La présente invention concerne un nouveau procédé d’aldolisations croisées multiples, et les produits polyhydroxylés obtenus.

Les polyols constituent une famille de molécules très répandue dont la synthèse stéréospécifique représente un enjeu important.

Ces motifs sont très présents dans les produits naturels et peuvent présenter des propriétés biologiques intéressantes, par exemple dans les statines (hypolipémiants), les médicaments anticancéreux, anti ostéoporose, antibiotiques, composés antifongiques ou édulcorants. Leur synthèse est en général assez complexe et a conduit au développement de réactions d’aldolisations organocatalytiques ( Chem Soc Rev, 2018, 47, 4388-4480) ou enzymatiques. En particulier, le motif chiral l,3-yy«diol se retrouve dans de nombreux produits naturels. Son obtention reste un challenge actuel (Chem. Eur. J. 2018, 24, 4909- 4915). La biocatalyse, et notamment les réactions catalysées par les désoxyribose-5 -phosphate aldolases (DERA) offrent des solutions intéressantes de par leur faible spécificité de substrat du côté de l’électrophile (J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 2013-2014), et ont prouvé leur potentiel dans l’obtention de molécules d’intérêt biologique (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 741-748).

Les différentes méthodes de synthèse de polyols décrites dans l’art antérieur présentent plusieurs inconvénients comme des rendements pas toujours élevés, un contrôle de la stéréochimie des produits (notamment pour les réactions organocatalysées) et des aldolisations multiples, pas toujours maîtrisés. Dans ce dernier cas en particulier, même si l’acétaldéhyde ou l’acétaldéhyde monosubstitué par un groupement alkoxy, halo ou azido, a été décrit comme conduisant, en présence d’une DERA, à une double addition de l’acétaldéhyde (Demande de brevet US005795749A), la triple addition constitue une limite puisque l’aldol correspondant n’a réussi à être obtenu qu’avec un rendement de 6% après 12 jours de réaction (J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 7585-7591) et uniquement en utilisant l’acétaldéhyde lors d’une auto aldolisation (pas d’aldolisation croisée).

Les aldolisations enzymatiques catalysées par les DERA présentent également souvent des problèmes inhérents à la stabilité du biocatalyseur et à l’inhibition de l’enzyme utilisée, par les produits ou les réactifs, ce qui a souvent nécessité des développements importants pour modifier ces enzymes afin de pallier à ces inconvénients (Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, 101, 5788-5793, Biotechnol. J. 2006, 1, 537- 548).

L’un des buts de l’invention est la mise à disposition d’un nouveau procédé écocompatible et stéréospécifique d’aldolisations croisées multiples sur une molécule de départ approprié.

L’un des autres buts de l’invention est la mise à disposition d’un nouveau procédé d’aldolisations croisées multiples permettant de réaliser plus de deux réactions d’aldolisations croisées successives. L’un des autres buts de l’invention est la possibilité de mettre en œuvre des réactions d’aldolisations à l’aide d’une enzyme naturelle de façon simple, sans problèmes de stabilité ou d’inhibition de l’enzyme. L’un des autres buts de l’invention est la possibilité d’accéder de façon stéréospécifique à une large variété de produits polyhydroxylés chiraux.

Un autre but de l’invention est la possibilité d’utiliser les composés polyhydroxylés obtenus comme médicaments ou comme intermédiaire de synthèse dans la préparation de principes actifs anti cholestérol, anticancéreux, anti-ostéoporose, antibiotiques, de produits antifongiques ou d’ édulcorants.

Un objet de la présente invention est l’utilisation d’une aldolase, préférentiellement une DERA, dans la mise en œuvre d’un procédé comportant des aldolisations croisées multiples successives.

Un premier objet de la présente invention est l’utilisation d’une aldolase, préférentiellement une DERA, dans la mise en œuvre d’un procédé comportant des aldolisations croisées multiples successives sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile utilisé par ladite aldolase, pour obtenir le composé correspondant au produit des aldolisations croisées.

Au sens de la présente invention, on entend par « aldolase » une enzyme catalysant les réactions d’aldolisation sur un substrat approprié, dont par exemple les dihydroxyacétone phosphate (DHAP) aldolases (fructose- 1,6-èAphosphate aldolase, rhamnulose-1 -phosphate aldolase, fuculose-1 -phosphate aldolase, tagatosc- 1.6- >/.vphosphate aldolase), les dihydroxyacétone (DHA) aldolases (fructose-6- phosphate aldolase), les acétaldéhyde aldolases (désoxyribose-5-phosphate aldolase, DERA), les pyruvate aldolases et les glycine aldolases. Les aldolases sont définies ici en fonction du substrat nucléophile qu’elles utilisent.

Au sens de la présente invention, on entend par « substrat nucléophile », le substrat utilisé par l’aldolase (enzyme) pour l’aldolisation, ledit substrat nucléophile étant choisi parmi le dihydroxyacétone phosphate (DHAP), la dihydroxyacétone (DHA), l’acétaldéhyde, le pyruvate et la glycine.

