NITRATO-AMINOSAURE-DISULFIDE ZUR THERAPIE VON ERKRANKUNGEN DES HERZ-KREISLAUF ^¬ SYSTEMS

Beschreibung

Die Erfindung betrifft neue, eine Disulfidgruppe enthaltende Nitrate und Verfahren zu deren Herstellung.

Organische Nitrate (Salpetersäureester) sind bewährte Arznei- Stoffe zur Behandlung von Herzerkrankungen. Sie entfalten ihre Wirkung sowohl durch eine Herzentlastung über eine Senkung von Vor- und Nachlast als auch eine Verbesserung der Sauerstoff¬ versorgung für das Herz über eine Erweiterung der Koronarien.

In den vergangenen Jahren wurde jedoch festgestellt, daß die in der Therapie eingesetzten klassischen organischen Nitrate wie Glyceroltrinitrat, Isosorbiddinitrat oder Isosorbid-5- mononitrat bei kontinuierlicher Zufuhr hoher Dosen innerhalb kurzer Zeit eine deutliche Abschwächung der Wirkung, die Nitrattoleranz, aufweisen. Dieser Mangel konnte mit den durch EP 0 362 575 und EP 0 451 760 zur Verfügung gestellten Verbin¬ dungen behoben werden.

Entsprechend EP 0 362 575 und EP 0 451 760 wird die Wirkung der Nitroverbindungen über hieraus gebildete NO-Radikale ver¬ mittelt. Durch Reaktion der Nitrate mit der Thiolgruppe von Cystein kommt es dabei zunächst zur Ausbildung eines reaktiven und kurzlebigen, bisher noch hypothetischen Intermediärproduk¬ tes, das vermutlich der Thiolester der Salpetersäure oder ein Thionitrat ist, das intramolekular umlagert und nachfolgend in ein pharmakologisch aktives NO-Radikal und ein instabiles Thioradikal zerfällt, welches mit weiteren Thioradikalen zu dem entsprechenden Disulfid umgesetzt wird. Die Bildung und Freisetzung des NO-Radikals benötigt eine reduzierte Thiol- gruppe enthaltendes Cystein, das zu Disulfiden umgesetzt wird, so daß die Abnahme der Wirkung von Nitroverbindungen bei an¬ dauernder Zufuhr oder Gabe hoher Dosen auf eine Erschöpfung

des SH-Gruppenpools zurückgeführt wird. In EP 0 362 575 und EP 0 451 760 werden Verbindungen beansprucht, die Sulfhydryl- gruppen enthalten und aufgrund dieses allgemeinen Bauprinzips eine Nitrattoleranz verhindern oder eine bereits eingetretene Nitrattoleranz abschwächen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß auch Nitroverbin¬ dungen, die anstelle einer freien Thiolgruppe eine Disulfid¬ gruppe enthalten, wirksam sind und bei andauernder Zufuhr ebenfalls keine Nitrattoleranz aufweisen. Gegenstand der vor¬ liegenden Erfindung sind daher Verbindungen der allgemeinen Formel I

^R —( ^CH 2)

0 1' (CH ₂ ) _p , o

II

-(CH ₂ )m' -(CH ₂ ) _n C—(CH ₂ ) ₀ '_C_R ^:

I _? ,

R ^~

in der R und R' Gruppen der allgemeinen Formeln

0 ₂ N—0—(CH ₂ ) _r —C— und bedeuten,

^Rl2 _D 1

worin

R ¹¹ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, substi¬ tuiertes Niedrigalkyl, worin der Substituent Halogen, Hy- droxy, Niedrigalkoxy, Aryloxy, Amino, Niedrigalkyla ino, Acylamino, Acyloxy, Arylamino, Mercapto, Niedrigalkylthio, Arylthio ist

R ^AÄ wie R Wasserstoff oder Niedrigalkyl bedeuten

R ^J Nitratoalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist

r die Zahlenwerte 0 bis 10 besitzt

und in der

1 1 '

R , R Wasserstoff oder Niedrigalkyl bedeuten

R 2 , R5' Wasserstoff, Niedrigalkyl, Phenyl, Methoxyphenyl,

Phenylniedrigalkyl, Methoxy-phenylniedrigalkyl, Hydroxyphenylniedrigalkyl, Hydroxyniedrigalkyl, Alkoxyniedrigalkyl, Amino-niedrigalkyl, Acylamino- niedrigalkyl, Mercaptoniedrigalkyl oder Niedrig- alkylthio-niedrigalkyl ist

R , R ^J Hydroxy, Niedrigalkoxy, Niedrigalkenoxy, Di- niedrigalkylamino-niedrigalkoxy, Acylamino- niedrigalkoxy, Acyloxyniedrigalkoxy, Aryloxy,

Arylniedrigalkoxy, substituiertes Aryloxy oder substituiertes Arylniedrigalkoxy, worin der Substituent Methyl, Halogen oder Methoxy ist; Amino, Niedrigalkylamino, Di-niedrigalkylamino, Arylniedrig- alkylamino, Hydroxyniedrigalkylamino, Pyrollidin,

Piperidin, Morpholin, Piperazin oder Aminosäurereste über Peptidverknüpfung sind

R 4, R ' Wasserstoff oder Niedrigalkyl ist,

R , R ⁵ wie R , R Wasserstoff oder Niedrigalkyl bedeuten,

R ² und R ³ sowie R ² ' und R ³ ' miteinander unter Bildung eines Esters oder A ids verbunden sein können,

R ^x und R^ sowie R ^x und R^ miteinander unter Bildung einer Alkylenbrücke mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, einer Alkylenbrücke mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen und einem Schwefelatom, einer Alkylenbrücke mit 3 bis 4 Kohlen¬ stoffatomen, die eine Doppelbindung oder eine Alky¬ lenbrücke wie oben erhält, substituiert durch Hy- droxy, Niedrigalkoxy, Niedrigalkyl oder Di-niedrigal- kyl, verbunden sein können,

m, n, o, p, q sowie m' , n', o', p' und q' die Zahlenwerte 0 bis 10 besitzen

sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung Verbin¬ dungen, die die folgenden Bezeichnungen tragen:

- N'-3-Nitratopivaloyl-L-cysteinamid-glutathion-mixed- disulfid,

- N'-3-Nitratopivaloyl-L-cysteinethylester-glutathion-mixed- disulfid, - N'-3-Nitratopivaloyl-L-cysteinethylester-N'-acetyl-L- cystein-mixed-disulfid,

N-(3-Nitratopivaloyl)-L-cysteinethylester-D,L-penicillami n- mixed-disulfid,

2-Acetylamino-3-[2-(2,2-dimethyl-3-nitrooxy-propionylamin o)- 2-ethoxycarbonyl-ethyldisulfanyl]-3-methylbuttersäure.

Es handelt sich hierbei um asymmetrische Disulfide, die all- gemein schwefelhaltige Aminosäuren, insbesondere Glutathion oder Penicillamin, enthalten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Form ihrer Säure-Additionssalze vorliegen.

Nach einer Weiterbildung der Erfindung besitzt/en der/die aliphatische/n Teil/e der Nitratoalkylarylalkansäure und Nitratoalkansäurebestandteile eine Kettenlänge von 2-6 Kohlenstoffatomen; sie können geradkettig, verzweigt, racemisch oder optisch isomer sein.

Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Nitratoalkan- und Nitratoalkylarylalkan-Carbonsäurederivate der allgemeinen Formel (I) Disulfide von schwefelhaltigen Aminosäuren, insbesondere Cystin, Homocystin oder Penicillamindisulfid.

Nach einer weiteren Ausbildung der Erfindung liegen die Amino- säurendisulfide in der stereochemischen L- oder DL-Form vor.

Nach einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung weisen die beanspruchten Verbindungen die folgenden chemischen Formeln auf:

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-D,L-homocystin

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-diethylester N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-D,L-homocystin-diethylester N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-tert.-butylester N,N'-Di-(4-Nitratomethylbenzoyl)-L-cystin-dimethylester N,N'-Di-(3-Nitratomethylbenzoyl)-L-cystin-dimethylester N, '-Di-(4-Nitratomethylbenzoyl)-L-cystin-di-(N,N'-butylamid) N,N'-Di-(3-Nitratomethylbenzoyl)-L-cystin-di-(N,N'-butylamid ) N,N'-Di-(4-Nitratomethylbenzoyl)-L-cystindiamid N,N'-Di-(3-Nitratomethylbenzoyl)-L-cystindiamid N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-penicillamin-disulfid-diamid N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-diamid N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-(N,N'-methylamid) N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-(N,N'-butylamid) N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-(N, '-ter .-butylamid)

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-morpholid N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-diisopropylester

Entsprechend EP 0 362 575 können die erfindungsgemäßen Verbin¬ dungen der allgemeinen Formel I in an sich bekannter Weise hergestellt werden, indem die entsprechende Nitratocarbonsäure oder deren reaktionsfähige Derivate mit der Aminogruppe eines freien, veresterten oder amidierten Aminosäuredisulfides kon¬ densiert werden.

Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der R ³ und R ³ ' zu¬ sammen mit der benachbarten Carbonylgruppe eine Säureamid- funktion ausbilden, weisen gegenüber den bisher bekannten Nitraten eine verzögert einsetzende und lang anhaltende Wir- kung auf. Dies hat eine verminderte Aktivierung der durch die Gefäßerweiterung hervorgerufenen physiologischen Gegenregula¬ tionen zur Folge und erlaubt eine Verlängerung des Applikati¬ onsintervalls. Insbesondere die Abschwächung kompensatorischer Mechanismen ist vorteilhaft, da sie eine Reduktion der unter einer Nitrattherapie auftretenden Nebenwirkungen wie reflekto¬ rische Tachykardie erwarten läßt.

Besonders bevorzugt sind daher Verbindungen der allgemeinen Formel I in der R ^J und R ^J eine substituierte oder unsubstitu- ierte Aminogruppe bedeuten.

Alternativ können die betreffenden Nitratoalkyl- oder Nitra- toalkylarylalkyl-Carbonsäuren oder deren reaktive Derivate zunächst mit der Aminogruppe einer eine Thiolgruppe enthalten- den Aminosäure zum entsprechenden Säureamid kondensiert wer¬ den, welches anschließend mit Hilfe eines Oxidationsmittels wie Kaliumjodat unter Dimerisierung zu dem entsprechenden Di- sulfid der allgemeinen Formel I oxidiert wird.

Die Herstellung dieser Verbindungen gemäß diesen Methoden führt jedoch zu uneinheitlichen Produktgemisehen, in denen die

gewünschten Verbindungen nur in geringer Ausbeute enthalten sind und erfordern eine aufwendige Aufreinigung.

Diese Nachteile können dadurch vermieden werden, indem zu- nächst die entsprechenden Nitratocarbonsauren oder deren reak¬ tionsfähige Derivate mit den Aminogruppen freier über Disul- fidbrücken verknüpften Aminosäuren kondensiert werden, die er¬ haltenen Verbindungen an ihren Carbonsäurefunktionen in akti¬ vierte Ester überführt werden und diese anschließend mit Ammoniak, einem primären oder einem sekundären Amin zu den gewünschten Verbindungen umgesetzt werden. Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel II

R- -(CH ₂ ) ) ₀ - -R-

II

R'_(CH ₂ ) _m ) ₀ -R ³ '

in der R und R' Gruppen der allgemeinen Formeln

0 ₂ —0—(CH ₂ ) _r und bedeuten,

worin

R ¹¹ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, substi¬ tuiertes Niedrigalkyl, worin der Substituent Halogen, Hy- droxy, Niedrigalkoxy, Aryloxy, Amino, Niedrigalkylamino, Acylamino, Acyloxy, Arylamino, Mercapto, Niedrigalkylthio, Arylthio ist

R 12 wie R11 Wasserstoff oder Niedrigalkyl bedeuten

R 1 ^J 1 Nitratoalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist

die Zahlenwerte 0 bis 10 besitzt

und in der

R , R ¹ Wasserstoff oder Niedrigalkyl bedeuten

R 2, R ^~ ' Wasserstoff, Niedrigalkyl, Phenyl, Methoxyphenyl,

Phenylniedrigalkyl, Methoxy-phenylniedrigalkyl,

Hydroxyphenylniedrigalkyl, Hydroxyniedrigalkyl, Alkoxyniedrigalkyl, Amino-niedrigalkyl, Acylamino- niedrigalkyl, Mercaptoniedrigalkyl oder Niedrig- alkylthio-niedrigalkyl ist

R , R ^J Amino, Niedrigalkylamino, Di-niedrigalkylamino, Arylniedrigalkylamino, Hydroxyniedrigalkylamino,

Pyrollidin, Piperidin, Morpholin, Piperazin oder Aminosäurereste über Peptidverknüpfung sind

R , R ⁴ ' Wasserstoff oder Niedrigalkyl ist,

R ⁵ , R ⁵ ' wie R ⁴ , R ⁴ ' Wasserstoff oder Niedrigalkyl bedeuten,

R ^x 1 und R" sowie R1 ' und ' miteinander unter Bildung einer Alkylenbrücke mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, einer Alkylenbrücke mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen und einem Schwefelatom, einer Alkylenbrücke mit 3 bis 4 Kohlen- stoffatomen, die eine Doppelbindung oder eine Alky¬ lenbrücke wie oben enthält, substituiert durch Hy- droxy, Niedrigalkoxy, Niedrigalkyl oder Di-niedrigal¬ kyl, verbunden sein können,

m, n, o, p, q sowie m' , n', o', p' und q' die Zahlenwerte 0 bis 10 besitzen,

das dadurch gekennzeichnet ist, daß Verbindungen der allgemeinen Formel III

R—(CH ₂ ) _m —C—OH III

in der R Gruppen der allgemeinen Formeln

0 ₂ N- -(CH ₂ ) _r und bedeuten.

worin

R ¹¹ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, substi¬ tuiertes Niedrigalkyl, worin der Substituent Halogen, Hy- droxy, Niedrigalkoxy, Aryloxy, Amino, Niedrigalkylamino, Acylamino, Acyloxy, Arylamino, Mercapto, Niedrigalkylthio, Arylthio ist

