神经氨酸苷酶抑制剂的前药及其组合物和用途 技术领域

本发明属于医药领域， 具体而言， 本发明涉及作为神经氨酸苷酶抑制剂 的前药的化合物、 包含所述化合物的药物组合物、 以及所述化合物和药物组 合物在制备药物和治疗相关疾病中的用途。 皆景技术

流行性感冒，筒称流感，是由流行性感冒病毒 引起的急性呼吸道传染病。 该疾病传染性强， 传播面广， 常为地方性流行。 2009年全球流感病毒感染患 者高达上亿人， 死亡人数约为一万三千六百人。 因此， 流行性感冒是目前期 待解决的重要公共健康问题之一。

已发现， 流感病毒脂质包膜具有 2个重要的糖蛋白， 分别为血凝素和神 经氨酸苷酶（ neuraminidase ) 。 其中神经氨酸苷酶是一种糖水解酶， 其通过 分裂唾液酸残基， 使病毒从宿主细胞上释放后不能自行相互聚合 ， 从而促进 病毒在粘膜的分泌物中弥散、 传播， 并且通常还认为神经氨酸苷酶与流行性 感冒病毒的致病性相关。

神经氨酸苷酶已经成为治疗流行性感冒的一个 药物靶点。 奥塞米韦 ( Oseltamivir, 即 "达菲，， ， 见下式 A ) 即是一种作用于神经氨酸苷酶的特 异性抑制剂， 其抑制神经氨酸酶的作用， 因此可以抑制成熟的流感病毒脱离 宿主细胞，从而进一步抑制流感病毒在人体内 的传播以起到治疗流行性感冒 的作用。 目前， 达菲被

式 A

然而， 由于达菲价格昂贵，在一定程度上限制了其应 用。更为不利的是, 在长期应用过程中， 流感病毒快速变异， 已经出现了达菲耐药性突变株， 例 如甲型 H1N1流感病毒 H274Y突变株。 鉴于此， 已经开始研究和开发达菲 的前药或衍生物， 以用于抑制达菲抗药性病毒。 例如以下式 I表示的化合物 1 (公开于 WO96/026933 ) , 其为用胍基取代氨基的奥塞米韦胍类似物， 能 效抑制流行性感冒病毒（参见 Choung U. Kim等人， Structure-Activity

Med. Chem. 1998, 41, 2451-2460 )

然而， 研究表明， 化合物 1的体内半衰期短， 仅有 2-5个小时（参见 Li, W.等人, Identification of GS 4104 as an orally bioavailable prodrug of the influenza virus neuraminidase inhibitor GS 4071. Antimicrob Agents Chemother, 1998. 42(3): p. 647-653 ) , 限制了其在治疗流感方面的应用。 因此， 本领域 仍然需要开发能够有效抑制神经氨酸苷酶、从 而能够治疗流感及抑制其传播 的化合物。 发明内容

为了改善化合物 1在动物体内的半衰期，从而优化化合物 1抑制神经氨 酸苷酶的作用， 本发明人有针对性地设计了化合物 1的多种前药， 并通过大 量实验测定这些化合物 1的前药的体内半衰期。 发明人发现， 采用化合物 1 的前药， 可以使化合物 1在动物体内的半衰期得到显著提高。

因此， 本发明的一个目的在于提供一种作为神经氨酸 苷酶抑制剂的前药 的化合物或其药物可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型体、 对映体或外消旋混 合物， 以满足目前对于神经氨酸苷酶抑制剂类药物的 需求。

本发明的另一个目的在于提供以所述化合物或 其药物可接受的盐、 溶 剂化物、 多晶型体、 对映体或外消旋混合物为活性成分的药物组合 物。

本发明的又一个目的在于提供所述化合物或其 药物可接受的盐、 溶剂 化物、 多晶型体、对映体或外消旋混合物或药物组合 物在制药方面的用途。

本发明的还一个目的在于提供采用所述化合物 或其药物可接受的盐、溶 剂化物、 多晶型体、 对映体或外消旋混合物或者采用所述药物组合 物用于 治疗相关疾病的方法。 为了实现上述目的， 本发明采取的技术方案如下：

一方面， 本发明提供一种式 la所示的化合物或其药物可接受的盐、溶 剂化物、 多晶型体、

其特征在于，

-Ai-X-Ri和 -A ₂ -Y-R ₂ 不能同时为 H, 并且其中：

Ai独立地为键或 0;

A ₂ 独立地为键或 0;

X独立地为键、 C(0)、 C(0)0、 C(0)NH、 S(0) ₂ 、 S(0) ₂ NH、 CH ₂ OC(0)、 C(0)CH ₂ OC(0);

Y独立地为键、 C(0)、 C(0)0、 C(0)NH、 S(0) ₂ 、 S(0) ₂ NH、 CH20C(0)、 C(0)CH ₂ OC(0);

Ri独立地为 11、 C(0)0、 OC(0)、 烷基、 环烷基、 烯基、 炔基、 芳基 或芳烷基， 或 独立地为被 1-3个选自下述的取代基取代的 C(0)0、 0C(0)、 烷基、 环烷基、 烯基、 炔基、 芳基或芳烷基： 烷基、 亚烷基、 羟 基、 氧代、 面代、 氰基、 叠氮、 硝基、 氨基烷氧基、 芳氧基、 烷氧基烷基、 芳氧基烷基、 烷硫基、 烷硫基烷基、 烷氨基、 烷氨基烷基、 面代烷氧基；

R ₂ 独立地为 11、 C(0)0、 0C(0)、 烷基、 环烷基、 烯基、 炔基、 芳基 或芳烷基， 或 R ₂ 独立地为被 1-3个选自下述的取代基取代的 C(0)0、 0C(0)、 烷基、 环烷基、 烯基、 炔基、 芳基或芳烷基： 烷基、 亚烷基、 羟 基、 氧代、 面代、 氰基、 叠氮、 硝基、 氨基烷氧基、 芳氧基、 烷氧基烷基、 芳氧基烷基、 烷硫基、 烷硫基烷基、 烷氨基、 烷氨基烷基、 面代烷氧基； 以及

