La présente invention concerne de nouveaux com¬ posés chimiques , leur procédé de préparation ainsi que leur utilisation, notamment en agriculture , pour la sé¬ lection des microorganismes de la rhizosphère et de la phyllosphère. C ' est au niveau de la rhizosphère , partie du sol directement en contact avec les racines, que l'acti¬ vité microbienne liée au développement des plantes est la plus importante. Il peut donc s'avérer souhaitable, au niveau de ladite rhizosphère, d'introduire ou de sé- lectionner un microorganisme aux propriétés intéressantes pour la plante ou de favoriser sa multiplication. Or, le fort pouvoir neutralisant du sol dû en particulier au phénomène de compétition rend difficile le développement de bactéries allogènes. II est à présent admis que la présence ou l'absence de certains médiateurs chimiques libérés par les plantes conditionne en grande partie le type et le nombre de microorganismes situés dans cette rhizosphère.

Les mêmes raisonnements s'appliquent à la phyll sphère, à savoir l'espace avoisinant les parties aérienne des plantes telles que les feuilles.

La présente invention concerne des composés chimiques nouveaux pouvant être utilisés comme médiateurs nutritionnels (Tepfer et al. Journal of Bacteriology, Mar 1988, vol. 170, No. 3 ; FR 2 582 671). Il s'agit de com¬ posés répondant à la formule I suivante :

dans laquelle R- est l'hydrogène ou un alkyl éventuel¬ lement substitué, R- représente l'hydrogène, un alkyl éventuellement substitué ou un radical dérivé de la fonction hydroxyle, et n est compris entre 0 et 7 à condition que lorsque R ₁ est le méthyl alors n est différent de 0.

Les composés de la présente invention pou¬ vant être en conformation chaise ou en conformation bateau, les fonctions hydroxylées peuvent être en liaison axiale ou équatoriale.

En outre, les fonctions hydroxylées ne sont pas, en général, fixées sur le même carbone cyclique. De préférence ₁ et R~ représentent l'hydro- gène,et les composés selon la présente invention possè¬ dent au moins un hydroxyle positionné de façon à créer une structure aminoacétalique entre l'azote et cet hydroxyle.

De préférence, l'hydroxyle impliqué dans la structure aminoacétalique est en position 1.

A ce jour, une telle structure ^" aminoacétali¬ que n'a jamais été mise en évidence pour des molécules de type tropanique ; elle peut être schématisée par l'équilibre suivant entre deux formes tautomères, également incluses dans la formule générale des corn-

posés de la présente invention

De préférence, les composés selon l'invention possèdent, outre un hydroxyle en position 1, d'autres groupements hydroxyle et notamment en positions 2 et 3.

Parmi ces composés, il faut citer les compo¬ sés de formule II :

dans laquelle n' est compris entre 0 et 4.

D'autres composés préférés de l'invention ré¬ pondent aux formule (lia) et (Ilb) suivantes :

La présente invention concerne aussi le procé¬ dé de préparation des composés mentionnés ci-dessus. Ce procédé comporte, de préférence, les étapes successives suivantes : a) l'extraction à partir de racines de plantes d'un mélange comportant un ou plusieurs iso mères desdits composés, des acides aminés et/ou de la mannopine, b) enrichissement biologique du mélange obtenu au cours de l'étape a) en un extrait enrich en un ou plusieurs isomères desdits composé c) le cas échéant, séparation des composés obt nus au cours de l'étape b) en leurs isomère respectifs.

De préférence, l'extraction est réalisée à par tir de racines de certaines convolvulacées, et notamment Calystegia sepium ou Convolvulus arvensis.

De préférence, le procédé suivant 1'invention comporte :

- une extraction en phase aqueuse d'un broyât de racineset récupération du surnageant, - les composés selon 1'invention sont extraits du surnageant par fixation sur une résine cationique et élution en milieu basique NH ₄ OH,

- l'éluat est éventuellement traité pour éli- miner les acides aminés et la mannopine,

- les composés selon l'invention sont éven¬ tuellement purifiés à l'aide d'une résine cationique comme précédemment.

Plus particulièrement, on effectue en premier lieu un broyage des racines dans de 1'eau suivi d'une centrifugation. On récupère la fraction soluble que l'on fixe sur une résine cationique (DOWEX 50) . On ef¬ fectue ensuite une élution par NH.OH ^' puis une évapora- tion à sec. L'extrait obtenu à l'issu de cette étape est un mélange complexe comportant un ou plusieurs isomères des composés de la présente invention, associés à di¬ verses substances dont notamment des acides aminés et/ ou de la mannopine. Dans le but d'enrichir ce mélange en composés de la présente invention, on peut recourir à diverses techniques chimiques, de préférence biologiques, con¬ nues de l'homme de l'art pour éliminer les acides ami¬ nés et la mannopine. De préférence, après avoir stérilisé ce mélan¬ ge par filtration, on réalise, au cours del'étape b) une dégradation des acides aminés et de la mannopine par une souche d'Agrobacterium tumef ciens, telle que la souche B _g 806. Oh élimine ensuite les bactéries par centrifu-

gation ; on fait passer le surnageant sur. résine DOWEX 50. On élue par NH.OH et on évapore à sec.

A l'issue de cette étape, on obtient un mélange comportant un ou plusieurs isomères des composés de la pré sente invention et éventuellement des traces d'acides aminés.

La dernière étape du procédé de la présente in¬ vention consiste, le cas échéant, à séparer les principaux isomères des composés ainsi extraits et purifiés. Cette séparation peut être effectuée par deux étapes successives :

1 ) une filtration sur colonne de trisacryl (GF05) suivie d'une élution à l'aide d'un tampon volatil au bicarbonate de triéthylamine et d'une évaporation à sec, puis

2) une séparation en H.P.L.C.