R ¹² wie R ^x Wasserstoff oder Niedrigalkyl bedeuten

R ¹³ Nitratoalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist

m und r die Zahlenwerte 0 - 10 besitzen

in Form ihrer freien Säuren, reaktiven Säurehalogenide, Säure- Azide, Ester und Säure-Anhydride in an sich bekannter Weise mit Verbindungen der allgemeinen Formel IV

in denen

R , R ¹ ' Wasserstoff oder Niedrigalkyl bedeuten

R9, R ' Wasserstoff, Niedrigalkyl, Phenyl, Methoxyphenyl,

Phenylniedrigalkyl, Methoxy-phenylniedrigalkyl, Hydroxyphenylniedrigalkyl, Hydroxyniedrigalkyl, Alkoxyniedrigalkyl, Amino-niedrigalkyl, Acylamino- niedrigalkyl, Mercaptoniedrigalkyl oder Niedrig- alkylthio-niedrigalkyl ist

R 1, R ^J ' Hydroxy oder Halogen bedeutet

R 4, R ' Wasserstoff oder Niedrigalkyl ist,

R , R ^J wie R , R Wasserstoff oder Niedrigalkyl bedeuten,

R und R" ⁶ sowie R ^x und R^ miteinander unter Bildung einer Alkylenbrücke mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, einer

Alkylenbrücke mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen und einem Schwefelatom, einer Alkylenbrücke mit 3 bis 4 Kohlen¬ stoffatomen, die eine Doppelbindung oder eine Alky¬ lenbrücke wie oben enthält, substituiert durch Hy- droxy, Niedrigalkoxy, Niedrigalkyl oder Di-niedrigal- kyl, verbunden sein können,

n, o, p, q sowie n', o', p' und q' die Zahlenwerte 0 bis 10 besitzen

zu Verbindungen der allgemeinen Formel V

kondensiert werden, diese an ihren freien oder halogenierten Carbonsäurefunktionen mit N-Hydroxysuccinimid zu aktivierten Carbonsäure-N-hydroxysuccinimidester der allgemeinen Formel VI

R'_(CH ₂ ) _m ³

überführt werden, in denen

R° 1 und R ^J 1 ' abweichend von der oben genannten Bedeutung

bedeutet

und diese anschließend mit .Ammoniak, einem primären oder einem sekundären Amin, insbesondere mit Niedrigalkylamin, Di-nied- rigalkylamin, Arylniedrigalkylamin, Hydroxyniedrigalkylamin, Pyrollidin, Piperidin, Morpholin, Piperazin oder Aminosäuren zu den Verbindungen der allgemeinen Formel II umgesetzt wer- den.

Die in den allgemeinen Formeln genannten "niederen Alkylester" sind unverzweigte ober verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit höchstens 6 Kohlenstoffatomen. Spezielle Beispiele sind die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl, Isobutyl-, tert. Butyl-, Pentyl- und Isopentylgruppe. Die niederen Alkoxyreste enthalten ebenfalls höchstens 6 Kohlenstoffatome. Spezielle Beispiele sind die Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Isopropoxy-, Butoxy-, Isobutoxy- und tert.-Butoxygruppe. Bevorzugte niedere Alkyl- oder Alkoxyreste enthalten höchstens 4 Kohlenstoffa¬ tome. Besonders bevorzugt sind Reste mit 2 Kohlenstoffatomen. Der bevorzugte phenylsubstituierte niedrige Alkylrest ist die Phenylmethylgruppe oder die Phenylethylgruppe.

Die "niederen Alkanoylreste" sind Acylreste von Fettsäuren mit 2-6 Kohlenstoffatomen.

Als Halogenatome kommen Fluor-, Chlor-, Brom- und Jodatome in Frage. Bevorzugt sind Chlor- und Bromatome.

"Aryl-" bedeutet Benzyl- oder Phenylreste.

Die substituierten Benzyl- oder Phenylreste tragen den Substi- tuenten vorzugsweise in 4-Stellung.

Die hydroxysubstituierten niederen Alkylreste besitzen eine Hydroxylgruppe an einem Alkylrest der vorstehend beschriebe¬ nen Art, vorzugsweise aus endständigen Kohlenstoffatomen. Spe¬ zielle Beispiele sind die Hydroxymethyl- und die 2-Hydroxy- ethylgruppe.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen der allgemeinen For¬ mel I und II sowie ihre Salze können in flüssiger oder fester Form oral, enteral oder parenteral appliziert werden.

Als Injektionsmedium kommt vorzugsweise Wasser zur Anwendung, welches die bei Injektionslösungen üblichen Zusätze wie Stabi¬ lisierungsmittel, Lösungsvermittler oder Puffer enthält. Der¬ artige Zusätze sind z.B. Tartrat- und Citratpuffer, Ethanol, Komplexbildner (wie Ethylendiamintetraessigsäure und deren nicht toxische Salze), hochmolekulare Polymere (wie flüssiges Polyethylenoxid) zur Viskositätsregulierung. Feste Träger¬ stoffe sind z.B. Stärke, Lactose, Mannit, Methylcellulose, Talkum, hochdisperse Kieselgelsäuren, höhermolekulare Fettsäu¬ ren (wie Stearinsäure), Gelatine, Agar-Agar, Calciumphosphat, Magnesiumstearat, tierische und pflanzliche Fette und feste hochmolekulare Polymere (wie z.B. Polyethylenglykole) ; für orale Applikation geeignete Zubereitungen können gewünschten- falls Geschmacks- und Süßstoffe enthalten.

Nach einer weiteren Ausbildung der Erfindung weisen Arzneimit¬ tel einen Gehalt an einer und/oder einem Gemisch der erfin¬ dungsgemäßen Verbindungen auf.

Diese Arzneimittel können zur Behandlung von Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems, beispielsweise als Mittel zur Behand¬ lung der koronaren Herzkrankheit, des Blut-Hochdrucks und der Herzinsuffizienz sowie zur Erweiterung der peripheren Gefäße, einschließlich der Hirn- und Nierengefäße eingesetzt werden.

Pharmazeutische Zubereitungen, eine vorausberechnete Menge ei¬ ner oder mehrerer der erfindungsgemäßen Verbindungen enthal- tend, können einmal täglich in Form retardierter Zubereitungen oder mehrmals täglich in regelmäßigen Intervallen (2-3 mal täglich) verabreicht werden. Die überlicherweise pro Tag ap- plizierten Wirkstoff engen sind 20 - 300 mg pro Tag, bezogen auf 75 kg Körpergewicht. In Form von Injektionen können die erfindungsgemäßen Verbindungen 1-8 mal pro Tag bzw. durch

Dauerinfusion gegeben werden. Normalerweise reichen Mengen von 5-200 mg/Tag aus.

Eine typische Tablette kann folgende Zusammensetzung aufwei- sen:

1) N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystindiamid 30 mg

2) Stärke, U.S.P. 57 mg

3) Lactose, U.S.P. 73 mg 4) Talkum, U.S.P. 9 mg

5) Stearinsäure 6 mg

Die Stoffe 1, 2 und 3 werden gesiebt, granuliert, mit 4 und 5 homogen gemischt und anschließend tablettiert.