Au sens de la présente invention, on entend par « DERA » toute enzyme capable de catalyser la rétroaldolisation du 2-désoxy-D-ribose-5 -phosphate pour conduire à l’acétaldéhyde et au D- glycéraldéhyde-3-phosphate.

Au sens de la présente invention, on entend par « aldolisations croisées multiples successives » des réactions d’aldolisations croisées d’un nombre supérieur ou égal à deux et allant jusqu’à 10, notamment 6, de préférence 4, intervenant les unes à la suite des autres. Avantageusement, le nombre de réactions d’aldolisations croisées d’un nombre supérieur ou égal à trois et allant jusqu’à dix, avantageusement, le nombre de réactions d’aldolisations croisées d’un nombre supérieur ou égal à quatre et allant jusqu’à dix, avantageusement d’un nombre supérieur ou égal à cinq et allant jusqu’à dix, avantageusement d’un nombre supérieur ou égal à six et allant jusqu’à dix, avantageusement d’un nombre supérieur ou égal à sept et allant jusqu’à dix, avantageusement d’un nombre supérieur ou égal à huit et allant jusqu’à dix, avantageusement d’un nombre supérieur ou égal à neuf et allant jusqu’à dix.

Au sens de la présente invention, on entend par « composé correspondant au produit d’aldolisations » ou « composé correspondant au produit d’aldolisations croisées » un composé obtenu par la mise en œuvre d’un procédé comportant des aldolisations croisées multiples successives sur le substrat électrophile de départ.

A titre d’exemple, la mise en œuvre d’un procédé de triple aldolisation croisées ou de quadruple aldolisation croisées sur l’hydroxypyruvaldéhyde phosphate (HPP) en présence d’acétaldéhyde comme réactif conduit à obtenir les composés polyhydroxylés suivants correspondant aux produits d’aldolisations croisées ou à toutes formes cycliques correspondantes (hémiacétals) :

o

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle le procédé comportant des aldolisations croisées multiples successives est « one-pot » et « one-step ».

Au sens de la présente invention, on entend par « one-pot » des réactions consécutives qui ont lieu dans le même contenant sans transvasement du milieu réactionnel après chaque réaction successive.

Au sens de la présente invention, on entend par « one-step » des réactions consécutives où substrat et réactifs sont introduits dans le milieu réactionnel dès le début et sans isolement ni purification des produits intermédiaires obtenus après chaque réaction successive.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle le procédé comporte au moins trois aldolisations croisées successives.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle le procédé comporte trois, quatre ou cinq aldolisations croisées successives.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, préférentiellement une DERA, dans la mise en œuvre d’un procédé comportant des aldolisations croisées multiples successives, notamment au moins trois aldolisations croisées successives, notamment, trois, quatre ou cinq aldolisations croisées successives, sur un substrat électrophile de départ pour obtenir le composé correspondant au produit d’aldolisations croisées.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée,

dans laquelle R = O ou S ; le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée,

dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à G,. Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à Ce, O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à C _Ô , N-Cycloalkyle2 en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce, NHCO-Cycloalkyle en C3 à Ce,

Ri et R ₂ pouvant former un cycle.

Au sens de la présente invention on entend par « forme salifiée » un substrat électrophile de départ de formule I ou II, dans lequel le groupement phosphate est sous une forme ionique, ayant un ou deux contre-ion(s) cationique(s), notamment choisi(s) parmi le sodium, le potassium, le lithium ou l’ammonium. Les formes salifiées sont de préférence les di-sels de sodium de formule IA ou IB suivantes :

(MA)

Au sens de la présente invention, on entend par « alkyle en Ci à Ce » une chaîne carbonée acyclique, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone. On entend par « cycloalkyle en C ₃ à Ce » un cycle à 3, 4, 5 ou 6 chaînons, saturé ou insaturé, ramifié ou non, notamment un cyclopropyle, un cyclobutyle, un cyclopentyle ou un cyclohexyle.

Au sens de la présente invention, l’expression « Ri et R ₂ pouvant former un cycle » désigne des composés spirocycliques comme par exemple, de façon non-limitante, les structures ci-dessous :

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne futilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle le substrat électrophile de départ est de formule (II) dans laquelle Ri et/ou R ₂ = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO ₂ ,

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne futilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle le substrat électrophile de départ est de formule (II) dans laquelle,

Ri et/ou R ₂ = Alkyle en Ci à Ce, S-Alkyle en Ci à G. O-Alkyle en Ci à G. NH-Alkyle en Ci à G. SCO- Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à G. N-Alkyle ₂ en Ci à G. NH-Alkyle en Ci à G. NHCO-Alkyle en Ci à Ce,

Ri et R ₂ pouvant former un cycle,

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne futilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle le substrat électrophile de départ répond à la formule (II) dans laquelle Ri et/ou R ₂ = Cycloalkyle en C ₃ à Ce, O-Cycloalkyle en C ₃ à G. S-Cycloalkyle en C ₃ à G. OCO-Cycloalkyle en C ₃ à G. SCO-Cycloalkyle en C ₃ à G. SCS-Cycloalkyle en C ₃ à G. N-Cycloalkyle ₂ en C ₃ à Ce. NH-Cycloalkyle en C ₃ à Ce. N-Alkylcycloalkyle en C ₃ à Ce. NHCO-Cycloalkyle en C ₃ à Ce. le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée.