R ₃ 独立地为 d-C ₁₂ 烷基、 C ₃ -C ₆ 环烷基、 或 C ₃ -C ₁₂ 环烷基烷基。

根据本发明的一些实施方式，本发明提供式 la所示的化合物或其药物 可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型体、 对映体或外消旋混合物， 其中， Ai 独立地为键或 O , X独立地为键或 C(0)0 , 1^独立地为 H、 c(o)o、 oc(o)、 Ci-Ce烷基或被(^-0；烷基和 /或 d-C ₆ 亚烷基取代的 C(0)0、 OC(0)、 C C ₆ 烷基。

优选地， -Ai-X-Ri为 H;

优选地， -A ₂ -Y-R ₂ 为- OH。

进一步优选地， R ₃ 是 C _r C ₆ 的烷基，优选 -CH ₃ 、 -CH ₂ CH ₃ 、 -CH ₂ CH ₂ C¾、 -CH(C¾) ₂ 、 -C(C¾) ₃ 、 -CH(CH ₃ )C¾C¾、 -CH ₂ CH(C¾)CH ₃ 、

-CH ₂ CH ₂ CH ₂ C¾、 -CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₃ , 进一步优选 -CH ₃ 、 -CH ₂ CH ₃ 、 -CH ₂ CH ₂ C¾、 -CH(C¾) ₂ , 更优选 -CH ₂ CH ₃ 。

根据本发明的具体实施方式，本发明提供式 la所示的化合物或其药物 可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型体、 对映体或外消旋混合物， 其中所述式 la所

110 111

114 115

116 或 117。

优选地， 本发明提供的式 la所示化合物的结构分别如式 12、 13、 14、 15、 16、 17或 18所示； 进一步优选如式 12所示。

再一方面， 本发明提供一种药物组合物， 该药物组合物包含式 la所述 的化合物或其药物可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型体、 对映体或外消旋混 合物， 以及药学上可接受的辅料。

所述药物可接受的盐是指本发明的化合物可以 与无机酸或有机酸形 成可药用盐， 其中无机酸诸如盐酸、 氢溴酸、 氢碘酸、 硝酸、 高氯酸、 硫 酸或磷酸； 所述有机酸诸如甲磺酸、 三氟甲磺酸、 乙磺酸、 苯磺酸、 对甲苯 磺酸、 富马酸、 草酸、 马来酸、 柠檬酸。

所述溶剂化物例如水合物、 醇合物等。

选择和制备药物可接受的盐和溶剂化物等是本 领域公知技术。

根据具体剂型和施用方式， 所述药物组合物中的药学上可接受的辅料 可以包括下述的一种或多种： 稀释剂、 增溶剂、 崩解剂、 悬浮剂、 润滑剂、 粘合剂、 填充剂、 矫味剂、 甜味剂、 抗氧化剂、 表面活性剂、 防腐剂、 包 裹剂、 和色素等。

所述药物组合物可以为临床施用的任何剂型， 例如片剂、 栓剂、 分散 片、 肠溶片、 咀嚼片、 口崩片、 胶嚢、 糖衣剂、 颗粒剂、 干粉剂、 口服溶 液剂、 注射用小针、 注射用冻干粉针或大输液。

优选地， 本发明提供的药物组合物经胃肠外输注、 局部施用或口服施 用。 进一步优选经胃肠外输注施用， 例如采用静脉点滴、 静脉注射和肌肉 注射施用。

又一方面， 本发明提供上述化合物或其药物可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型体、 对映体或外消旋混合物或上述药物组合物在制 备药物中的用 途， 所述药物用于治疗由病毒引起的感染； 优选地， 所述病毒为流行性感 冒病毒。

并且， 本发明还提供上述化合物或其药物可接受的盐 、 溶剂化物、 多 晶型体、 对映体或外消旋混合物或所述药物组合物在制 备神经氨酸苷酶抑 制剂类药物中的用途。

还一方面， 本发明提供一种用于治疗、 预防或延緩由病毒引起的感染 的方法， 所述方法包括给予有治疗需要的患者治疗有效 量的上述化合物或 其药物可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型体、 对映体或外消旋混合物或上述 药物组合物。 其中所述病毒为流行性感冒病毒。 并且， 本发明提供的上述 化合物或其药物可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型体、 对映体或外消旋混合 物或者本发明提供的药物组合物可以与其它疗 法或治疗剂共同施用。 施用 方式可以为同时、 顺序或以一定时间间隔进行。

实施治疗、 预防或延緩等作用所需的化合物或药物组合物 的剂量通常 取决于施用的具体化合物、 患者、 具体疾病或病症及其严重程度、 给药途 径和频率等， 并且需要由主治医师根据具体情况判定。 例如， 在通过经静 脉途径施用本发明提供的化合物或药物组合物 时， 可以每周一次甚至以更 长时间间隔进行施用。

综上所述， 本发明提供了一种新型化合物， 所述化合物可作为具有神 经氨酸苷酶抑制剂活性的化合物 （具体为化合物 1 ) 的前药。 实验证明， 本 发明的化合物通过酶促和 /或非酶促机制，可以产生具有活性的神经氨� �苷酶 抑制剂。并且可以将该抑制剂即化合物 1在动物体内的半衰期提高到大于 20 小时。 因此本发明的化合物适合制成多种剂型的药物 ， 以广泛用于治疗季节 性流感、 禽流感、 猪流感以及对达菲有耐药性的流感病毒突变株 。 附图说明

以下， 结合附图来详细说明本发明的实施例：

图 1为实施例 10中化合物 12的药代动力学实验结果。 实施发明的最佳方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的 详细描述， 给出的实施 例仅为了阐明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施 例中所用的药材原料、 试剂材料等， 如无特殊说明， 均可自常规生化试剂 商店或药品经营企业购买得 实施例 1: 化合物 1的制备

