonction ammonium, comme la doxorubicine. Dans le cas d'une fonction cationique, la solution aqueuse peut être tamponnée à un pH supérieur au pKa de la fonction cationique.

[000105] Selon un mode de réalisation, la phase aqueuse est tamponnée à un pH inférieur à 7, notamment inférieur ou égal à 6, en particulier inférieur ou égal à 5, tout particulièrement inférieur ou égal à 4, voire inférieur ou égal à 3. Ce mode de réalisation peut en particulier être utilisé dans le cas où l'agent cytotoxique est anionique, notamment via une fonction carboxylate. Dans le cas d'une fonction anionique, la solution aqueuse peut donc être tamponnée à un pH inférieur au pKa de la fonction anionique.

[000106] L'addition peut être effectuée à une température inférieure à 40°C, notamment inférieure à 30°C, en particulier à une température allant de 18 à 25°C.

[000107] Dans le cas où l'agent cytotoxique présente une partie chargée positivement, en particulier de type ammonium, et tout particulièrement dans le cas de la doxorubicine, le procédé peut impliquer : i) la présence d'au moins une base dans la phase organique,

ii) la présence d'au moins un adjuvant hydrophobe présent dans la phase organique et/ou

iii) une phase aqueuse tamponnée à un pH supérieur ou égal à 7 et/ou à un pH supérieur au pKa de la fonction cationique.

[000108] Dans le cas où l'agent cytotoxique présente une partie chargée négativement, en particulier de type carboxylate, le procédé peut impliquer :

i) la présence d'au moins un acide dans la phase organique,

ii) la présence d'au moins un adjuvant hydrophobe dans la phase organique et/ou iii) une phase aqueuse tamponnée à un pH inférieur à 7 et/ou à un pH inférieur au pKa de la fonction anionique.

[000109] En particulier, le procédé selon l'invention permet d'obtenir des nanoparticules présentant un taux d'incorporation en agent cytotoxique, notamment en doxorubicine, particulièrement élevé, notamment supérieur ou égal à 10 % en poids, en particulier supérieur ou égal à 15 % en poids par rapport au poids total des nanoparticules.

[000110] En particulier, le procédé selon l'invention permet notamment d'obtenir des nanoparticules présentant une efficacité d'incorporation en agent cytotoxique, notamment en doxorubicine, particulièrement élevé, notamment supérieur ou égal à 60 % en poids, en particulier supérieur ou égal à 75 % en poids, tout particulièrement supérieur ou égal à 80 % en poids, voire supérieur ou égal à 85 % en poids par rapport au poids total d'agent cytotoxique.

[000111] Ces excellentes efficacités peuvent être obtenues avec des teneurs en agent cytotoxique dans la phase organique élevées, notamment une teneur supérieure ou égale à 10 % en poids, en particulier supérieure ou égale à 15 % en poids, voire supérieure ou égale à 20 % en poids par rapport au poids total de polymère comprenant au moins un bloc PLA, et en particulier de copolymère dibloc HA-PLA.

[000112] Tout particulièrement, l'étape f) du procédé est effectuée par lyophylisation. Celle-ci conduit à une poudre de nanoparticules. Cette poudre peut comprendre une teneur en eau inférieure ou égale à 2 % en poids, en particulier à 1 % en poids, voire inférieure ou égale à 0,5 % en poids, et tout particulièrement inférieure ou égale à 0,1 % en poids par rapport au poids de la poudre. [000113] Tout particulièrement dans cette dernière étape au moins un cryoprotecteur est ajouté. Ainsi, la poudre de nanoparticule peut comprendre au moins un cryoprotecteur.

[000114] Bien entendu, le procédé décrit ci-avant est non limitatif, et d'autres procédés de préparation ne sont pas exclus de la portée de l'invention à partir du moment où ils permettent de conduire aux nanoparticules selon l'invention.

[000115] L'invention concerne encore les nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus.

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE

[000116] Selon un aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant des nanoparticules selon l'invention et un support pharmaceutiquement acceptable.

[000117] Tout particulièrement, la teneur en nanoparticules est telle qu'elle conduit à une teneur en agent cytotoxique allant de 0,1 à 10 mg/ml, notamment de 0,2 à 5 mg/ml.

[000118] Selon un mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention comprend en outre un ou plusieurs homopolymères acide hyaluronique (homopolymère HA). Dans ce cas, l'homopolymère HA n'est pas un sous-produit de la synthèse des copolymères diblocs HA-PLA présents dans les nanoparticules, mais a été ajouté de manière distincte, en plus des nanoparticules, à la composition pharmaceutique.