Selon un mode de réalisation particulier, l’utilisation d’une aldolase telle que définie précédemment est particulièrement appropriée sur des substrats électrophiles de départ ayant une structure correspondant aux formules (I) ou (II), éventuellement salifiée, afin de mettre en œuvre des réactions d’aldolisations croisées multiples successives.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne futilisation d’une aldolase, choisie parmi les dihydroxyacétone phosphate (DHAP) aldolases (fructose- 1.6- >/.vphosphate aldolase, rhamnulose-1 -phosphate aldolase, fuculose-1 -phosphate aldolase, tagatosc- 1.6- >/.vphosphate aldolase), les dihydroxyacétone (DHA) aldolases (fructose-6-phosphate aldolase), les acétaldéhyde aldolases (désoxyribose-5 -phosphate aldolase, DERA), les pyruvate aldolases et les glycine aldolases, dans la mise en œuvre d’un procédé comportant n aldolisations croisées successives, où n est un entier de 3 à 10, sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile utilisé par ladite aldolase pour obtenir le composé polyhydroxylé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées,

dans laquelle le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes :

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle R = O ou S ; le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à C _Ô , N-Cycloalkyle2 en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce, NHCO-Cycloalkyle en C3 à Ce,

Ri et R ₂ pouvant former un cycle, et

dans laquelle le substrat nucléophile utilisé par l’aldolase est choisi parmi le dihydroxyacétone phosphate (DHAP), la dihydroxyacétone (DHA), l’acétaldéhyde, le pyruvate et la glycine.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle n est un entier égal à 3, 4 ou 5.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, choisie parmi les dihydroxyacétone phosphate (DHAP) aldolases (fructose- 1,6-ùAphosphate aldolase, rhamnulose-1 -phosphate aldolase, fuculose-1 -phosphate aldolase, tagatosc- 1.6- >/.vphosphate aldolase), les dihydroxyacétone (DHA) aldolases (fmctose-6-phosphate aldolase), les acétaldéhyde aldolases (désoxyribose-5 -phosphate aldolase, DERA), les pyruvate aldolases et les glycine aldolases, dans la mise en œuvre d’un procédé comportant n aldolisations croisées successives, où n est un entier égal à 3, sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile utilisé par ladite aldolase pour obtenir le composé polyhydroxylé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées,

dans laquelle le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes :

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle R = O ou S ; le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à C _Ô , N-Cycloalkyle2 en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce, NHCO-Cycloalkyle en C3 à Ce,

R _I et R ₂ pouvant former un cycle, et

dans laquelle le substrat nucléophile utilisé par l’aldolase est choisi parmi le dihydroxyacétone phosphate (DHAP) la dihydroxyacétone (DHA), l’acétaldéhyde, le pyruvate et la glycine.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, choisie parmi les dihydroxyacétone phosphate (DHAP) aldolases (fructose- 1.6- >/.vphosphate aldolase, rhamnulose-1 -phosphate aldolase, füculose-1 -phosphate aldolase, tagatosc- 1.6- >/.vphosphate aldolase), les dihydroxyacétone (DHA) aldolases (fructose-6-phosphate aldolase), les acétaldéhyde aldolases (désoxyribose-5 -phosphate aldolase, DERA), les pyruvate aldolases et les glycine aldolases, dans la mise en œuvre d’un procédé comportant n aldolisations croisées successives, où n est un entier égal à 4, sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile utilisé par ladite aldolase pour obtenir le composé polyhydroxylé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées,

dans laquelle le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes :

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle R = O ou S ; le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à C _Ô , N-Cycloalkyle2 en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce, NHCO-Cycloalkyle en C3 à Ce,

Ri et R ₂ pouvant former un cycle, et

dans laquelle le substrat nucléophile utilisé par l’aldolase est choisi parmi le dihydroxyacétone phosphate (DHAP), la dihydroxyacétone (DHA), l’acétaldéhyde, le pyruvate et la glycine.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, choisie parmi les dihydroxyacétone phosphate (DHAP) aldolases (fructose- 1.6- >/.vphosphate aldolase, rhamnulose-1 -phosphate aldolase, fuculose-1 -phosphate aldolase, tagatosc- 1.6- >/.vphosphate aldolase), les dihydroxyacétone (DHA) aldolases (fmctose-6-phosphate aldolase), les acétaldéhyde aldolases (désoxyribose-5 -phosphate aldolase, DERA), les pyruvate aldolases et les glycine aldolases, dans la mise en œuvre d’un procédé comportant n aldolisations croisées successives, où n est un entier égal à 5, sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile utilisé par ladite aldolase pour obtenir le composé polyhydroxylé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées,

dans laquelle le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes :

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle R = O ou S ; le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à C _Ô , N-Cycloalkyle2 en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce, NHCO-Cycloalkyle en C3 à Ce,

Ri et R ₂ pouvant former un cycle, et

dans laquelle le substrat nucléophile utilisé par l’aldolase est choisi parmi le dihydroxyacétone phosphate (DHAP), la dihydroxyacétone (DHA), l’acétaldéhyde, le pyruvate et la glycine.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle le substrat électrophile de départ est le HPP de formule (III)

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée.

