La présente invention concerne plus particu¬ lièrement l'élaboration d'un vaccin contre la rage. La rage est une maladie, provoquée par le virus rabique, qui se présente sous forme d'une encé- phalomyélite gravissime qui peut être fatale en quelques jours.

La rage est une zoonose. Tous les animaux à sang chaud, qu'ils soient mammifères ou oiseaux, sont réceptifs. Le principal vecteur est en général constitué par des mammifères mordeurs, qu'ils soient domestiques ou sauvages.

Les principales victimes de la rage sont es- sentiellement l'homme et le bétail.

Les mesures de prévention efficaces ont permis de limiter les cas de rage humaine, qui se réduisent à quelques cas accidentels dans les pays fortement indus¬ trialisés. Néanmoins, la rage reste encore une maladie très importante dans certains pays d'Amérique du Sud, en Afrique et en Asie.

L'arme essentielle de la lutte contre la rage est la prévention par la vaccination. Les vaccins actuellement utilisés sont essen¬ tiellement constitués par des virus inactivés.

Toutefois, pour être reproduits industrielle¬ ment, ces virus doivent être cultivés sur des milieux tels que des cerveaux de souriceaux nouveau-nés, sur des embryons d'oiseaux ou sur des cellules rénales animales ou sur des cellules diploïdes humaines, après quoi ils sont complètement inactivés par action de β-propiolactone par exemple.

Toutefois, les risques d'accidents neuro- paralytiques liés à l'utilisation de ces vaccins ont

grandement limité les possibilités de la vaccination, au moins au niveau humain.

En outre, bien que les nouveaux substrats utili¬ sés pour la culture des virus aient beaucoup réduit le risque neurologique, celui-ci n'est pas complètement sup¬ primé. De plus, l'utilisation de vaccins inactivës pose toujours le problème du risque d'une inactivation insuf¬ fisante. Enfin, la nature particulière des milieux de culture conduit à de nombreuses difficultés au stade industriel qui font que le vaccin antirabique reste ac¬ tuellement un vaccin très cher.

Le but de la présente invention est la prépara¬ tion d'une protéine antigénique vaccinante exempte de risque d'accident neuroparalytique et qui, en outre, peut être préparée dans des conditions industrielles telles qu'elle assure un coût très faible du vaccin. Le virus de la rage est un rhabdovirus. Ce rhabdovirus est constitué d'une nuclëocapside hélicoïdale contenant un ARN inclus dans une enveloppe lipoprotéinique ayant la forme d'un obus.

Ce virion comprend cinq protéines qui sont codées par le génome : G (glycoprotêine) , N (nuclëocapside) , Ml et M2 (matrice) et L (large, transcriptase) . Comme la. couverture membranaire provient de l'hôte, le seul anti- gène efficace présent sur la surface est la glycoprotêine. Cette protéine transmembranaire a un poids moléculaire d'environ 75 000 daltons et possède une activité hémagglu- tinant .

La glycoprotêine purifiée est environ six fois plus active dans les essais d'hëmagglutination que le virus intact.

Comme son nom l'indique, la glycoprotêine du virus de la rage est glycosylee, bien que le rδle de cette glycosylation soit inconnu. La séquence d'ADN complémentaire du mARN de la

OMPI

glycoprotêine du virus de la rage a été décrite dans l'article de A. Anilionis et al., Nature 294; 275-278 (1981).

Ce gêne a été utilisé dans le cadre des expéri- « 5 mentations qui seront décrites ci-après et est représenté schëmatiquement sur la figure 1 σi-annexée.

La présente invention concerne un vecteur d'ex¬ pression d'une protéine antigénique de la rage, caracté¬ risé en ce qu'il comporte au moins : 10 . une séquence d'ADN (I) correspondant à tout ou partie de la séquence d'ADN efficace codant pour .la pro¬ téine antigénique de la rage,

. un promoteur de l'expression de cette séquence dans une bactérie. 15 De préférence, la séquence d'ADN (I) est la sui¬ vante:

AGA GGC CTA TAT AAG TCT TTA AAA GGA GCA TGC AAA CTC AAG TTA TGT GGA GTT CTA GGA CTT AGA CTT ATG GAT GGA ACA TGG GTC GCG.

Les expériences effectuées ont montré que les 20 vecteurs comportant la séquence d'ADN (I) précédemment mentionnée étaient susceptibles de conduire à 1'expres¬ sion d'une glycoprotêine précipitant avec un antisërum correspondant à la glycoprotêine de la rage purifiée. La terminologie "ADN (I)" est uniquement des- 25 tinëe à simplifier les dénominations; une telle séquence est dite correspondre à tout ou partie de la séquence t d'ADN efficace codant pour la protéine antigénique de la rage lorsqu'elle est soit identique à tout ou partie _* ; s* . de cette séquence d'ADN efficace soit qu'elle conduit 30 lorsqu'elle est exprimée à une protéine ayant des pro¬ priétés immunologiques identiques ou très similaires à celles de la protéine antigénique efficace codée par la séquence en cause de l'ADN efficace.

Dans certains cas, il peut être intéressant ou 35 nécessaire d'utiliser des fragments d'ADN efficace de

dimension plus importante, en particulier, il peut être intéressant d'utiliser les fragments d'ADN du gène de la rage compris entre les sites de restriction HindIII - HindIII, HindIII - AosI , HindIII - Nrul. D'autres frag- ments sont également utilisables, en particulier des fragments compris entre les sites HindIII - Ps I et StuI - PstI, bien que dans ce cas, la séquence d'ADN correspondante code dans sa partie terminale pour le peptide transmembranaire dont le caractère hydrophobe peut constituer un inconvénient dans l'obtention d'une protéine hydrosoluble.

De façon générale, il est intéressant d'utili¬ ser comme séquence d'ADN efficace une séquence limitée en 5' par le site HindIII. Les vecteurs selon la présente invention peuvent, bien entendu, comporter d'autre fragments d'ADN destinés en particulier à assurer l'attachement des ribosomes correspondants ou bien à donner une configuration au vecteur facilitant l'expression de la protéine antigéni- que de la rage.

En particulier, les vecteurs selon la présente invention peuvent comporter tout ou partie de l'ADN d'un phage, notamment du phage Ml3, le promoteur du vecteur selon la présente invention étant d'ailleurs de prëfêren- ce le promoteur de l'operon lactose.

