Die Erfindung betrifft neue polycyclische Phthalazinderi¬ vate, speziell 2-carboxyalkyl- und 2-carboxyaryl-substi- tuierte Maduraphthalazine (10, 12, 15, 16-Tetrahydroxy-8-me- thoxy-ll-methyl-1, 9, 14-trioxo-l, , 6, 7, 9, 14-hexahydro- naphtaceno- [1, 2-g]-phthalazine) sowie deren Salze, Ester und Amide. Sie stellen stark antibakterielle, insbeson¬ dere gegen grampositive, speziell gegen multiresistente Staphylokokken (MRSA) und resistente Enterokokken, wirk¬ same Substanzen dar, die zur Bekämpfung von Infektions- Krankheiten bei Menschen und Tieren verwendbar sind. Die Verbindungen sind für die Herstellung verschiedenster

pharmazeutischer Zubereitungen und Appli ationsformen ge¬ eignet.

Die Verbindungen sind erste Vertreter eines bisher unbe- kannten Ringsystems, des Naphthaceno- [1, 2-g] -phthalazins . Sie leiten sich von Madurahydroxylakton bzw. Maduransaure ab, welches aus Actinomadura rubra biotechnologisch ge¬ winnbar ist (W. Fleck, D. G. Strauss, J. Meyer, Z. Allg. Mikrobiol. .18, 368 - 398 (1978)) . Die Struktur des Madurahyroxylaktons (Formel II) wurde von Paulus und Mitarbeitern aufgeklärt (E. F. Paulus, K. Dornberger, W. Werner, D. Fenske, Acta Cryst. (1994) C50, 2064 - 2067) . Madurahydroxylakton selbst besitzt nur un¬ genügende biologische Wirksamkeit. Madurahydroxylakton gehört zu der Klasse der Benzonaphthacenchinone, unter denen in letzter Zeit insbesondere die Benanomycine und Pradimycine als interessante antifungale Substanzen be¬ kannt geworden sind (T. Oki in "Recent Proqress in Anti- fungal Chemotherapy", Eds . H. Yamaguchi, G. S. Kobayachi, H. Takahashi, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong, 1992, S. 38) .

Die Erfindung dient zur Bereitstellung von 2-substituιer- ten, speziell 2-carboxyalkyl- und 2-carboxyaryl-substitu- ierten Maduraphthalazinen (10, 12, 15, 16-Tetrahydroxy-8- methoxy-ll-methyl-1, 9, 14-trioxo-l, 2,6,7,9, 14-hexahydro- naphthaceno- [1, 2-g] -phthalazinen) und entsprechenden Sal¬ zen, Estern und Amiden sowie zu ihrer Verwendung. Mit den Verbindungen wird angestrebt, die Palette antibakteriel- 1er, speziell gegen grampositive Bakterien, besonders gegen multiresistente Staphylokokken wirksamer Präparate zu vergrößern. Für die Losung dieser Aufgabe sind die neuen Verbindungen deshalb von Vorteil, wei 1 die bisher bekannten Antibiotika bzw. Antiinfektiva große Nachteile, wie z. B. ungenügende Wirksamkeit gegenüber resistenten Bakterienstammen, aufweisen (W. Witte, C. Braulke, D. Heuck, C. Cuny; "Λnalysis of nosocomial outbreaks with

multiply and methJ-cillin resistent staphylococcυs aureus (MRSA) in Germany: implications for hospital Hygiene", Infection 22, (1994), Suppl . 2, 128 - 134; G. M. Eliopu- los, "Increasing problems in the therapy of enterococcal infection", Eur. J. Clin. microbiol. Infect. Dis. 2, (1993) 409 - 412.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereit ^¬ stellung von neuen polycyclischen Phthalazinen der Formel I

worin R^ - Carboxyalkyl oder Carboxyaryl bedeutet und R und R ³ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Acyl stehen, sowie Salze, Ester und Amide von Verbindungen der Formel I, mit der Maßgabe, daß R^ von gegebenenfalls sub¬ stituiertem Carboxyphenyl verschieden ist, wenn R ³ Ci-g-Alkanoyl bedeutet.

Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet Alkyl (auch in Wort- Kombinationen wie Alkoxy oder Carboxyalkyl) C _[ _-i _Q -Alkyl, geradkettig oder verzweigtkettig, vorzugsweise C]__4~Alkyl, während unter einem Arylrest (auch einem der weiter unten genannten Arylreste oder in Wortkombinatio¬ nen wie Aralkyl) substituiertes oder unsubstituiertes Aryl, insbesondere entsprechendes Phenyl, dessen Substi- tuenten OH, OAlkyl, OAryl, Halogen, Alkyl, Aryl sein kon-

nen, verstanden wird. Acyl ist im Ralimen dieser Erfindung in erster Linie C__g-AlkanoyJ , ]__g-Alkoxycarbonyl, Aroyl, insbesondere Benzoyl oder substituiertes Benzoyl (worin die Substituenten die gleichen wie bei substitu¬ iertem Aryl sind) , und gegebenenfalls durch ein oder zwei Cι_4-Alkylreste substituiertes Carbamoyl.

Entsprechende Reste R ¹ sind z. B. solche der Formeln -(C ⁴ R ⁵⁾ n -COY oder

wobei R ⁴ und R ⁵ = H, Alkyl, Aryl oder substituiertes Aryl, n = 1 - 4, R ⁶ = H, Alkyl, OH, Alkoxy in o-, m- und p-Stellung, COY in o-, m- und p-Stellung, und Y - OR^, wobei R ^"7 - H, Alkyl, Aryl oder subs i uiertes Aryl, ein Alkalimetallion ,wie z. B. Na ⁺ oder K ⁺ , oder ein Ammo¬ niumion (NH ⁺ bzw. ein Mono-, Di- oder Trialkylammonium- ion oder ein N-Methyl-D-glucammoniumsalz) bedeuten, oder Y = NR ⁸ R ⁹ , wobei R ⁸ und/oder R ⁹ = H, Alkyl, Aryl oder substituiertes Aryl oder Aralkyl bedeuten, sein können. Im Falle des Vorliegens asymmetrischer C-Atome sind die entsprechenden D- und L-Formen, Enantiomere und Diastereomere sowie die Racemate bzw. Enantiomeren- und Diasteromerengemische ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

In besonders bevorzugten Verbindungen der Formel I steht R ¹ für Carboxy-Cj_4-alkyl oder alkyl oder für Carboxyphenyl, und R ² und P ³ für Wasser¬ stoff, worin die Carboxyqruppe in freier Form oder in Salzform vorliegt. Hervorzuheben sind d e in den Beispie- len genannten Verbindungen der Formel I und ihre Salze.

Die erfmdungsgemaßen Verbindungen werden z. B. herge ^¬ stellt, indem Madurahydroxylakton bzw. Maduransaure (3, 9, 11, 14, 15-Pentahydroxy-10-methyl-7-methoxy-l, 8, 13- trioxo-1, 3, , 6, 8, 13-hexahydro-naphthaceno[1, 2-f]benzoiso- furan) der Formel II

II

mit Hydrazmoalkylcarbonsauren oder Hydrazin phenylcar- bonsauren bzw. deren Estern und Amiden, gegebenenfalls in Form ihrer SaLze, umgesetzt werden. Die Reaktion wird unter Verwendung geeigneter Losungsmittel, z. B. Eis¬ essig, durchgeführt. Die Reaktionstemperatur liegt ge¬ wohnlich bei der Siedetemperatur des Losungsmittels, die Reaktionszeit kann bis zu einigen Stunden betragen.

Erfindungsgemaß hergestellte Verbindungen der Formel I können in an sich bekannter Weise in andere Verbindungen der Formel I überführt werden. So können erhaltliche Ver¬ bindungen der Formel 1 mit Y = O-Alkyl durch alkalische Verseifung, z. B. mit 2M Matronlauge, und anschließendes Ansäuern, z. B. mit 2M Salzs ure, in die entsprechenden Sauren (Formel I mit Y = OH) umgewandelt werden. Anderer¬ seits können die erhaltenen Verbindungen der Formel I mit R ² bzw. R ³ = H durch Acylierung der phenolischen OH-Grup- pen in einem zweiten Schritt in O-Acylderivate, Formel I mit R ² bzw. R ³ = H bzw. Acyl (z. B. -CO-Alkyl, -COO-Alkyl) überfuhrt werden. Dieser Reaktionsschritt

wird nach üblichen Methoden der Acyiierung phenolischer OH-Gruppen, z. B. mittels Säureanhydrid (z. B. Acetanhy- drid bzw. Propionsaureanhydrid) oder mittels Chlor¬ ameisenester (z. B. Chlorameisensäuremethylester) in alkalischer Lösung, z. B. in 2M Natronlauge oder in Tetrahydrofuran/Triethylamin durchgeführt. Die Reaktions¬ temperatur kann dabei von -20 C bis -+20 C liegen.