Au sens de la présente invention, on entend par « HPP » l’hydroxypyruvaldéhyde phosphate, analogue du glycéraldéhyde-3 -phosphate (G3P), substrat électrophile de départ naturel de nombreuses aldolases.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle l’aldolase est choisie parmi les aldolases ayant comme substrat électrophile de départ le glycéraldéhyde-3 -phosphate (G3P) de formule (IV)

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, notamment sous la forme d’un di-sel de sodium de formule (V) ssion un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne 1’utilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle l’aldolase est une DERA.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle le composé correspondant au produit d’aldolisations croisées répond à l’une des formules suivantes sous leurs formes linéaire, hémiacétale, acétale, hémicétale ou cétale :

Outre 1’utilisation d’une aldolase dans la réalisation d’aldolisations croisées multiples successives, l’invention porte également sur le procédé d’aldolisations croisées multiples en lui-même.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne rutilisation d’une aldolase, telle que définie précédemment, dans laquelle le procédé conduit à obtenir un mélange de produits d’aldolisations croisées, ayant subi un nombre d’aldolisations croisées différent, ce nombre d’aldolisations croisées pouvant être supérieur ou égal à 1.

Un second objet de la présente invention est un procédé comportant n aldolisations croisées multiples successives, n étant un entier de 3 à 10, notamment 6, de préférence 4, en présence d’une aldolase sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile de ladite aldolase, pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées, comportant une première étape d’aldolisation croisée sur un substrat électrophile de départ en présence d’une aldolase et du substrat nucléophile de ladite aldolase pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée,

suivie d’une deuxième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 2 réactions d’aldolisation croisées, optionnellement, suivie d’une (i)ième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi (i-1) réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi (i) réactions d’aldolisation croisées, i étant un entier variant de 3 à (n-1),

suivie d’une dernière étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi (n-1) réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, comportant trois, quatre ou cinq aldolisations croisées successives. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, n est un nombre entier égal à 3, 4 ou 5.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, dans lequel le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée,

dans laquelle R = O ou S ;

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée,

dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à C _Ô , N-Cycloalkyle2 en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce, NHCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à Ce,

Ri et R ₂ pouvant former un cycle.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, dans lequel le substrat électrophile de départ est de formule (II)

dans laquelle Ri et/ou R ₂ = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à Ce, O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, dans lequel le substrat électrophile de départ est de formule (II)

dans laquelle Ri et/ou R2 = Alkyle en Ci à Ce, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à G. NH-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle2 en Ci à Ce, NH-Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce,

Ri et R2 pouvant former un cycle,

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée,

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, dans lequel le substrat électrophile de départ répond à la formule (II)

dans laquelle Ri et/ou R2 = Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à C ₍ ,. S-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à G. SCO-Cycloalkyle en C3 à G. SCS-Cycloalkyle en C3 à G. N- Cycloalkyle2 en C3 à Ce. NH-Cycloalkyle en C3 à Ce. N-Alkylcycloalkyle en C3 à Ce. NHCO- Cycloalkyle en C3 à C ₍ ,.

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, dans lequel le substrat électrophile de départ est le HPP de formule (III)

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, notamment sous la forme d’un di-sel de sodium de formule (VI)

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé comportant n aldolisations croisées multiples successives, n étant un entier de 3 à 10, en présence d’une aldolase choisie parmi les dihydroxyacétone phosphate (DHAP) aldolases (fructose- 1.6- >/.vphosphate aldolase, rhamnulose-1 -phosphate aldolase, füculose-1 -phosphate aldolase, tagatosc- 1.6- >/.vphosphate aldolase), les dihydroxyacétone (DHA) aldolases (fructose-6-phosphate aldolase), les acétaldéhyde aldolases (désoxyribose-5 -phosphate aldolase, DERA), les pyruvate aldolases et les glycine aldolases, sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile utilisé par ladite aldolase, pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées comportant une première étape d’aldolisation croisée sur un substrat électrophile de départ en présence d’une aldolase et du substrat nucléophile de l’aldolase pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée ,

suivie d’une deuxième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 2 réactions d’aldolisation croisées,

optionnellement, suivie d’une (i)ième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi (i-1) réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi(i) réactions d’aldolisation croisées, i étant un entier variant de 3 à (n-1),

suivie d’une dernière étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi (n-1) réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées, dans lequel le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle R = O ou S ;

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à C _Ô , N-Cycloalkyle2 en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce, NHCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à Ce,