Enfin, diverses techniques spectrométriques (spectrométrie de masse haute résolution, R.M.N.) permet¬ tent de déterminer la structure et donc l'identité des isomères ainsi obtenues.

Enfin, la présente invention concerne l'utili¬ sation des composés mentionnés ci-dessus pour la sélection des microorganismes de la rhizosphère.

En effet, les composés de la présente invention ou médiateurs, ne sont métabolisables que par un nombre restreint de microorganismes* Ceux-ci se multiplient donc de façon préférentielle dans la rhizosphère des plantes sécrétant ces médiateurs.

C'est ainsi que des essais ont été réalisés en vue de comparer le nombre de bactéries capables de métaboli ser les composés de la présente invention dans la rhizosphè re de Calystegia sepium et Convolvulus arvensis avec celui de la rhizosphère de deux plantes témoins, Allaria petiola- ta et la graminée. Les résultats sont d'environ 25 % pour la rhizosphère des deux liserons et de 0 % pour les plantes témoins.

En outre, parmi une quarantaine de souches de bactéries du sol échantillonées en laboratoire que l'on a testées (dont Pseudomonas, Azospirillum, Klebsiella, Agro- bacterium seule la souche Rhizobiu meliloti 41 s'est ré¬ vélée capable d'utiliser les médiateurs de la présente in¬ vention comme unique source d'azote et de carbone.

Les gènes permettant ce catabolisme sont portés par un plasmide de 225 kb, le pRme 41 et sont localisés dans une région de 50 Kb.

C'est ainsi que, dans la rhizosphère de plantes produisant un tel médiateur, la multiplication des bacté¬ ries capables de cataboliser ce médiateur sera favorisée par rapport à celle des bactéries ne possédant pas cette propriété. La possibilité de préparer les composés selon la présente invention permet, en outre, en les utilisant en combinaison avec les microorganismes déterminés, de favoriser le maintien de ces microorganismes au niveau de la rhizosphère. La présente invention concerne en particulier l'application des composés selon l'invention dans la rhi¬ zosphère ou dans la phyllosphère de plantes utiles afin d'y maintenir certains microorganismes présentant le caractère CAC ⁺ , ce caractère CAC étant défini comme la faculté de cataboliser les composés selon la présente invention. Pour l'implantation dans la rhizosphère, cette application peut être réalisée par des moyens connus .tels que traitement de graines (enrobage, pelliculage, inoculation) , enfouissement épandage ou injection au voisinage des plantes utiles. Pour l'implantation dans la phyllosphère, cette application peut se faire par pulvérisation des parties aériennes (feuilles, tiges, bourgeons) .

Les microorganismes CAC seront sélectionnés par des procédés traditionnels sur des milieux sélectifs conten les composés selon l'invention à partir de souches naturel-

les, de souches mutées ou bien de souches transformées par un ou des plasmides portant les qènes CAC σoππe cela sera explicité ci-après. Les composés selon la présente invention peu¬ vent être utilisés en combinaison avec les microorganismes présentant une activité rhizos hèrique ou phyllαsphérique favorable à plante, éventuellement sur le même support, par exeπple un support tel que la tourbe , mais il est possible également de prévoir des produits encapsulés comportant , outre le microorganisme , le ou les composés de la présente inventio Ce type d ' encapsulation est connu ; il s ' agit par exemple , 0 de billes d ' alginates dont la technologie de préparation ne sera pas décrite en détail dans ce qui suit . L ' utili¬ sation des composés de la présente invention permet une amélioration des plantes , et notamment des légumineuses car elles facilitent le maintien dans la rhizosphère de

' ^ microorganismes tels que les Rhizobium ou les τ rq<iyrhizobium.

En outre , il peut être intéressant d ' intro¬ duire dans la rhizosphère de certaines plantes des bacté¬ ries productrices de facteurs de croissance ou d'antibiotiques et ce, en vue de fertiliser le sol ou de détruire les microorganismes phyto- ⁰ pathogènes (John DAVISCN, Biotechnology, vol. 6, Mars 1988) .

Les composés de la présente invention sont plus particulièrement destinés à être utilisés pour la détoxif ication de certains sols . On sait notamment que , suite à la culture intensive de plantes telles que la 5 manioc , ou suite à un traitement chimique ou biologique particulier , certains sols non seulement s ' appauvrissent en éléments énergétiques , mais aussi se chargent de substances particulièrement toxiques . Lorsque cela est possible , il est touj ours préférable de remédier à ces 0 problèmes par un procédé biologique plutôt que chimique .

A cette fin , certains microorganismes peuvent se révéler particulièrement utiles et notamment s ' ils possèdent

la capacité de cataboliser lesdites substances toxiques . Or , l ' introduction de tels microorganismes au niveau du sol à détoxifier conduit , le plus souvent, à une compétition entre microorganismes autochtones , et microorganismes introduits , au détriment de ces derniers . La présente invention vise à résoudre ce problème et ce , grâce à l ' introduction conjointe de calystégines et de microorganismes déterminés sous la forme de poudres , capsules ou en mélange à des engrais et ce au niveau du sol à détoxifier. Les composés de l ' invention peuvent , de façon géné rale , permettre d ' introduire des microorganismes permettant la dégradation de substances polluantes et ce , grâce à un pouvoir de sélection exercé en faveur de ceux-ci .