Parmi les phages M13 utilisables, il faut citer plus particulièrement les phages :

- M13tgl02

- M13tgll0 - Ml3tglll

- Ml3tgll2

- M13tgll5

- M13tgll6

- M13tgll7 .- M13tgll8

- M13tgl20

- Ml3tgl21

OMPI . Y Y/IIPPOO

Il est bien entendu possible d'utiliser un autre type de promoteur comme par exemple un promoteur contrôlé tel que celui du bactériophage lambda et également d'in¬ troduire un site d'initiation de la traduction puissant tel que celui du gène cil du phage lambda.

Les vecteurs selon l'invention peuvent également être des plas ides. En particulier, un plasmide vecteur qui porte au moins :

- l'origine de réplication d'un plasmide bactê- rien,

- un promoteur du. bactériophage λ : P.., P ou

R

- une région codant pour l'initiation de la traduction. La présence d'une origine de réplication pour un plasmide est essentielle pour permettre la réplication du vecteur dans les cellules bactériennes correspondantes, en particulier dans le cas de E. coli on utilisera, de préférence, l'origine de réplication du plasmide pBR322. Le plasmide pBR322 présente, en effet, l'avantage de donner un grand nombre de copies et ainsi d'augmenter la quantité de plasmides produisant la protéine désirée. Il est, bien entendu, possible d'utiliser d'au¬ tres origines de réplication, en particulier celle d'un plasmide codant pour les facteurs de résistances quelcon¬ ques ou d'un episoracolicinogénique (c'est-à-dire conférant à une bactérie la faculté de synthétiser une colicine) .

Toutefois, il convient de. choisir des plasmides dont la réplication n'est pas contrôlée de façon trop sévère et qui ne présente pas de site de restriction indésirable, en dehors de la région de clonage.

Parmi les promoteurs du bactériophage λ , on utilisera, de préférence, le promoteur principal de gau¬ che noté λP_ . P_ est un promoteur puissant responsable de la transcription précoce de λ.

OMPI

Il est également possible d'utiliser d'autres promoteurs du bactériophage λ _r notamment le promoteur de droite, P _R , ou le second promoteur de droite, P'- _R*

Bien qu'il soit possible d'utiliser des séquences d'initiation de la traduction très variées, on préfère utiliser celle de la protéine cil du bactériophage λ qui sera nommée ci-après ^λ cIIrbs.

Si l'utilisation de la région λσllrbs est plus particulièrement intéressante, pour des raisons qui se- ront explicitées ci-après, il est néanmoins possible d'utiliser d'autres séquences d'initiation de la traduc¬ tion, notamment celle du gène ^ E qui est limitée par des sites de restriction intéressants.

La région codant pour l'initiation de la traduc- tion λcllrbs est plus particulièrement intéressante car :

1°) il a été démontré que la protéine cil est synthétisée en grande quantité sous le contrôle du pro¬ moteur P_,

2°) la région en cause est limitée par des sites de restriction qui permettent un isolement facile de ladite région,

3°) une enzyme de restriction (Ndel) recouvre le codon d'initiation de la traduction.

Dans ces conditions, l'insertion de la séquence d'ADN (I) étrangers sur ce site avec reconstruction du codon d'initiation ATG permet l'expression de protéines non-f sionnées, c'est-à-dire ne contenant pas d'amino- acide étranger à la protéine que l'on devra préparer à l'exception de la mëthionine initiale.

Par contre, le clonage de la séquence d'ADN (I) dans l'un des sites de restriction uniques en aval de λcllrbs conduit à l'expression d'une protéine fusionnée.

La zone de clonage de l'ADN (I) est située en aval du promoteur P et de la région d'initiation de traduction de cil. Parmi les sites d'insertion uniques

O PI

qui figurent de préférence dans cette zone, on peut citer EcoRI, Sali, Acc , BamH , HindIII, HindII et PstI corres¬ pondant à des enzymes de restriction couramment itilisées. L'insertion des gênes codant pour une protéine particulië- re dans de tels sites placés à 40-50 bp en aval du codon d'initiation de la traduction conduit à la synthèse de protéines étrangères fusionnées à l'extrémité N terminale des aminoacides bactériens dérivant de ci .

Le vecteur en cause comporte, en outre, de prë- férence une fonction d'antiterminaison de transcription codée par exemple par le gène N de λ noté λN; En présence du produit de transcription du gène N la transcription à partir de se poursuit au delà de la plupart des signaux stop. Ceci écarte les problèmes posés par un arrêt prê- mature de la transcription qui peuvent se produire lors¬ que les gènes étrangers clones présentent de tels signaux stop. En outre, il a été démontré que l'expression à partir de P.. est améliorée dans un environnement N . Lorsque le promoteur n'est pas P.. ou P mais P* par exemple, la fonction d'anti erminaison peut être différente. P'_ est responsable de la transcription des gènes tardifs du bactériophage λ. L'expression du gêne tardif est régulée positivement par le produit du gêne Q dont il a été démontré qu'il agit comme antite minateur de transcription analogue à la protéine N, Q agit à la terminaison pour l'ARN 6S de λ constitutif initié à P' .K en permettant ainsi la transcription de la région du gène tardif distal. L'expression de Q est elle-même con¬ trôlée par P„ qui, comme P , est régulé par le répresseur cl. Cette cascade d'interactions peut être reconstruite sur un plasmide d'expression et utilisée de la même façon pour P-..

Afin d'écarter les problèmes de toxicité et d'instabilité du système hôte-vecteur en cas de produc- ^' tion en continu de grandes quantités d'une protéine

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étrangère,. ^" il est nécessaire de prévoir le contrôle de l'activité du promoteur en lui adjoignant tout ou partie d'un système d'expression inductible, en particulier thermo- inductible. De préférence, le contrôle par la température de la synthèse de la protéine étrangère est effectué au niveau de la transcription au moyen d'un rëpresseur thermosensible codé dans la bactérie hôte, par exemple cl857, qui réprime l'activité de P _L à 28°C mais qui est inactivé à 42°C. Le répresseur agit sur l'opérateur 0_i_l qui est adjacent au promoteur P X_J. Bien que dans le ^" cas précédent une partie du système d'expression theπno-induc¬ tible soit partie intégrante de la bactérie hôte, il est possible de prévoir que ce système fasse partie du vec- teur lui-même.

