[定義]
 糖尿病性神経障害とは、糖尿病がもとにな� ��て起こる合併症の一つであり、末梢神経障� ��と自律神経障害のことである。臨床的には� ��期には手足などのしびれや痛み、慢性期に� ��感覚麻痺、運動神経失調を引き起こす障害� ��ある。病理学的には、神経組織のミエリン� ��と軸索の変性と損傷が挙げられる。これら� ��神経障害は、末梢神経伝導速度の低下、神� ��軸索膜由来ナトリウム/カリウムATPase(Na, K-A TPase)活性の低下として観察、定量することが できる。

 糖尿病性神経障害の改善効果とは、発芽� ��米由来ASG又は発芽玄米由来ASGの有効成分が� ��する効果であって、人又は動物の個体、組� ��又は細胞において、糖尿病性神経障害を原� ��として低下したナトリウム/カリウムATPase活 性又はHTase活性を正常値に近づけるべく上昇� ��せる効果あるいは運動神経伝導速度の低下� ��防止する効果をいう。

 本発明でいう神経障害とは、糖尿病性神� ��障害と同一又は類似の生理学的、細胞組織� ��的、又は生化学的所見を示す病態をいうが� ��糖尿病を原因とするものに限られない。す� ��わち、中枢および末梢神経において、病理� ��織学的には、特に、神経軸索の損傷、ミエ� ��ン鞘脱髄、神経生理学的には、運動神経伝� ��速度の低下、生化学的には、神経膜由来ナ� ��リウム/カリウムATPase活性の低下、又は血清 中の高密度リポ蛋白(HDL)分画に含まれているH Tase活性の低下として観察、定量することが� �きる全ての神経障害をいう。

 HTaseとは、動脈硬化の危険因子であるホ� �システイン・チオラクトン(homocysteinethiolacton e)の加水分解酵素のことであり、パラオキソ� ��ーゼ(paraoxonase)ファミリーに分類される。神 経障害を伴った患者ではパラオキソナーゼ活 性が低下することが報告されていることから (非特許文献6参照)、HTase活性の低下は動脈硬� ��の危険因子となるだけではなく、神経障害� ��進行程度にも関連すると考えられている。

[実験材料及び方法]
<発芽玄米>
 公知の方法(特許文献1-3参照)により調整し� �。

<分画-脂質画分の抽出>
 脂質画分は5gの発芽玄米あるいは玄米の糠� �ら、30ml及び20mlのクロロホルム・メタノール (1:1及び2:1、容積比)を用いて2回抽出して脂質 画分とした。

<分画-シリカゲルクロマトグラフィー>
 糖脂質の組成分析と各成分の精製
 発芽玄米および玄米の脂質画分をさらにシ� ��カゲルカラムクロマトグラフィー(1x15 cm)に かけ、溶媒クロロホルム:ヘキサン(1:1) 40 ml� ��クロロホルム:ヘキサン(9:1) 70 ml を通液し て得た分画をFr.1とする。引き続き、溶媒ク� �ロホルム:メタノール(9:1)80 mlを通液して得� �分画をFr.2とする。さらに溶媒クロロホルム: メタノール:水(7:3:0.1) 80 ml、溶媒クロロホル ム:メタノール:水(3:6:0.8)120 mlを通液して得た それぞれの分画をFr.3とFr.4とする。各分画を� ��ータリーエバポレーターで濃縮乾固した。� ��分画1 μgをシリカゲルはく層(TLC)プレート� �スポットして、溶媒クロロホルム:メタノー� ��:水(70:30:0.1)にて展開する。展開後、TLCプレ� ��トにオルシノール試薬をスプレーする。TLC� ��レートをホットプレートに載せ110℃で5分間 加熱する。オルシノール発色で検出された各 糖脂質成分をデンシトメータで定量して組成 を求めた。

 A2画分の精製
 発芽玄米および玄米の糠の抽出分離画分Fr.2 およびFr.3に含まれる各糖脂質成分(A2, A4, B1,  B2, B3, B4, B5)をさらにシリカゲルカラムク� ��マトグラフィー(1x15cm)にかけ、溶媒(クロロ� ��ルム:メタノール:水(70:30:0.1)、流速0.2ml/min)� �用いてフラクションコレクターで単離精製� �した。