Die Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung, ohne darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Darstellung von N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl1-L-cystin

149,1 g (3,727 Mol) Natriumhydroxid wurden in 2,5 1 Wasser gelöst, auf 0°C gekühlt und unter Rühren und Eisbadkühlung 448,0 g (1,864 Mol) L-Cystein portionsweise zugegeben, wobei 5°C nicht überschritten wurden. Hierzu wurden 2,0 1 Dichlor¬ methan zugegeben. Anschließend wurden unter Kühlung und starkem Rühren gleichzeitig Lösungen, bestehend aus 734,0 g (3,961 Mol) 3-Nitratopivaloylchlorid in 1,0 1 Dichlormethan und 167,8 g (4,195 Mol) Natriumhydroxid in 1,0 1 Wasser langsam zugetropft, wobei die Temperatur auf maximal 29°C stieg. Nach zweieinhalbstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Dichlormethan-Phase abgetrennt, die Wasser-Phase mit 1,0 1 Dichlormethan gewaschen und unter Rühren mit 350 ml 37 %iger (4,227 Mol) Salzsäure versetzt, wobei ein öliges Produkt ausfiehl. Nach dreimaliger Extraktion dieses Gemisches mit je 2,0 1 Ethylacetat wurden die Extrakte vereinigt und am Rotavapor ^® eingeengt, wobei ein brauner, öliger Rückstand zu¬ rückblieb. Dieser wurde in 2,0 1 siedendem Ethylacetat gelöst und bei stark vermindertem Druck (Ölpumpenvakuum) und einer Badtemperatur von ca. 55°C bis zur Gewichtskonstanz eingeengt (Produkt schäumt stark). Der dabei erhaltene Rückstand wurde in 1,0 1 siedendem Ethylacetat gelöst, auf Raumtemperatur ab¬ gekühlt, mit 1,0 1 Dichlormethan verdünnt und unter Zugabe von Impfkristallen im Gefrierschrank bei ca. -30°C zur Kristalli- sation gebracht. Die auskristallisierte Substanz wurde abge¬ saugt, zweimal mit je 250 ml einer Lösung von 300 ml Dichlor¬ methan und 200 ml Ethylacetat von ca. -30°C gewaschen und im Vakuumtrockenschank bei ca. 40°C bis zur Gewichtskonstanz ge¬ trocknet.

Die Ausbeute betrugt 318,03 g (entsprechend 32,16 % d.Th. ) Fp: 47,2°C

Beispiel 2

Darstellung von N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl -D,L-Homocvstin

Die Darstellung und Aufarbeitung erfolgte analog Beispiel 1. Beim Ansäuern mit 37 %-iger Salzsäure fiel festes Produkt aus, das wie beschrieben mit Ethylacetat extrahiert und eingeengt wurde, wobei 51,3 g weißes, festes Produkt (entsprechend 73,5 % d.Th. ) zurückblieben.

Dieses wurde unter Erwärmen in 400 ml Methanol gelöst, fil¬ triert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Hierzu wurden unter Rühren 400 ml dest. Wasser zugegeben und 3 Std. bei Raumtempe¬ ratur gerührt, wobei langsam ein Produkt auskristallisierte. Dieses wurde abgesaugt, einmal mit einem Gemisch, bestehend aus 60 ml dest. Wasser und 40 ml Methanol gewaschen und an¬ schließend im Vakuumtrockenschrank bei ca. 40°C und ca. 2 Torr bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Die Ausbeute betrug 31,3 g (entsprechend 44,8 % d.Th.). Fp: ca. 42°C

Beispiel 3

Darstellung von N,N'-Di-f3-Nitratopivaloylsäure^-L-cvstin- diethylester

24,4 g (82,9 mmol) 3-Nitratopivaloyl-L-cysteinethylester wurden bei Raumtemperatur in 150 ml Eisessig gelöst und unter Rühren eine Lösung von 2,9 g (13,9 mmol) Kaliumjodat in 300 ml dest. Wasser langsam zugetropft, wobei sich der Ansatz bräunlich verfärbte und nach 15 Min. Rühren eine kristalline Substanz ausfiel. Die Substanz wurde abgesaugt, in 150 ml Dichlormethan gelöst und nacheinander je einmal mit 100 ml

1 %-iger Natriumthiosulfat-Lösung, 100 ml 1 n Salzsäure und 100 ml dest. Wasser gewaschen. Die Dichlormethan-Phase wurde eingeengt, der verbleibende Rückstand (25,4 g) in 150 ml Methanol gelöst und mit 45 ml dest. Wasser versetzt. Nach Zugabe von Impfkristallen kristallisierte die Substanz bei Raumtemperatur. Zur Vervollständigung der Kristallisation wurde der Kolben über Nacht in den Kühlschrank (ca. 0°C) gestellt. Die abgesaugte Substanz wurde zweimal mit je 30 ml eines ca. -25°C kalten Gemisches, bestehend aus Methanol und dest. Wasser im Verhältnis 1:1 gewaschen und im Vakuumtrocken¬ schrank über Phosphopentoxid bei ca. 35°C und ca. 250 Pa bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Die Ausbeute betrug 16,9 g (entsprechend 69,5 % d.Th.). Fp: 84,9°C

Beispiel 4

Darstellung von Di- t Nitratopivaloyl ) -D , L-Homocvstin- diethylester

11,4 g (35 mmol) Homocystindiethylester und 12,0 g (73,5 mmol) 3-Nitratopivalinsäure wurden in 200 ml Dichlormethan gelöst, auf ca. 10°C gekühlt und unter Rühren eine Lösung von 15,2 g (73,5 mmol) DCC in 100 ml Dichlormethan in ca. 15 Min. zuge¬ tropft, wobei gegen Ende des Zutropfens DCC-Harnstoff ausfiel. Anschließend wurde über das Wochenende bei Raumtemperatur ge¬ rührt, der Harnstoff abgesaugt und zweimal mit je 50 ml Dichlormethan gewaschen. Die vereinigten Dichlormethan-Lö- sungen wurden je zweimal mit 100 ml 1 n Salzsäure, zweimal mit je 100 ml Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit 100 ml dest. Wasser gewaschen, im Rotavapor ^® eingeengt und der dabei erhaltene Rückstand unter Erwärmen in einem Gemisch, bestehend aus 175 ml Ethanol abs. und 25 ml Ethylacetat gelöst. Die er¬ haltene Lösung wurde filtriert, über Nacht in den Kühlschrank (0°C) gestellt. Die dabei gebildeten Kristalle wurden abge-

saugt und nach zweimaligem Waschen mit je 20 ml Ethanol abs. von ca. 0°C im Vakuumtrockenschrank bei Raumtemperatur und ca. 250 Pa bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Die Ausbeute betrug 12,4 g (entsprechend 57,6 % d.Th.). Fp: 120,4°C

Beispiel 5

Darstellung von N^'-Di-f3-Nitratopivaloyl -L-cystin-di-tert.- butylester

17,76 g (0,03 Mol) L-Cystin-tert.-butylester und 10,36 g (0,126 Mol) Natriumacetat wurde in 80 ml Wasser und 120 ml Dichlormethan gelöst und bei 10°C bis 15°C eine Lösung von 12,0 g (0,066 Mol) 3-NitratopivaloylChlorid und 50 ml Dichlor¬ methan zugetropft. Dieser Ansatz wurde über Nacht bei Raumtem¬ peratur gerührt, die organische Phase abgetrennt und diese mit jeweils 50 ml 1 n Salzsäure und konz. Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurde fil¬ triert und einrotiert.