Le vecteur en cause peut également comporter un gène de résistance à un antibiotique, par exemple l'ampi- cilline dans le cas de pBR322, mais d'autres gênes de résistance peuvent être utilisés, résistance à la trëtra- cycline (Tet ) ou au chloramphénicol (Cm ) .

L'incorporation d'un tel marqueur est nécessaire pour la sélection des bactéries contenant les transfor¬ mants porteurs du plasmide selon l'invention pendant les expériences de clonage. L'incorporation d'un gène de résistance permet d'augmenter la stabilité du plasmide en imposant une pression de sélection lors de la fermentation, et en outre facilite l'isolement des ^' transformants.

Pour le clonage il est intéressant de disposer d'un système permettant de détecter l'insertion dans le plasmide de la séquence d'ADN (I) .

A titre d'exemple, il est possible de prévoir dans la zone de clonage le fragment N-terminal de la 3-galactosidase de E. coli (lacZ') en le fusionnant avec la région d'initiation de traduction dérivée de λcll, ce qui met la traduction du fragment α sous le contrôle des

O PI

séquences de cil.

Le fragment est complêmenté par l'expression du fragment ωC-terminal codé dans l'hôte, ceci conduit à une activité β-galactosidase dans les cellules. Cette activité β-galactosidase produit des colonies bleues en présence d'un substrat chromophorique, le 5-bromô-4-chlo- ro-3-indolyl-β-D-galactosidase.

A 28°C, le promoteur P_ est inactivé, le frag- ment α n'est pas synthétisé et les colonies demeurent blanches. Lorsque la température est amenée à 42°C, le promoteur P _τ J_l est activé, le fragment α est synthétisé et les colonies virent au bleu.

L'insertion d'ADN (I) dans les sites de clonage situés dans ce système de détection empêche la synthèse de la B-galactosidase et conduit donc à des colonies blanches aussi bien à 28°C qu'à 42°C.

Il est également possible de remplacer le gène lacZ' par d'autres gènes permettant une détection.

La présente invention concerne également les souches bactériennes transformées par lesdits plasmides ou transfectées par lesdits phages.

Parmi les souches bactériennes utilisables, il faut citer en particulier les bactéries gram négatives telles que Escherichia coli, notamment lorsque l'ADN support est l'ADN du phage M13, mais d'autres souches bactériennes sont utilisables comme par exemple Bacillus subtilis.

La présente invention concerne également l'appli¬ cation de ces vecteurs à la préparation de glycoprotéines antigéniques de la rage par culture sur un milieu de cul¬ ture approprié de souches bactériennes incorporant un vecteur selon l'invention.

Bien entendu les conditions de culture et les milieux à utiliser ne constituent pas des caractéristiques du procédé selon la présente invention et peuvent être

OMPI

déterminés pour chaque souche par l'homme de métier.

La présente invention concerne également les protéines obtenues par la mise en oeuvre du procédé se¬ lon là présente invention et en particulier les protéines comportant la séquence suivante d'acide aminé :

R G LY K S L K G A C K L K L C G V L G L R L M D G T W V i i

Les protéines ainsi obtenues immunoprécipitent avec les anticorps spécifiques correspondant à l'antigène majeur de la rage et peuvent donc être utiliséespour provoquer une immunostimulation permettant le traitement ou la prévention de la rage.

C'est pourquoi la présente invention concerne également des vaccins utiles aussi bien pour la préven¬ tion que pour le traitement de la rage comportant à titre de principe actif immunostimulant au moins une protéine telle que décrite précédemment.

De préférence, la protéine antigénique selon la présente invention se présente sous forme d'une solution aqueuse lorsqu'elle doit être utilisée comme vaccin.

Bien entendu, la séquence d'acide aminé de cette protéine peut être synthétiséspar voie chimique à l'aide de procédés connus. De même, s'il est préférable que cette séquence soit incorporée dans une protéine plus importante, il n'est pas forcément indispensable que les acides aminés de part et d'autre correspondent à ceux du gène complet de la protéine antigénique de la rage, il est possible de prévoir d'autres acides aminés qui améliorent l'effi¬ cacité du composé, en particulier qui modifient sa solu¬ bilité. Il est même possible de prévoir que certains éléments différents des acides aminés soient greffés sur la chaîne. Avant de décrire en détail les procédés mis en

OMPI

oeuvre pour la préparation des vecteurs selon la présente invention, il convient de résumer ci-après le schéma des manipulations correspondantes.

Les vecteurs selon la présente invention ont été préparés par insertion dans les sites appropriés de pha¬ ges M13 de différentes séquences de restriction obtenues à partir du plasmide pRG décrit dans : A. Anilionis et ._ al., Nature 294, 275-278 (1981).

La structure du gène codant pour la glycoprotëi- ne de la rage est représentée à la figure 1.

Sur cette figure on a également représenté les différents sites de restriction présents sur ce gène ainsi que les acides aminés codés par cette séquence.

Les séquences de protéines encadrées correspon- dent aux régions hydrophobes de la glycoprotêine, quant aux régions entourées elles correspondent aux sites de glycosylation de la glycoprotêine.

Il semble que cette glycoprotêine soit traduite sous forme d'un précurseur comportant un peptide signal hydrophobe de 19 acides aminés, ce peptide est noté de 1 à -19 sur la figure 1.

Il est intéressant de noter que la protéine contient deux autres régions hydrophobes, le peptide transmembranaire situé en fin de séquence, et une petite zone hydrophobe centrale dont la fonction est actuelle¬ ment inconnue.

Comme on peut le remarquer sur la figure 1, le départ de la séquence qui code pour la glycoprotêine mature est suivi très rapidement par un site HindIII. II est donc intéressant de pouvoir cloner des fragments du gène débutant au site HindIII.

Afin de pouvoir cloner de façon satisfaisante une telle séquence d'ADN, il a été nécessaire de cons¬ truire un vecteur avec un signal de traduction-initiation immédiatement suivi par un site HindIII en phase correcte.