Enfin, les composés de l'invention sont utilisés de façon avantageuse au niveau de la phyllosphère des plantes. A ce niveau, les coπposés de l'invention peuvent notanment permettre la lutte contre le gel et ce en favorisant la présence de bactéries anti-gel telles que Pseudcmonas ou Erwinia.

De façon générale, les ccπçosés de l'invention peuvent per- mettre d ^J introduire, au niveau des parties aériennes de plantes, des microorganismes destinés à la lutte biologique, contre des agents patho gènes ou des prédateurs (bactéries, champignons , insectes, nématodes) . L'objet des différents exemples présentés ci-après est de mettre en évidence l' influence positive des composés selon l'invention dans la rhizosphère de plantes sur la survie et la croissance de bacté¬ ries CAC par rapport à celle d'autres bactéries ne différant si possi¬ ble que par leur caractère CAC~.

Les exeπples ci-après démontrent successivement le rôle du plasmide, l'effet de la calystégine purifiée, l'étude de la σcπçétitivi té pour la nodulation des souches utilisées (lorsque plusieurs souches de Rhizobium sont présentes, la légu ineuse peut favoriser une ou plusieurs souches pour la formation de ses nodosités ;. il y a cαrçé- titivité pour la nodulation entre les di férentes souches) , et l'in¬ fluence de l'environnement chimique créé au niveau de la rhizosphère des» plantes synthétisant les calystégines sur la population microbienne

Ces exemples sont illustrés par :

~ la figure 1 représentant un schéma du dispositif expérimental utilisé pour étudier la multiplication des bactéries dans la rhizosphère ;

- la figure 2 représentant un schéma du tube GIBSON utilisé pour l'étude de la compétitivité pour la nodulation.

Les milieux de culture utilisés dans les exem- pies sont

1/ Le milieu JENSEN comportant, pour un litre de milieu :

CaHP0 ₄ : 1,0 g

K ₂ HP0 ₄ : 0,2 g

MgS0 ₄ , 7H ₂ 0 : 0,2 g

NaCl : 0,2 g

FeCl. 0,3 ml d'une solution à d = 1,26 oligoéléments 1 ml d'une solution contenant

B 0,05 %

Mn 0,05 %

Zn 0,005 %

Mo 0,005 %

Cu 0,002 % eau permutée 1 3 pH ajusté à 7 avec NaOH pour milieu gélos : gélose 15 g

Stérilisation : 20 min à 120 ^» C.

2/ Le milieu WRIGHT comportant pour un litre d milieu

NaCl 0,2 g CaCO- 0,1 g

MgS0 ₄ , 7 H ₂ 0 0,2 g K„HPO _Λ 0,5 g

Mannitoi 10 g

Extrait de levure 2,5 g eau permutée 1 1 pK 6,8 pour un milieu gélose : gélose 15 g

Stérilisation : 20 min à 120°C.

Les composés selon la présente invention utili sés dans les exemples sont des produits de la plante qui S correspondent essentiellement aux structures lia et 11b ; ce mélange étant nommé parfois "calystégine".

EXEMPLE 1 ROLE DU PLASMIDE A) Méthodes 0 1 Qïîi2i£§_^ §_:≥2ϋ2îϋë§

On dispose de deux types de souches (voir ta¬ bleau 1) :

- Rhizobium meliloti 2011 ne contenant pas le plasmide pRme 41 et ne portant aucune 5 ^• résistance à des antibiotiques ;

- Rhizobium meliloti 41. Des souches possé¬ dant ou non le plasmide pRme 41 sont uti¬ lisées. Afin de différencier les souches, des gènes de résistance à des antibiotiques 0 sont utilisés comme gènes marqueurs. A par¬ tir de la souche R. meliloti 41 guérie du

plasmide par un traitement à la chaleur, deux mutants spontanés ont été isolés, l'un résistant à la spectinomycine (souche 3) et l'autre à la rifa picine (souche 4) . Ces mutations sont situées sur le chromo¬ some. Ce sont les deux souches ne catabo- lisant pas les composés de l'invention qui seront utilisées (souches cac~) . Dans ces deux souches, le plasmide pRme 41 portant une résistance à la kanamycine a été ré¬ introduit : ce sont les deux souches cata- bolisant les composés selon la présente invention (souches cac ) qui vont être uti¬ lisées (souche 1 : résistance à la specti- nomycine et à la kanamycine ; souche 2 : résistance à la rifampicine et à la kana¬ mycine) .

Tableau 1 : Réça2itulation_des_souçhes_de_R _i _meliloti_4 âY £_2ϋ_E ^§ 2 _EiËË2i ê_E5ïïË_il_ïï£i iΞέÊΞ

N° DES SOUCHES CARACTERISTIQUES RESISTANCE

+ cac spectinomcine kanamycine cac rifampicine kanamycine

3 cac spectinomycine 4 cac rifampicine

2/ Çulture_des_£lantes_en_çonditions_axénigue Des graines de Calystegia sepium et de Convolvu- lus arvensis sont scarifiées par trempage pendant 30 min dans de l'acide sulfurique concentré puis sont rincées cinq fois avec de l'eau permutée. Elles sont ensuite sté¬ rilisées en surface pendant 15 min dans une solution satu¬ rée d'hypochlorite de calcium et rincées six fois succes¬ sivement avec de l'eau permutée stérile. Les graines sont réparties dans des boîtes de Pétri contenant de l'eau gé- losée stérile à 15 % et sont mises à germer dans l'obscu¬ rité à la température du laboratoire. Au bout d'une pério¬ de comprise entre 72 heures et une semaine, lorsque la racine atteint au moins un centimètre, les plantules sont repiquées dans des tubes de 22 cm X 22 mm contenant 12 ml de milieu Jensen stérile dilué au 1/5 additionné de 0,5 g de nitrate de potassium. Les graines sont disposées sur une bande de papier Chardin de 15 cm X 1 cm pliée en son milieu afin de servir de support. La racine est placée le long de la bande de papier pour éviter le dessèchement. Le tube est bouché avec du coton cardé, permettant ainsi les échanges gazeux (voir figure 1 ) . Les tubes sont pla¬ cés dans une chambre climatisée avec 16 heures de jour, u température de 22°C le jour et de 18°C la nuit et une hu¬ midité relative de l'air de 80 %.