Der verbliebene Rückstand wurde aus Ethanol umkristallisiert, welcher über Nacht bei -25°C vervollständigt wurde und einmal mit 10 ml Ethanol (-25°C) gewaschen wurde.

Die Ausbeute betrug 12,73 g (entsprechend 66,02 % d.Th.). Fp: 93,7°C

Beispiel 6

Darstellung von N,N'-Di-(4-Nitratomethylbenzoyl -L-cystin- dimethylester

1,48 g (0,055 Mol) L-Cystindimethylester-Base wurden unter Rühren in 10 ml Methylenchlorid gelöst, 0,56 g (0,055 Mol) Triethylamin zugefügt, anschließend eine Lösung von 2,16 g (0,01 mol) 4-Nitratomethylbenzoylchlorid in 10 ml Methylen¬ chlorid langsam zugetropft. Nach 2 h Rühren wurde das Produkt abgesaugt, mit 2 x 15 ml 1 n Salzsäure und 2 x 15 ml Wasser gewaschen, getrocknet und aus Ethylacetat umkristallisiert, wobei farblose Kristalle erhalten wurden.

Die Ausbeute betrug 1,89 g (entsprechend 60,4 % d.Th.) Fp.: 155°C

Beispiel 7

Darstellung von N^'-Di-f3-Nitratomethylbenzoyl -L-cystin- dimethylester

Die Darstellung erfolgte analog dem 4-Nitratomethylbenzoyl- derivat. Da hier das Rohprodukt im Methylenchlorid des Re¬ aktionsansatzes gelöst blieb, wurde nach 2 h Rühren mit 15 ml 1 n Salzsäure und 2 x 15 ml Wasser gewaschen, getrocknet, i.Vak. eingedampft und anschließend aus Diisopropylether umkristallisiert, wobei farblose Nadeln erhalten wurden.

Die Ausbeute betrug 2,68 g (entsprechend 85,6 % d.Th.). Fp.: 91°C

Beispiel 8

Darstellung von Di-N,N'-(4-Nitratomethylbenzoyl -L-cvstin-di- N,N'-butylamid

1,23 g (0,0035 Mol) L-Cystin-di-N,N'-butylamid-Base wurden in 20 ml Methylenchlorid gelöst, 0,61 g (0,006 Mol) Triethylamin zugesetzt und eine Lösung von 1,29 g (0,006 Mol) 4-Nitratome- thylbenzoylchlorid in 10 ml Methylenchlorid langsam zuge¬ tropft. Nach 2 h Rühren wurde mit 20 ml 1 n Salzsäure und 2 x 15 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, i.Vak. zur Trockne eingeengt und aus Methylenchlorid umkristalli¬ siert, wobei ein farbloses Pulver erhalten wurde.

Die Ausbeute betrug 0,93 g (entsprechend 26,3 % d.Th.) Fp.: 183°C

Beispiel 9

Darstellung von ( S,S ^ -Bis-N , N' - t 3-Nitratomethylbenzoyl ) • cystin-di-N,N '-butylamid

erfolgte analog dem 4-Nitratomethylbenzoyl-Derivat.

Aussehen: Farbloses Pulver

Die Ausbeute betrug 0,4 g (entsprechend 11,3 % d.Th.). Fp: 174-175°C

Beispiel 10

Darstellung von N,N'-Di-(4-Nitratomethylbenzoyl -cystindiamid

1,03 g (0,0035 Mol) Cystindia id-Base wurden in 20 ml Methy¬ lenchlorid supendiert, 0,60 g (0,006 mol) Triethylamin zuge¬ setzt und eine Lösung von 1,29 g (0,006 mol) 4-Nitratomethyl- benzoylchlorid in 10 ml Methylenchlorid langsam zugetropft. Nach Rühren über Nacht wurde mit 20 ml 1 n Salzsäure und 2 x 20 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, einro¬ tiert und der Rückstand aus Methylenchlorid umkristallisiert, wobei ein farbloses Pulver erhalten wurde.

Die Ausbeute betrug 0,32 g (entsprechend 15,3 % d.Th.). Fp.: 143°C

Beispiel 11

Darstellung von (S,S^-N,N'-Bis-(3-Nitratomethylbenzoyl - cystindiamid

erfolgte analog dem 4-Nitratomethylbenzoyl-Derivat, wobei ein farbloses Pulver erhalten wurde.

Die Ausbeute betrug 0,25 g (entsprechend 12,2 % d.Th.). Fp: 136°C

Beispiel 12

Darstellung von N,N'-Di-f3-Nitratopivaloyl -L-penicillamin- disulfid-diamid

1. Stufe: Herstellung von L-Penicillamindisulfidbisamid

In ca. 100 ml flüssigen Ammoniak wurden bei -40 bis -55°C 7,95 g (0,02 Mol) L-Penicillamindisulfiddimethylester x 2 HCl eingetragen, über Nacht bei -40 bis -30°C gerührt und das Kühlbad entfernt, worauf der Ammoniak abdampfte. Anschließend wurde der Ansatz am Rotavapor ^® bei einer Badtemperatur von 50°C eingeengt, der gesamte Rückstand in 40 ml warmen Isopropanol aufgenommen und filtriert. In das Filtrat wurde HCl-Gas ein¬ geleitet, wobei das Produkt ausfiel, welches abgesaugt wurde.

Die Ausbeute betrug 4,6 g (entsprechend 62,61 % d.Th.).

2. Stufe: Herstellung von N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L- penicillamindisulfid-diamid

4,41 g (12 mmol) L-Penicillamindisulfidbisamid x 2 HCl und 4,03 g (48 mmol) Natriumhydrogencarbonat wurden in 100 ml Wasser gelöst, 60 ml Dichlormethan zugegeben und solange gerührt, bis beide Phasen klar gelöst waren. Dann wurde bei Raumtemperatur eine Lösung von 4,36 (24 mmol) 3-Nitratopi- valoylchlorid in 60 ml Dichlormethan zugetropft, über Nacht gerührt, die organische Phase abgetrennt und zweimal mit je 50 ml 1 n Salzsäure gewaschen. Das Dichlormethan wurde ab¬ gezogen, wobei ein öliger Rückstand zurückblieb, der säulen- chromatographisch aufgereinigt wurde.

Die Ausbeute betrug 3,45 g (theoretisch 49,17 % d.Th.).