[000119] Le support pharmaceutiquement acceptable peut être choisi en fonction de la voie d'administration, notamment telle que précisée ci-dessous, la localisation des tissus cibles, de l'agent cytotoxique utilisé, ou encore en fonction du profil de libération.

[000120] La composition pharmaceutique ou les nanoparticules peuvent être administrées au patient par toute voie d'administration connue, y compris par voie parentérale, topique ou orale. Par « patient », on entend au sens de la présente invention un être humain ou un animal, en particulier choisi parmi les mammifères, les oiseaux, les reptiles, les amphibiens, et les poissons. Les mammifères peuvent être choisis parmi les rongeurs, les souris, les rats, les lapins, les singes, les chiens, et les cochons.

[000121] Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique est une composition injectable contenant les nanoparticules selon l'invention en dispersion dans un solvant aqueux et/ou organique.

[000122] Les préparations injectables, en particulier les suspensions aqueuses ou huileuses injectables stériles peuvent être formulées en utilisant des agents dispersants, mouillants ou de suspension convenables. La préparation injectable stérile peut être une solution, une dispersion ou une émulsion dans un solvant ou un diluant parentéralement acceptable, par exemple une solution dans le 1,3-butanediol. Parmi les solvants et véhicules acceptables figurent l'eau, la solution de Ringer, et les solutions de chlorure de sodium isotonique. En outre, des mono- et les di-glycérides peuvent être utilisés, comme solvant ou milieu de suspension. Des acides gras, notamment l'acide oléique, peuvent encore être utilisés dans les préparations de formulations injectables.

[000123] Tout particulièrement, les formulations injectables sont préparées par addition d'eau, et éventuellement d'additifs, à des nanoparticules lyophylisées.

[000124] Les formulations injectables peuvent être stérilisées, notamment par filtration sur un filtre retenant les bactéries, par irradiation ou par chauffage, en particulier par filtration sur un filtre retenant les bactéries et par irradiation.

[000125] Les préparations injectables peuvent comprendre au moins un tensioactif, notamment choisi parmi le polysorbate 20 et le polysorbate 80.

[000126] Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est apte à être congelée. Dans ce cas un cryoprotecteur peut être ajouté, comme du sucrose, du glucose et/ou du tréhalose, par exemple afin de prévenir l'agrégation de nanoparticules.

[000127] Les compositions aptes à être congelées peuvent comprendre un cryoprotecteur en une teneur allant de 0,5 à 30 % en poids par rapport au poids total de la composition. Tout particulièrement la composition peut comprendre des nanoparticules en une teneur allant de 1 à 30% en poids, un cryoprotecteur en une teneur allant de 2 à 30% en poids, et de l'eau en une teneur allant de 50 à 97 % en poids par raport au poids total de la composition. ADMINISTRATION

[000128] Selon un mode de réalisation, l'administration parentérale est particulièrement souhaitable, notamment lorque le contact avec les enzymes digestives n'est pas souhaité. Les nanoparticules ou la composition pharmaceutique peuvent ainsi être administrées par injection, notamment intraveineuse, sous-cutanée ou intra-musculaire, intra-péritonéale ou intra-tumorale ; par voie rectale ; par voie vaginale ; par voie topique, notamment sous forme de poudre, crème, pommade ou onguent, solution, notamment spray ; ou encore par inhalation, par exemple sous forme de spray.

[000129] Tout particulièrement l'administration est effectuée par injection, notamment intraveineuse, sous-cutanée ou intra-musculaire, intra-péritonéale ou intra-tumorale.

[000130] Les nanoparticules ou la composition pharmaceutique peuvent être administrées au patient de manière systémique, par exemple par perfusion ou injection par voie intra-veineuse (iv).