合成方案

化合物 1-10

化合物 1-11 OH

TH F/ H ₂ 〇

步骤 3 53%

化合物 1-12 化合物 1

1.化合物 1-10的合成 向 250-mL 3颈圆底烧瓶中加入硫脲 (2 g, 26.27 mmol, 1.00当量)在四氢 呋喃 (50 mL)中的溶液，然后在 -10-0°C和搅拌下分若干批加入 NaH (60%) (2.3 g)。在 -10-0°C下搅拌所得溶液 1小时。在 o°c和搅拌下向其中逐滴加入二碳 酸二叔丁酯（12.6 g, 57.73 mmol, 2.20当量)在四氢呋喃 (50 mL)中的溶液。 在 室温下搅拌所得溶液过夜， 通过加入 100 mL水淬灭反应， 然后用 2x100 mL 乙酸乙酯萃取。 经无水硫酸钠干燥合并的有机层， 然后在真空下浓缩。 在硅 胶柱上纯化残余物， 用乙酸乙酯： 石油醚 (1 :5-1 :2)洗脱， 得到 1.5 g (21%)叔 丁基 N-([[(叔丁氧基)羰基]氨基]硫代亚甲基)氨基甲� �酯（ tert-butyl

N-([[(tert-butoxy)carbonyl]amino]methanethioyl)carbamate ) , 为白色固体。

2.化合物 1-11的合成

化合物 1-11 向 50-mL 3颈圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-氨基 -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基 氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯磷酸 (680 mg, 1.66 mmol, 1.00当量)在 Ν,Ν-二甲基 甲酰胺 (20 mL)中的溶液、叔丁基 N-([[(叔丁氧基)羰基]氨基]硫代亚甲基)氨基 甲酸酯 (500 mg, 1.81 mmol, 1.10当量）、 三乙胺 (700 mg, 6.92 mmol, 4.16当 量)， 然后在室温下分若干批加入 HgCl ₂ (0.54 g, 1.20当量)。 在室温下搅拌所 得溶液过夜。 滤出固体。 用 50 mL ¾O稀释滤液， 然后用 2x100 mL乙酸乙 酯萃取。 经无水硫酸钠干燥合并的有机层， 然后在真空下浓缩。 在硅胶柱上 纯化残余物， 用乙酸乙酯： 石油醚 (1 :3)洗脱， 得到 0.9 g (98%)

(3R,4R,5S)-5-[[(lZ)-[ [(叔丁氧基)羰基]氨基] ([ [(叔丁氧基)羰基]亚氨基])甲基] 氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 - 1 -烯 - 1 -甲酸乙酯， 为白色固体。

3.化合物 1-12的合成

化合物 1-11 化合物 1-12

向 100-mL 3颈圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-[[(lZ)-[ [(叔丁氧基)叛基]氨 基 ]([ [(叔丁氧基)羰基]亚氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (500 mg, 0.90 mmol, 1.00当量）、 四氢呋喃 (25 mL)、 水 (25 mL)、 和氢氧化钾 (500 mg, 8.91 mmol, 9.89当量）。 在 40 °C下搅拌所得溶液过 夜， 然后冷却。 用乙酸将溶液的 pH值调节为 6, 然后在真空下浓缩所得混 合物以去除 THF。 通过过滤收集固体， 得到 250 mg (53%)

(3R,4R,5S)-5-[[(lZ)-[ [(叔丁氧基)羰基]氨基] ([ [(叔丁氧基)羰基]亚氨基])甲基] 氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸， 为白色固体。

4.化合物 1的合成 ζ \ ο

0 八 OH

\、 **

H 、細.

¾合嫩 2 合物 i 向 50-mL圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-[[(lZ)-[ [(叔丁氧基)叛基]氨 基 ]([ [(叔丁氧基)羰基]亚氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1—烯 -1—甲酸 (200 mg, 0.38 mmol, 1.00当量)在二氯甲烷 (20 mL)中的溶液和 CF ₃ COOH (0.5 mL)。 在 40 °C下搅拌所得溶液过夜， 冷却， 用 100 mL碳酸氢 钠 /H20洗涤， 经无水硫酸钠干燥， 然后在真空下浓缩， 得到 70 mg (56%) (3R,4R,5S)-5-甲脒 -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸， 为白色固 体。

LC-MS-PH-GRM- 1101-1-0 (ES, m/z): 327 [M+l]+

H-NMR-PH-GRM- 1101-1-0 (300HMz, DMSO, ppm): 8.22 (s, 1H), 7.83 (m, 4H), 6.35 (1H, s), 4.05 (s, 1H), 3.66 (2H, s), 2.66 (m, 1H), 2.12 (m, 1H), 1.82 (s 3H), 1.39 (m, 4H), 0.76 (m, 6H). 实施例 2: 化合物 12的制备

合成方案

奥塞米韦

1

化合 Ιδ

[.化 12-10的合成

化 '合物12- 10 向奥塞米韦（4.1 g, 10 mmol, 1.0 eq)和 Et ₃ N (6.1 g, 60 mmol, 6.0 eq)在 EtOH (10 mL)中的混合物中加入 BrCN (1.1 g, 10 mmol)。 然后在室温下搅拌 混合物过夜。 TLC和 LCMS显示反应完全。向所得混合物中加入盐水 (50 mL)。 在真空下浓缩该混合物，以去除 EtOH,然后用 DCM (50 mL x3)提取残余物。 用盐水 (50 mL)洗涤提取物， 经 Na ₂ S04干燥， 然后浓缩得到粗产物 (3.9 g), 为黄色的油。 无需纯化， 将该残余物用于下一步骤。

2.化合物 12的合成

化合 ¾I2 10 化合物 12 向化合物 12-10 (9 g)和 Et3N (8.1 g, 80.02mmol, 3.0 eq)在 EtOH (300 mL) 中的溶液中加入 NH20H.HC1 (11 g, 80.02mmol, 3.0 eq)。在室温下搅拌混合物 24小时。 在真空下浓缩该反应混合物， 以去除 EtOH。 用 EtOAc (250 mL)稀 释残余物。 用水和盐水（各 40 mL ) 洗涤该混合物， 然后经 Na ₂ S04干燥。 蒸发溶液， 以去除大多数 EtOAc溶剂。 使剩余过饱和溶液静置 10-20分钟。 沉淀出大量白色固体，然后过滤所得固体。干 燥滤饼， 然后从丙酮中重结晶， 得到化合物 12 ( 6.0 g, 2步产率： 66% ) , 为白色固体。

^ NMR (CD30D, 400 MHz): δ 6.87 (brs, 1H), 4.22-4.31 (m, 3H), 3.94-4.03 (m, 2H), 3.44-3.51 (m, 1H), 2.84 (dd, J = 17.6, 4.4 Hz, 1H), 2.43-2.49 (m, 1H), 2.02 (s, 3H), 1.50-1.63 (m, 4H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.90-0.98 (m, 6H)