La souche de R. meliloti 2011 est repiquée dan un tube contenant du milieu Wright gélose et mise en culture pendant 48 heures à 28°C. Puis les bac téries sont mises en suspension dans 9 ml d'eau stérile.

La solution ainsi obtenue est diluée jusqu'au 1/100.000.

On inocule chaque tube par 0,1 ml de la dilution au

3 1/100.000 afin d'avoir environ 10 bactéries par tube.

Cette souche va servir à épuiser le milieu.

Une semaine après, un mélange de souches cac et cac en proportion égale est apporté. Les souches cac et cac sont préalablement cultivées séparément sur milie gélos Wright pendant 40 heures à 28°C. Puis elles sont m ses en suspension dans 9 ml d'eau stérile et 0,1 ml de cette suspension est inoculé dans 10 ml de milieu Wright liquide contenu dans une fiole de 50 ml bouchée par du coton cardé. Les fioles sont mises en culture, ladite cul ture étant agitée pendant 48 heures à 28°C. Un prélèvemen est alors fait pour déterminer la concentration en bacté¬ ries des différentes cultures. Pendant la durée du dénom¬ brement, les fioles sont conservées à 4°C. Une fois la concentration connue, les différentes souches de R. melil ti 41 sont mélangées deux à deux de façon à obtenir un mélange de proportion égale. Les deux mélanges suivants sont réalisés :

- souche 1 (cac ) + souche 4 (cac )

- souche 2 (cac ) + souche 3 (cac )

Le mélange est dilué au 1/1.000.000 et 0,1 ml des dilutions au 1/1.000.000, 1/10.000 ou 1/100 sont ino¬ culées par tube afin d'avoir trois niveaux d'inoculations. Des témoins sont obtenus en inoculant des tubes dépourvus de plante.

Au préalable, 0,3 ml du contenu de trois tubes aura été prélevé afin de dénombrer le niveau obtenu par la souche épuisante R. meliloti 2011.

Trois répétitions sont faites par type de mé¬ lange, niveau d'inoculation et type de plante.

4/ Déngιώrement_des_Rhizobium

Dix jours après, des prélèvements de milieu son faits dans les tubes et sont dilués de façon convenable. Les dilutions sont étalées sur des boîtes de Pétri conte¬ nant 20 ml de milieu Wright gélose additionné d'actidione à raison de 20 μg/ml afin d'éviter une contamination des

boîtes par des champignons. Pour différencier les souches, des antibiotiques sont ajoutés au milieu Wright :

- kanamycine (100 μg/ml) pour obtenir les sou¬ ches cac ;

5 - spectinomycine (150 μg/ml) pour obtenir la souche 3 ;

- rifampicine (50 μg/ml) pour obtenir la souche 4.

Le milieu témoin (Wright plus actidione) permet T0 d'obtenir la totalité des souches, y compris P.. meliloti 2011. L ^r incubation des boîtes se fait à 28°C pendant 3 jours. Les prélèvements peuvent s'étaler sur plusieurs se maines car le niveau atteint par les bactéries reste sta¬ ble.

15

B) Résultats

Les nombres de bactéries cac et cac observées après dix jours sont donnés dans le tableau IV. Les ré¬ sultats représentent la moyenne de trois répétitions.

20 Le mesure du nombre de bactéries de la souche

2011 utilisée pour épuiser le milieu en l'absence de plan te avant inoculation des souches cac et cac a permis de mettre en évidence qu'il existait dans le milieu suf¬ fisamment de nutriments pour permettre 1'installation de g

25 2,6 X 10 bactéries par tube. En présence de plantes, ce nombre est multiplié par 2 à 3. Durant le reste de l'ex¬ périence, ces nombres resteront stables.

En l'absence de plante, il y a eu 8 générations de bactéries cac au plus bas niveau d'inoculation et 6

30 à 8 générations de cac , ce qui donne pour les deux cou¬ ples de souches un rapport cac /cac de 4 -à 1,4. A des niveaux d'inoculation plus élevés, il n'y a formation que de 2 ou 3 générations des souches cac et cac ce qui don ne un rapport cac /cac semblable au rapport de départ.

35

En présence d'une plante sécrétant de la calystégine, il y a une multiplication beaucoup plus importante des sou¬ ches -cac par rapport aux cac . Cette multiplication dif¬ férentielle s'observe mieux au plus bas niveau d'inocula- tion : en présence de Calystegia pour le couple 1-4, la souche cac a donné 11 générations et la cac à peine 1 , ce qui donne un rapport cac /cac ^" de 1790. Aux niveaux d'inoculation 10 5 et 107, la souche CAC+ a donné de 2 à

3 générations alors que la cac en a donné de 0 à 1 ce qui donne des rapports cac /cac de respectivement 13 et 1,4. Ce même phénomène s'observe un peu atténué en pré¬ sence de Convolvulus et avec le couple de souches 2-3. Il existe donc un effet du niveau d'inoculation. Pour la même plante, selon le couple de souches, le rapport cac /cac ^" varie. Les mutations de résistance aux antibio¬ tiques influent donc sur la croissance des souches. Pour un même couple de souches, le rapport cac /cac est plus faible avec C. arvensis qu'avec C. sepium.