<アルカリ分解>
 A2 (0.1mg)に0.5 mlの0.5 M NaOH /メタノール:水 (4:1)を加えて溶解して室温で20時間撹拌する� �撹拌後に、2.5 mlのクロロホルム:メタノール (2:1)を加えてフォルチ分配をおこなう。
下層を集めて、濃縮する。分配した下層を少 量のクロロホルムTLCプレートにスポットして 、溶媒 クロロホルム:メタノール:水(70:30:0.1) にて展開する。展開後、TLCプレートにオルシ ノール試薬をスプレーする。TLCプレートをホ ットプレートに載せ110℃で5分間加熱する。� �ルシノール発色させ、アルカリ処理前後のA2 およびA4のTLC展開移動度を比較した。

<分画-薄層クロマトグラフィー>
 シリカゲルをコートした市販の縦10 cm のTL Cプレート(Silica gel 60, Merck)の下より1.5cmの� �置にマイクロシリンジでサンプルを塗布す� �。展開溶媒クロロホルム:メタノール:水(70:30 :0.1)にて展開した。展開後風乾した。

<オルシノール(orcinol)染色>
 0.2%オルシノール/2N硫酸をスプレーによりTLC プレートに均一にスプレーする。スプレーを 受けたTLCプレートを110℃に熱されたホットプ レート上で加熱する。TLCプレート上で分離し た糖を含む各成分は特異的な小豆色の発色を 呈することで同定された。

<ガスクロマト質量分析法(GCMS)>
 A2(50μg)を1.0mlの1 N 塩酸/メタノールに溶か� ��、86℃で16から24時間、加水分解した。反応� ��、室温まで冷却した後に、1.0 mlのヘキサン を加えて撹拌、遠心して2層に分離した。下� �
に再び1.0 mlのヘキサンを加えて2層分離を行� ��た。さらに下層に対してもう一回2層分離を おこなった。ヘキサンを多く含む上層のみを 集めて窒素ガスで乾燥させて脂肪酸分画とし た。ヘキサン層は脂肪酸のGCMS分析に用いら� �た。一方、残った塩酸メタノール層に等量� �エチルエーテルを加えて2層分配をおこなっ� ��。エーテル層は窒素ガスで乾燥させてステ� ��ール分画としてステロールのGCMS分析に用い られた。GCMS分析はHewlett-PackardGC-MS (5972 MS &a mp; 5890 GC)に装着したキャピラリーカラム DB -1 (50 m X0.25 mm)によって実施された。脂肪� �の分析は初期温度70℃(5分), 10℃/分(18分), � �温度250℃(15分)の10℃/分のグラデイエント昇� ��プログラムで実施された。ステロールの分� ��は初期温度70℃ (1分),10℃/分(18分), 終温度2 50℃(21分)のグラデイエント昇温プログラムで 実施された。

<核磁気共鳴分析法(NMR)>
 A2(1.0 mg)を0.5 mlのCD ₂ Cl ₂ に溶解して予備的なNMRデータを取った後に、 CD ₂ Cl ₂ を窒素ガスで乾燥除去した。再び0.5mlのCDCl ₃ に溶解して本格的な測定をおこなった。デー タは25℃で800 MHzと900MHzでおこなった。デー� �の収集は ¹ HNMRのスペクトラムに加えて、2次元スペクト� ��[COSY、HSQC(carbon-proton one-bond correlated data)、 HMBC(carbon-proton multiple bond correlated data)]でも 収集された。

<リポタンパク質の分離>
 リポタンパク質は以前に報告された手順(非 特許文献8参照)で準備した。簡単に述べると� ��正常ラットから採取した新鮮な血清を集め� ��固体KBrを用いて密度を1.3g/mlに合わせた。上 記の調製した血清(1.5ml、1.3g/ml)の上に通常の� ��理食塩水(3.5ml、1.006g/ml)を重層し、超遠心に より遠心管の中に不連続の密度勾配を作製し た。リポタンパク質はTV865ローターで369548g、 4℃、45分間の超遠心により分離した。3種の� �なリポタンパク質画分(VLDL、LDL、HDL)を回収� �、PBSに対して4℃で一晩透析した。本明細書� ��おいてはLDLは当該方法で得られた画分を意� ��する。

