ANTECEDENTES DE LA INVENCION La base o mecanismo de formación de las arrugas faciales es una tensión de los músculos de la epidermis que arrastran la piel hacia el interior. Esta tensión muscular es el resultado de una hiperactividad de los nervios que inervan los músculos faciales. La hiperactividad nerviosa se caracteriza por una liberación incontrolada y excesiva de neurotransmisores que excitan las fibras musculares. Por ello, las moléculas que controlan la exocitosis neuronal contribuyen a relajar la tensión muscular y, consecuentemente, a eliminar las arrugas.

Las toxinas botulínicas son una familia de neurotoxinas bacterianas producidas por Clostridium botulinum (1) [véase el apartado relativo a la BIBLIOGRAFÍA]. Se conocen 7 serotipos diferentes (serotipos A, B, C, D, E, F y G) con un peso molecular medio de 150 kDa. Estas toxinas inhiben la exocitosis de acetil-colina en la unión neuromuscular (sinapsis neurona-músculo) de músculo esquelético (1).

A nivel molecular, las toxinas botulínicas son proteasas que degradan proteínas neuronales que están involucradas en el mecanismo de exocitosis activada por el ion calcio (1-3).

Por ejemplo, la toxina botulínica A, la más comúnmente utilizada en clínica y cosmética [por sus aplicaciones en la

eliminación de las arrugas faciales y de la asimetría facial, y para suavizar la sintomatología de enfermedades espasmódicas], trunca la proteina neuronal SNAP-25. Esta proteina (SNAP-25) juega un papel clave en la neurosecreción puesto que está involucrada en la formación de un complejo proteico (conocido con el nombre de complejo SNARE o de fusión) que dirige y controla la liberación de la acetilcolina acumulada en vesículas. El núcleo de dicho complejo de fusión lo constituyen las proteínas SNAP-25 y sintaxina, localizadas en la membrana plasmática presináptica, y la proteina sinaptobrevina (o VAMP), localizada en la membrana plasmática vesicular (4,5). La función principal del complejo de fusión es aproximar y poner en contacto la vesícula cargada de neurotransmisor (acetilcolina) con la membrana plasmática presináptica (4,5). De esta forma, en respuesta a una elevación de la concentración de calcio, se favorecerá la fusión de ambas membranas plasmáticas, produciendo así la liberación del neuro-transmisor. Por tanto, dicho complejo proteico SNARE de atraque y fusión vesicular constituye una diana clave para controlar la neurosecreción. E1 truncamiento de cualquiera de las proteínas que forman el complejo de fusión previene su ensamblaje y, por tanto, inhibe la liberación vesicular y exocitosis neuronal.

La potencia de las toxinas botulínicas y, en particular, el serotipo A (BOTOX@) inhibiendo la neurosecreción, así como su selectividad neuronal (sólo actúan en neuronas) está siendo ampliamente explotada terapéuticamente para corregir dolencias espasmódicas tales como las distonías, estrabismo, tics, blefarospasmo, torticolis, etc. (6-13). La toxina botulínica A (botulina A) es, además, un agente eficaz en la eliminación de las arrugas faciales y de la asimetría facial. De hecho, la administración de BOTOXs es la primera terapia eficaz que no requiere intervención quirúrgica para eliminar los signos

del envejecimiento (6,7).

El tratamiento terapéutico y cosmético con BOTOXs consiste en la inyección localizada de preparados farmacéuticos (complejo botulina A-hematoglutinina, 500 kDa) diluidos en las zonas donde se localiza la tensión muscular.

Los efectos paralíticos de la toxina son reversibles con una media de duración de 6 meses (6,7). E1 tratamiento, por tanto, requiere la inyección repetida de BOTOX. El problema principal de este tratamiento es la posibilidad de que se desencadene una reacción inmune contra el preparado farmacéutico debido a que por su tamaño molecular puede ser objeto de reconocimiento por el sistema inmunitario del paciente. La aparición de anticuerpos contra la botulina A constituye un grave problema ya que contribuye a una clara pérdida de eficacia del tratamiento (6-13). Esta pérdida de eficacia del tratamiento con BOTOX') conlleva la necesidad de aumentar la concentración del preparado en tratamientos posteriores, lo que a su vez produce una potenciación de la respuesta inmune. Como alternativa se ha barajado el uso de serotipos distintos de toxinas botulínicas (BoTox), tales como BoTox B, BoTox F y BoTox E. No obstante, la aplicación de preparados farmacéuticos con serotipos distintos no puede considerarse una solución al problema puesto que, tarde o temprano, la reacción inmune se puede volver a producir.