Tableau IV: Nombre des différentes bactéries 201 1 , cac , cac , contenues dans le milieu exprimé en nombre de bactéries par tube pour les deux couples de souches uti ¬ lisés aux 3 niveaux d' inoculation en présence ou en l ' absence de Calystegia ou de Convolvulus. Le rapport des souches cac /cac est également donné

Di lut ion INOCULUH SANS PMHIC CAUSICGI» CONVOI UIUS

1.9 10 ^J 2,6 10 ^β J.5 ιo" 6,5 10 ⁸

,0 ³ f 1,9 10 ^J 6.6 10 ³ 7, 5 ιo ^J 0,9 1.J ιo ^β 2,0 10 ⁶ 4,9 10 ⁵ 1, 5.4 ιo ⁸ 1.7 10 ⁷

1* 9,5 10 ^J 1790 3.1 ιo ^a 4.5 ιo ⁷ 1.3 10 ⁵ 346

1,9 10 ^J 6,6 10 ⁵ 7.5 10 ⁵ 0.9 1,6 10 ^β 5.* ιo ⁶ 10 ⁶ 1,3 1.1 10 ^β 4 ,2 10 ⁶ 3.3 10 ⁵ 13 5.2 10 ⁸ 4,2 10 ⁷ 7.4 10 ⁶ 5, 7 ιo' l 1,9 ιo ^J 6.6 10 ⁷ 7, 3 10 ⁷ 0,9 1.0 10 ⁹ 2.5 10 ^β 2,8 10 ⁸ 0,9 8, 1 10 ^β 1.7 10 ⁸ 1,2 10 ⁸ 1.4 1,4 10 ⁹ 2.6 V 4 , 1 ιo ⁸ 0,6

' ^• 1,9 10 ^} * ,β lo' 5.) 10 ^J 0,9 1.2 10? 1.7 10 ⁶ 1,2 10 ⁶ 3.1 10 ⁸ 9.6 10 ⁶ 6, 5 10*

2* 1.4 6,4 ιo ⁸ 6,2 10 ⁶ 3 ,4 M* 182 152 1°05 ³ » ' 1,9 10* 4.» 10 ⁵ 5,3 10 ⁵ 0.9 1.5 ιo ^β M 10 ⁶ 5.6 10 ⁶ 0,7 1.6 10 ⁸ 3.5 10 ⁶ 6, 1 10 ⁵ 5,a 2.1 10 ⁸ 7.2 10 ⁶ 2,2 10 ⁶ 3,3

10 ⁷ ) i 1.9 ιo 4,8 10 ⁷ 5.3 10 ⁷ 0,9 1,0 1θ' 1.J 10 ⁸ 2.5 1θ" 0,5 4.2 ιo ⁸ 9.5 10 ⁷ 1.7 10 ⁸ 0,6 β.9 10 ^β 9.4 10 ⁷ 1.3 10 ⁸ 0.7

* souche 1 : cac , résistante à la spectinomycine et à la kanamycine souche 2: cac , résistante à la rl famplc ne et à a kanam yclne souche 3: cac , résistante à la spectinomycine . souche 4 : cac ^" , résistante à la rifamplc ne

EXEMPLE 2 ROLE DE LA CALYSTEGINE PURIFIEE

A) Méthodes

1 / Origine_des__souçhes La souche R. meliloti 2011 et les souches cac et cac ^" 1 et 4 sont utilisées.

2/ lEÉEâEi=i2ïl_ §§_=ï2bes Des tubes contenant du milieu de culture sont préparés selon la méthode décrite dans les exemples précé dents , mais aucune plante n'est présente. Le milieu de culture est supplémenté par de la calystégine purifiée à différentes concentrations : 0 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml ou 20 μg/ml.

L'inoculum est produit selon la méthode décrite dans les exemples précédents mais n'est inoculé qu'à la

3 seule concentration de 10 bactéries par ml. Pour chaque concentration en calystégine quatre répétitions sont fai¬ tes .

B) Résultats

Neuf jours après son introduction à un niveau 2 de 6,3 X 10 bactéries/ml, la multiplication de la souche

R. meliloti 2011 avant inoculation par le couple cac -cac est donnée dans le tableau VII. La souche 2011 trouve dans le milieu suffisamment de nutriments pour passer de

2 6

6,3 X 10 à 5 X 10 bactéries/ml, mais elle n'est pas ca- pable d'utiliser la calystégine puisque selon les diffé¬ rentes concentrations sa multiplication ne varie pas. La croissance des bactéries cac et cac est exprimée dans l tableau VIII en nombre de bactéries/ml. Au départ, X 10 bactéries cac et cac ont été inoculées (49 % de la sou- che 1 cac et 51 % de la souche 4 cac ) . Lorsqu'il n'y a

pas de calystégine rajoutée , le rapport cac /cac reste peu différent de 1 : il n ' y a pas eu de multiplication différentielle. Mais lorsqu'on rajoute les cαroosés selon la pré¬ sente invention au milieu, la souche cac ne se multiplie pas alors la cac donne 13 à 14 générations ce qui donne un rapport cac + /cac — de 1 ' ordre de 1 04 . L ' augmentation du rapport n ' est pas proportionnelle à l ' augmentation de calystégine dans le milieu.