Die erhaltenen Verbindungen mit Y = OH können nach ub- liehen Methoden in entsprechende Salze mit Y = OR ⁷ umge¬ wandelt werden, wobei R ^"7 ein Alkalimetallion (z. B. Na, K) oder ein Λmmoniumion (NH4, ein Mono-, Di- oder Trialkylammoniumion, z. B. ein Triethylammoniυmion oder ein N-Methyl-D-glucammoniumion) sein kann. Die syntheti- sierten Verbindungen können mittels üblicher Methoden (z. B. durch Umkristallisation bzw. Säulenchromato¬ graphie) gereinigt werden.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten Verbindungen hemmen das Wachstum von Bakterien, insbesondere von qrampositi- ven Bakterien, speziell von multiresistenten Staphylokok¬ ken sowie von Enterokokken. Von besonderer Bedeutung ist, daß die Verbindungen auch gegen chmolonresistente Staphylokokken sowie gegen mehrfachresistente, auch gegen glykopeptidresistente, z. B. gegen vancomycinresistente Hospitalstämme (MRSA) hochwirksam sind.

In einem Mikrobouillonverdünnungstest nach DIN 58 940 (Teil 8) wurden die Verbindungen auf ihre minimale Hemm- konzentration (MHK) gegen folgende Bakterienstamme ge¬ prüft: Staphylococcus aureus, Stamme 8325-4 (empfind¬ licher Staphyloccocu.s a ureus-Stanuu, repräsentativ für die Species) , NCTC 6571 (empfindlicher internationaler Kon¬ trollstamm) , 108/83 ("alter" MRSA ohne ChinoJonresi- stenz), 134/94 ("neuer" MRSA, mit Chinolonresistenz) , Staph . epidermidis CM 2124 (empfindlicher Kontroll¬ stamm) , Enteroococcus faeci um 70/90 (gegen Vancomycin re-

sistenter Stamm) und 64/3 (empfindlicher Stamm) . Zum Ver ^¬ gleich wurden die bekannten, wenn auch strukturell ver ^¬ schiedenen, Substanzen Vancomycin, Teicoplanin und Cipro- floxacin in die Untersuchungen einbezogen.

Die Ergebnisse der antibakteriellen Testung sind in der Tabelle zusammengefaßt. Aus den Resultaten geht hervor, daß die erfindungsgemäß dargestellten Substanzen gegen einige Bakterienstämme die Hemmwerte der Vergleichssub- stanzen signifikant übertreffen und erfolgreich bakteri¬ elle Resistenzen überwinden können.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I eignen sich aufgrund ihrer antibakteriellen Eigenschaften zur Anwen- düng als Arzneimittel bei bakteriellen Infektionen, ins¬ besondere bei Infektionen mit multiresistenten Staphylo¬ kokken. Bei solchen Erkrankungen können die Verbindungen der Formel I entweder allein oder mit physiologisch ver¬ träglichen Hilfs- oder Tragerstoffen angewandt werden, wobei prinzipiell alle üblichen pharmakologischen Anwen- dungsformen und physiologisch vertraglichen Dosierungen möglich sind. Die Applikation erfolgt z. B. oral oder pa- renteral, wie z. B. intravenös.

Beispiele

Beispiel 1

Substanz 1 :

2- (4-Carboxyphenyl) -maduraphthalazin (2- (4-Carboxyphenyl- 10, 12, 15, 16-tetrahydroxy-8-methoxy-ll-methyl-l, 9, 14-trio- xol, 2 , 6, 1, 9, 14-hexahydro-naphthaceno- [1, 2g]-phthalazin-) , Formel I mit R ¹ = 4-Carboxyphenyl, R ² ,R ³ = H, ^C 33 ^H 22 ^N 2°10 ⁽ 606,54 ⁾ .

Eine Mischung von 100 mg (0,2 mol) Madurahydroxylakton (80-prozentig) und 50 mg 4-Hydrazino-benzoesäure (0,2 mmol) wurde in 10 ml Eisessig 4 Stunden unter Rück¬ fluß gekocht. Die erhaltenen roten Kristalle wurden mit Ether gewaschen.