Ri et R2 pouvant former un cycle, et

dans lequel le substrat nucléophile utilisé par l’aldolase est choisi parmi le dihydroxyacétone phosphate (DHAP), la dihydroxyacétone (DHA), l’acétaldéhyde, le pyruvate et la glycine.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé comportant n aldolisations croisées multiples successives, n est un entier égal à 3, en présence d’une aldolase choisie parmi les dihydroxyacétone phosphate (DHAP) aldolases (fructose- 1.6- >/.vphosphate aldolase, rhamnulose-1 -phosphate aldolase, fuculose-1 -phosphate aldolase, tagatosc- 1.6- >/.vphosphate aldolase), les dihydroxyacétone (DHA) aldolases (fructose-6-phosphate aldolase), les acétaldéhyde aldolases (désoxyribose-5 -phosphate aldolase, DERA), les pyruvate aldolases et les glycine aldolases, sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile utilisé par ladite aldolase, pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées comportant une première étape d’aldolisation croisée sur un substrat électrophile de départ en présence d’une aldolase et du substrat nucléophile de l’aldolase pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée,

suivie d’une deuxième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 2 réactions d’aldolisation croisées, suivie d’une dernière étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi (n-1) réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées, dans lequel le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle R = O ou S ;

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à C _Ô , N-Cycloalkyle2 en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce, NHCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à Ce,

Ri et R2 pouvant former un cycle, et

dans lequel le substrat nucléophile utilisé par l’aldolase est choisi parmi le dihydroxyacétone phosphate (DHAP), la dihydroxyacétone (DHA), l’acétaldéhyde, le pyruvate et la glycine.

Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé comportant n aldolisations croisées multiples successives, n étant un entier de 4 à 10, en présence d’une aldolase choisie parmi les dihydroxyacétone phosphate (DHAP) aldolases (fructose- 1,6-ôAphosphate aldolase, rhamnulose-1 -phosphate aldolase, fticulose-1 -phosphate aldolase, tagatosc- 1.6- >/.vphosphate aldolase), les dihydroxyacétone (DHA) aldolases (fructose-6-phosphate aldolase), les acétaldéhyde aldolases (désoxyribose-5 -phosphate aldolase, DERA), les pyruvate aldolases et les glycine aldolases, sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile utilisé par ladite aldolase, pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées comportant une première étape d’aldolisation croisée sur un substrat électrophile de départ en présence d’une aldolase et du substrat nucléophile de l’aldolase pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée,

suivie d’une deuxième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 2 réactions d’aldolisation croisées,

suivie d’une (i)ième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi (i-1) réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi (i) réactions d’aldolisation croisées, i étant un entier variant de 3 à (n-1),

suivie d’une dernière étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi (n-1) réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées, dans lequel le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle R = O ou S ;

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à C _Ô , N-Cycloalkyle2 en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce, NHCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à Ce,

Ri et R2 pouvant former un cycle, et dans lequel le substrat nucléophile utilisé par l’aldolase est choisi parmi le dihydroxyacétone phosphate (DHAP), la dihydroxyacétone (DHA), l’acétaldéhyde, le pyruvate et la glycine.

Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé comportant n aldolisations croisées multiples successives, n est un entier égal à 4, en présence d’une aldolase choisie parmi les dihydroxyacétone phosphate (DHAP) aldolases (fructose- 1.6- >/.vphosphate aldolase, rhamnulose-1 -phosphate aldolase, füculose-1 -phosphate aldolase, tagatosc- 1.6- >/.vphosphate aldolase), les dihydroxyacétone (DHA) aldolases (fructose-6-phosphate aldolase), les acétaldéhyde aldolases (désoxyribose-5 -phosphate aldolase, DERA), les pyruvate aldolases et les glycine aldolases, sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile utilisé par ladite aldolase, pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées comportant une première étape d’aldolisation croisée sur un substrat électrophile de départ en présence d’une aldolase et du substrat nucléophile de l’aldolase pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée,

suivie d’une deuxième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 2 réactions d’aldolisation croisées,

suivie d’une troisième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 2 réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 3 réactions d’aldolisation croisées, suivie d’une dernière étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 3 réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 4 réactions d’aldolisation croisées, dans lequel le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle R = O ou S ;

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à Ce, N-Cycloalkyle2 en C3 à G,. N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce. NHCO-Cycloalkyle en C3 à G. N-Alkylcycloalkyle en C3 à Ce.

Ri et R2 pouvant former un cycle, et

dans lequel le substrat nucléophile utilisé par l’aldolase est choisi parmi le dihydroxyacétone phosphate (DHAP), la dihydroxyacétone (DHA), l’acétaldéhyde, le pyruvate et la glycine.

Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé comportant n aldolisations croisées multiples successives, n est un entier égal à 5, en présence d’une aldolase choisie parmi les dihydroxyacétone phosphate (DHAP) aldolases (fructose- 1.6- >/.vphosphate aldolase, rhamnulose-1 -phosphate aldolase, füculose-1 -phosphate aldolase, tagatosc- 1.6- >/.vphosphate aldolase), les dihydroxyacétone (DHA) aldolases (fmctose-6-phosphate aldolase), les acétaldéhyde aldolases (désoxyribose-5 -phosphate aldolase, DERA), les pyruvate aldolases et les glycine aldolases, sur un substrat électrophile de départ en présence du substrat nucléophile utilisé par ladite aldolase, pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi n réactions d’aldolisation croisées comportant une première étape d’aldolisation croisée sur un substrat électrophile de départ en présence d’une aldolase et du substrat nucléophile de l’aldolase pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée,

suivie d’une deuxième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 1 réaction d’aldolisation croisée pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 2 réactions d’aldolisation croisées,

suivie d’une troisième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 2 réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 3 réactions d’aldolisation croisées, suivie d’une quatrième étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 3 réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 4 réactions d’aldolisation croisées, suivie d’une dernière étape d’aldolisation croisée sur le susdit composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 4 réactions d’aldolisation croisées pour obtenir le composé correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi 5 réactions d’aldolisation croisées, dans lequel le substrat électrophile de départ répond à l’une des formules (I) ou (II) suivantes