Tableau VII Nombre de bactéries R. meliloti 201 1 par ml dans le milieu 9 jours après inoculation et avant 1'introduction des souches cac et cac ^" en fonction de la concentration de calystégi

Concentration de calystégine Nombre de bactéries 2011

(μg/ml)

0 5.10 ⁶

5 3,6.10 ⁶

10 6,5.10 ⁶

20 1 ,4.10 ⁷

Tableau VIII Nombre des différentes souches (2011, cac cac ) contenues dans le milieu donné en nombre de bactéries par ml et rapport des souches cac /cac en fonction de la con¬ centration de calystégine

CONCENTRATION DE

CALYSTEGINE 2011 CAC ⁺ CAC~ CAC ⁺ /CAC ^* (μg/ml)

0 1 ,9.10 3,9.10 ^' 2,3.10 ^" 1,7

5 5,0.10 2,2.10 2,0.10' 11.000

10 3,5.10 3 .10 2,0.10' 15.000

20 1,1.10 5,5.10 2,3.10' 24.000

EXEMPLE 5 COMPETITIVITE POUR LA NODULATION

A) Méthodes

1/ Origine_des_souches Les souches 1, 2, 3 et 4 de R. meliloti 41 sont utilisées. De plus une souche de R. leguminosarum P153 est utilisée pour servir de souche épuisant le-milieu.

2/ Çulture_des_E §ïltes Des tubes Gibson sont utilisés (voir figure 2) . Des tubes de 22 cm x 22 mm sont remplis de 30 ml de milieu Jensen gélose à 15 %. Ils sont bouchés par une triple épaisseur de papier aluminium maintenue en place par un élastique. Le papier aluminium est percé par un trou bou¬ ché par du coton. Après stérilisation par autoclavage, le tubes sont inclinés de façon à ce que la gélose vienne to

cher le papier aluminium. 11 ml de milieu Jensen dilué au 1/4 et ne contenant pas de nitrate est ajouté. Les plantules de luzerne stérilisées et âgées de 36 heures sont repiquées en faisant un trou dans la capsule d'alu- minium à la limite de la gélose et en y introduisant la r cine après avoir débarassé les cotylédons des téguments de la graine.Il faut s'assurer que la racine est bien en contact avec la gélose afin d'éviter son dessèchement. Le tubes sont ensuite recouverts d'un plastique prévenant la dessication des plantules et placés en chambre climatisée

3/ 2£ Eâ£â£i S_è§_iliS 2ϋlHîS Un inoculum de souche de R. leguminosarum est obtenu de la même manière que R. meliloti 2011 et est ino

3 culé dans les tubes à une concentration de 8,7 X 10 bactéries/ml afin d'épuiser le milieu. Six jours après, les luzernes sont repiquées dans les tubes et le lende¬ main sont inoculées par 0,5 ml d'un mélange de bactéries. Les mélanges de bactéries sont obtenus selon la technique déjà décrite. Huit types de traitements sont effectués selon l'inoculum apporté, avec 10 répétitions par traitement (voir tableau III) :

S- Traitement A : souche 1 (46 %) + souche 2 (54 - Traitement E : souche 3 (52 %) + souche 4 (48 - Traitement C : souche 1 (46 %) + souche 4. (54 - Traitement D : souche 2 (52 %) + souche 3 (48 10~bact _é ries//~ -Traitement E : souche 1 + souche 4 + 120 μg d mi / calystégine j - Traitement F : souche 2 + souche 3 + 120 μg d V. calystégine Traitement G : souche 1 + souche 4 + 120 μg d calystégine Traitement H : souche 2 + souche 3 -r 120 μg calystégine

Tableau III Souches Utilisées pour l 'expérience de compétitivité pour la nodulation selon le traitement

SOUCHES UTILISEES

TRAITEMENT N ^* CARACTERISTIQUES N* CARACTERISTIQUES

cac ^* , résistante specti¬ 2 cac*, résistante rifam¬ nomycine et kanamycine picine et kanamycine cac , résistante specti¬ 't cac , résistante rifam¬ nomycine picine cac , résistante specti¬ k cac , résistante rifam¬ nomycine et kanamycine picine cac ⁺ , ré-si ^• s it.ant.e ri - efam¬ 3 cac , résistante specti¬ picine et kanamycine nomycine cac , résistante specti¬ !» cac , résistante rifam¬ nomycine et kanamycine picine cac , résistante rifam¬ 3 cac , résistante specti¬ picine et kanamycine nomycine cac , résistante specti¬ k cac , résistante rifam¬ nomycine et kanamycine picine cac , résistante rifam¬ 3 cac.., résistante specti¬ picine et kanamycine nomycine

4/ Iden ifiçation_des_souçhes_formant_les nodosités

Au bout d'un mois, les nodosités formées sont détachées des racines et aseptisées au chlorure mercuriqu de la même manière que les graines de luzerne . Far traitement, cinquante nodosités choisies au hasard sont écrasées dans 0,1 ml d'eau permutée- stérile puis elles sont étalées sur boîte de Pétri afin de libérer les bactéries, puis elles sont étalées sur boîte de Pétri contenant du milieu Wright αélosé comprenant les différents antibiotiques. Les

boîtes sont mises à incuber 3 jours à 28°C.