Die Substanz wurde zweimal über präparative DC (Merck Fertigplatten Si 60, 1 mm, Laufmittel CH ₂ C1 ₂ /CH ₃ 0H 9:1) gereinigt, in THF gelöst, filtriert und mit Petrolether ausgefällt. Ausbeute 78 mg (63 - der Theorie), Fp. > 350 ^' C, Reinheit nach HPLC (Eurospher, Acetonitril/- Wasser 3:2) : 94,7 ?., t = 9,4 min, DC (Merck Alufolie Si 60), Laufmittel CH ₂ C1 ₂ /CH 0H 9:1) R _f =0,77, MS FAB (3NBA) [M+H] ' : m/z = gefunden 607,1, ^l tt NMR (DMS0-D ₆ ) : d(ppm)=14,l, 13,6, 12,98, 11,2 (4H,s, 10-, 12-, 15-, 16-OH) 8,6 (lH,s,4-CH) 7,3 und 7,5 (2xlH,s,5- CH und 13-CH), 7,8, 7,83, 8,08, 8,12 (4H, 2-Phenylen) , 3,85 (3H, s, 8-OCH. ) 2,1 (3H, s, II-CH3),

Beispiel 2

Substanz 2:

2-Ethoxycarbonylmethyl-maduraphthalazin

(10, 12, 15, 16-Tetrahydroxy-8-methoxy-2-ethoxycarbonyl- methyl-ll-methyl-1, 9, 14-trioxo-1, 2, ,7, 9, 14-hexahydro- naphthaceno- [1, 2-g] -phthalazin) , Formel 1 mit R ¹ = CH ₂ COOC ₂ H5, R ² , R ³ = H, C ₃ oH ₂ 4N ₂ 0 ₁₀ (572,53) .

Die Mischung von lg Maduransaure (97-prozentig) (2 mmol) und 400 mg Hydrazinoessigsaureethylester-Hydrochlorid (2,5 mmol) wurde in 20 ml Eisessig unter Rühren 2 Stunden gekocht. Nach Absaugen wurde gut mit Wasser und Eisessig gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert. Hellrote

Kristalle, Fp. 324 - 25° C (Zersetzung) Ausbeute: 622 mg

(54 ^J -, der Theorie) . Reinheit nach HPLC (Nucleosil RP18,

Acetonitril/Wasser 3:2) : 98,14 ° , t = 10,45 min,

DC (Merck Alufolie Si 60) : Butylacetat/Eisessig 4:1: R _f = 0,87,

MS FAB (3NBA) [M+H] ' : m/z = gefunden 573,1,

!H NMR (DMSO-Dg) d(ppm) : 14,07 13,56 12,77 11,18 (4xH,s, 10,12, 15 und 16-OH) 8,50 (1H,S,4-CH), 7,40 und 7,28 (2H,s,5-CH und 13-CII) , 4,97 (2H,s,NCH ₂ ) 4,13-4,25 (2H,q, CH ₂ von Ethyl), 3,81 (3H, s, 8-OCH3) 2,08 (3H,s,10- CH ), 1,20 - 1,268 (3H,t,CH ₃ von Ethyl)

Beispiel 3

Substanz 3:

2-Carboxymethyl-maduraphthalazin

(10, 12, 15, 16-Tetrahydroxy-8-methoxy-2-carboxymethyl-ll- methyl-1, 9, 14-trioxo-l, 2, 6, 7, 9, 14-hexahydro-naphthaceno- [l,2-g]-phthalazin) , Formel I mit R ¹ = CH _? COOH, R ² ,R ³ = H, C28H?( _j N ₂ O _{j 0} (544,47) .

570 mg (1 mmol) 2-Carbethoxymethyl-ιnadurapht haIazin (Sub¬ stanz 2) wurden in 35 ml 2M Natronlauge \ Tag stehen ge- lassen. Anschließend wurde mit 2M Salzsaure angesäuert. Die erhaltenen roten Kristalle wurden durch Umkristalli¬ sieren oder durch Kochen in Eisessig bzw. durch Lösen in

Tetrahydrofuran und Ausfällen mit Petrolether gereinigt. Fp. 234 - 36 ^' C (Zersetzung), Ausbeute: 322 mg (59 ' der Theorie) .