Beispiel 13

Darstellung von N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystindiamid

1. Stufe: Darstellung von N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L- cystin-di-(N, '-hydroxysuccinimidester)

477,5 g (0,9 Mol) N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin (Bei- spiel 1) und 213,4 g (1,854 Mol) N-Hydroxysuccinimid wurden in 1400 ml Tetrahydrofuran gelöst, auf 5°C gekühlt und unter Rüh¬ ren und Eisbadkühlung eine Lösung von 382,5 g (1,854 Mol) DCC in 600 ml Tetrahydrofuran in 30 Min. zugetropft. Hierbei stieg die Temperatur des Ansatzes auf 30°C und kristallisierte, so daß er zur Aufrechterhaltung des Rührens zunächst mit 0,5 1 Tetrahydrofuran versetzt, dann auf ca. 50°C erwärmt und an¬ schließend mit 0,5 1 Aceton nochmals verdünnt wurde. Hier¬ auf wurde ca. 30 Min. bei ca. 50 °C gerührt, der DCC-Harn- stoff abgesaugt (393,1 g getrocknet = 94,5 % d.Th.) und mit 0,5 1 Aceton gewaschen. Die vereinigten organischen Lösungen wurden am Rotavapor ^® bis zur Trockene eingeengt, der Rückstand in 1,7 1 Ethylacetat unter Refluxieren gelöst und die dabei verbliebenen DCC-Harnstoff-Reste (7,5 g = 1,8 % d.Th.) abfil¬ triert. Nach Stehen über Nacht bei Raumtemperatur wurde die auskristallisierte Substanz abgetrennt, zweimal mit je 0,2 1

Ethylacetat gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei Raumtem¬ peratur und ca. 250 Pa bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Die Ausbeute betrugt 373,9 g (entsprechend 57,3 % d.Th.)

2. Stufe: Darstellung von N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L- cystindiamid

72,4 g (0,1 Mol) N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-(N- hydroxysuccinimidester) wurden in 300 ml Ethylacetat gelöst. Hierzu wurde unter Rühren eine Lösung, bestehend aus 16,5 ml (25 %iger) Ammoniaklösung und 60 ml Wasser, zugetropft,

15 Min. nachgerührt, nochmals eine Lösung, bestehend aus 1,65 ml (25 %iger) Ammoniaklösung und 6 ml Wasser, zugegeben und 30 Min. nachgerührt.

Nach Abtrennung der organischen Phase wurde mit 100 ml Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, mit Aktivkohle ge¬ klärt und das Lösungsmittel vollständig abgezogen, wobei 56,72 g Rückstand verblieben. Dieser wurde in 90 ml Methanol gelöst, mit 40 ml Wasser versetzt und bei -25°C umkristalli- siert.

Das ausgefallene Produkt wurde abgesaugt und zweimal mit je 25 ml Methanol/Wasser 1:1 gewaschen.

Die Ausbeute betrug 37,4 g (entsprechend 70,75 % d.Th.). . Fp: 82,3°C

Beispiel 14

Darstellung von N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl -L-cystin-di-

72,4 g (0,1 Mol) N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-(N- hydroxysuccinimidester) (Beispiel 13, 1. Stufe) wurden in 300 ml Ethylacetat gelöst, unter Rühren bei Raumtemperatur eine Lösung, bestehend aus 19 ml (40 %iger) N-Methylaminlösung und 60 ml Wasser, zugetropft und 15 Min. nachgerührt. Hierauf wurden nochmals 1,7 ml zugegeben und 30 Min. nachgerührt.

Die organische Phase wurde abgetrennt, mit 100 ml Wasser gewa¬ schen, mit Natriumsulfat getrocknet und mit Aktivkohle ge¬ klärt. Das Lösungsmittel wurde vollständig abgezogen, wobei 59,44 g Rückstand verblieben. Dieser wurde in 90 ml Methanol gelöst, mit 40 ml Wasser versetzt und umkristallisiert.

Das ausgefallene Produkt wurde abgesaugt und zweimal mit je 25 ml Methanol/Wasser 1:1 gewaschen.

Die Ausbeute betrug 38,51 g (entsprechend 69,18 % d. Th.). Fp: 166,5°C

Beispiel 15

Darstellung von N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di- (N-butylamid)

7,3 g (0,01 Mol) N,N'-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-(N-hy- droxysuccinimidester) (Beispiel 13, 1. Stufe) wurden in 80 ml Dichlormethan bei Raumtemperatur gelöst, unter Rühren eine Lö¬ sung von 1,61 g (0,022 Mol) n-Butylamin in 20 ml Dichlormethan zugegeben und eine Stunde nachgerührt. Anschließend wurde die organische Phase nacheinander je einmal mit 10 ml 1 n Salz- säure, 10 ml 9 %iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 10 ml Wasser gewaschen und am Rotavapor ^® abdestilliert, wobei 5,7 g (= 89,0 % d.Th.) Rückstand erhalten wurde, der aus 20 ml Methanol und 2 ml H ₂ 0 bei 0°C umkristallisiert wurde.

Die Ausbeute betrug 4,3 g (entsprechend 67,1 % d.Th.). Fp: 78,4°C

Beispiel 16

Darstellung von NrN'-Di-f3-Nitratopivaloyl^-L-cystin-di- (N-ter .-butylamid )

7,3 g (0,01 Mol) N,N'-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-(N-hy- droxysuccinimidester) (Beispiel 13, 1. Stufe) wurden in 80 ml Dichlormethan gelöst, unter Rühren eine Lösung von tert.- Butylamin in 20 ml Dichlormethan zugegeben und eine Stunde

nachgerührt. Anschließend wurde die organische Phase nach¬ einander je einmal mit 10 ml 1 n Salzsäure, 10 ml 9 %iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 10 ml Wasser gewaschen und am Rotavapor ^® abdestilliert-, wobei 6,1 g (= 95,2 % d.Th.) Rückstand erhalten wurde, der aus 25 ml Methanol und 2 ml H ₂ 0 bei 0°C umkristallisiert wurde.

Die Ausbeute betrug 2,4 g (entsprechend 37,5 % d.Th.). Fp: 81-82°C

Beispiel 17

Darstellung von N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cvstindi- morpholid

7,3 g (0,01 Mol) ,N-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-(N-hydro- xysuccinimidester) (Beispiel 13, 1. Stufe) wurde in 80 ml Dichlormethan gelöst, unter Rühren eine Lösung von 1,92 g (0,022 Mol) Morpholin in 20 ml Dichlormethan zugetropft und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die organische Phase nacheinander mit jeweils 10 ml 1 n Salzsäure, konzentrierte Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewa¬ schen, mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und vollständig abdestilliert, wobei 6,06 g (entsprechend 91,2 % d.Th.) Rück¬ stand verblieben, der säulenchromatographisch aufgereinigt wurde.

Die Ausbeute betrug 4,71 g (entsprechend 70,9 % d.Th.). Fp: 33,6 °C

Beispiel 18

Darstellung von N,N'-Di-f3-Nitratopivaloyl)-L-cvstindiiso- propylester

7,3 g (10 mMol) N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystin-di-(N- hydroxysuccinimidester) (Beispiel 13, 1. Stufe) wurde in 150 ml Propanol-2 gelöst, über Nacht bei Raumtemperatur ge- rührt und das Propanol-2 anschließend am Rotavapor ^® weitgehend abgezogen. Der verbliebene Rückstand wurde in 50 ml Dichlorme¬ than aufgenommen, zweimal mit jeweils 25 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer voll¬ ständig einrotiert, wobei ein Rückstand von 5,86 g Öl (95,28 % d.Th.) verblieb.

Dieser wurde unter Erwärmen in 35 ml Methanol gelöst und bei -25°C umkristallisiert. Das ausgefallene Produkt wurde abge¬ saugt, zweimal mit jeweils 5 ml tiefgekühltem Methanol gewa- sehen und im Vakuumtrockenschrank bei Raumtemperatur getrock¬ net.