<HTase活性測定>
 ラット血清HDL中のHTase活性は市販の測定キ� �トを用いて測定した(AlfresaAuto HTLase; Alfresa  Pharma Corp., Osaka, Japan)。このキットはγ-チオ ブチロラクトン(thiobutyrolactone)を基質として� �用する。HTaseはラクトン環を加水分解し、遊 離チオール(thiol)基を生成する。チオール基� �5,5'-ジチオビス(5,5'-dithiobis(2-netrobenzoic acid))� ��反応することにより、450nmの吸収で測定さ� �る5-チオ-2-ニトロベンゾイック酸(5-thio-2-netro benzoicacid)を生成した。450 nmの吸収を測定し� �酵素活性を算出した。

<ナトリウム/カリウムATPase活性のための粗� ��製坐骨神経膜の調製>
 粗精製膜は以前に報告された手順(非特許文 献7参照)により調製した。簡単に述べると、� ��ットの坐骨神経を、冷却等浸透圧溶液(250mM� �スクロース、10mMHEPES-Tris緩衝液(pH7.6)、2mM EDT A、1mM PMSF)中で破砕均質化した。当該均質化� ��た液を10分間4℃で3000rpmで遠心分離し、上澄 み液を回収し、さらに45分間45000rpmで遠心分� �した。上澄み液を捨てた後に、沈殿を100μl� �250mMスクロース溶液(10mMHEPES-Tris緩衝液(pH7.6)� �溶解)に懸濁した。

<ホモシステイン・チオラクトン修飾LDLの� �整>
 試験管内でのLDLのホモシシテイン・チオラ� ��トン化は以前に報告された実験条件で行っ� ��(非特許文献5)。簡単に述べると、適量のLDL� ��液(LDLタンパク質、100μg)を10 mM PBS (pH8.2)に 懸濁し、全体を37℃で優しく掻き混ぜながら� ��モシシテイン・チオラクトン(100μmol/L)及び� ��示した量の全脂質画分(TLp)あるいはASG(0.01か ら10.0μg)と2時間インキュベートした。インキ ュベート後に、未反応のホモシシテイン・チ オラクトンを除去するために、10mM PBS (pH8.2) で平衡させたBio-gelP-2カラムに当該混合液を� �過した。

<Na/K ATPase活性測定>
 ナトリウム/カリウムATPase活性は以前の報告 (非特許文献7参照)のように測定した。簡単に 述べると、ナトリウム/カリウム依存的活性� �測定するためのナトリウム/カリウムATPase活� ��測定溶液(0.2ml)の組成は10mMMgCl ₂ 、20mM HEPES-Tris(pH7.0)、120mM NaCl、30mM KCl、0.5mg /mlの粗精製膜タンパク質、及び25mM[γ- ³² P]ATP(10,000cpm)であった。測定溶液を37度で15分� ��ンキュベートした後、0.1mg/mlの活性炭を加� �、15,000rpmで15分間遠心分離した。上澄み液を 回収し、無機の ³² P放射活性をシンチレーションカウンターで� �定した。

[結果及び考察]
<発芽玄米由来の有効成分の分画>
 発芽玄米の糠の層に含まれる脂質画分をフ� ��クション1、2、3及び4に分画し、さらに薄層 クロマトグラフィーを用いて分画することに より、非特許文献5で示された糖尿病性神経� �害の改善機能を有する有効成分はAcylatedsteryl -β-glucoside(ASG)であることが判明した。

 有効成分が単一の画分A2(以下、A-2と表記� ��る場合もあるが、特に区別しない)にのみ含 まれていたことは特筆すべきことである。す なわち、発芽玄米のような天然の食品に特定 の薬学的効果が認められた場合に、複数の因 子が協同的に働いて効果を発揮していたとし ても不思議は無いからである。なお、単一の 画分A2は複数種類のASGを含んでいたが、薄層� ��ロマトグラフィーを用いた分画ではそれぞ� ��を分離することは出来なかった。これは、� ��れぞれのASGの構造及び化学的性質が互いに� ��似しているからと考えられる。