Además, el tratamiento con toxinas botulínicas es caro debido, principalmente, a la labilidad e inestabilidad de las preparaciones farmacéuticas que las contienen.

Existe, por tanto, una necesidad imperiosa de desarrollar moléculas que imiten los efectos paralíticos de las toxinas botulínicas pero que estén dotadas de estructuras moleculares mucho más sencillas y estables, que no induzcan reacciones inmunes, y cuyo coste de producción sea económico. Las moléculas de naturaleza peptídica cumplen estas propiedades.

Se han descrito secuencias aminoacidicas que inhiben la exocitosis neuronal. En concreto, se ha demostrado que péptidos con un número de aminoácidos superior a 20, derivados de la secuencia C-terminal de SNAP-25, bloquean la liberación de catecolaminas de células cromafines permeabilizadas (14).

Del mismo modo, se han descrito péptidos derivados de las secuencias aminoacídicas de las proteínas sintaxina y VAMP que también pueden afectar al proceso exocitótico (15). Aunque estos péptidos muestran actividad biológica, no se ha producido su desarrollo ulterior como agentes cosméticos y/o terapéuticos debido, probablemente, a su tamaño ya que dificultan y encarecen su desarrollo como agentes terapéuticos útiles. Por tanto, existe la necesidad de encontrar moléculas de tamaño inferior que puedan aplicarse en cosmética y medicina.

Esta invención proporciona una solución a las necesidades existentes que comprende el descubrimiento de unas secuencias aminoacídicas más pequeñas, entre 3 y 30 aminoácidos, derivadas del extremo amino (dominio N-terminal) de la proteina SNAP-25, que inhiben la exocitosis ueuronal. Además, se ha descubierto que el uso simultáneo de peptide derivados del extremo amino y del extremo carboxilo (dominio C-terminal) de SNAP-25 produce un aumento considerable de su actividad inhibitoria, es decir, existe una potenciación de su actividad frente a la mostrada por los péptidos individuales.

Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye un péptido que tiene una secuencia constituida por 3 a 30 aminoácidos contiguos contenidos en el extremo amino de la proteina SNAP-25, que inhibe la exocitosis neuronal.

Un objeto adicional de esta invención lo constituye un ácido nucleico que esencialmente codifica un péptido de los proporcionados por esta invención. Los plásmidos y vectores que contienen dicho ácido nucleico (también identificados como

construcciones), así como las células transformadas con dichos plásmidos o vectores que expresan un péptido de la invención también constituyen objetos adicionales de la presente invencion.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye una mezcla de, al menos, un péptido de los proporcionados por esta invención y, al menos, un péptido que tiene una secuencia constituida por 3 a 30 aminoácidos contiguos contenidos en el extremo carboxilo de la proteina SNAP-25.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye una composición cosmética que comprende, al menos, un péptido de los proporcionados por esta invención. E1 empleo de los péptidos proporcionados por esta invención en la elaboración de dicha composición cosmética, así como el método de tratamiento cosmético que comprende la aplicación de dicha composición cosmética constituyen objetos adicionales de esta invención.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye una composición farmacéutica que comprende, al menos, un péptido de los proporcionados por esta invención, o, alternativamente, un vector que contiene un ácido nucleico que codifica un péptido de la invención. E1 empleo de los péptidos y vectores (construcciones) proporcionados por esta invención en la elaboración de dichas composiciones farmacéuticas, así como el método de tratamiento del cuerpo humano o animal que comprende la aplicación de dicha composición cosmética constituyen objetos adicionales de esta invención.

Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye una combinación de fármacos que comprende, al menos, un péptido de los proporcionados por esta invención junto con, al menos, un fármaco destinado a una segunda diana terapéutica que puede ser igual o diferente a la diana terapéutica a la que va dirigido el péptido proporcionado por

esta invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona un péptido derivado del extremo amino de la proteina SNAP-25. De forma más concreta, la invención proporciona un péptido, en adelante péptido de la invención, que tiene una secuencia de 3 a 30 aminoácidos contiguos contenidos en la SEC. ID. N° : 1 [véase el apartado relativo a la LISTA DE SECUENCIAS].

La invención también incluye péptidos sustancialmente homólogos al péptido de la invención. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión"sustancialmente homólogo" significa que el péptido en cuestión tiene una homología a nivel de aminoácidos de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos, un 80%, y, más preferentemente, de, al menos, un 95%.

La invención también incluye péptidos funcionalmente equivalentes al péptido de la invención. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión"funcionalmente equivalente"significa que el péptido en cuestión tiene, al menos, una de las actividades biológicas del péptido de la invención, por ejemplo, la capacidad de inhibir, al menos parcialmente, la exocitosis neuronal.

En una realización particular, el péptido de la invención tiene una longitud de 3 a 20 aminoácidos, preferentemente, de 6 a 19 aminoácidos.

Los aminoácidos que constituyen las unidades estructurales del péptido de la invención pueden tener la configuración D o L. E1 aminoácido del extremo amino puede tener el grupo amino terminal acetilado y el aminoácido del extremo carboxilo puede tener el grupo carboxilo terminal amidado. Por tanto, la presente invención también incluye derivados del péptido de la invención en los que el extremo

amino terminal está acetilado y/o en los que el extremo carboxilo terminal está amidado.

Ejemplos particulares de péptidos de la invención son los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC. ID. N° : 2 y SEC. ID. N° : 3.

Dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales cosmética y/o farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención. El término"sales cosmética y/o farmacéuticamente aceptables"incluye las sales habitualmente utilizadas para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos o bases libres. La naturaleza de la sal no es crítica, siempre y cuando sea cosmética y/o farmacéuticamente aceptable. Las sales cosmética y/o farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención pueden obtenerse a partir de ácidos o bases, orgánicos o inorgánicos, por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia haciendo reaccionar el ácido o la base apropiados con el péptido de la invención.

Adicionalmente, el péptido de la invención puede sufrir modificaciones químicas reversibles con el fin de aumentar su biodisponibilidad (incluyendo la estabilidad y liposolubilidad) y su facilidad de paso de la barrera hematoencefálica y tejido epitelial. Ejemplos de tales modificaciones químicas reversibles incluyen la esterificación de los grupos carboxilato de los aminoácidos glutámico y aspártico con un grupo acetometilo, con lo que se elimina la carga negativa del aminoácido y se incrementa su hidrofobicidad. Esta esterificación es reversible ya que el enlace éster formado es reconocido por esterasas intracelulares que lo hidrolizan devolviendo la carga a los residuos de aspártico y glutámico. E1 efecto neto es una acumulación de péptido intracelular puesto que el péptido internalizado y desesterificado no puede atravesar la membrana

celular.

El péptido de la invención puede obtenerse por métodos convencionales de síntesis química de péptidos en fase sólida siguiendo la metodología basada en Fmoc y/o Boc (16).

Alternativamente, el péptido de la invención se puede obtener por métodos convencionales basados en la tecnología del ADN recombinante, por ejemplo, mediante un método que, brevemente, comprende insertar la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de la invención en un plásmido o vector apropiado, transformar células competentes para dicho plásmido o vector, y crecer dichas células bajo condiciones que permiten la expresión del péptido de la invención y, si se desea, ais'ar y, opcionalmente, purificar el péptido de la invención por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. La secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de la invención puede deducirse fácilmente de la correspondencia existente entre los aminoácidos y los codones de nucleótidos que codifican tales aminoácidos. En este caso, un objeto adicional de esta invención lo constituye una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica el péptido de la invención. En una realización particular, dicho ácido nucleico se selecciona entre ADN monocatenario, ADN bicatenario y ARN. Un objeto adicional de esta invención lo constituyen los plásmidos y vectores de expresión que contienen dicha secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de la invención, así como células procarióticas o eucarióticas que expresan el péptido de la invención. Una revisión de los principios de la tecnología del ADN recombinante puede encontrarse, por ejemplo, en el libro de texto titulado 5xPrinciples of Gene Manipulation : An Introduction to Genetic Engineering", R. W. Old & S. B.