Die Ausbeute betrug 4,01 g (entsprechend 65,31 % d.Th.).

Fp: 88,2°C

Beispiel 19

Darstellung von N'-S-Nitratopivaloyl-L-cvsteinamid-glutathion- mixed-disulfid

3,1 g (10 mmol) Glutathion wurden in 10 ml H ₂ 0 gelöst und mit einer Lösung, bestehend aus 5,3 g (10 mmol) N,N'-Di-(3-Nitra- topivaloyl)-L-cysteindiamid (Beispiel 13) in 50 ml Methanol unter Stickstoffbegasung vermischt, drei Tage bei Raumtempera-

tur stehengelassen und anschließend am Rotavapor ^® bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand von 8,7 g wurde in 30 ml Me¬ thanol und 20 ml Wasser gelöst und mittels Büchi Chromatogra¬ phie System über eine RP-18 Säule chromatographiert. Die zweite Fraktion wurde am Rotavapor ^® bis zur Trockene eingeengt, wobei ein Rückstand von 1,5 g erhalten wurde, welcher unter Erwärmen in 1 ml Wasser und 25 ml Ethanol gelöst wurde. Die über Nacht im Kühlschrank bei 0°C auskristallierte Substanz wurde abgesaugt, zweimal mit je 5 ml Ethanol von 0°C gewaschen und über Phosphopentoxid im Vakuumtrockenschrank bei Raumtem¬ peratur und ca. 2 Torr bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Die Ausbeute betrug 0,87 g (entsprechend 15,3 % d.Th.). Fp: 87,7°C

Beispiel 20

Darstellung von N'-S-Nitratopivaloyl-L-cvsteinethylester- glutathion-mixed-disulfid

17,7 g (60 mmol) 3-Nitratopivaloyl-L-cysteinethylester wurden in 100 ml Essigsäure gelöst und mit einer Lösung, bestehend aus 18,50 g (60 mmol) Glutathion in 85 ml H ₂ 0 und 50 ml Essig- säure versetzt. Zu dieser Mischung wurde unter Rühren und Was¬ serbadkühlung (10°C) eine wäßrige Lösung, bestehend aus 4,28 g (20 mmol) Kaliumjodat in 65 ml Wasser in ca. 30 Min. so zuge¬ tropft, bis der Ansatz eine hellgelbe Farbe hatte (exotherm). Nach einigen Min. Rühren bei Raumtemperatur kristallisierte eine Substanz, die mittels Dünnschichtchromatographie als

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystindiethylester identifiziert wurde. Die Lösung wurde mit 100 ml Wasser versetzt und auf ca. 0°C gekühlt, die auskristallisierte Substanz abgesaugt, mit 75 ml Wasser gewaschen und getrocknet (9,0 g = 76,7 % d.Th.). Die Mutterlauge hiervon wurde am Rotavapor ^® bis zur Trockene ein¬ geengt und der zurückbleibende Rückstand mit 100 ml Wasser und 250 ml Ethylacetat verrührt. Hierbei fiel ein geleeartiges

Produkt aus, welches sich nicht absaugen ließ und daher durch Zugabe von 100 ml 1 n HCL gelöst wurde. Die vereinigten wä߬ rigen Lösungen wurden am Rotavapor ^® bis zur Trockene eingeengt, wobei ein öliger Rückstand erhalten wurde (15,5 g). Dieser wurde in 50 ml Wasser gelöst und mit 25 %iger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Die eingestellte Lösung wurde auf 0°C gekühlt, wobei jedoch keine Kristallisation er-' folgte. Sie wurde daher erneut am Rotavapor ^® bis zur Trockene eingeengt und mittels Büchi Chromatographiesystem über eine RP-18 Säule chromatographiert. Da keine Auftrennung erfolgte, wurde die Lösung eingeengt und der erhaltene Rückstand (10,9 g) mittels Abimed Chromatographiesystem in 15 Säulenläufen aufgetrennt. Die vereinigten zweiten Fraktionen wurden am Ro¬ tavapor ^® bis zur Trockene eingeengt, der verbliebene Rückstand (1,2 g) in 25 ml Ethanol und 1,5 ml Wasser unter Erwärmen ge¬ löst und über Nacht bei 0°C in den Kühlschrank gestellt. Das dabei auskristallisierte Produkt wurde abgesaugt, zweimal mit je 5 ml Ethanol von 0°C gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei Raumtemperatur und ca. 2 Torr über Phosphopentoxid bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Die Ausbeute betrug 0,77 g (entsprechend 6,4 % d.Th.). Fp: 167,6°C

Beispiel 21

Darstellung von N'-Nitratopivaloyl-L-cvsteinethylester-N' acetyl-L-cvstein-mixed-disulfid

5,9 g (20 mmol) 3-Nitratopivaloyl-cysteinethylester wurden in 50 ml Essigsäure gelöst und mit einer Lösung, bestehend aus 3,3 g (20 mmol) N-Acetyl-L-Cystein in 25 ml Wasser versetzt. Zu dieser Mischung wurde unter Rühren und Wasserbadkühlung (10°C) eine wäßrige Lösung, bestehend aus 1,43 g (0,66 mmol) Kaliumjodat in 25 ml Wasser in ca. 15 Min. so zugetropft, bis der Ansatz eine hellgelbe Farbe hatte (exotherm). Nach einigen

Min. Rühren bei Raumtemperatur kristallisierte eine Substanz, die mittels Dünnschichtchromatographie als N,N'-Di-(3- Nitratopivaloyl)-L-cystindiethylester identifiziert wurde. Die Lösung wurde mit 100 ml Wasser versetzt und auf ca. 0°C gekühlt, die auskristallisierte Substanz abgesaugt und getrocknet (2,8 g = 71,6 % d.Th.). Die Mutterlauge hiervon wurde am Rotavapor ^® bis zur Trockene eingeengt. Der zurückbleibende Rückstand wurde mit 50 ml Wasser und 200 ml Ethylacetat verrührt. Die org. Phase wurde abgetrennt, nacheinander je einmal mit 50 ml 1 n HCl und 50 ml H ₂ 0 gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Rotavapor ^® bis zur Trockene eingeengt. Hierbei blieben 4,1 g öliges Produkt zurück, welches säulenchromatographisch mittels RP-Säule über Büchi System gereinigt wurde. Der Rückstand, der am Rotavapor ^® eingeengten zweiten Fraktion (3,9 g) wurde in 10 ml Methanol gelöst und mit 15 ml Wasser versetzt und unter Rühren auf ca. 0°C abgekühlt. Die dabei auskristallisierte Substanz wurde abgesaugt und im Vakuumtrockenschrank bis zur Gewichtskonstanz getrockne .

Die Ausbeute betrug 2,4 g (entsprechend 79,0 % d.Th.)

Fp:

Kristalle, nach einigen Wochen zähes Öl.