 本明細書で「ASG」というときは、一般名称� ��してのASGを表す。「発芽玄米由来(の)ASG」� �いうときは、A2画分に相当する複数種類のASG の集合を表す。ただし、文脈上明らかな場合 には「ASG」がA2画分に相当する複数種類のASG� ��集合を表すこともある。
 本発明は当該発芽玄米由来のASGに関するも� ��であり、また、当該発芽玄米由来のASGを用� ��た糖尿病性神経障害の改善又は予防剤に関� ��るものである。

<発芽玄米由来の有効成分の同定>
 A2画分についてNMRを用いて解析を行った結� �、予想通り、A2画分はASGで構成されることが 確認され、A2を構成するASGのステロールはCamp esterol、Stigmasterol、5α-cholest-8(14)-en-3β-ol及びβ -Sitosterolであることが判明した。また、A2を� �成するASGの脂肪酸はパルミチン酸(16:0、以下 略号で示すことがある。他の脂肪酸について も同じ。)、ステアリン酸(18:0)、2-ヒドロキシ -オクタデカン酸(18:0(2h))、オレイン酸(18:1)、� ��ノール酸(18:2)及びリグノセリン酸(24:0)であ� ��ことが判明した。ASGの一般構造及びA2を構� �するASGのステロールの構造を図1に示す。

 図1から分かるように、A2画分のASGは、糖( Sugar)の骨格に上記4種類のステロールの何れ� �が結合し、かつ、上記6種類の脂肪酸の何れ� ��が結合している。理論的には24種類の組み� �わせがあり、したがって、24種類のASGが含ま れうるが、現実のA2画分のASGはより少ない種� ��に限定されている可能性がある。なお、糖� ��ステロールの結合様式にはα結合とβ結合が あるが、発芽玄米由来ASGの場合にはβ結合の� ��であることが判明した(下記を参照)。

<発芽玄米由来ASGのHTase活性に対する効果> ;
 HTaseとは、動脈硬化の危険因子であるホモ� �ステイン・チオラクトン(homocysteinethiolactone)� ��加水分解酵素のことであり、パラオキソナ� ��ゼ(paraoxonase)ファミリーに分類される。神経 障害を伴った患者ではパラオキソナーゼ活性 が低下することが報告されていることから(� �特許文献5参照)、HTase活性の低下は動脈硬化� ��危険因子となるだけではなく、神経障害の� ��行程度にも関連すると考えられている。本� ��発明のASGはラット血清LDL中のHTase活性を上� �させることから、神経障害の改善又は予防� �としての機能を有することを示唆する。

<発芽玄米由来ASGに特異的なHTase活性に対す る効果>
 発芽玄米由来ASG(ASG)を加えた場合には量依� �的なHTaseの活性上昇が見られるのに対して、 SG(発芽玄米由来ASGから脂肪酸を除去したもの )及び大豆由来ASG(S-ASG)を加えた場合にはHTase� �活性上昇は見られなかった(表6)。このこと� �、量依存的にHTaseの活性を上昇させる効果は 、発芽玄米由来ASGに特異的なものであること を示している。

<発芽玄米由来ASGの神経障害の改善効果>
 神経障害は、末梢神経伝導速度の低下又は� ��経軸索膜由来ナトリウム/カリウムATPase(Na,  K-ATPase)活性の低下として観察、定量できるこ とが知られているが(非特許文献5及び9)、本� �究においては、多数のサンプルを処理する� �めの利便性等の観点から、ナトリウム/カリ� ��ムATPase活性を神経障害の指標として用いた� ��即ち、ナトリウム/カリウムATPase活性がより 低い方が、神経障害の程度が重篤であること を示す。

 神経軸索膜由来ナトリウム/カリウムATPase活 性の低下は、ホモシステイン・チオラクトン によってLDLが修飾されLDLの機能が阻害される ことが原因であると考えられている。本研究 においては、神経障害を再現するために、健 常ラットから調整した粗精製坐骨神経膜のナ トリウム/カリウムATPase活性をホモシステイ� �・チオラクトン修飾LDL(HT-modifiedLDL)存在下で� ��定した。
 ホモシステイン・チオラクトン修飾LDL(HT-mod ified LDL)存在下において、発芽玄米由来ASGは� ��経軸索膜由来ナトリウム/カリウムATPase(Na/KA TPase)活性を量依存的に上昇させた(図2)。この ことから、発芽玄米由来ASGが神経障害を改善 させる機能を有することが示された。