Primrose, editado por Blackwell Scientific Publications, 4a edición (1989).

El péptido de la invención es capaz de inhibir, al menos parcialmente, la exocitosis neuronal, probablemente mediante un mecanismo que implica la interferencia en el ensamblaje del complejo proteico de fusión (SNARE) y/o su desestabilización térmica.

La capacidad de los péptidos de la invención como inhibidores de la exocitosis neuronal (neurosecreción) se puso de manifiesto mediante un ensayo que evalúa la potencia de dichos péptidos en la inhibición de la liberación de catecolaminas inducida por calcio en células cromafines permeabilizadas con un detergente [véase el Ejemplo 1.2.1].

Brevemente, las células cromafines en cultivo se incuban con adrenalina y noradrenalina marcadas con tritio, se permeabilizan con digitonina, se estimulan con calcio y se mide la cantidad de radiactividad liberada por las células al medio extracelular, que constituye un reflejo de la exocitosis de dichas catecolaminas marcadas.

El hexapéptido de la invención [SEC. ID. N° : 2], a una concentración de 1 mM, bloqueó aproximadamente el 20% de la liberación de catecolaminas (adrenalina y noradrenalina) en células cromafines permeabilizadas, mientras que el péptido de 13 aminoácidos [SEC. ID. N° : 3], a una concentración de 1 mM inhibió un 35% aproximadamente de la liberación de catecolaminas en las células cromafines permeabilizadas.

Los péptidos mostrados en SEC. ID. N° : 5 y SEC. ID. N° : 6, procedentes del extremo carboxilo de SNAP-25 [SEC. ID. N° : 4] inhibieron la secreción inducida por Caz'en células cromafines permeabilizadas con digitonina en un 40% aproximadamente cuando se utilizaron a una concentración de 1 mM.

Ensayos paralelos efectuados utilizando conjuntamente, al menos, un péptido procedente del extremo amino de la SNAP- 25, por ejemplo, el péptido de la SEC. ID. N° : 2 o de la SEC.

ID. N° : 3, y, al menos, un péptido procedente del extremo carboxilo de la SNAP-25, por ejemplo, el péptido de la SEC.

ID. N° : 5 o de la SEC. ID. N° : 6, pusieron de manifiesto que el empleo conjunto de, al menos, un péptido procedente del extremo amino de la SNAP-25 y, al menos, un péptido procedente del extremo carboxilo de la SNAP-25, potencia la actividad biológica observada para cada uno de los péptidos ensayados por separado.

En un caso particular, se ensayaron mezclas de péptidos constituidas por uno de los péptidos mostrados en la SEC. ID.

N° : 2 o en la SEC. ID. N° : 3 y uno de los péptidos mostrados en la SEC. ID. N° : 5 o en la SEC. ID. N° : 6, a una concentración de 0,5 mM de cada uno de ellos, obteniéndose un porcentaje de inhibición de liberación de catecolaminas en células cromafines permeabilizadas del 55%.

En su conjunto, estos resultados indican que ambos tipos de péptidos, tanto los procedentes del extremo amino como los procedentes del extremo carboxilo, inhiben la exocitosis de catecolaminas, y que el uso conjunto de péptidos procedentes del extremo amino y del extremo carboxilo potencia la actividad biológica observada para cada uno de ellos por separado.

Por tanto, la invención proporciona, además, una mezcla de péptidos que comprende : (a) al menos un péptido de la invención, y (b) al menos, un péptido que tiene una secuencia de 3 a 30 aminoácidos contiguos contenidos en la SEC. ID. N° : 4 [en adelante, péptido (COOH) para indicar su relación con el extremo carboxilo de la SNAP-25].

En una realización particular, dicha mezcla de péptidos está constituida por, al menos, un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos mostrados en la SEC. ID. ? : 2 y en la SEC. ID. N° : 3, y, al menos, un péptido seleccionado

del grupo formado por los péptidos mostrados en la SEC. ID.