DESTINATION

[000131] Tout particulièrement, les nanoparticules et les compositions pharmaceutiques les comprenant sont utilisées en tant que médicament, en particulier dans le traitement de diverses formes de cancers, notamment du cancer du col utérin ; du cancer colo-rectal ; de tumeur cutanée ; de cancer de l'endomètre ; de cancer de l'estomac ; de cancer du foie ; de tumeur stromale gastro-intestinale ; d'hémopathie maligne, comme la leucémie, les myélomes multiples, les lymphomes, plus particulièrement la maladie de Hodgkin et les lymphomes non-hodgkinien ; le carcinome hépatocellulaire ; le cancer du larynx ; le mésothéliome ; le cancer de l'oesophage ; l'ostéosarcome ; le cancer de l'ovaire ; le cancer du pancréas ; le cancer de la peau, et en particulier le cancer de la bouche ; le cancer du poumon ; le cancer de la prostate ; le rhabdomyosarcome ; le cancer du rein ; le cancer du sein ; le cancer du testicule ; le cancer de la thyroïde ; le sarcome des tissus mous ; le carcinome de la vessie ; le myélome ou cancer osseux ; le plasmocytome ; les tumeurs du cerveau.

[000132] Plus particulièrement, le traitement peut concerner le cancer du col utérin ; le cancer colo-rectal ; une tumeur cutanée ; le cancer de l'endomètre ; le cancer de l'estomac ; le cancer du foie ; une tumeur stromale gastro-intestinale ; d'hémopathie maligne, comme la leucémie, les myélomes multiples, les lymphomes, plus particulièrement la maladie de Hodgkin et les lymphomes non-hodgkinien ; le carcinome hépatocellulaire ; le cancer du larynx ; le mésothéliome ; le cancer de l'oesophage ; l'ostéosarcome ; le cancer de l'ovaire ; le cancer du pancréas ; le cancer de la peau, et en particulier le cancer de la bouche ; le cancer du poumon ; le cancer de la prostate ; le rhabdomyosarcome ; le cancer du rein ; le cancer du sein ; le cancer du testicule ; le cancer de la thyroïde ; le sarcome des tissus mous ; le carcinome de la vessie ; le myélome ou cancer osseux ; et le plasmocytome.

[000133] En particulier, le traitement vise un cancer sous forme de tumeur solide.

[000134] Selon un mode de réalisation le traitement vise des cancers CD44+, c'est- à-dire des cancers dans lesquels les cellules tumorales surexpriment le récepteur CD44.

EXEMPLES

Exemple 1 : Synthèse d'un acide polylactique racémique fonctionnalisé par un groupement azoture à une de ses extrémités (Mn = 6,4 kg/mol)

Un acide polylactique racémique avec une masse molaire moyenne en nombre de 6,4 kg/mol fonctionnalisé par un groupement azoture à une de ses extrémités est obtenu par polymérisation par ouverture de cycle du rac-lactide amorcée par du 3-azido- propan-l-ol et catalysée par l'octoate d'étain suivant la procédure décrite dans les publications Kricheldorf et al. (Macromolecules 2000, 33, 702-709) et Iwata et al. (Carbohydrate Polymers 2012, 87, 1933-1940).

Un mélange composé de 8,86 g de rac-lactide (61,5 mmol) avec 141 mg de 3-azido- propan-l-ol (1,40 mmol) et 57 mg d'octoate d'étain (0,14 mmol) dans du toluène anhydre (17 mL) est agité sous argon pendant 150 min à 90°C puis neutralisé par ajout de 0,1 mL d'acide acétique. Le polymère formé est ensuite précipité par ajout d'éther diisopropylique puis séché sous vide.

Rendement : 90%.

RMN ^J H (DMSO-de, 300 K, 500 MHz, ppm) : 5,45 (d, CH-OH), 5,20 (m, CH PLA), 4,25- 4,10 (m, CH-OH et CH2-CH2-CH2-N3), 3,42 (t, CH2-CH2-CH2-N3), 1,85 (quintuplet, CH ₂ - CH2-CH2-N3), 1,45 (m, CH ₃ PLA), 1,30 (m, CH(CH ₃ )-OH). L'analyse RMN *H indique l'obtention d'un acide polylactique racémique avec un degré moyen de polymérisation de 88, soit une masse molaire moyenne en nombre de 6,4 kg/mol.

Exemple 2 : Synthèse d'un acide polylactique racémique fonctionnalisé par un groupement azoture à une de ses extrémités (Mn = 12,7 kg/mol)

Un acide polylactique racémique avec une masse molaire moyenne en nombre de 12,7 kg/mol fonctionnalisé par un groupement azoture à une de ses extrémités est obtenu par un procédé similaire à celui utilisé pour l'exemple 1.

Rendement : 83 %.

RMN ^J H (DMSO-de, 300 K, 500 MHz, ppm) : 5,45 (d, CH-OH), 5,20 (m, CH PLA), 4,25- 4,10 (m, CH-OH et CH2-CH2-CH2-N3), 3,42 (m, CH2-CH2-CH2-N3), 1,85 (m, CH ₂ -CH ₂ - CH2-N3), 1,45 (m, CH ₃ PLA), 1,30 (m, CH(CH ₃ )-OH).