(全部 "NH"、 "OH"和" N¾"均未检测到 )

LC-MS: m/z 371.2 [M+l]+. 实施例 3: 化合物 13的制备

合成方案

化合物 13-10

1.化合物 13-10的合成

化合物 13- 10 向 250-mL圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-氨基 -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧 基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (5 g, 16.00 mmol, 1.00当量）、 KOCN (4 g)、 乙酸 (50 mL)、 和水 (50 mL)。 在 50 °C搅拌所得溶液过夜， 在真空下浓缩， 然后用 100 ml H ₂ 0稀释。 通过过滤收集固体， 得到 1.7 g (30%) (3R,4R,5S)-5- (氨基甲酰 基) -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白色固体。

2.化合物 13-11的合成

物 13- 10 化合物 13 向 50-mL圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5- (氨基甲酰基 )-4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (500 mg, 1.41 mmol, 1.00当量)在吡啶 (10 mL) 中的溶液和 TsCl (1 g, 5.25 mmol, 3.73当量)。 在室温下搅拌所得溶液过夜， 然后直接用于下一步骤。

3.化合物 13的合成

化合物 13- 11 化合物 13

将 C¾0N¾.HC1 (250 mg)加入到 (3R,4R,5S)-5- (氰基氨基 )-4-乙酰氨基

-3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯在吡啶 (10 mL)中的溶液中。 在室温下 搅拌所得溶液过夜， 然后在真空下浓缩。 用 100 mL乙酸乙酯稀释残余物， 用 100mlx2水洗涤，经无水硫酸钠干燥，然后在真� �下浓缩。通过 Prep-HPLC 纯化粗产物，得到 22 mg (2%) (3R,4R,5S)- ⁴ -乙酰氨基 -5-(1-甲氧基甲脒) -3- (戊

-3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白色固体。

LC-MS-PH-GRM-1101-3-0 (ES, m/z): 385 [M+l]+

H-NMR-PH-GRM- 1101-3-0 (300MHz, DMSO, ppm): 7.78 (d, 1H), 6.63 (s,

1H), 5.05 (s, 1H), 4.13 (m, 2H), 4.01 (m, 1H), 3.81 (m, 1H), 3.43 (m, 4H), 2.80

(m, 1H), 2.03 (1H, s), 1.82 (3H, s), 1.42 (m, 4H), 1.24(m, 3H), 0.80 (m, 6H). 实施例 4: 化合物 14的制备

合成方案 Kr C 0 ₃ 丙酮 步骤 2 52%

化合物 14-10

化合物 14-11 化合物 14

化合物 14-10的合成

化合物 14-10 向 50-mL圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-[[(lE)-[ [(叔丁氧基)叛基]氨 基 ]([ [(叔丁氧基)羰基]亚氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (200 mg, 0.36 mmol, 1.00当量)在二氯甲烷 (20 mL)中的溶液 和 CF ₃ COOH (0.2 mL)。 在室温下搅拌所得溶液过夜， 然后用 50 mL碳酸氢 钠 /¾0洗涤。 经无水硫酸钠干燥有机层， 然后在真空下浓缩。 在硅胶柱上纯 化残余物， 用乙酸乙酯： 石油醚 (1 :5-2: 1)洗脱， 得到 100 mg (61%)

(3R,4R,5S)-5-[[(lE)-氨基 ([[(叔丁氧基)羰基]亚氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白色固体。

2.化合物 14-11的合成

化合物 14-10 物 14-11 向 100-mL圆底烧瓶中加入 ( ³ R,4R, ⁵ S)- ⁵ -[[(lE)-氨基 ([[(叔丁氧基)羰基] 亚氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (500 mg, 1.10 mmol, 1.00当量)在丙酮 (50 mL)中的溶液、 碳酸钾 (400 mg, 2.89 mmol, 2.63当量）、 和氯代（乙氧基）甲酮（170 mg, 1.57 mmol, 1.42当量）。 在室 温下搅拌所得溶液 3小时， 用 100 mL H2O稀释， 然后用 2x100 mL乙酸乙 酯萃取。 经无水硫酸钠干燥合并的有机层， 然后在真空下浓缩。 在硅胶柱上 纯化残余物， 用乙酸乙酯： 石油醚 (1 :5-1 : 1)洗脱， 得到 300 mg (52%)

(3R,4R,5S)-5-[[(lZ)-[ [(叔丁氧基)羰基]亚氨基] [(乙氧基羰基)氨基]甲基]氨 基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白 固体。

4

3.化合物 14的合成

化合物 向 50-mL圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-[[(lZ)-[ [(叔丁氧基)叛基]亚氨 基] [(乙氧基羰基)氨基]甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1- 甲酸乙酯 (300 mg, 0.57 mmol, 1.00当量)在二氯甲烷 (20 mL)中的溶液和

CF ₃ COOH (0.5 mL)。 在 40 °C下搅拌所得溶液 24小时， 冷却， 然后用 50 mL 碳酸氢钠 /¾0洗涤。 经无水硫酸钠干燥有机层， 然后在真空下浓缩。在硅胶 柱上纯化残余物， 用乙酸乙酯： 石油醚 (1 :5-1 :3)洗脱， 得到 140 mg (58%) (3R,4R,5S)-4-乙酰氨基 -5-([[(乙氧基羰基)氨基]甲亚胺酰基]氨基) -3- (戊 -3-基 氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为无色固体。 LC-MS-PH-GRM-1101-5-0 (ES, m/z): 427[M+1]+

H-NMR-PH-GRM-1101-5-0 (300MHz, DMSO, ppm): 7.88 (d, IH), 7.41 (s, 2H), 6.68 (s, IH), 6.25 (s, IH), 4.20 (m, 4H), 3.94 (m, 3H), 3.42 (m, IH), 2.72 (m IH), 2.10 (s, IH), 1.82 (s, 3H), 1.50 (m, 4H), 1.10 (m, 6H), 0.70 (m, 6H). 实施例 5: 化合物 15的制备