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle R = O ou S ; le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, dans laquelle Ri et/ou R2 = H, Alkyle en Ci à Ce, Halogène, SH, S-Alkyle en Ci à G,. O-Alkyle en Ci à C ₆ , OCO-Alkyle en Ci à Ce, SCO-Alkyle en Ci à Ce, SCS-Alkyle en Ci à Ce, N-Alkyle ₂ en Ci à Ce, NH- Alkyle en Ci à Ce, NHCO-Alkyle en Ci à Ce, NO2, Cycloalkyle en C3 à Ce, S-Cycloalkyle en C3 à Ce, O-Cycloalkyle en C3 à Ce, OCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, SCS-Cycloalkyle en C3 à C _Ô , N-Cycloalkyle2 en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à C6, NH-Cycloalkyle en C3 à Ce, NHCO-Cycloalkyle en C3 à Ce, N-Alkylcycloalkyle en C3 à Ce,

Ri et R ₂ pouvant former un cycle, et

dans lequel le substrat nucléophile utilisé par l’aldolase est choisi parmi le dihydroxyacétone phosphate (DHAP), le dihydroxyacétone (DHA), l’acétaldéhyde, le pyruvate et la glycine.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, dans lequel l’aldolase est choisie parmi les aldolases ayant comme substrat électrophile de départ le glycéraldéhyde-3 -phosphate (G3P) de formule (IV)

le groupement phosphate pouvant être sous une forme salifiée, notamment sous la forme d’un di-sel de sodium de formule (V)

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, dans lequel l’aldolase est une DERA.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, mis en œuvre à une température de 0 à 40 °C, en particulier de 0 à 10°C, de 10 à 20°C, de 20 à 30 °C, de 30 à 40°C, pour une durée allant d’une réaction instantanée à 2 semaines, en particulier de 0 à 1 minute, de 2 à 5 minutes, de 5 à 10 minutes, de 10 à 30 minutes, de 30 minutes à 1 heure , de 1 à 2 heures, de 2 à 5 heures, de 5 à 10 heures, de 10 à 24 heures, d’ 1 à 2 jours, de 2 à 5 jours, de 5 à 10 jours, de 10 jours à 2 semaines.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, dans lequel le composé correspondant au produit d’aldolisations croisées répond à l’une des formules suivantes sous leurs formes linéaire, hémiacétale, acétale, hémicétale ou cétale,

Par ailleurs, au-delà de rutilisation d’une aldolase dans la réalisation d’aldolisations croisées multiples successives et du procédé correspondant, l’invention porte également sur les produits obtenus par ces réactions d’aldolisations croisées multiples.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, dans lequel les réactions d’aldolisations croisées multiples successives ont lieu dans un milieu réactionnel comprenant de l’eau.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le procédé, tel que défini précédemment, conduisant à obtenir un mélange de composés correspondant au substrat électrophile de départ ayant subi un nombre d’aldolisations croisées différent, ce nombre pouvant être supérieur ou égal à 1.

Un des avantages du procédé de l’invention est qu’il n’entraîne pas l’inactivation de l’enzyme après la réaction d’aldolisation. Celle-ci peut être réutilisée pour catalyser d’autres réactions d’aldolisation.

Cet avantage permet d’envisager d’utiliser le procédé de l’invention sous la forme d’un procédé en continu comportant l’enzyme immobilisée qui pourrait être industrialisable.

Un troisième objet de la présente invention est un composé polyhydroxylé répondant à l’une des formules suivantes sous leurs formes linéaire, hémiacétale acétale, hémicétale ou cétale :

Les produits obtenus par les réactions d’aldolisations croisées multiples précédemment décrites peuvent notamment être utilisés comme médicaments ou pour la préparation de médicaments.

Les produits précédemment décrits obtenus par les réactions d’aldolisations croisées multiples de l’invention peuvent également être engagés dans une réaction de déphosphorylation conduisant par exemple aux produits suivants :

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un composé obtenu par des réactions d’aldolisations croisées multiples, tel que défini précédemment, pour son utilisation comme médicament, ou comme intermédiaire de synthèse dans la préparation de principes actifs anti cholestérol, anticancéreux, anti-ostéoporose, antibiotiques, de produits antifongiques ou d’ édulcorants.

Exemples :

Les réactifs suivants ont été achetés chez Sigma-Aldrich : dihydroxyacétone (DHA), acétaldéhyde, chlorure de cobalt hexahydrate, NADH, a-glycérophosphate déshydrogénase du muscle de lapin, glycylglycine.

L’isopropyl- -D-thiogalactoside (IPTG) a été acheté chez Alexis Biochemicals.