Reinheit nach HPLC (Nucleosil RP18 , Acetonitril/Wasser 3:2) 99,8 ^y . , t = 0,87 min,

DC (Merck Alufolie Si 60) : Butylacetat/Eisessig 4:1: R _f = 0,31,

MS FAß (3NBA) [M+H] ⁺ : m/z = gefunden 545,0, --H NMR (CDC1 ₃ ) d(ppm) : 14,0 , 13,5 , 12,8 , 11,2 (4H,s, 10,12,15 und 16-OH) 8,42 (lH,s,4-CH), 7,2 und 7,3

(2H,s,5-CH und 13-CH) , 3,9 (3H, s, 7-OCH ) 2,9 und 2,5

(2x2H,s, 6-und 7-CH ₂ ) , 2,1 (3H, s, IO-CH3) ,

¹³ C NMR (CDCI3) 28 C-Atome d(ppm) : 187,66 und 185,54

(Chinongruppe) , 169,0 (2-COOH) , 61,04 (OCH3), 52,30 (NCH ), 29,21 und 22,21 (6- und 7-CH ₂ ), 8,17 (II-CH3)

¹³ C NMR DEPT 135: d(ppm) : 139,44 (CH=N) 114,19 , 106,06

(2x ArH), 60,79 (8-OCH3), 52,04 (NCH ) , 29,05 , 21,96 (2x CH ₂ ), 7,92 (II-CH3)

Aus der Substanz 3 kann durch Zusatz eines Amins, bei¬ spielsweise Triethylamin oder N-Methyl-D-glucamin, in ei¬ nem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Tetrahydro¬ furan, ein wasserlösliches Trialkylammoniumsalz, bei¬ spielsweise ein Triethylammoniumsalz oder ein N-Methyl-D- glucaπuTioniumsalz, gewonnen werden.

Beispiel 4

Substanz 4:

2- (D,L-a-Carboxypropyl) -maduraphthalazin (10, 12, 15, 16-Tetrahydroxy-8-methoxy-2- (D,L-a-carboxy- propyl-ll-methyl-1, 9, 14-trioxo-l, 2,6,7, 9, 14-hexahydro- naphthaceno- [1, 2-g] -phthalazin) , Formel I mit R ¹ = D, L-a- Carboxy-propyl, R ² , R ³ = H, C ₃₀ H ₂ N ₂ O ₁₀ (572,15) .

Die Mischung von 2 g (4,1 mmol) Madurahydroxylakton und 0,52 g (4,4 mmol) D, L-a-Hydrazmobuttersaure wurde in 50 ml Eisessig 2 Stunden unter Ruckfluß gekocht. Die er¬ haltenen dunkelroten Kristalle wurden nach Stehen über Nacht abgesaugt, mit Ether gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert. Ausbeute 1,8 g (76 ° der Theorie), Fp. 225 - 30° C (Zersetzung),

Reinheit nach HPLC (RP18 Eurospher 100 C7 , Acetoni- tril/Wasser 3:2 + 0, 05-prozentige Trifluoressigsaure) : 99,6 , t = 13,3 min,

DC (Merck Alufolie Si 60) : Butylacetat/Eisessig 4:1:

Rf= 0,79,

MS FAB (3NBA) [M+H] ⁺ : m/z = gefunden 573,4,

¹ H NMR (DMSO-D6) d(ppm) : 14,1 , 13,6 , 12,9 , 11,3 (4H,s, 10,12,15 und 16-OH)

8,5 (1H,S,4-CH), 7,2 und 7,4 (2H,s,5-CH und 13-CH) , 5,3 UH,d,NCH), 3,9 (3H,s,7-OCH ₃ ) , 2,0 (3H, s, 10CH ₃ ) , 0,9 (3H, s, CH aliph.) . ¹³ C NMR (DMSO-D6) Dept 135: d(ppm) : 29,48, 22,43, 22,22 (3 x CH ₂ ) •

In den Beispielen bedeuten:

DC - Dunnschichtchromatographie

THF - Tetrahydrofuran HPLC - High Performance Liquid Chro atography min - Minute

Fp. - Schmelzpunkt

MS - Massenspektrometrie

NMR - Nuclear Magnetic Resonance

Tabelle

Wirksamkeit von Maduraphthalazinderivaten gegen verschiedene grampositive Bakterienstamme

Substanz MHK (mg/ml;

Stap yl ccot 8325.4a)

1. 0,5

3. 0,063

4. 0,063 Vancomycin 0, 5 Teicoplanin 0, 5 Ciprofloxacin 0,25

^a ' emp indlicher Staphylococcus aureus-Stamm, repräsentativ für die Species ^b) „alter" MRSA (ohne Chinolonresistenz) ^c) „neuer" MRSA (mit Chinolonresistenz)