合成方案

化合物 15-10

化合物 1

化合物 15 化合物 15-10的合成

OH cue '。丫。 ' CC I,

〇

化合物 15-10 向 50-mL 3颈圆底烧瓶中加入碳酸二三氯甲酯 (2.9 g, 9.77 mmol, 1.00 当量)在二氯甲烷 (20 mL)中的溶液， 三乙胺 (2 g, 19.76 mmol, 2.02当量）， 然后在 0-10°C和搅拌下逐滴加入己 -1-醇（1 g, 9.79 mmol, 1.00当量）。在 0-10 ° 下搅拌所得溶液 2小时， 然后在真空下浓缩， 得到 2 g粗氯代（己氧基) 甲酮， 为黄色固体。

2. 化合物 15-11的合成

向 100-mL 3颈圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-[[(lZ)-氨基 ([[(叔丁氧基)羰 基]亚氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (300 mg, 0.66 mmol, 1.00当量)在丙酮 (50 mL)中的溶液、碳酸钾 (240 mg, 1.74 mol, 2631.13当量）、 和氯甲酸己酯（163 mg, 0.99 mmol, 1.50当量)。 在室温下 搅拌所得溶液 3小时，用 100 mL H ₂ 0洗涤，然后用 2x100 mL乙酸乙酯萃取。 经无水硫酸钠干燥合并的有机层， 然后在真空下浓缩。 在硅胶柱上纯化残余 物， 用乙酸乙酯： 石油醚 (1 :5-1 : 1)洗脱， 得到 300 mg (78%)

(3R,4R,5S)-5-[[(lE)-[ [(叔丁氧基)羰基]亚氨基 ]([ [(己氧基)羰基]氨基])甲基]氨 基] -4乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白色固体。

3.化合物 15的合成

化合物 15-11 化合物 15 向 50-mL圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-[[(lE)-[ [(叔丁氧基)叛基]亚氨 基] ([[(己氧基)羰基]氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (300 mg, 0.51 mmol, 1.00当量)在二氯甲烷 (30 mL)中的溶液和 CF ₃ COOH (0.5 mL)。 在 40 °C下搅拌所得溶液过夜， 冷却， 然后用 100 mL碳 酸氢钠 /¾0洗涤。 经无水硫酸钠干燥有机层， 然后在真空下浓缩。在硅胶柱 上纯化残余物， 用乙酸乙酯： 石油醚 (1 :5-1 :1)洗脱， 得到 50 mg (20%) (3R,4R,5S)-4-乙酰氨基 -5-[([[(己氧基)羰基]氨基]甲亚胺酰基)氨基] -3- (戊 -3- 基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白色固体。

LC-MS-PH-GRM- 1101 -6-0 (ES, m/z): 483[M+1]+

H-NMR-PH-GRM- 1101 -6-0 (300MHz, DMSO, ppm): 7.86 (d, IH), 6.67 (s, IH), 4.16 (m, 4H), 3.85 (m, 4 H), 3.40 (m, IH), 2.72 (m, IH), 2.09 (s, IH), 1.80 (s, 3H), 1.45 (m, 6H), 1.20 (m, 9H), 0.84 (m, 9H). 实施例 6: 化合物 16的合

合成方案

0 CI CH ₂ CI ₂ HiO

义 人 0 CH^COOH

+ CH ₃ SNa _

C 0- 、 步骤 1 55% 步骤 2

化合物 IS-10

、

化合物 化合物 IS-12

化合物 IS 化合物 16-10的合成

CI CH ₂ CI ₂ H50 0

人 + CH ₃ SNa ^ 人

CI 0 、 步骤 1 55¾

化合物 I S-10 向 100-mL圆底烧瓶中加入氯代 (1-氯代乙氧基）甲酮（10 g, 69.95 mmol, 1.00当量)在二氯甲烷 (20 mL)中的溶液、 TBAB (500 mg, 1.55 mmol, 0.02当 量)， 然后在 < ² 5 °C和搅拌下逐滴加入 (甲基硫烷基)钠 ( ⁵ · ⁶ g, 79.90 mmol, 1.14 当量)在水 (25 mL)中的溶液。 在室温下搅拌所得溶液 3小时。 经无水硫酸钠 干燥有机层，然后在真空下浓缩。通过在减压 下 (30 mm Hg)蒸微纯化粗产物， 在 90°C下收集级份， 得到 6 g ( ⁵ 5%) (l-氯代乙氧基 )(甲基硫烷基)甲酮， 为无 色的油。

2.化合物 16-11的合成

X I 。。 H ] 、 。丄。

化合物 16-10 化合物 向 50-mL圆底烧瓶中加入 DIPEA (3.7 g),然后在 15 °C和搅拌下逐滴加 入乙酸 (1.7 g, 28.31 mmol, 1.46当量)。 在<10°(3和搅拌下向其中逐滴加入 (1- 氯代乙氧基 )（甲基硫烷基)甲酮 ( ³ g, 19.40 mmol, 1.00当量)在乙酸 ( ² mL)中的 溶液。在 50 °C下搅拌所得溶液过夜，冷却，用 100 mL H ₂ 0稀释，然后用 2x100 mL乙酸乙酯萃取。 经无水硫酸钠干燥合并的有机层， 然后在真空下浓缩， 得到 3.5 g粗 1-[[(甲基硫烷基)羰基]氧基]乙酸乙酯， 为无色粗油。

3.化合物 16-12的合成

、

化合物 IS-11 化合物 IS-12 向 250-mL 3颈圆底烧瓶中加入 1-羟基吡咯烷 -2,5-二酮 (2.7 g, 23.46 mmol, 1.19当量）、 UHP (9.2 g)、 二氯甲烷 (100 mL)、 和 2,5-二氢呋喃 -2,5-二 酮 (5.8 g, 59.15 mmol, 3.01当量）。 在室温下搅拌所得溶液 30分钟。 向混合物 中加入 1-[[(甲基硫烷基)羰基]氧基]乙酸乙酯 (3.5 g, 19.64 mmol, 1.00当量)在 二氯甲烷 (10 mL)中的溶液。 在室温下搅拌所得溶液过夜， 用 2x100 mL H ₂ 0 洗涤， 经无水 酸钠干燥， 然后在真空下浓缩， 得到 2.5 g (52%) 1-([[(2,5- 二氧代吡咯烷- 1 -基)氧基]羰基]氧基）乙酸乙酯， 为浅黄色的油。