La DHAP (Dihydroxyacétone phosphate) a été préparée à partir de la dihydroxyacétone selon la procédure précédemment publiée ( Adv . Synth. Catal. 2012, 354, 1725-1730).

Les mesures d’activité et le suivi cinétique des réactions enzymatiques ont été réalisés sur un spectrophotomètre Lambda 25 de chez Perkin Elmer à 340 nm dans des cuves en polystyrène de 1 mL. Les spectres de RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) ont été mesurés dans l’eau deutérée (D2O) sur un spectromètre Bruker AC-400, opérant à 400 MHz pour les spectres 'H et 100 MHz pour les spectres ¹³ C. Les déplacements chimiques (d) sont décrits en ppm par rapport au signal du TMS. Les constantes de couplage sont données en Hertz.

Les spectres de masse en ionisation par électrospray (ESI-MS) et haute résolution (HR-MS) ont été enregistrés sur un micro Orbitrap Q-Exactive (70000 V) avec une masse interne (H ₃ PO ₄ ) et une masse externe (Leu-enképhaline). Exemple 1 : Production des enzymes

Exemple 1-1 : criblage des DERA dans les réactions d’aldolisation

124 DERA se sont révélées capables de réaliser des multi-additions dans des conditions non optimisées (Tableau 1). Ceci a été mis en évidence par un criblage LC/MS des lysats d’une collection de DERA issues de la biodiversité en présence de HPP et d’acétaldéhyde. Une DERA capable de faire une quadruple addition (Uniprot id P0A6L0) a été sélectionnée.

[Table 1]

: Aldolisations avec des DERA issues de la biodiversité

Exemple 1-2 : Production et purification de t DERA _/ ,,/,

Les différentes protéines impliquées ie de Bacteroides thetaiotaomicron /RhuA _/; , _/ ,. ,: Uniprot Id Q8A1A0), et de E. coli (P0A6L0) ont été surexprimées dans E. coli et purifiées.

La souche E. coli contenant le plasmide avec le gène d’intérêt a été mise en culture à l’échelle des 200 mL dans Luria-Bertani (LB) en présence d’ampicilline à 37°C sous agitation jusqu’à atteindre une DO de 0,5 mesurée par spectrophotométrie à 600 nm. L’expression des aldolases a été induite avec l’IPTG (isopropyl b-D-l-thiogalactopyranoside) (0,5 mM) à une température de 30°C pendant 12 h. Les cellules ont été recueillies par centrifugation, lavée deux fois et re-suspendues dans un tampon phosphate 50 mM pH 8 contenant 10 mM d’imidazole. Les cellules en solution ont été cassées par sonication à 4°C selon le programme suivant : 10 s d’ultra-sons alternés par 15 s de repos pendant 25 min. Le lysat obtenu a été centrifugé à 4000 tr/min pendant 15 min et le surnageant contenant la protéine d’intérêt a été récupéré. Les protéines ont ensuite été purifiées par chromatographie d’affinité IMAC (Immobilized Métal Ion Affinity Chromatography) sur une colonne Ni-NTA-agarose (résine d’agarose chargée avec un composé nickel-acide nitriloacetique) de diamètre 1,5 cm et un volume de phase stationnaire de 5 mL. La résine a d’abord été lavée abondamment par de l’eau. Le lysat a été déposé sur la résine et rincé avec un tampon phosphate 50 mM pH 8 contenant 20 mM d’imidazole pour éliminer les protéines non retenues. La protéine d’intérêt a été éluée avec un tampon phosphate 50 mM pH 8 contenant 250 mM d’imidazole. Une dialyse contre de l’eau a été réalisée pour retirer tout sous-produit provenant du tampon avant lyophilisation.

Exemple 1-3 : Tests d’activité pour RhuAm _het et DERA _/ ,,/,

L’activité de RhiiA _/; , _/ „., a été déterminée selon la procédure précédemment publiée (V. Laurent, E. Darii, A. Aujon, M. Debacker, J.-L. Petit, V. Hélaine, T. Liptaj, M. Breza, A. Mariage, L. Nauton, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 5467-5471).

L’activité DERA _/ ,,, _/ , a été confirmée selon le protocole de rétroaldolisation suivant :

dans une cuve de spectrophotomètre sont introduit :

960 pL de tampon GlyGly (50 mM, pH 7,5)

- 20 pL NADH ( 12 mg .mL ¹ )

10 pL D-désoxyribose-5 -phosphate (170 mM)

- 2 pL GPDH/TPI (soit 26 U TPI et 3U GDPH)

10 pL de DERA à tester (1 mg.mL ¹ )

La disparition du NADH est suivie au cours du temps par spectrophotométrie par mesure de la DO à 340 nm. Une mole de NADH disparue par minute correspond à une mole de D-désoxyribose-5 - phosphate disparue par minute.

Exemple 2 : Synthèse du HPP (hydroxypyruvaldéhyde phosphate) (1)

15 mg d’aldolase (RhuA _/; , _/ „,: Uniprot Id Q8A1A0) ont été additionnés à une solution aqueuse d’un volume de 5 mL contenant 3 mL de DHAP (provenant d’une solution mère à 66 mM dans l’eau) et 80 pL de CoCL (provenant d’une solution à 50 mM dans l’eau). Le pH a été ajusté à 7.5 avant l’ajout de RhuA. Le mélange réactionnel a été agité sous atmosphère d’oxygène à température ambiante pendant 3h jusqu’à disparition complète de la DHAP. La consommation de la DHAP a été suivie par spectrophotométrie .