L'analyse RMN indique l'obtention d'un acide polylactique racémique avec un degré moyen de polymérisation de 176, soit une masse molaire moyenne en nombre de 12,7 kg/mol.

Exemple 3 : Synthèse d'un acide hyaluronique fonctionnalisé par un groupement alcyne à son extrémité réductrice

Un acide hyaluronique est fonctionnalisé à son extrémité réductrice par un groupement alcyne selon la procédure décrite dans la demande de brevet FR2937974 (Lecommandoux et al.).

La masse molaire en nombre (Mn) de l'acide hyaluronique utilisé peut être estimée par RMN du proton selon le protocole suivant. L'acide hyaluronique est dissout dans D ₂ 0 à environ 30 g/L et acidifié par passage sur de la résine échangeuse d'ion deutérée. Le spectre est acquis à 500 MHz suivant une séquence classique (impulsion à 90°, Dl de 15 s, 8 scans) à 333 K. Dans ces conditions, l'ensemble des signaux anomériques des extrémités réductrices apparait distinctivement dans la zone 5,8-5,0 ppm et a pour intégration . Le signal acétamide à 2,2 ppm caractéristique de l'unité répétitive a pour intégration I ₂ . Le degré moyen de polymérisation (DP) est alors calculé selon la formule DP = I2/I1. La masse molaire moyenne en nombre (Mn) du hyaluronate de sodium est alors obtenue à l'aide de la formule Mn = DP x M motif avec M motif = 401 g/mol.

9,9 g (environ 1,5 mmol) de hyaluronate de sodium (Lifecore Biomédical, Mw = 7,5 kg/mol, Mn = 3,6 kg/mol) sont dissous dans 40 mL d'eau. 100 mL d'une solution de tampon borate 1,4 M et 1,9 g (34 mmol) de propargylamine sont ensuite successivement ajoutés. La solution est alors dégazée par bullage d'argon et 0,71 g (11 mmol) de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés. Le milieu réactionnel est agité à 40°C pendant 4 jours. Le produit est ensuite purifié par diafiltration contre du NaCI (150 mM) et de l'eau. Le produit en solution est ensuite acidifié par passage sur résine échangeuse d'ion puis isolé par lyophilisation sous forme d'un solide blanc. Rendement : 80%.

RMN *H (D ₂ 0, 300 K, 500 MHz, ppm) : 4,40-4,60 (m, CH anomérique), 4,25-4,15 et 4,05-3,25 (m, CH sucre et CH ₂ -C≡CH), 1,95 (m, CH ₃ sucre).

Exemple 4 : Synthèse d'un copolymère à bloc (acide hyaluronique)-£>-(acide polylactique) avec un acide polylactique de Mn 6,4 kg/mol (Copolymère Al)

L'acide polylactique portant un groupement azoture à une de ses extrémités décrit dans l'exemple 1 et l'acide hyaluronique comportant un groupement alcyne à son extrémité réductrice décrit dans l'exemple 3 sont couplés par réaction de cycloaddition de Huisgen catalysée par du cuivre selon le procédé décrit dans le brevet US7375234 (Sharpless et al.).

1,6 g (environ 0,24 mmol) d'acide hyaluronique de l'exemple 3 est dissous à 60°C dans 26 mL de DMSO. La solution est ensuite refroidie à 30°C puis 1,0 g (0,16 mmol) d'acide polylactique de l'exemple 1 et 110 mg (0,55 mmol) d'ascorbate de sodium sont successivement ajoutés. La solution est ensuite dégazée à l'argon et 79 mg (0,32 mmol) de sulfate de cuivre sont ajoutés. Le milieu réactionnel est agité pendant 18 h à 30°C avant d'être dilué au dixième par un tampon phosphate (50 mM) contenant 1 mM d'EDTA. Cette solution est ensuite purifiée par diafiltration sur une membrane PES contre du NaCI (150 mM), du NaCI (2 M) et de l'eau. La solution est alors amenée à pH = 2,5 par ajout progressif d'une solution de HCI IN puis lyophilisée pour finalement isoler le copolymère dibloc (acide hyaluronique)-b-(acide polylactique), ou copolymère dibloc HA-PLA, sous forme d'un solide blanc.

Rendement : > 90 %.