OMPI

WIIPPOO

A cette fin, on construit des vecteurs à partir du phage M13 dans lesquels le site HindIII est en phase 1, 2 ou 3 suivant les vecteurs afin d'être certain de l'expression correcte de la protéine. Comme cela a été indiqué précédemment, et afin d'obtenir de préférence une protéine soluble, on essaie¬ ra d'éliminer la protéine transmembranaire situé après le site HindII. ^•

Par digestion du plasmide pRG avec les enzymes correspondantes, on isole les séquences de restriction suivantes :

1. HindIII - PstI

2. HindIII - Xhol

3. HindIII - StuI 4. HindIII - Nru

5. HindIII - AosII 8. StuI - PstI 10. HindIII - HindII Ces séquences sont insérées dans les sites correspondants des phages M13 : les fragments HindIII/ sont clones dans le phage M13tgl09 et le fragment StuI/ PstI dans le phage M13mp701.

La figure 2 rassemble les différentes séquences de restriction qui ont été clonëes _r avec à la partie inférieure la mention du phage M13 utilisé ainsi que le site de restriction correspondant du phage.

La souche E. coli JM103 est infectée avec les phages comportant lesdites insertions et cultivée sur des milieux appropriés, en particulier supplémentês avec du succinate de sodium comme source de carbone de façon à limiter la répression catabolique du promoteur lac. L'expression de ce promoteur est induite par addition de IPTG, la synthèse de la protéine étant suivie par incorporation de méthionine marquée. Les bactéries sont ensuite collectées puis la

glycoprotêine en est extraite et purifiée par incubation avec un antisérum correspondant à la protéine purifiée. Les complexes antigènes-anticorps sont récupérés par chromatographie d'affinité, lavés puis dissociés de façon à isoler la protéine antigénique.

Les poids moléculaires des protéines ainsi obte¬ nues après purification sont cohérents avec ce "qui était attendu, c'est-à-dire une protéine hybride comportant une partie - β-galactosidase et une partie de la glycopro- ^" téine antigénique de la rage correspondant à la séquence clonêe.

Les résultats observés sont rassemblés dans le tableau I ci-après.

Ces résultats sont rappelés sur la figure 3 afin de mieux comprendre les enseignements que l'on peut tirer de ces expériences.

Sur cette figure 3 on a noté G le fragment de restriction PstI - PstI du gène de la rage sur lequel ont été représentes les principaux sites de restriction qui ont été mis en oeuvre.

On a ensuite représenté par P le schéma de la glycoprotêine antigénique de la rage, les chiffres repré¬ sentant le nombre d'aminoacides comptés à partir de l'origine de la glycoprotêine mature. On a représenté également par des cercles noirs ou blancs les sites de glycosylation.

Dans les mêmes conditions que pour P, on a re¬ présenté en H la séquence de la glycoprotêine antigéni¬ que sur laquelle figurent, représentées par des carrés, les régions hydrophobes.

On a ensuite schématisé par iP les différents fragments de restriction clones. Les fragments de restric-

+ tion notés iP et représentés en traits doubles corres¬ pondent à des fragments de restriction qui, après clonage, ont donné naissance à une protéine immunoprécipitante.

OMPI WIPO

TABLEAU I

Les calculs ont été effectués en admettant que le poids moléculaire moyen d'un acide aminé est de .110 daltons, \ (a) la fin de la traduction se produit au codon stop de la glycoprotêine naturelle. λ f-."» la . in en nr_.rlιι.t an (•nrlnn etnn rie. I 'r. — nf»ιτh _r._- β— πa I ar .ne îrlaco

₀ \\ (c) traduction hors phase du segment distal de l' -peptide. g; j (d) traduction hors phase de la séquence distale codant pour la (

•S >_/ (e) aucune bande n'a été observée lors de l'immunoprécipitation.

par contre les fragments de restriction notés iP et représentés par un seul trait n'ont pas donné lieu à une immunoprécipitation. Les essais effectués sur iP +-et iP— conduisent donc par recouvrement à isoler une zone représentée dans le schéma iZ par un carré qui est la zone indispensable pour qu'apparaisse dans la protéine correspondante une propriété immunoprécipitante.

On a représenté sous iZ la protéine codée par ce fragment de recouvrement situé entre StuI et Nrύl.

Les abréviations utilisées dans cette descrip¬ tion correspondent aux codes internationaux et en parti¬ culier les codes à une seule lettre pour les acides aminés sont les suivants : R = Arg C ≈ Cys

G ≈ Gly V = Val

L ≈ Leu M = Met

Y = Tyr D ≈ Asp

K = Lys T = Thr S = Ser = Trp

A = Ala

Les exemples suivants sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantagesdes pro¬ cédés et des produits selon la présente invention; ils seront décrits en se référant aux figures annexées sur lesquelles :

La figure 1 représente la structure du gène codant pour la glycoprotêine de la rage; la figure 2 représente les différentes séquences de restriction qui ont été clonées sur M13; la figure 3 représente la stratégie pour mettre en évidence une séquence importante dans le cadre de l'invention; la figure 4 représente la structure de différents phages dérivés de M13;

OMPI

la figure 5 schématise la synthèse du plasmide pTG907; . _{. ..} .. la figure 6 schématise la synthèse du phage M13tg910; la figure 7 schématise la structure du phage

M13tg910; la figure 8 schématise la synthèse du plasmide pTG908; la figure 9 schématise la synthèse du plasmide pTGlβl; la figure 10 représente le fragment ADN présent dans les phages M13tgRG7 et M13RG151 et leur produit de traduction; la figure 11 illustre la détection de la glyco- protéine de la rage produite par diverses souches selon l'invention; la figure 12 représente l'effet de la tempéra¬ ture d'induction sur l'expression de la glycoprotêine de la rage. En outre, sauf indication contraire les procédés et les souches mis en oeuvre sont les suivants : a) Souches bactériennes

Les souches bactériennes utilisées dans le cadre de la présente invention sont les suivantes : - TGE900 qui est une souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes : su F his ilv bio (λcl857ΔBamΔHI)

- N6437, souche de E.coli ayant les caractéris- tiques suivantes : F -his ilv gai+ Δ8proC+ : tnlO lacΔml5 (λcl857ΔBamΔHI) .

- Jml03 qui est une souche de E. côli ayant les caractéristiques suivantes : Δ(lac-pro) sup thi endA sbcBl5 sttAr ^" nK ⁺ / F ¹ traD36 proAB ⁺ laci ^a lacZΔml5.