N° : 5 y en la SEC. ID. N° : 6.

La capacidad de los péptidos de la invención de interferir con la formación y la estabilidad del complejo de fusión (SNARE), se puso de manifiesto mediante la realización de unos ensayos de reconstitución in vitro del complejo proteico de fusión con proteínas recombinantes [véase el Ejemplo 1.2.2]. Brevemente, la proteina SNAP-25 se inmovilizó en placas de 96 pocillos, se añadieron las proteínas VAMP y sintaxina en presencia y/o ausencia de los péptidos de la invención y se evaluó la formación del complejo proteico de fusión (SNARE). La detección del complejo se realiza utilizando un anticuerpo contra la sintaxina (anti-sintaxina), seguido de un segundo anticuerpo marcado que reconoce al anticuerpo anti-sintaxina. Los datos obtenidos parecen indicar que la presencia de los péptidos de la invención durante el ensamblaje del complejo de fusión produce una disminución significativa del mismo. Por tanto, el mecanismo de la acción inhibidora de la exocitosis neuronal parece implicar que los péptidos de la invención interfieren en la formación y/o estabilidad del complejo proteico de fusión (SNARE).

Los resultados obtenidos con dichos ensayos sugieren que los péptidos de la invención, unos péptidos de pequeño tamaño, entre 3 y 30 aminoácidos, derivados de la secuencia aminoacídica del extremo amino de la SNAP-25, opcionalmente junto con péptidos procedentes del extremo carboxilo de la SNAP-25, actúan como inhibidores de la exocitosis neuronal.

Dado que estos péptidos imitan las secuencias de proteínas neuronales involucradas en la exocitosis, su actividad es específica puesto que tan sólo interaccionan con las correspondientes proteínas neuronales sin afectar otros componentes celulares.

El mecanismo de acción de los péptidos de la invención

parece ser similar al de las toxinas botulínicas, afectando, por tanto, a la formación y/o estabilidad del complejo proteico de fusión, por lo que se puede considerar que los péptidos de la invención tengan aplicaciones cosmético- terapéuticas similares a las descritas para la toxina botulínica. Por tanto, los péptidos de la invención pueden convertirse en sustitutos efectivos, estables, seguros y económicos de las toxinas botulínicas tanto en el tratamiento de arrugas faciales y/o asimetría facial como en el tratamiento de la sintomatologia de las enfermedades espasmódicas, y su empleo como neuroprotectores en el tratamiento de desórdenes neurológicos y enfermedades neurodegenerativas.

Los estudios realizados por los solicitantes sugieren, además, el concepto innovador del uso simultáneo de péptidos procedentes de los dominios N-terminal y C-terminal de SNAP-25 como moduladores de la exocitosis neuronal.

En su conjunto, los resultados obtenidos con los péptidos de la invención, junto con su estabilidad y simplicidad estructural y la diversidad química que se puede obtener atendiendo a la composición de los extremos amino y carboxilo de la SNAP-25, confieren a los péptidos de la invención un elevado potencial cosmético y/o terapéutico.

Los péptidos de la invención pueden ser utilizados con fines cosméticos y/o terapéuticos mediados por una exocitosis neuronal patológica.

Entre las aplicaciones cosméticas de los péptidos de la invención se encuentran el tratamiento y eliminación, total o parcial, de las arrugas faciales y/o de la asimetría facial en un ser humano.

La invención proporciona una composición cosmética que comprende una cantidad cosméticamente eficaz de, al menos, un péptido de la invención junto con al menos un adyuvante

cosméticamente aceptable. Adicional y opcionalmente, dicha composición cosmética puede contener uno de los péptidos identificados como péptido (COOH).

Para sus aplicaciones cosméticas, los péptidos de la invención pueden aplicarse por cualquier medio que produzca el contacto del péptido con el sitio de acción del mismo en el cuerpo de un mamífero, preferiblemente el ser humano.

La cantidad de péptido cosméticamente eficaz que debe aplicarse asi como su dosificación para el tratamiento de las arrugas faciales y/o de la asimetría facial con los péptidos y/o composiciones cosméticas de la invención dependerá de numerosos factores, incluyendo la edad, estado del sujeto que desea el tratamiento, la severidad de las arrugas y/o de la asimetría facial, la ruta y la frecuencia de aplicación y el péptido particular a utilizar.