RMN ^J H (DMSO-de, 300 K, 500 MHz, ppm) : 8,25 (m, =CH triazole), 5,20 (m, CH PLA), 4,90-4,10 (m, CH anomérique & OH), 3,90-2,90 (m, CH sucre), 1,80 (m, CH ₃ sucre), 1,45 (m, CH ₃ PLA).

FT-IR (ATR, cm ¹ ) : 3350 (m), 3004 (w), 2944 (w), 1748 (s, C=0 ester), 1630 (m, C=0 amide), 1550 (w, N-H amide), 1451 (m), 1370 (m), 1267 (w), 1186 (s), 1128 (s), 1100 (s), 1043 (s). L'analyse RMN-DOSY (DMSO-d ₆ , 298 K, 500 Mhz) du composé Al est présenté en Figure 1. Cette analyse DOSY du composé Al, dissous dans le DMSO perdeutéré à 30 mg/mL, est obtenue par acquisition à 297,5 K sur un spectromètre Bruker Avance III à 500 MHz en utilisant une sonde de 5 mm multi-nucléaire inverse, équipée d'un gradient de champs sur l'axe z. L'expérience est enregistrée via une séquence avec écho stimulé incorporant des impulsions de gradient bipolaires et un délai compensant les courants d'Eddy (Iedbpgp2s.pl). La force du gradient est incrémentée linéairement 64 fois avec une acquisition de 16 scans à chaque étape. Le temps de diffusion est de 150 ms avec une impulsion de gradient de 5 ms. Après transformée de Fourier et correction de la ligne de base dans la dimension directe, la dimension indirecte (diffusion) est analysée en 1D à l'aide du module T1/T2 du logiciel TOPSIN (3,2, Bruker) ou en 2D à l'aide du module DOSY du même logiciel.

Exemple 5 : Synthèse d'un copolymère à bloc (acide hyaluronique)-£>-(acide polylactique) avec un acide polylactique de Mn 12,7 kg/mol (Copolymère A2).

Un couplage entre l'acide polylactique portant un groupement azoture à une de ses extrémités décrit dans l'exemple 2 et l'acide hyaluronique comportant un groupement alcyne à son extrémité réductrice décrit dans l'exemple 3 est réalisé selon le même protocole que celui décrit dans l'exemple 4 pour donner un copolymère à bloc (acide hyaluronique)-£>-(acide polylactique).

Rendement : > 90 %

RMN ^J H (DMSO-de, 300 K, 500 MHz, ppm) : 8,25 (m, =CH triazole), 5,20 (m, CH PLA), 4,90-4,10 (m, CH anomérique & OH), 3,90-2,90 (m, CH sucre), 1,80 (m, CH ₃ sucre), 1,45 (m, CH ₃ PLA).

Exemple 6 : Formation de nanoparticules de copolymère Al « vides » (phase aqueuse Phosphate ou H?Q)

Le copolymère Al décrit dans l'exemple 4 est solubilisé à 10mg/mL dans le DMSO. La solution ainsi obtenue est appelée phase « organique » par la suite. La phase dîte « aqueuse » est de l'eau milliQ. La nanoprécipitation est réalisée en ajoutant à température ambiante (25°C) 9mL de phase aqueuse à ImL de phase organique. Cet ajout est réalisé à une vitesse de 140mL/h à l'aide de pousse-seringue et en homogénéisant le mélange tout au long de l'ajout.

Exemple 7 : Formation de nanoparticules de copolymère Al chargées en doxorubicine Exemple 7.1 : pH neutre (phase aqueuse Phosphate) - NPl

Le copolymère Al décrit dans l'exemple 4 est solubilisé à 10 mg/mL dans le DMSO en présence de doxorubicine à 2 mg/mL. La solution ainsi obtenue est appelée phase « organique » par la suite. La phase dîte « aqueuse » est une solution tampon phosphate 10 mM à pH 7,4. La nanoprécipitation est réalisée en ajoutant à température ambiante (25°C) 9 mL de phase aqueuse à 1 mL de phase organique. Cet ajout est réalisé à une vitesse de 140mL/h à l'aide de pousse-seringue et en homogénéisant le mélange tout au long de l'ajout. On obtient ainsi une solution de NPl à 1 mg/mL en copolymère et 0,2 mg/mL en doxorubicine.