Beispiel 22

Darstellung von N-f3-Nitratopivaloyl^-L-cvsteinethylester-D,L- penicillamin-mixed-disulfid

8,82 g (30 mmol) 3-Nitratopivaloyl-L-cysteinethylester wurden in 120 ml Methanol gelöst und bei 5°C - 10°C eine Lö¬ sung, bestehend aus 4,50 g (30 mmol) D,L-Penicillamin in 40 ml Wasser und 20 ml 1 n Salzsäure zugefügt. Nach Zugabe von 2,14 g (10 mmol) Kaliumjodat wurde ca. 1,5 h bei 10°C - 15°C ge¬ rührt, mit Natriumthiosulfat entfärbt und der kristallisierte

Rückstand bei ca. 5°C abgesaugt. Nach Trocknen an der Luft wurden 5,8 g Rückstand erhalten, der dünnschichtchrσmatogra- phisch als N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)-L-cystindiethylester identifiziert wurde.

Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer vollständig einro¬ tiert, der Rückstand in 100 ml konz. Natriumacetatlösung auf¬ genommen, bei ca. 80°C mit 1 g Aktivkohle geklärt und mit 20 g Natriumchlorid versetzt (klare Lösung) . Das über Nacht im Kühlschrank kristallisierte Produkt wurde abgesaugt und bei Raumtemperatur im Vakuumtrockenschrank getrocknet.

Die Ausbeute betrug 1,83 g (entsprechend 13,8 % d.Th.)

Fp: 132,5°C

Beispiel 23

Darstellung von 2-Acetylamino-3-r2-f2,2-dimethyl-3-nitrooxy- propionylamino -2-ethoxycarbonyl-ethyldisulfanyl1-3-methyl- buttersäure

1,91 g (10 mmol) N-Acetyl-D,L-penicillamin und 2,94 g (10 mmol) 3-Nitratopivaloyl-L-cysteinethylester wurden in 40 ml

Methanol und 15 ml Wasser gelöst. Bei 15°C - 20°C wurden por¬ tionsweise 710 mg (3,3 mmol) Kaliumjodat zugegeben. (Nach Zugabe einer zusätzlichen Spatelspitze Kaliumjodat blieb eine dauerhafte Gelbfärbung durch freies Jod. ) Der Ansatz wurde durch Zugabe von wenig Natriumthiosulfat entfärbt und einrotiert. Der Rückstand wurde in konz. Natriumhydrogencarbo- natlösung aufgenommen (C0 ₂ -Entwicklung) und das N,N'-Di-(3- Nitratopivaloyl)-L-cystindiethylester unter DC-Kontrolle durch mehrmaliges Extrahieren mit Dichlormethan entfernt. Die Extrakte wurden einrotiert, wobei ein Rückstand von 1,1 g verblieb.

Die wäßrige Phase wurde mit konz. Salzsäure angesäuert und mit 50 ml Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wurde vollstän¬ dig abgezogen, wobei ein Rückstand von 1,48 g verblieb.

Der Gesamtrückstand wurde in 150 mg-Portionen säulenchromato- graphisch gereinigt (Abimed Chromatographiesystem, RP-18 Sau- le).

Der Rückstand aus Fraktion 2 wurde aus 30 ml Ethylacetat/n- Hexan 1/1 umkristallisiert.

Die Ausbeute betrug 350 mg (entsprechend 7,24 % d.Th.).

Fp: 120,2°C

Pharmakologische Daten

Gefäßrelaxation in vitro

Die gefäßerschlaffende Wirkung der Verbindungen der allgemei¬ nen Formel I wurde in vitro an isolierten Rattenaortenringen untersucht. Hierzu wurde Ratten nach Betäubung die Aorta thoracalis entnommen, diese von Fett- und Adventivgewebe be- freit und in ca. 5 mm breite Ringsegmente zerteilt. Die Aor¬ tenringe wurden in temperierte, mit Carbogen begaste Bäder mit Tyrodelösung überführt und einer Vorlast von 2 g ausgesetzt. Unter kontinuierlicher Registrierung der Kraftentwicklung wurden die Gefäßringe nach 90 minütiger Aquilibrierung mit 2 x 10" mol/1 Phenylephrin vorkontrahiert. Nach Erreichen eines stabilen Kontraktionsniveaus wurden die Nitratoverbindungen kumulativ der Gefäßbadflüssigkeit zugesetzt, wobei die Zugabe der jeweiligen nächsthöheren Konzentration erst nach Errei¬ chen eines stabilen Relaxationsniveaus erfolgte. Aus den er- haltenen Konzentrations-Wirkungs-Kurven wurde die Konzentra¬ tion der jeweiligen Verbindung ermittelt, welche zu einer 50 %igen Relaxation des vorkontrahierten Gefäßringes führt (ECg _Q -Wert). Tabelle 1 enthält die so ermittelten ECg _Q -Werte beispielhaft ausgewählter Verbindungen.

Tabelle 1

Substanz EC ₅₀ [mol/1] .Anzahl der Einzelver¬ suche [n]

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 1,5 x 10 -6 6 L-cystindiethylester

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 1,2 x 10 -4 6 L-cystin

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 3,0 x 10 -5 6 L-cystindiamid

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 5,9 x 10 -5 3 L-cystin-di-tert.-butylester

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 1,0 x 10 ^"4 6 L-cystindipiperidid

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 2,4 x 10 -5 L-cystin-di-(N,N'-methylamid)

Blutdruckeffekte am wachen Hund

Zum Nachweis der Nitratwirkung in vivo wurden die Effekte der erfindungsgemäßen Verbindungen auf den systolischen arteriel¬ len Blutdruck (SAP), zentralvenösen Blutdruck (CVP) und pulmo- nalarteriellen Blutdruck (PAP) am wachen Hund untersucht. Die Messung des SAP erfolgte über einen über die Femoralarterie in die Aorta eingeführten Tip-Katheter-Transducer, die Messung des CVP sowie des PAP über einen über die V.jugularis sin. eingeführten Swan-Ganz-Katheter, dessen Katheterspitzen bis zur A. pulmonalis bzw. bis zum rechten Herzvorhof vorgeschoben wurden, über deren Lumen der jeweilige Druck auf Statham ^® - Druckumwandler gegeben wurde. Zur Quantifizierung der durch

die erfindungsgemäße Verbindung hervorgerufenen Blutdrucksen¬ kung wurden die Flächen unterhalb der registrierten Blutdruck- Verlaufskurven (AUC) bestimmt. Tabelle 2 enthält die AUC-Werte der jeweiligen Blutdrucksenkung nach intravenöser Gabe von 13,4 μg/kg der erfindungsgemäßen Disulfidverbindungen bzw. nach intravenöser Gabe von 26,8 μg/kg Isosorbid-5-mononitrat (5-ISMN) .

Tabelle 2

AUC (SAP) AUC (CVP) AUC (PAP) (mg) (mg) (mg)

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 94,1 85,7 12,0 L-cystindiethylester

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 17,3 67,9 2,7 L-cystin

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 55,3 46,9 28,1 L-cystindiamid N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 10,4 36,9 18,5 L-cystindipiperidid

N,N'-Di-(3-Nitratopivaloyl)- 41,9 33,7 3,5 L-cystin-di-(N, '-methylamid)

5-ISMN 22,2 25,4 8,9

Die gegenüber dem klassischen Nitrat 5-ISMN deutlich erhöhten AUC-Werte für die Blutdrucksenkung nach Gabe der erfindungsge¬ mäßen Verbindungen belegen ihre hohe Wirksamkeit.