Les souches mentionnées précédemment ont été utilisées parce qu'elles étaient disponibles, mais il est

OMΠ

bien entendu qu'il est possible d'utiliser d'autres sou¬ ches dans la mesure où elles présentent certaines carac¬ téristiques essentielles qui sont rappelées dans le cours de la description détaillée. b) Préparation des ADN

Des mini-préparations d'ADN de plasmides ou de phages Ml3 sont effectuées comme cela est décrit par . ^• : Ish-Horowitz (référence 1) à la seule différence que l'ADN est précipité une seconde fois avec de l'éthanol avant d'être utilisé.

Les maxi-préparations sont effectuées comme cela est décrit dans la publication précédente, avec une puri¬ fication complémentaire par un gradient de densité CsCl/ bromured'êthidium. c) Techniques de clonages

Le traitement des ADN avec des enzymes de res¬ triction est effectué, sauf indications contraires, en utilisant les conditions indiquées par le fabricant. (New England Biolabs, Bethesda Research Laboratories et Boehringer Mannheim) .

Lorsque cela est nécessaire, les phosphates des extrémités 5' sont éliminés en utilisant, soit une phos- phatase alcaline bactérienne, soit une phosphatase d'in¬ testin de veau, pendant 30 minutes à 37°C dans le. tampon d'enzyme de restriction.

La réparation des extrémités cohësives utilisant la polymérase de Klenow (Boehringer Mannheim) est effec¬ tuée à 25°C pendant 15 minutes dans un mélange de 50 mMol. Tris HC1, pH 7,8, 5mMol. MgCl ₂ , lO Mol. de g-mercapto- éthanol, 0,4 mMol. de dNTPs avec l'enzyme de 10 à 200 yg/ml d'ADN.

La nuc.léase S. (Miles) est utilisée à 2 u/μg d'ADN à 25°C pendant 30 minutes dans un milieu 0,3 Mol. NaCl, 0,03 Mol. NaOAc, pH 4,8, 0,003 Mol. ZnCl-- Bal31 est utilisée selon le procédé de Panayotatos

' ^Ë ζ

OMPI

et al (référence 2) . Les ligations sont effectuées à 15°C (sauf lorsque cela est indiqué différemment) pendant 4 à 24 heures en utilisant de l'ADN ligase - (Boehringer Mannheim) avec 100 mMol. de NaCl, 66 mMol. de Tris HC1, pH 7,5, 10 mMol. de MgCl ₂ , 0,5 mMol. de spermidine, 0,2 mMol. de EDTA, 2 mMol. de DTT, 1 mMol. d'ATP, O,l mg/ml de BSA et 5 à 50 μg/ml d'ADN.

Pour la ligation d'extrémités cohésives, on utilise environ 30 unités/ml de ligase. Pour la ligation des extrémités franches on utilise environ 100 unités/ml de ligase.

Entre les différentes réactions enzymatiques, des échantillons d'ADN sont extraits avec un mélange phénol/chloroforme puis précipités à l'éthanol. Lorsque cela est nécessaire, du tARN de E. coli ou de levures est utilisé comme entraîneur. Les adaptateurs moléculai¬ res (Collaborative Research, Bethesda Research Laborato¬ ries, New England Biolabs) sont préhybridës et utilisés en excès molaire de 10 à 50 fois pour les extrémités franches d'ADN utilisant les conditions de tampon décri¬ tes précédemment avec 100 unités/ml de ligase T. à 4°C pendant 15 heures. Lorsque l'on utilise des adaptateurs non phosphorylés, les adaptateurs qui n'ont pas réagi sont éliminés directement après ligation par précipita- ^* tion avec le tétrachlorhydrate de spermine (Hoopes et al. (référence 3) .

Lorsque l'on utilise des adaptateurs phosphory¬ lés, le mélange de ligation est tout d'abord extrait avec un mélange.phénol/chloroforme puis précipité avec de l'éthanol avant coupure spécifique avec les enzymes de restriction appropriées puis précipitation avec le tétra¬ chlorhydrate de spermine.

Les cellules bactériennes compétentes sont pré¬ parées puis transformées avec les plasmides ou tranfëctées par l'ADN de M13 selon les procédés décrits par Dagert et Ehrlich (référence 4) .

OMPI

EXEMPLE 1 Construction de nouveaux vecteurs 13

La construction de ces vecteurs est indiquée dans le tableau II ci-après sur lequel figurent les références du phage de départ, la nature de l'enzyme de restriction avec laquelle il a été découpé, le traitement particulier qu'ont subi les fragments ainsi obtenus et la nature de l'insert qui a été fixé dans les sites ainsi révélés. Le phage M13mp7 est commercialisé par la

Société BRL.

Ml3mp701 est obtenu à partir de M13mp7 par remplacement du fragment PstI - EcoR à droite (CTG CAG GAA TTC) par la séquence : CTG CAG CAA TTC. Le principe de la construction est décrit dans le schéma suivant :

ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCC CCG GAT CCC TCA CTG SCC X13sp7Q

ATGACCATGATTACGAATTCCCCG GATCCGTCGACCTG G ASTTC CTGGCC

TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAG GCAGCTCGACGTCGTTAAGTCACCGS

D"A poly I≈erase

ATGACCATGATTACGAATTCCCCGGATC -IGATCCGTCGACCTG -G i ÏTCACTGGCC TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAG CTAGGCAGCTGGî. GïCGTTAAGÎGACCGG

Linker KindïII

;

ATGACCATGATTACGAATTCCCCGGATCCCAAGCTT GG CCAAGCTTG GATCÛGTCGACCT&CJGCAAT TCACTGGCC TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAGGGTTCGAACC GGTTCGAACCCTAGGCAGCTGGACGTCGTTAAGTGACCG2

HindIII!