Las composiciones cosméticas que contienen los péptidos de la invención pueden presentarse en cualquier forma de aplicación adecuada, por ejemplo, sólida, liquida o semisólida, tales como cremas, pomadas, geles o soluciones, y pueden aplicarse por cualquier via apropiada, preferentemente, por via tópica, para lo cual incluirán los adyuvantes cosméticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada. En una realización particular y preferida, los péptidos de la invención se encapsulan en liposomas, opcionalmente junto con otro u otros péptidos (COOH), que se incorporan a los otros componentes de la preparación cosmética. Una revisión de las distintas formas cosméticas de aplicación de compuestos activos y de los adyuvantes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el libro de texto"Cosmetología de Harry", Wilkinson & Moore, Ed. Díaz de Santos (1990).

Por tanto, un objeto adicional de esta invención lo

constituye el empleo de los péptidos de la invención en la elaboración de composiciones cosméticas para el tratamiento de las arrugas faciales y/o de la asimetría facial.

La invención proporciona también un método para el tratamiento cosmético en un mamífero, preferentemente, en el ser humano, de las arrugas faciales y/o de la asimetría facial que comprende aplicar a dicho mamífero que tiene arrugas faciales y/o asimetría facial, una cantidad cosméticamente eficaz de al menos un péptido de la invención, opcionalmente junto con uno o más péptidos (COOH), preferentemente en forma de una composición cosmética que lo contiene.

Adicionalmente, los péptidos de la invención son adecuados para el tratamiento de las enfermedades espasmódicas, por ejemplo, distonías, estrabismo, blefarospasmo, torticolis, tics, etc.; y/o como neuroprotectores en el tratamiento de desórdenes neurológicos y/o enfermedades neurodegenerativas.

Entre dichos desórdenes neurológicos se encuentran las dolencias neurológicas agudas, por ejemplo, las que tienen lugar en las primeras etapas de la isquemia cerebral. Es conocido que durante un proceso isquémico se produce una liberación incontrolada en la zona afectada del neurotransmisor glutamato. Este neurotransmisor interacciona con receptores específicos de membrana neuronal provocando una entrada masiva de iones calcio al interior de la neurona. E1 calcio intracelular provoca la liberación de más glutamato, desencadenándose de este modo una reacción en cadena. Además, la entrada masiva y prolongada de calcio dentro de las neuronas provoca su muerte lo que se traduce en la aparición de tejido necrótico en la zona isquémica. Claramente, el progreso del dano isquémico puede frenarse, al menos parcialmente, si se controla la exocitosis incontrolada del glutamato. Por tanto, los péptidos de la invención, por su

capacidad de inhibir la exocitosis pueden resultar adecuados para prevenir y/o ralentizar la muerte neuronal característica del proceso isquémico, por lo que son útiles en el tratamiento de neuropatologías que ocurren por una exocitosis excesiva del glutamato como, por ejemplo, demencia senil, demencia de Alzheimer, demencia asociada al SIDA, epilepsia, esclerosis amiotrófica, esclerosis lateral múltiple, etc. En este caso, la aplicación en el tratamiento de dolencias neurológicas sería similar a la descrita para la toxina botulínica A (18).

Los péptidos de la invención podrían formar parte, por tanto, de una terapia combinada (dirigida a varias dianas terapéuticas) cuyo objetivo fuese frenar más eficazmente la neurodegeneración.

Un objeto adicional de esta invención lo constituye una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un péptido de la invención junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una realización particular, dicha composición farmacéutica contiene, además, uno o más péptidos (COOH). Alternativamente, la composición farmacéutica de la invención puede contener una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector que contiene, al menos, una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de la invención, junto con al menos un adyuvante y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vector puede ser utilizado en terapia génica.

Los productos activos de la invención (péptidos o vectores) pueden administrarse para el tratamiento de la exocitosis neuronal patológica, manifestada, por ejemplo, por enfermedades espasmódicas, desórdenes neurológicos o enfermedades neuro-degenerativas, por cualquier medio que produzca el contacto del péptido con el sitio de acción del mismo en el cuerpo de un mamífero, preferiblemente el ser humano.