B) Résultats

Les pourcentages de nodosités occupées par les différentes souches sont donnés dans le tableau IX. D'apr les traitements A et B, la différence de compétitivité po la nodulation, faible entre souches sans plasmide, devien importante lorsque les deux souches ont le plasmide. La comparaison des traitements A à C et B à D montre l'effet du plasmide : l'introduction du pRme 41 dans la souche résistante à la rifampicine entraine une perte de compé¬ titivité de la souche ainsi formée par rapport à celle résistante à la spectinomycine avec ou sans plasmide. De même, la comparaison des traitements A à D et B à C donne le même résultat pour la souche résistante à la spectinomycine par rapport à celles résistantes à la ri¬ fampicine avec ou sans plasmide, mais à un moindre degré. En comparant les traitements C et E ou D et F, l'effet de la calystégine peut être observé : en présence de calys- tégine, la souche cac résistante à la spectinomycine forme 36 % des nodosités au lieu de 24 % sans calystégi¬ ne, la souche cac résistante à la rifampicine en forme 6 % au lieu de 0 %. La calystégine permet donc l'augmen¬ tation de la compétitivité des souches capables de la cat boliser. Une augmentation de la compétitivité de la souc CAC par rapport à la souche CAC est .également observée présence de calystégine et lorsque le niveau de bactéries inoculées est plus grand.

Tableau IX Pourcentage des nodosités occupées par les différentes souches testées calculé à partir de 50 nodosités par traitement

SOUCHES FORMANT LES NODOSITES

TRAITEMENT 1 2 3 4 DOUBLE OCCUPATION

A 98 2 0

B 52 38 10

C 24 72 4

D 0 100 0

E 36 54 10

F 6 94 0

G 50 44 6

H 25 75 0

EXEMPLE 6 ETUDE DE LA RHIZOSPHERE DE PLANTES SYNTHETISANT LES CALYSTEGINES

A) Matériels et méthodes a) Eçhantillonages

Il s'agit de comparer la rhizosphère de Calystegia sepium et Convolvulus arvensis synthétisant les calystégines avec la rhizosphère de plantes témoins, Alliaria petiolata et une Graminée ne synthétisant pas de calystégines.

Les plantes échantillonées sont préalablement choisies de façon à ce que l'espèce végétale domine dans le lieu de prélèvement.

Deux échantillons de terre sont prélevés autour 5 des racines de Calystegia sepium et de Convolvulus arvensi deux espèces de liserons très répandues, ainsi qu'un autou d'une Graminée et un autour d'une dicotylédone Alliaria petiolata (famille des Crucifères) .

La terre qui adhère aux racines des plantes TŒ est placée dans 50 ml d'eau stérile et agitée pendant

30 minutes, sur un agitateur magnétique. La solution mère ainsi obtenue est diluée selon la gamme 10 -1 , 10-2, 10-3, 10 —4. 200 μl de chaque dilution ainsi obtenue sont étalés sur des boîtes contenant le milieu suivant :

T5 Peptone 5,0 g

Extrait de levure deshydratée 2,5 g

Glucose 1,0 g

Agar-agar 15,0 g

Eau qsp 1 000,0 ml zσ pH = 7 +/- 0,1

On ajoute dans le milieu deux antifongiques :

Nystatine : 50,0 mg/ml

Métalaxyl : 20,0 mg/ml 25 Les boîtes sont ensuite placées à l'étuve à 28°C environ

48 heures, c'est-à-dire le temps nécessaire pour obtenir un bon développement bactérien.

On sélectionne donc les bactéries sur au moins deux critères : leur aérobiose et leur capacité de pousser 30 à 28°C.

On récupère ensuite :

- 25 colonies pour Calystegia sepium,

- 23 colonies pour Convolvulus arvensis,

- 42 colonies pour les témoins : 25 . 32 pour Alliaria petiolata

. 10 pour la graminée.

Puis, on fait un test catabolique.

b) Test_çataboligue On utilise une culture bactérienne liquide d'en- viron 12 heures à 28°C (FR 2582671) . On utilise pour cette précultur le même milieu que celui utilisé pour le développement. Les bactéries sont au bout de ce temps en phase exponentielle de croissance.

Les bactéries sont lavées deux fois dans un mi- lieu SM (milieu minimum). La composition de ce milieu est la suivante :

KH ₂ P0 ₄ 4,00 g

MgS0 ₄ , 7 H ₂ 0 0,10 g CaCl ₂ 0,02 g (après autoclavage) MnCl ₂ , 4 H ₂ 0 1,00 ml d'une solution 10 M

NaOH qsp pH=7,1

La stérilisation est effectuée par filtration.

La DO de la suspension bactérienne obtenue est ajustée- à 0,5 (longueur d'onde = 650 nm) . 200 μl de la suspension ainsi obtenue sont in¬ cubés à 28°C pendant 40 heures avec 5 μl d'une solution de calystégines A et B de concentration 10 mg/ml environ. Les tubes sont agités pendant toute la durée de l'incubation. Après 40 heures, les tubes sont centrifugés et les surna- géants récupérés. On évapore ces surnageants et les résidus sont repris dans 10 μl d'eau osmosée. Ils sont ensuite dé¬ posés sur papier Whatman 3 MM en vue d'une électrophorèse en milieu acide (tampon acide acétique/acide formique) pendant 20 minutes à 3000 V. Après séchage, on relève avec un réactif au nitrate d'argent. Sa composition est la suivante :

- Solution 1 : AgN0 ₃ (AgN0 ₃ : 4g ^' ; H ₂ 0 : 20 ml Acétone qsp 1000 ml).

On sèche rapidement.

- Solution 2 : NaOH (NaOH 20 % dans H ₂ 0 : 100 ml Ethanol 96 % : 900 ml) .

On sèche lentement.

- Solution 3 : Fixateur photo (suivre la for¬ mule du fabricant) .

On lave à l'eau plusieurs fois et on sèche.

B) Résultats

On voulait donc comparer le nombre de bactéries capables de dégrader les calystégines (dites CAC ) dans la rhizosphère de Calystegia sepium et Convolvulus arvensis avec celui de la rhizosphère de deux plantes témoins, Alliaria petiolata etde la graminée.