Exemple 7.2 : triéthylamine (TEA) - NP2

Une solution contenant la doxorubicine à 3,4 mg/mL et 2 équivalents molaires de triéthylamine (TEA) soit 1,2 mg/mL est préparée dans le DMSO puis homogénéisée pendant 30 minutes. Le copolymère Al décrit dans l'exemple 4 est ensuite ajouté à une concentration finale de 10 mg/mL. La solution ainsi obtenue est appelée phase « organique » par la suite. La phase dîte « aqueuse » est de l'eau MilliQ. La nanoprécipitation est réalisée en ajoutant à température ambiante 9 mL de phase aqueuse à lmL de phase organique. Cet ajout est réalisé à une vitesse de 140 mL/h à l'aide de pousse-seringue et en homogénéisant le mélange tout au long de l'ajout. On obtient ainsi une solution de NPl à 1 mg/mL en copolymère et 0,2 mg/mL en doxorubicine.

Exemple 7.3 : α-tocophérol (Vitamine E) - NP3

Le copolymère Al décrit dans l'exemple 4 est solubilisé à 10mg/mL dans le DMSO en présence de doxorubicine à 2 mg/mL et de α-tocopherol à 0,085 mg/mL. La solution ainsi obtenue est appelée phase « organique » par la suite. La phase dîte « aqueuse » est de l'eau milliQ. La nanoprécipitation est réalisée en ajoutant à température ambiante 9 mL de phase aqueuse à lmL de phase organique. Cet ajout est réalisé à une vitesse de 140 mL/h à l'aide de pousse-seringue et en homogénéisant le mélange tout au long de l'ajout. On obtient ainsi une solution de NPl à 1 mg/mL en copolymère et 0,2 mg/mL en doxorubicine.

Exemple 7.4 : Purification des nanoparticules de copolymère Al chargées en doxorubicine

5mL de chacune des formulations issues des étapes de nanoprécipitation NPl, NP2 et NP3 sont transférées dans des dispositifs de dialyse Spectra/Por® Float-A-Lyzer® de 5 mL (seuil de coupure lOOkDa). Une expérience de dialyse « Contrôle » est également menée en parallèle en remplissant un dispositif Spectra/Por® Float-A- Lyzer® de 5 mL (seuil de coupure lOOkDa) avec de la doxorubicine à 0,2 mg/mL. Les dispositifs sont placés dans un bain de dialyse contenant 500 mL de la phase aqueuse correspondante (celle précédemment utilisées pour l'étape de nanoprécipitation). La dialyse est réalisée pendant 5h avec des prélèvements de 100 μ ΐ dans le dispositif de dialyse toutes les heures.

Exemple 7.5 : Caractérisation par diffusion dynamique de la lumière (DLS)

La taille des nanoparticules formées par nanoprécipitation est mesurée avant ou après purification par diffusion dynamique de la lumière sur un appareil Malvern NanoZS. Le diamètre hydrodynamique moyen des nanoparticules est ainsi obtenu, en l'occurrence il s'agit de la moyenne en volume.

Exemple 7.6 : Dosage de la doxorubicine par spectrométrie UV

La doxorubicine est dosée par spectroscopie UV à 485 nm avec un étalonnage externe. Les échantillons sont dilués d'un facteur 2 dans un tampon Tris 200 mM (pH 7,4) puis d'un facteur 10 dans le DMSO. Les étalons sont préparés dans un tampon phosphate 5 mM, Tris 100 mM (pH 7,4) puis dilués d'un facteur 10 dans le DMSO. Les échantillons et les standards sont centrifugés avant analyse.

Exemple 8 : Comparaison des efficacités d'encapsulation et des taux d'encapsulation obtenus avec PQ4, TEA ou Vitamine E.

Les notions d'efficacité d'encapsulation et de taux d'encapsulation sont définies comme suit :

Efficacité ou rendement d' encapsulation

Qté de principe actif dans le produit final

%

Qté de principe actif engagé au départ

Qté de principe actif dans le produit final

Taux d' encapsulation = — — %

Qte de polymère dans le produit final

Exemple 9 : Lyophilisation des formulations des nanoparticules et reconstitution d'une formulation injectable

Les suspensions de nanoparticules issues des étapes de nanoprécipitation NPl, NP2 et NP3 sont lyophilisées en absence et en présence de 1 % en poids de sucrose. Les lyophilisats sont reconstitués dans l'eau milliQ à la même concentration d'avant lyophilisation, ce qui permet de conduire à une formulation injectable.

Ces exemples montrent que les formulations reconstituées après lyophilisation ne contiennent pas d'agrégats.