La cantidad de producto activo de la invención [péptidos o vectores (construcciones)] terapéuticamente eficaz que debe administrarse así como su dosificación para tratar un estado patológico con los péptidos y/o composiciones farmacéuticas de la invención dependerá de numerosos factores, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, la ruta y frecuencia de administración y el péptido particular a utilizar.

Las composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos o los vectores (construcciones) de la invención pueden presentarse en cualquier forma de administración apropiada, por ejemplo, sólida, liquida o semisólida, tales como pomadas, cremas, geles o soluciones, y pueden administrarse por cualquier via apropiada, por ejemplo, por via oral, parenteral o tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el"Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S. A. Ediciones, Madrid.

Como se ha mencionado previamente, los péptidos de la invención podrían formar parte de una terapia combinada con el fin de frenar la neurodegeneración de forma más eficaz. En este caso, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende, al menos un péptido de la invención, opcionalmente junto con otro u otros compuestos inhibidores de la exocitosis neuronal, y junto con, al menos, un fármaco destinado a otra diana terapéutica, seleccionado del grupo formado por un bloqueante de los receptores de glutamato neuronales, un agente quelante de calcio, un antioxidante, un destructor de radicales libres y sus mezclas.

En una realización particular, dicha composición útil en una terapia combinada puede contener, al menos, un péptido de la invención, opcionalmente junto con otro u otros compuestos capaces de inhibir la exocitosis neuronal y un bloqueante de los receptores de glutamato neuronales. En otra realización de esta invención dicha composición podría contener, al menos, un péptido de la invención, opcionalmente junto otro u otros compuestos capaces de inhibir la exocitosis neuronal, un bloqueante de los receptores de glutamato neuronales, un agente quelante de calcio, un antioxidante y/o un destructor de radicales libres. Entre los compuestos capaces de inhibir la exocitosis neuronal se encuentran los péptidos procedentes del extremo carboxilo de la SNAP-25 identificados como péptidos (COOH). Otros muchos ejemplos de composiciones pueden ser planteados, teniendo todos ellos en común la necesidad de controlar la exocitosis de neurotransmisores.

Un objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de los péptidos de la invención o de vectores que contienen al menos una secuencia que codifica un péptidos de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y/o alteraciones patológicas mediadas por la exocitosis neuronal patológica, por ejemplo, enfermedades espasmódicas, desórdenes neurológicos y/o enfermedades neurodegenerativas.

La invención proporciona, además, un método para el tratamiento en un mamífero de enfermedades y alteraciones patológicas mediadas por la exocitosis neuronal patológica, por ejemplo, enfermedades espasmódicas, desórdenes neurológicos y/o enfermedades neurodegenerativas, que comprende administrar a dicho mamífero que padece dicha enfermedad o alteración patológica una cantidad terapéuticamente eficaz de, al menos, un péptido de la invención, o de un vector que contiene al menos una secuencia

de ADN que codifica un péptido de la invención, preferiblemente, en forma de una composición farmacéutica que lo contiene. En una realización particular de esta invención dicha composición farmacéutica contiene, además del péptido o péptidos de la invención, uno o más péptidos (COOH).

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.

EJEMPLO 1 Péptidos inhibidores de la exocitosis de neurotransmisores 1.1 Síntesis de péptidos Se han sintetizado los péptidos mostrados en SEC. ID. N° : 2, SEC. ID. N° : 3, SEC. ID. N° : 5 y SEC. ID. N° : 6 mediante métodos convencionales de síntesis de péptidos en fase sólida utilizando la metodología sintética basada en Fmoc y/o Boc (16). Los péptidos resultantes se purificaron por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) y se analizaron por espectrometría de masas.

1.2 Evaluación de la actividad biolóqica Para evaluar la actividad biológica de los péptidos obtenidos en el Ejemplo 1.1 se desarrolló un ensayo que evalúa la potencia de dichos péptidos en la inhibición de la liberación de catecolaminas inducida por calcio en células cromafines y un ensayo de reconstitución in vitro del complejo de fusión (SNARE).