<発芽玄米由来ASGに特異的な神経障害の改� �効果>
 発芽玄米由来ASG(ASG)を加えた場合には量依� �的なナトリウム/カリウムATPaseの活性上昇が� ��られるのに対して、SG及び大豆由来ASG(S-ASG)� ��加えた場合にはナトリウム/カリウムATPaseの 活性上昇は見られなかった(表7)。このことは 、量依存的にナトリウム/カリウムATPaseの活� �を上昇させる効果は、発芽玄米由来ASGに特� �的なものであることを示している。

<発芽玄米由来ASGの有効成分(S-ASGとの比較)& gt;
 前述のように、発芽玄米由来ASGは単一のASG� ��はなく、複数種類のASGの混合物である(表4� �び表5)。発芽玄米由来ASGには、ステロール部 分としてCampesterol、Stigmasterol、β-Sitosterol又は 5α-cholest-8(14)-en-3β-olを有するものが含まれて いる。一方、大豆由来ASGにはステロール部分 としてCampesterol、Stigmasterol又はβ-Sitosterolを有 するものしか含まれていない。これは、発芽 玄米由来ASGの真の有効成分が、ステロール部 分として5α-cholest-8(14)-en-3β-olを有するASGであ る可能性を強く示唆する。理論的には、弱い 作用を有する複数の因子が協働的に作用して 強い効果を生み出すこともあり得るが、現実 的には考えにくい。

 また、発芽玄米由来ASGには、脂肪酸部分� ��して16:0、18:0、18:0 (2h)、18:1、18:2又は24:0を� ��するものが含まれている。一方、大豆由来A SGには脂肪酸部分として16:0、18:0、18:1、18:2、 22:0(ベヘン酸)又は24:0を有するものしか含ま� �ていない。これは、発芽玄米由来ASGの真の� �効成分が、脂肪酸部分として18:0(2h) を有す� ��ASGである可能性を強く示唆する。やはり、� ��論的には、弱い作用を有する複数の因子が� ��働的に作用して強い効果を生み出すことも� ��り得るが、現実的には考えにくい。

 したがって、発芽玄米由来ASGに含まれる� ��の有効成分は、ステロール部分として5α-cho lest-8(14)-en-3β-olを有するか又は脂肪酸部分と� ��て18:0(2h) を有するASGである可能性が極めて 高い。理論的には、発芽玄米由来ASGには4×6=2 4種類のASGが含まれうるが、本研究によれば� �発芽玄米由来ASGに含まれる真の有効成分の� �補は、6+4-1=9種類のASGに限定される。即ち、� ��テロール部分として5α-cholest-8(14)-en-3β-olを� ��しかつ脂肪酸部分として16:0、18:0、18:0(2h)、 18:1、18:2又は24:0を有する6種類のASG、又は、� �テロール部分としてCampesterol、Stigmasterol、β- Sitosterol又は5α-cholest-8(14)-en-3β-olを有しかつ� �肪酸部分として18:0(2h)を有する4種類のASGで� �る(1種類は重複してカウントされている)。

 本願発明は、この発芽玄米由来ASGの真の� ��効成分に関するものであり、真の有効成分� ��含む発芽玄米由来ASGに関するものである。

<発芽玄米由来ASGの有効成分(SGとの比較)>
 本研究では、発芽玄米由来ASGを加水分解し� ��脂肪酸部分を除去することにより調整したS Gとの比較も行った。脂肪酸部分を失ったSGは 神経障害の改善作用を有さず(表6及び表7)、� �肪酸部分の存在は必須であることが分かっ� �。

<産業上の応用>
 本発明の発芽玄米由来ASG(単一又は複数種類 )は、上記の方法により得られた画分をその� �ま直接使用してもよいが、一般的には適当� �液体に溶解するかもしくは分散させ、また� �、適当な粉末担体と混合するかもしくはこ� �に吸着させ、場合によっては、さらにこれ� �に乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透� �、湿潤剤、安定剤等を添加し、乳剤、油剤� �水和剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤等� �製剤として使用する。