ATGACCAT GATTACGAATTCCCCGGATCCCA AGCTTGGGATCCGTCGACCÏGCAGCAATTCACTGGCC

TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAGGGTTCGA ACCCTAGGCAGCTGΞACGTCGTTAAGTGACCGÛ

ATG ACC ATG ATT ACG A -AT TCC CCG GAT CCC AAG CTT GGG ATC CGT CCA CCT GCA _CA ATT C C

Eco R I San HI Hï n III Saa HI Sal PstI

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Les protocoles d'utilisation des enzymes (res¬ triction, DNA polymérase, T,DNA ligase) sont ceux indiqués dans les notices des fournisseurs. Le lin er HindIII est un oliglonuclëotide synthétique de séquence j'CCAAGCTTGG ³ (Collaborative Research, Inc., altham, Mass 02154, U.S. .). La séquence du phage recombinant Ml3tgll8 obtenu a été vérifiée. Le DNA double brin des phages Ml3tgll8 et mp701 a été purifié selon la méthode de Ish-Horowicz D. et Burke J.F. (Nucl. Acids Res. S _r 2989 - 2998, (1981)), coupé avec les enzymes de restriction appropriées et déphosphorylê. ^" à l'aide de phosphatase alcaline intesti¬ nale de veau (Sigma) .

La figure 4 représente les différents phages Ml3 en cause ainsi que les phages mp7 et mp701 qui ont servi à les élaborer.

Sur la figure 4, on a représenté, outre la sé¬ quence d'ADN du phage, la protéine correspondante ainsi que. les sites de restriction.

Sur la droite de la figure on a également fait figurer l'existence ou non d'une α-complémentation pour le gène lac lorsque le phage Ml3 est inséré dans un E. coli, en particulier dans la souche M103.

EXEMPLE 2 Préparation des fragments du gène de La glycoprotêine de La rage i . Purifi cation du fragment de 1 ,6 b HindIII-PstI

Le plasma pRG, inclus dans la souche E . coli ^~ - HB101 , a été purifié selon la méthode de lysat clair de Ish-Horowicz. 500 ug de DNA plasmidial a été coupé par les enzymes de restriction HindIII et PstI. Le produit de digest a été déposé sur un gel de "low température" agarose (BRL) . Après migration, le morceau de gel conte¬ nant la bande de 1 , 6 Kb a été découpé, dissout à 67 °C, phënolisë et l 'ADN précipité à l ' éthanol et appliqué sur une colonne de 1 ml de Sephadex G-50 (Pharmacia)

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équilibré au TE (Tris/HCl pH 7,5 10 mMol.; EDTA 1 mMol.). Les ractions exclues ont été précipitées à 1*éthanol (2 vol.) et reprises dans 100 ul de tampon TE. 200 ug de DNA purifié ont été ainsi obtenus. ii. Digestion par des enzymes de restriction

.P.o r le clonage de chaque sous fragment, 5 ug de DNA purifié ont été digérés par les enzymes de res¬ triction appropriées.

EXEMPLE 3 Clonage des sous fragments

Les sous fragments du gène de la glycoprotêine de la rage ont été ligués dans les vecteurs préparés comme indiqué précédemment. La ligation a été effectuée mole à mole, dans les conditions préconisées par le fournisseur.

Le produit de ligation a ensuite été transformé dans la bactérie E. coli JM103. La présence et la taille des inserts dans les phages MI3 obtenus ont été testées_ par la méthode de mini lysat de Birnboim H.C. et Doly J. (Nucl. Acids Res. 1_, 1513-1523 (1979)). Des phages recom¬ binants ont été obtenus pour les fragments

HindIII - PstI

HindIII - Xhol

HindIII - StuI HindIII - NruI

HindIII - AosII HindIII - HindII ' ^stuI ~ PstI EXEMPLE 4 I munoprécipitation des protéines synthétisées

Les phages recombinants ont été cultivés ^' dans 10 ml de milieu minimum M„ (Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics (1972)) avec du succinate de sodium

* Col d Spring Harbor Labora tory

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(0,5%) comme source de carbone jusqu'à une DOg _g0 de 0,25.

A ce stade, de l'IPTG* a été ajouté à la concentration de 0,1 mMol., ainsi que de la L-( 35S)- méthionine (12 uCi/ l) et de la L-mêthionine à la concentration de 5 ug/ml. Après 1 heure d'incorporation, les bactéries ont été récoltées et lysëes en présence de lysozyme à la concentration de

2 mg/ml pendant 5 mn à 4°C. Le surnageant clarifié a été incubé à 4°C pendant 16 heures avec des anticorps anti- glycoprotéine rabique (fournis par l'Institut istar, U.S.A.) puis 1 heure à 25°C avec 8 mg de protéine A

Sepharose (Pharmacia) selon Lathe R. et al.. Nature 284, 473-474 (1980) . Après des lavages abondants, cette pro¬ téine A a été déposée sur un gel d'acrylamide 10% + SDS classique (Laemmli U.K., Nature 227, 680-685 (1970)). Après migration, le gel a été traité au PPO, puis séché et mis à exposer (Bonner .M. et Laskey R.A. , Eur. u. Bioche . 4_5_, 83-88 (1974)).

Ces ^" essais mettent en évidence que la glycopro¬ têine synthétisée par les bactéries ainsi que les sous fragments sont efficacement reconnus par l'antisërum, en particulier pour les fragments codés par les séquences HindIII/PstI, HindIII/Acyl , StuI/PstI et HindiII/NruI.

* IPTG: Isopxopyl thiogalactopyranos±de .

EXEMPLE 5

La préparation d'un plasmide selon l'invention implique tout d'abord la préparation d'un plasmide com¬ portant :

- l'origine de réplication de pBR322, - le gène de résistance à l'ampicilline de ce p même plasmide amp ,

- le promoteur P _x et le gène λN, et, en outre, au cours de cette synthèse on doit s'effor¬ cer de faire disparaître les sites de restriction gênants afin de pouvoir obtenir plus tard dans le cours de la

synthèse des sites uniques de restriction.

1 - Suppression du site PstI dans pBR322

_Le plasmide de ^* base utilisé est le plasmide pBR322; toutefois, celui-ci présente l'inconvénient ^* d'avoir à l'intérieur du gêne amp un site de restriction PstI, car un site de même nature sera utilisé par la sui¬ te dans la zone de clonage- comme site unique de restric¬ tion. Il convient donc de faire disparaître ce site de restriction PstI en utilisant un mutant du plasmide pBR322, le plasmide pUC8, dans lequel le gène de résis¬ tance à l'ampicilline ne présente pas de site de restric¬ tion PstI (ce site a été éliminé par mutation in vitro) . pBR322 est commercialisé notamment par Bethesda Research Laboratories et pUC8 est décrit dans l'article référencé 5.