4.化合物 16-13的合成

化合物 16-13 向 250-mL圆底烧瓶中加入 1-([[(2,5-二氧代吡咯烷 -1-基)氧基]叛基]氧 基）乙酸乙酯（1.2 g, 4.89 mmol, 1.11当量)在 C¾CN (20 mL)中的溶液、

(3R,4R,5S)-5-[[(lE)-氨基 ([[(叔丁氧基)羰基]亚氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (2 g, 4.40 mmol, 1.00当量)、 和碳酸氢 钠（1.2 g, 14.28 mmol, 3.25当量)在水 (50 mL)中的溶液。 在室温下搅拌所得溶 液过夜， 用 50 mL ¾O稀释， 然后用 2x100 mL乙酸乙酯萃取。 经无水硫酸 钠干燥合并的有机层， 然后在真空下浓缩。 在硅胶柱上纯化残余物， 用乙酸 乙酯： 石油醚 (1 :2-1 :1)洗脱, 得到 2 g (78%) (3R,4R,5S)-5-[[(lZ)-([[l- (乙酰基 氧基)乙氧基]羰基]氨基) ([[(叔丁氧基)羰基]亚氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白色固体。

5.化合物 16的合成

化合物 16-13 化合物 16

向 50-mL圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-[[(lE)-([[l- (乙酰基氧基）乙氧基] 羰基]氨基) ([[(叔丁氧基)羰基]亚氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧 基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯（1 g, 1.71 mmol, 1.00当量)在二氯甲烷 (30 mL)中的 溶液和 CF ₃ COOH (l mL)。 将所得溶液加热至回流过夜， 冷却， 然后用 2x50 mL碳酸氢钠 /¾0洗涤。 经无水硫酸钠干燥有机层， 然后浓缩。 在硅胶柱上 纯化残余物， 用乙酸乙酯： 石油醚 (1 : 1-2: 1)洗脱， 得到 350 mg (42%)

(3R,4R,5S)-5-[[([[l- (乙酰基氧基）乙氧基]羰基]氨基)甲亚胺酰基]� ��基] -4-乙酰 氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白色固体。

LC-MS-PH-GRM-1101-7-0 (ES, m/z): 485[M+1]+ H-NMR-PH-GRM- 1101-7-0 (300MHz, DMSO, ppm): 7.87 (m, 1H), 6.67 (s 2H), 6.44 (s, 1H), 4.16 (m, 2H), 4.06 (m, 2H), 3.80 (m, 1H), 3.39 (m, 1H), 2.61 (m, 1H), 2.07 (d, 3H), 1.81 (3H, s), 1.41 (m, 6H), 1.23 (m, 3H), 0.85 (m, 6H). 实施例 7: 化合物 17的合成

合成方案

〇 CI

DIPEA

人。人 OH

步骤 1

化合物 17- 10 化合物 17-11

化合物 17-12

化合物 17 化合物 17-10的合成

-S

化合物 17- 10

向 50-mL圆底烧瓶中加入 DIPEA (3.7 g),然后在 15 °C和搅拌下逐滴加 入 2,2-二甲基丙酸 (2.9 g, 28.39 mmol, 1.46当量)。 在室温和搅拌下向其中逐 滴加入 (1-氯代乙氧基 )（甲基硫烷基)甲酮 ( ³ g, 19.40 mmol, 1.00当量)在新戊酸 (2 mL)中的溶液。 在 55 °C下搅拌所得溶液过夜， 冷却， 然后用 100 mL H ₂ O 稀释。 用碳酸氢钠将溶液的 pH值调节为 7, 然后用 2x100 mL 乙酸乙酯萃取 所得溶液。 经无水硫酸钠干燥合并的有机层， 然后在真空下浓缩， 得到 粗 2,2-二甲基丙酸 1-[[(甲基硫烷基)羰基]氧基]乙酯， 为无色粗油。

2.化合物 17-11的合成

化合物 17- 10 2 55% 化合物 17-11 向 250-mL圆底烧瓶中加入 1-羟基吡咯烷 -2,5-二酮 (3.1 g, 26.94 mmol, 1.19当量)在二氯甲烷 (150 mL)中的溶液、 UHP (l l g)、 和 2,5-二氢呋喃 -2,5- 二酮 (7 g, 71.39 mmol, 3.15当量)。在室温下搅拌所得溶液 30分钟。向混合物 中加入 2,2-二甲基丙酸 1-[[(甲基硫烷基)羰基]氧基]乙酯 (5 g, 22.70 mmol, 1.00当量)在二氯甲烷 (15 mL)中的溶液。 在室温下搅拌所得溶液过夜， 用 2x100 mL H ₂ 0洗涤， 然后浓缩。 在真空炉中干燥固体， 得到 3.6 g (55%) 2,2- 二甲基丙酸 1-([[(2,5-二氧代吡咯烷 -1-基)氧基]羰基]氧基）乙酯， 为白色固体。

3.化合物 17-12的合成

化合物 17-12

向 250-mL圆底烧瓶中加入 2,2-二甲基丙酸 1-([[(2,5-二氧代吡咯烷 -1- 基)氧基]羰基]氧基）乙酯（1.4 g, 4.87 匪 ol, 1.11当量）、 （3R,4R,5S)-5-[[(lE)-氨 基 ([[(叔丁氧基)羰基]亚氨基])甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1- 烯 -1-甲酸乙酯 (2 g, 4.40 mmol, 1.00当量）、 碳酸氢钠（1.2 g, 14.28 mmol, 3.25 当量）、 水 (60 mL)、 和 C¾CN (30 mL)。 在室温下搅拌所得溶液 4小时， 用 100 mL ¾O稀释， 然后用 2x100 mL乙酸乙酯萃取。 经无水硫酸钠干燥合并 的有机层， 然后在真空下浓缩。 在硅胶柱上纯化残余物， 用乙酸乙酯： 石油 醚 (1 :2-2:1)洗脱，得到 1.2 g (44%) (3R,4R,5S)-5-[[(lZ)-[ [(叔丁氧基)叛基]亚氨 基] [([1-[(2,2-二甲基丙酰基)氧基]乙氧基]羰基)氨基 ]甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白色固体。 4.化合物 17的合成