 製剤として使用する場合における、画分の� ��用量は製剤の形態によっても異なるが、有� ��な投与量であれば良く、安全性に問題がな� ��ので特に上限は規定しない。
 また、本発明でいう機能性食品とは、発芽� ��米由来ASGを有効成分とし、神経障害を予防� ��る機能又は改善する機能を有する食品、あ� ��いは食品の摂取によりこれらの機能の発揮� ��期待される食品をいい、健康食品、特定保� ��用食品、栄養機能食品のいずれをも含む。

 食品としては、チューインガム、キャン� ��ィ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビ� ��ケットまたはスナック等の菓子、アイスク� ��ーム、シャーベットまたは氷菓等の冷菓、� ��料、プリン、ジャム、乳製品、調味料等が� ��げられ、これらの食品を目常的に摂取する� ��とが可能である。これらの食品に対する本� ��明の脂質画分の添加量としては、食品の形� ��によっても異なるが、安全性に問題がない� ��でその濃度に上限を設ける必要はない。

[参考例1]
[発芽玄米由来の有効成分の分画]
 実験材料及び方法に記載の方法で発芽玄米� ��質画分をフラクション1、2、3及び4(Fr1, Fr2,� �Fr3 Fr4)に分画した。各フラクションについ� �HTase活性測定を行ったところ、Fr2が活性を有 し(表1)、糖尿病性神経障害を改善する機能を 有する有効成分は当該Fr2に含まれることが分 かった。即ち、添加物(Additive)として1.0μgのFr .2を添加した場合にのみ、何も添加しない場� ��(None)と比較してHTaseの活性の上昇が観察さ� �た。

 各フラクションを更に薄層クロマトグラ� ��ィー(thin layer chromatography, TLC)を用いて分� �し、オルシノール(Orcinol)染色した結果を図3A に示す。Fr1、Fr2、Fr3の順に、TLC展開の上から 下へ向かって極性の異なる成分が移動度の順 に溶出されていることが観察される。GSLStを� ��ーカーとして用いた。Fr2及びFr3の主要なバ� ��ドを上から順に、それぞれ、A1-A5及びB1-B5と 名づけた。各バンドについてHTase活性測定を� ��ったところ、A2が活性を有し(表2)、糖尿病� �神経障害を改善する機能を有する有効成分� �当該A2に含まれることが分かった。即ち、添 加物(Additive)として0.1μgのA2(発芽玄米の脂質(T Lp)由来)を添加した場合にのみ、何も添加し� �い場合(None)と比較して顕著なHTaseの活性の上 昇が観察された。なお、通常の玄米の脂質(TL b)を分画した場合にはA2に相当するバンドは� �られなかった(ND、notdeterminedの略)。

 精製したA2、A4及びアルカリ処理したA2に� ��いて、TLC展開した結果を図3Bに示す。A2をア ルカリ処理するとA4と同じ移動度を示す。A4� �アルカリ処理によって移動度が変化しなか� �た。Matreya社から市販されている大豆由来のA SGがA2と同じ移動度を示し、アルカリ処理す� �ことでA4と同一の移動度を示すようになった 。さらに、図4に示すようにヘリコバクター� �(Helicobacterpylori)由来の脂質H4(Acylated steryl-β-g lucoside)と同じ移動度を示すことが分かった。 H4もアルカリ処理によってヘリコバクター菌� ��来のH6と同じ移動度を示すようになった。A4 とH6とを比較した場合には、僅かに移動度が� ��なっていたが、ほぼ同じ移動度を示した。� ��のことからA2もH4もA4とH6がアシル化した構� �であるということが判明した。移動度のわ� �かな相違はSteryl-β-glucosideとSteryl-β-glucosideの 相違点、β結合かα結合であるかという立体� �性体の特性によって起こったと考えられる� �即ち、A2はAcylatedsteryl-β-glucosideであることが 分かった。ASGは図1の一般式で示され、中心� �なる糖にステロールと脂肪酸(図中Rで表す)� �結合した構造を有する。