1.2.1 Inhibición de la liberación de catecolaminas Se realizó este ensayo para comprobar la capacidad de los péptidos sintetizados en el Ejemplo 1.1 como inhibidores de la exocitosis neuronal. En este ensayo se evalúa la potencia de dichos péptidos en la inhibición de la liberación de

catecolaminas (noradrenalina y adrenalina) inducida por calcio en células cromafines (obtenidas de glándulas suprarrenales bovinas) permeabilizadas con el detergente digitonina, según el método descrito por Gutiérrez et al. (1995 y 1997).

Brevemente, las células cromafines en cultivo se incuban con [3H]-adrenalina y [3H]-noradrenalina, se permeabilizan con digitonina 20 pM, y se estimulan con calcio (10 FM), en presencia de los péptidos a ensayar (separados o mezclados), y se mide la cantidad de radiactividad liberada por las células al medio extracelular, lo que constituye un reflejo de la exocitosis de [3H]-adrenalina y [3H]-noradrenalina.

Los resultados obtenidos en la inhibición de la liberación de catecolaminas en células cromafines permeabilizadas fueron los siguientes : a) el péptido de la SEC. ID. N° : 2, procedente del extremo amino de la SNAP-25, a una concentración de 1 mM, bloqueó aproximadamente el 20% de la liberación de catecolaminas en células cromafines permeabilizadas; b) el péptido de la SEC. ID. N° : 3, procedente del extremo amino de la SNAP-25, a una concentración de 1 mM, inhibió aproximadamente un 35% de la liberación de catecolaminas en células cromafines permeabilizadas; c) los péptidos de las SEC. ID. N° : 5 y SEC. ID. N° : 6, procedentes del extremo carboxilo de la SNAP-25, a una concentración de 1 mM, inhibieron la secreción inducida por Ca2'en células cromafines permeabilizadas con digitonina en un 40% aproximadamente; y d) mezclas de péptidos constituidas por uno de los péptidos mostrados en la SEC. ID. N° : 2 o en la SEC. ID. N° : 3 y uno de los péptidos mostrados en la SEC. ID. N° : 5 o en la SEC. ID. N° : 6, a una concentración de 0,5 mM de cada de ellos, inhibieron la liberación de catecolaminas en células cromafines permeabilizadas en un 55% aproximadamente.

En su conjunto, estos resultados indican que ambos tipos de péptidos, tanto los procedentes del extremo amino como los procedentes del extremo carboxilo, inhiben la exocitosis de catecolaminas, y que el uso conjunto de péptidos procedentes del extremo amino y del extremo carboxilo potencia la actividad biológica observada para cada uno de ellos por separado.

1.2.2 Reconstitución in vitro Se realizó este ensayo para determinar la capacidad de los péptidos obtenidos en el Ejemplo 1.1 de interferir con la formación y la estabilidad del complejo de fusión (SNARE). El ensayo consiste en evaluar la reconstitución in vitro del complejo proteico de fusión con proteínas recombinantes producidas en Escherichia coli. Los ensayos de reconstitución basados en métodos de ELISA (Enzyme-Linked Immuno Assay), implican la inmovilización de la proteína SNAP-25 en placas de 96 pocillos y la subsiguiente formación del complejo proteico de fusión añadiendo las proteínas VAMP y sintaxina en presencia y/o ausencia de los péptidos de la invención. La detección del complejo se realiza utilizando un anticuerpo contra la proteína sintaxina (anti-sintaxina), seguido de un anticuerpo que reconoce al anticuerpo anti-sintaxina marcado covalentemente con una peroxidasa. La cantidad de complejo proteico de fusión se siguió anadiendo dicloruro de 1,2- fenilneodiamina cuya reacción con la peroxidasa origina un producto con color amarillento-anaranjado que absorbe a 492 nm en medio ácido.

Los datos obtenidos pusieron de manifiesto que la presencia de los péptidos obtenidos en el Ejemplo 1.1 durante el ensamblaje del complejo de fusión produce una disminución significativa del mismo. Por tanto, el mecanismo de acción de dichos péptidos parece implicar la interferencia de tales

péptidos en la formación y/o estabilidad del complejo proteico de fusión (SNARE).

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