Les résultats obtenus sont les suivants :

nbre de ₊ +

Plantes testées nbre de CAC % de CAC colonies

Calystegia sepium 25 6 24

Convolvulus arvensis 23 6 26

Témoins 42 0 0

C) Test de fluorescence

Le caractère de fluorescence peut être observé de façon plus sure après culture sur un milieu gélose par- ticulier, le milieu King B.

Les bactéries sont mis en culture à 28°C pendan 48 heures sur ce milieu.

Après développement bactérien, les colonies sont observées avec un éclairage UV.

Les résultats observés sont les suivants : une souche bactérienne est fluorescente . Il s ' agit de la souche appelée D1 . Elle a été isolée à partir du sol rhizosphéri- que de Calystegia sepium. Les souches de bactéries présen- tant ce caractère de fluorescence sont typiqœment des bactéries pos¬ sédant des sidérophores . Ils peuvent intervenir dans des processus de protection de la plante contre des pathogènes .

Les conclusions que l ' on peut tirer des diffé¬ rents exemples sont les suivantes : D ' après les résultats obtenus lorsque les sou¬ ches portant le plasmide sont comparées aux souches sans plasmide , il apparait que le pRme 41 joue un rôle non né¬ gligeable dans la multiplication des souches CAC . Dans le milieu assimilé à la rhizosphère , il existe une diffé- rence de multiplication entre les souches possédant ou non le plasmide en présence de plantes synthétisant de la calystégine . Une hypothèse expliquant les différences de rapport CAC /CAC entre Convolvulus et Calystegia sepium serait que Convolvulus excréterait dans le milieu plus de compo- ses non spécifiques que Calystegia . Cela entraînerait alors une plus grande multiplication de la souche CAC en pré¬ sence de Convolvulus qu ' en celle de Calystegia , et donc un rapport CAC /CAC plus faible .

L'utilisation de la calystégine purifiée montre que ce cαn- posé sert effectivem ^e nt de substrat nutritif aux souches possédant le pRme 41 (Tepfer et al. Journal of Bacteriology, Mars 1988, vol 170, N° 3) Donc, les différences de multiplications observées avec Calystegia et Convolvulus peuvent bien s 'expliquer par l'exsixlation de calvstéqine par ces plantes et par son utilisation comme nutriment spécifique . L ' augmentation non proportionnelle du rapport

CAC /CAC~ comparée à la concentration en calystégine mon¬ tre qu ' il existe dans le milieu un facteur limitant au développement des souches . Ces résultats semblent égale¬ ment indiquer que , puisque pour une concentration en calystégine de 5 .. μg/ml il y a eu 1 3 générations de bacté-

ries CAC formées et puisqu'en présence de Calystegia cette même souche CAC n'a donné que 11 générations, le Calystegia a excrété dans le milieu moins de 5 μg de calystégine. Quant à la compétitivité pour la nodulation, puisque les deux souches CAC ou les deux souches CAC~ ne diffèrent,que par des résistances différentes à des antibiotiques, les différences de compétitivité pour la nodulation apparues entre les deux souches CAC ou CAC~ ne peuvent s'expliquer que par les mutations de résistance aux antibiotiques. D'après les quatre premiers traitements, il est possible de classer les souches utilisées résistan¬ te à la spectinomycine) est plus compétitive que :

- la souche 4 (CAC résistante à la rifampicine) elle-même plus compétitive que

- la souche 1 (CAC résistante à la spectinomy¬ cine et la kanamycine) elle-même plus compé¬ titive que

- la souche 2 (CAC résistante à la rifampicine et à la kanamycine) .

Bien que les traitements correspondants n'aient pas été réalisés, ce classement permet de déduire que la souche 3 est plus compétitive que la 1 et la 4 plus com¬ pétitive que la 2. L'introduction du plasmide diminue donc la compétitivité pour la nodulation des souches. Cette diminution est différente de celle entrainée par les ré¬ sistances aux antibiotiques. Il y a peut-être sur le plasmide pRme 41 , outre les gènes de catabolisme de la calystégine, des gènes entraînant une baisse de compéti- tivité pour la nodulation. Cela peut être également dû au transposon Tn5 introduit, portant un marquage de ré¬ sistance à la kanamycine. L'apport de calystégine dans le milieu permet d'améliorer la compétitivité égale. La quantité de calystégine apportée et la différence du nom- brede bactéries entrainée par cet apport a permis de

rattraper en partie l'écart de compétitivité des souches CAC par rapport aux CAC . L'inoculation à un fort taux avec de la calystégine réduit les différences de compé¬ titivité entre les souches avec ou sans plasmide. Enfin, dans la rhizosphère des deux liserons synthétisant des calystégines, on trouve des bactéries capables de dégrader ces substances et de les utiliser comme unique source de carbone et d'azote.Le nombre de ces bactéries est d'environ 25 %. Par contre, aucune bactérie des sols prélevés autour des plantes témoins n'a pu dégrader les calystégines Leur taux de présence doit donc être plus faible que dans la rhizosphère des liserons étudiés.

Les liserons semblent donc créer par leur exsudats racinaires un environnement favorable à cer¬ taines espèces de bactéries qui seraient capables de ca¬ taboliser les calystégines.

Pour connaître un éventuel rôle de protection de la plante conféré par les bactéries CAC vis-à-vis d'autres bactéries par exemple, on peut utiliser la fluo¬ rescence de la souche D1 en mettant ces bactéries en cultu¬ re avec d'autres bactéries CAC isolées du sol. La protec¬ tion de la plante devrait se traduire par une croissance des bactéries CAC ralentie ou inhibée.