La protéine (RhuA _/; , _/ „.,: Uniprot Id Q8A1A0) a ensuite été éliminée en utilisant une chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) et l’éluât a été lyophilisé. 1.2 mL d’eau ont ensuite été ajoutés au résidu sec et ce mélange a été centrifugé pendant 10 minutes à 14000 rpm. Le précipité de l’enzyme restante a été jeté alors que le surnageant a été fractionné en quatre portions de 300 pL chacune. Chaque fraction a été mélangée avec 1.5 mL d’éthanol, la suspension obtenue centrifugée et le surnageant enlevé. Cette opération est répétée quatre fois. Les solides combinés sont alors lavés trois fois avec 1.8 mL d’éthanol. Le solide est solubilisé dans 1 mL d’eau et la fraction non-soluble est éliminée par centrifugation. Le surnageant est alors évaporé deux fois sous vide pour éliminer les traces de solvant, et enfin lyophilisé.

83 mg de HPP (1) ont été obtenus. En utilisant le DMF comme référence interne, une pureté de 30% a été déterminée, le rendement obtenu est de 47%.

Dans D2O seule la forme hydratée a été observée : RMN H (400 MHz, D2O) d 5.01 (s, 1H, 1), 3.98 (d, J= 6.4 Hz, 2H, 3). RMN ¹³ C NMR (101 MHz, D ₂ 0) d 94.65 (d, J = 6.0 Hz, 2), 90.07 (1) , 66.46 (d, J = 3.6 Hz, 3). HRMS ESI-: m/z calculée pour [C ₃ H ₄ 0 ₆ P]- = 166.9751; mesurée 166.9741.

Exemple 3 : Synthèses utilisant la DERA avec l’acétaldéhyde comme nucléophile

Le HPP a été généré in situ en utilisant 3 mL de DHAP (provenant d’une solution mère à 66 mM dans l’eau). La RhuA est dénaturée en diminuant le pH à 5. Après centrifugation, 10 équivalents d’acétaldéhyde puis 20 mg de DERA _/ ,,, _/ , ont été ajoutés dans le milieu réactionnel après avoir ajusté le pH à 7.5. Le milieu réactionnel a été agité pendant 3 heures. La disparition du HPP (environ 1 heure) a été suivie par spectrophotométrie. La DERA a été éliminée par précipitation résultant de l’acidification du milieu réactionnel, puis centrifugation. Après avoir augmenté le pH à 6.5, la solution a été chargée sur une colonne remplie d’une résine échangeuse anionique (Dowex 1x8, bicarbonate form 200-400 Mesh). Cette dernière a été lavée avec 4 volumes d’eau. Puis l’aldol a été élué avec 4 volumes d’une solution à 0.5 M de NH4HCO3. Les fractions positives sur CCM (NH^OH/EtOH 4/5) ont été évaporées plusieurs fois avec de l’eau pour éliminer le NH4HCO3. 66 mg de produit ont été obtenus (86% de rendement). Dans l’eau, les deux formes a et b furanosiques sont obtenues dans les mêmes proportions : RMN ¾ (500 MHz, D2O) d 5.09 (dd, J = 10.2, 2.1 Hz, 2H, Hl, HG), 4.53 (q, J = 7.2 Hz, 1H, H7’), 4.48 (q, J = 7.2 Hz, 1H, H7), 4.37 (t, J = 6.3 Hz, 1H, H9), 4.31 (m, 2H, H3, H3’), 4.28 (m, 1H, H9’), 4.16 (m, lH, Hbl l’), 4.06 - 3.96 (m, 2H, H5, H5’), 3.89 (m, 3H, Hal l’, Hal l, Hbl l), 2.23 - 2.06 (m, 2H, H8, H8’), 2.07 - 1.95 (m, 1H, H6a’), 1.93 (m, 2H, H2b, H2b’), 1.86 (m, 1H, Ha6), 1.76 (m, 1H, Hb6’), 1.71 (m, 2H, H4b, H4’b), 1.66 (m, 1H, H6b), 1.53 (m, 4H, H2a, H2’a, H4a, H4’a).

RMN ¹³ C (101 MHz, D ₂ 0) d 106.10 (d, J = 7.3 Hz, 10’), 102.80 (d, J = 9.3 Hz, 10), 91.89 (2C, 1, 1’), 77.47 (7’), 75.18 (9’), 74.10 (7), 71.06 (9), 68.53 (5’), 68.22 (5), 66.67 (ls, 11), 65.21 (ls, 11’), 64.77 (2C, 3, 3’), 41.98 (6’), 40.21 (6), 38.04 (2C, 2, 2’), 37.17 (8’), 36.65 (8), 36.56 (2C, 4, 4’). HRMS ESI- : m/z calculée pour [C11H20O10P] = 343.0800; mesurée 343.0798.