化合物 17-12 化合物 17

向 50-mL圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-[[(lE)-[ [(叔丁氧基)叛基]亚氨 基] [([1-[(2,2-二甲基丙酰基)氧基]乙氧基]羰基)氨基 ]甲基]氨基] -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (600 mg, 0.96 mmol, 1.00当量)在二氯 甲烷 (20 mL)中的溶液和 CF ₃ COOH (0.6 mL)。 将所得溶液加热至回流过夜， 冷却， 然后用 2x50 mL碳酸氢钠 /¾0洗涤。 经无水硫酸钠干燥有机层， 容 纳后在真空下浓缩。 在硅胶柱上纯化残余物， 用乙酸乙酯： 石油醚 (1 :1-2: 1) 洗脱， 得到 150 mg (30%) (3R,4R,5S)-5-([[([l-[(2,2-二甲基丙酰基)氧基]乙氧 基]羰基)氨基]甲亚胺酰基]氨基) -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲 酸乙酯， 为白色固体。

LC-MS-PH-GRM- 1101-8-0 (ES, m/z): 527[M+1]+

H-NMR-PH-GRM- 1101-8-0 (300MHz, DMSO, ppm): 7.87 (s, 1H), 6.69 (d, 2H), 4.17 (m, 4H), 3.84 (s, 1H), 3.41 (s, 1H), 2.67 (m, 1H), 2.10 (s, 1H), 1.80 (s, 3H), 1.46 (m, 7H), 1.24 (m, 4H), 1.18 (s, 9H), 0.82 (m, 6H). 实施例 8: 化合物 18的合成

合成方案

L化合物 -10的合成

化合物 18-10

向 500-mL 3颈圆底烧瓶中加入 (3R,4R,5S)-5-氨基 -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3- 基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯磷酸 (10 g, 24.37 mmol, 1.00当量)在乙酸 /水 (200 mL, 1 :1)中的溶液和氰酸钾 (8 g, 98.81 mmol, 3.94当量）。 在 50°C下搅拌 所得溶液过夜， 在真空下浓缩， 然后用 200 mL水洗涤。 通过过滤收集固体, 然后干燥， 得到 3.4 g (39%) (3R,4R,5S)-5- (氨基甲酰基 )-4-乙酰氨基 -3- (戊 -3- 基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白色固体。

2.化合物 18-11的合成

化合物 18-10 化合物 18-11 向经吹扫且保持在氮惰性气氛下的 250-mL 3颈圆底烧瓶中加入

(3R,4R,5S)-5- (氨基甲酰基 )-4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙 酯 (3 g, 8.44 mmol, 1.00当量)在吡啶 (60 mL)中的溶液和 4-甲苯磺酰氯 (6 g, 3.73当量)。 在室温下搅拌所得溶液过夜。 通过 LCMS监测反应过程。 在真 空下浓缩所得混合物。 通过 Flash-Prep-HPLC纯化粗产物， 条件如下

(IntelFlash-1): 柱子， 硅胶； 流动相， 在 15分钟内从水 /乙腈 =98/2增加至水 /乙腈 =20/80; 检测器， UV 254 nm, 得到 2.2 g (77%) (3R,4R,5S)-5- (氰基氨 基) -4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为黄色固体。

3.化合物 18-12

向经吹扫且保持在氮惰性气氛下的 50-mL 3颈圆底烧瓶中加入

(3R,4R,5S)-5- (氰基氨基 )-4-乙酰氨基 -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (200 mg, 0.59 mmol, 1.00当量)在乙醇 (4 ml)中的溶液、盐酸羟胺 (61.7 mg, 0.89 mmol, 1.50当量）、 和三乙胺 (95.6 mg, 0.94 mmol, 1.60当量）。 在室温下搅拌 所得溶液 1小时。 通过 LCMS监测反应过程。 在真空下浓缩所得混合物， 得 到 200 mg粗 (3R,4R,5S)-4-乙酰氨基 -5-(1-羟基甲脒) -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1- 烯 -1—甲酸乙酯， 为浅黄色固体。

4.化合物 18的合成

向经吹扫且保持在氮惰性气氛下的 10mL圆底烧瓶中加入 2-甲基丙酸

(86 mg, 0.98 mmol, 1.20当量)在二氯甲烷 (6 mL)中的溶液和 1-(3-二甲氨基丙 基) -3-乙基碳二亚胺甲基碘 (481 mg, 2.00当量)。 在室温下搅拌所得溶液 1小 时。然后向混合物中加入 (3R,4R,5S)-4-乙酰氨基 -5-(l-羟基甲脒) -3- (戊 -3-基氧 基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯 (300 mg, 0.81 mmol, 1.00当量)。 在室温下搅拌所得 溶液 2小时， 然后在真空下浓缩。 通过 Prep-HPLC纯化粗产物， 条件如下 ( 1 #-Pre-HPLC-001 (SHIM ADZU))： 柱子， XBridge shield RP 18 OBD柱， 5um, 19*150 mm; 流动相， 水和乙腈（在 8分钟内从 36.0%乙腈增至 55.0%, 在 2 分钟内增至 100.0%, 在 1分钟内降至 36.0% ) ； 检测器， 254 & 220 nm, 得 到 25 mg (7%) (3R,4R,5S)-4-乙酰氨基 -5-[1-[(2-甲基丙酰基)氧基]甲脒] -3- (戊 -3-基氧基)环己 -1-烯 -1-甲酸乙酯， 为白色固体。

LC-MS-PH-GRM-1111-O (ES, m/z): 441 [M+H] +

H-NMR-PH-GRM-1111-0 (CDC13, 400MHz, ppm): 0.84-0.94 (m, 6H), 1.20-1.28 (m, 9H), 1.50-1.57 (m, 4H), 1.98 (s, 3H), 2.23-2.30 (t, J = 14.4Hz, 1H), 2.64-2.69 (m, 1H), 2.77-2.83 (m, 1H), 3.34-3.37 (t, J = 5.6Hz, 1H) , 3.80 (m, 1H), 4.09-4.07 (m, 1H) , 4.25-4.17 (m, 3H) , 4.85 (s, 2H), 5.50 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.92 (s, 1H). 实施例 9: 本发明化合物的体外稳定性试验

本实施例检测了本发明的化合物 12至化合物 18的体外代谢稳定性。 测试 4匕合物： 4匕合物 12、 13、 14、 15、 16、 17和 18;