Pour ce faire, on échange le fragment PvuI/PvuII de 1 669 bp de pBR322 avec le fragment analogue PvuI PvuII du plasmide pUC8. Afin de réaliser cet échange les plas¬ mides pBR322 et pϋC8 sont traités successivement par Pvul, PvuII, puis circularisés par section d'une ligase. On obtient ainsi la plasmide pTG902 qui ne présente plus de site de restriction PstI et qui a éga¬ lement perdu le site de restriction Ndel présent à l'ori¬ gine sur pBR322 (non représenté sur la figure 5) . En outre, la plasmide pTG902 porte un fragment de 50 bp correspondant à la séquence laci' dans lequel se trouve -le site PvuII.

2 - Insertion du promoteur P. et du gène λN et préparation du plasmide de pTG907 Le promoteur T? et le gène λN sont isolés du plasmide pKC30 pour être insérés dans pTG902, le segment prélevé contient également 1'opérateur O _τ J-l sur lequel agira le répresseur thermosensible cl850, comme cela sera décrit dans les essais. En outre, le procédé permet de supprimer les sites EcoRI et HindIII tout en conservant

un site unique BamHI en aval du gène N pour pouvoir ensuite insérer λcllrbs. Le plasmide de pKC30 est décrit dans la référence6. pTG902 est coupé en son site de restriction unique EcoRI et les extrémités 5' sortantes sont éliminées par traitement à la nucléase S _τ . Après une digestion avec BamHI, le fragment le plus important est purifié sur gel.

Le fragment portant le promoteur P et le gène λN est préparé de la même façon à partir de pKC30 en traitant successivement le plasmide par Pvul, la nucléa¬ se S et BamHI. Les fragments, après purification sur gel, sont soumis à l'action de la ligase, ce qui conduit à la fusion EcoRI/PvuI et à la reconstitution du site BamHI.

Le mélange de ligation est utilisé pour trans- former des cellules hôtes compétentes, TGE900, à 30°C.

Cette souche contient le prophage χ délétê, λcl857ΔBamΔHI, qui fournit le répresseur de λ thermosensible, cl857, qui est nécessaire pour bloquer la transcription à partir de

^P L" Ceci est important car l'activité de P _τ dans un milieu N est léthale compte tenu de la fonction d ¹ anti¬ terminaison de N.

Après analyse par enzymes de restriction, les clones contiennent des plasmides de structure correcte et sont ensuite testés pour leur manque de viabilité à 42°C.

L'un des plasmides obtenus, pTG906, est traité de façon à éliminer le segment Pvull-Sall de manière à supprimer les sites de restriction compris sur ce segment et afin de faire disparaître également les deux sites de restriction extrêmes. Pour ce faire, pTG906 est traité successivement avec Sali, la nucléase S , PvuII et la ligase.

On obtient ainsi le-plasmide pTG907 qui comporte l'ensemble des éléments évoqués au début de cette étape et, en outre, qui est Pst Eco Hind Sal Ava Nde

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PvuII . La synthèse ^' de ce plasmide est représentée sur la figure 1. . _.. . - . - ..- -. - . . - - -

3 - Clonage de la région λcllrbs

La seconde phase importante de la synthèse consiste à insérer la région λcllrbs sous forme d'un fragment Aval/Taql dans le début du gène lacZ* (fragment α de la β-galactosidase) lequel a été clone dans le phage M13 nommé M13tgll0. Cette stratégie permet un test fonc- . tionnel simple pour rbs, à savoir la production de la protéine lacZ' et, par conséquent, d'obtenir des plaques bleues en présence d'IPTG et de Xgal; ceci permet égale¬ ment un séquençage rapide de la construction en utilisant la méthode dite du didéoxy.

La région cllrbs est isolée à partir d'un plas- mide pOGll qui contient un fragment de λHaeIII/Sau3A qui s'étend du milieu du gène cro jusqu'au milieu de la région codant pour cil (cro et cil étant impliqués notamment dans la régulation de la lysogénie du bactériophage λ) . On prélève dans pOGll le fragment Aval/Taql de 186 bp contenant la région cllrbs et on le traite avec la polymérase Klenow. D'autre part, on traite le phage M13tgll0 par BamHI puis par la polymérase de Klenow suivi ^* d'un traitement à la phosphatase intestinale de veau. Les fragments obtenus sont soumis à l'action de la ligase T.. Un examen des séquences du fragment de pOGll comportant la région cllrbs et du phage M13tgll0 permet de prévoir que l'insertion du fragment portant cllrbs dans le site BamHI de M13tgll0 doit conduire à l'obtention de plaques bleues après fermentation des bactéries trans- fectées compte tenu du fait que le gêne lacZ' est en phase pour la traduction à partir de AUG du gène de cil, tandis que les plaques correspondant à la souche parentale M13tgll0 sont blanches.

Les plaques bleues sont prélevées puis les co- lonies sont sélectionnées par analyse de restriction ^" _.__

enzymatique des mini-préparations et l'on vérifie ensui¬ te par sequençage que la construction obtenue est correcte.

On obtient un clone résultant M13tg910 dont la structure globale est représentée à la partie inférieure de la figure 6 et la structure détaillée est représentée à la figure 7.

On constate que l'insertion du fragment cllrbs reconstruit en amont les sites BamHI et Aval et en aval le site BamHI. La traduction à partir de AUG de cil conduit à la fusion des 13 aminoacides terminaux de cil aux 8 aminoacides du H ₂ terminal de la protéine lacZ* .

4 - Insertion du fragment λcllrbs dans Le plasmide pTG907

La troisième étape de cette synthèse consiste à transférer le fragment clIrbs/lacZ* du phage M13tg910 sur le plasmide vecteur pTG907 préparé précédemment.

Pour ce faire, il convient tout d'abord d'éli¬ miner les sites EcoRI, BamHI et Aval en amont de cllrbs puis d'insérer un site BglII. Dans ces conditions, cllrbs peut être prélevé sous forme d'un fragment BglII-BglII et placé dans le site —Ba—m ^* HI en aval du promoteur PI_l et du gène λN de pTG907.