对照化合物： 维拉帕米 ( verapamil ) 。

微粒体：人肝微粒体 ( HMMC； PL050B )和雄性小鼠肝微粒体 ( RTMC；

RT046 ) , 购自 CellzDirect ( Invitrogen ) ； 使用前储存于— 80。C。

方法：

1 )根据表 1所示制备母液， 然后加入测试化合物或对照化合物， 使这 些化合物在反应体系中的最终浓度为 2μΜ。 然后在 37°C下预热混合溶液 2 分钟。

表 1. 母液的制备

成分 储液浓度 体积 最终浓度 微粒体

5mg/mL 0.5mg/mL

( HMMC或 RTMC )

MgCl ₂ 溶液 50mM 50μ 5mM 磷酸盐緩冲液 200mM 250μ lOOmM

超纯水 - 95μ 2 ) 向混合溶液中加入 NADPH , 使其最终浓度为 1 mM , 然后将反应体 系置于 37°C下。 空白对照中加入同样体积的超纯水代替 NADPH。

3 )在 0、 15、 30、 45和 60分钟时从反应体系中取出 50μ 的等分试样， 并加入 3倍体积的冷甲醇终止反应。 以 16000g离心该等份试样 10分钟以沉 淀蛋白。 将 ΙΟΟμ 的上清液用于 LC/MS/MS分析， 从而测定剩余的测试化 合物和对照化合物的量。 检测一式两份地进行。

LC分析采用的仪器和条件为：

Shimadzu (Degasser DGU - 20A3, Solvent Delivery Unit LC - 20ADXR, System Controller CBM - 20A, Column Oven CTO - 1 OAS VP), CTC Analytics HTC PAL - XT System

柱子： Phenomenex 5μ C 18(2) (2.0x50mm)

流动相： 0.1 %甲酸水溶液（ B )和 0.1 %甲酸 -乙腈（ A ) ； 洗脱程序为 0-2 min, 流动相 A为 5~100% , 流动相 B为 95%~0%； 2~2.2min, 流动相 A为 100% , 流动相 B为 0%; 2.2~2.4min, 流动相 A为 100%~5% , 流动 相 B为 0%~95%； 2.4~3min, 流动相 A为 5% , 流动相 B为 95%。

流速： 0.5mL/min;

柱温： 25 °C ;

上样体积： ΙΟμΙ^

MS/MS分析采用的仪器和条件为：

AB API4000 LC/MS/MS instrument

源： Turbo spray

电离模式： ESI

扫描类型： MRM

碰撞气： 6 L/min; 帘气： 30 L/min; 雾化气： 50 L/min; 辅助气： 50 L/min; 温度： 500°C ; 喷射电压： 4500 v

检测结果：

在存在 NADPH的人肝或小鼠肝微粒体体系中 ,测试化合物 12至化合物 18以及对照化合物维拉帕米的体外稳定性结果� ��表 2和表 3。

化合物 12 100.00 90.15 80.31 69.95 61.59 化合物 13 100.00 99.02 97.22 97.22 95.26 化合物 14 100.00 97.66 95.78 96.24 96.72 化合物 15 100.00 19.74 6.74 6.58 6.83 化合物 16 100.00 16.86 1.53 0.19 0.06 化合物 17 100.00 45.72 25.82 13.78 7.96 化合物 18 100.00 98.1 89.6 58.4 31.3

从表 2和表 3的数据可以看到， 在存在 NADPH的人肝微粒体和小鼠肝微 粒体体系中， 对照化合物维拉帕米迅速分解。 实施例 10: 本发明化合物的体内药代动力学试验

本实施例检测了本发明的化合物 12、 13、 14、 15、 16、 17和 18的体内药 代动力学。

方法：

将化合物 12至化合物 18分别以 10g/L的浓度溶于空白溶液（ 30% PEG-400 ) 中。

实验动物为雄性小鼠， 6至 8周龄， 体重 190-215克， 购自北京维利 通华实验动物技术有限公司。基于小鼠体重随 机分成 7组，每组 3只动物。 各组小鼠的给药剂量和途径见表 4。 表 4. 药代动力学试验分组及给药情况

在药代动力学试验前， 将小鼠禁食 16小时。 然后按照表 4中所示经 静脉（I mL/kg; lmg/kg )给药单个剂量的化合物。 采取颈静脉穿刺的方 式在给药后定时收集血液 20(^L, 其中对于经静脉给药的动物组， 在给药 后 0、 15分钟、 30分钟、 1小时、 2小时、 4小时、 8小时和 24小时收集 血液。 将血样收集于具有 EDTA的样品管中， 立即在 4°C下以 4000rpm离 心血样 5分钟， 然后将血浆转移到另一个样品管中， 储存于 -20摄氏度下。

检测各时间点取得的血样中由测试化合物转化 形成的化合物 1的浓 度， 由此对样品进行药代动力学检验， 采用的方法和仪器如下：

HPLC: Shimadzu (DGV-20A3, Serial NO: SSI-3-0536; LC-20AD Serial

NO: L20104551674 USB and L20104551673 USB;), CTC Analytics HTC PAL System (Serial NO: 4353);

MS: AB API4000 Q Trap LC/MS/MS instrument (Serial NO. AR 19020706) 柱子： Phenomenex Luna 5μ C18 (2.0x50 mm)

流动相： 100%乙腈 ( ² mM乙酸铵)和 100%水 ( ² mM 乙酸铵）

定量方法： 内标法

化合物 12至化合物 18的药代动力学结果见表 5。

表 5. 化合物 12至化合物 18的药代动力学数据比较

药物剂量 半衰期

药物 途径

(毫克 /公斤 ) (小时）

化合物 12 1 经静脉 23.8

化合物 13 1 经静脉 NA

化合物 14 1 经静脉 NA 化合物 15 1 经静脉 NA

化合物 ½ 1 经静脉 15.1

化合物 17 1 经静脉 11.6

化合物 18 1 经静脉 3.4

NA: 数据未得。

由表中数据可知， 相比化合物 1本身经静脉注射的半衰期， 化合物 12、 15 和: 16的半衰期显著延长。 其中， 化合物 12的半衰期长达近 24小时， 其药代动 力学图谱见图 1。