Le phage M13tg910 est digéré avec EcoRI puis traité avec Bal31 puis ensuite par la polymérase de

Klenow. Les fragments obtenus sont alors soumis à l'ac¬ tion de la ligase en présence d'adaptateurs BglII non phosphorylës. Le mélange de ligation obtenu est utilisé pour transformer des cellules compétentes JM103. On sélectionne alors les plaques bleues. Ces clones sont ensuite analysés afin dé vérifier qu'ils contiennent le site BglII et qu'ils ne présentent plus de site EcoRI ou BamHI en amont. On obtient ainsi des clones tels que M13tg9l2 dont la structure est représentée sur la figure 8.

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Le traitement par Bal31 a produit une délétion de 101 bp éliminant les sites EcoRI, BamHI et Aval; ainsi que les séquences de lac ATC et lac Shine/Dalgarno. Le site BglII introduit se trouve placé environ 100 bp en amont de 1'ATG _. de cil et 10 bp en aval de ^]P _lac -

Afin de remplacer le site BamHI du phage M13tg9l2 par un site EcoRI, ce .phage est traité par BamHI, la nu¬ cléase S puis le produit de ces traitements est ligué en présence d'un adaptateur ^' EcoRI-GGAATTCC, on obtient ainsi le phage M13tg9l3.

La suite de la synthèse met en oeuvre un adapta¬ teur Hgal/SphI qui permet l'insertion d'un fragment BglII/Hgal portant cllrbs et lacZ' entre les sites BamHI et SphI de pTG907. Le fragment BglII/Hgal de M13tg913 est introduit entre les sites BamHI et SphI de pTG907 grâce à un adap-- tateur Sphl-Hgal, afin de générer le plasmide pTGlδl.

Afin d'avoir une première indication montrant que les différents éléments du système d'expression se conduisent comme cela est désiré, la plasmide obtenu, pTG16l, peut être transféré dans une souche hôte N6437. Cette souche qui possède à la fois cl857 et le fragment ω de la β-galactosidase complémentant le fragment α qui est codé par le plasmide après transformation permet d'observer sur une boîte contenant IPTG + Xgal le passage de la couleur blanche à 28°C au bleu environ 30 minutes après lorsqu'on la transfère à 42°C.

EXEMPLE 6

Les différents fragments du gène de la rage sont clones dans le plasmide pTGlôl sous forme de fragment EcoRI/PstI par digestion du plasmide et du phage M13 correspondant avec ces enzymes. Les fragments de restric¬ tion sont liés par la ligase T..

On obtient de cette façon divers plasmides : pRG107, à partir du phage M13rg7

OMPI IPO

pRG7l-22, à partir d'un mutant du phage Ml3rg7 pRG72 et 73, à partir de phages dérivés de M13rg7l-22 PRG151, à partir du phage Ml3rgl5l pRG123, à partir du phage Ml3rgl23. Ces plasmides sont utilisés pour tranformer la souche de E.coli TGE900.

Les souches TGE900 incorporant les différents plasmides sont mises en culture sur un milieu riche à 28,5°C jusqu'à une densité optique de 0,1 à 660 n , puis de nouveau incubées pendant 5 heures à 35°C. Les cellu¬ les sont récupérées par centrifugation et soumises à une électrophorèse sur gel en présence de SDS.

Les protéines séparées sur gel sont transférées par électrophorèse sur de la nitrocellulose. Les anti- gènes capables de se lier aux anticorps monoclonaux dirigés contre les glycoprotéines de la rage sont détec¬ tés par incubations successives avec les anticorps et un antisérum de chèvre marqué à 1125 dirigés ^" contre une immunoglobuline de souris, comme cela est décrit par Burnette (1981).

Les bandes radio-actives sont révélées par autoradiographie (figure 11) . Les différents résultats correspondent aux colonnes suivantes :

A - plasmide pTGl6l sans insertion B - plasmide pRG7

C - plasmide pRG71-22

D - plasmide pRG73

Ξ - plasmide pRGl5l

F - plasmide pRGl23 m - indique la position des marqueurs de poids moléculaire en kD.

Compte tenu de la nature de ces expériences, les positions observées sont seulement approximatives.

Lès positionsdes bandes spécifiquement détectées sont indiquées par des flèches. Dans la colonne F une

OMPI IPO

bande légère à environ 38 kD peut indiquer une réaction _" ; légère de 1'anticorps avec la séquence de glycoprotéines rabiques exprimées dans cette souche.

La fixation initiale des antigènes rabiques est effectuée en utilisant un mélange de deux anticorps mono- clonaux 101-1 et 509-6 neutralisant le virus qui a été fourni par le istar Institute.

EXEMPLE 7

Influence de La température d'induction La souche .TGE900/pRGl23 est mise en croissance sur un milieu enrichi à 2S,5°C jusqu'à ^' une densité opti¬ que de 0,1 à 660 nm. On ajoute de la L-méthionine S-. ₅ avec une activité de 5 uCi.ml et les aliquots sont mis en incubation pendant 5 heures à différentes températures. Les cellules sont concentrées par centrifugation et des échantillons soumis à une électrophorèse sur gel de poly- acrylamide à 10% en présence de SDS, comme cela est décrit par Laemmli (1970) . Les bandes radioactives sont révélées par fluorographie (Laskey & Mills, 1975) . Les résultats de cette fluorographie sont représentés à la figure 12. Les températures d'incubation sont les suivantes : A - 28,5°C B - 34,5°C C - 37°C D - 39°C

E - 42°C.

La position des marqueurs de poids moléculaire est indiquée dans la colonne m, les poids moléculaires étant indiqués en kD. La ^' flèche indique la position de la glycoprotêine de la rage et l'on constate une forte influence de la température d'incubation sur la produc¬ tion de cette protéine, la température optimum étant de 34,5°C.

REFERENCES

1. Ish-Horowicz D. et Burke J.F., Nucl. Acids Res. J9, 29S9-2998 (1981).

2. Panayotatos N. et Trong K., Nucl. Acids Res. .9, 5679-5688 (1981).

3. Hoopes B.C. et McClure R.R., Nucl. Acids Res. _ , 5493-5504 (1981).

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7. Burnette .N., Analytical Biochem. 112, 195-203 (1981)

8. Laem li U.K., Nature 227, 680-685 (1970).

9. Laskey R.A. & Mills A.D., Eur. J. Biochem., 56, 335-341 (1975) .