CAMPO TÉCNICO

[001] La presente invención se encuentra enmarcada en el campo técnico de la biotecnología y la industria farmacéutica para acuicultura continental para la identificación del sexo en paiche (Arapaima gigas , principalmente en el campo de la reproducción y cultivo de esta especie.

ESTADO DE LA TÉCNICA

[002] En la actualidad, la determinación del sexo en Arapaima gigas se realiza mediante endoscopía laparoscópica y métodos bioquímicos o inmuno- enzimáticos de vida útil muy corta. Estos métodos tienen la limitante que su utilidad es aplicable sólo en la fase adulta. En el primer caso, la endoscopía es un método de muestreo invasivo en animales adultos (Carreiro et al., 201 1 ), el cual tiene la desventaja que requiere realizar muestreo invasivo y cirugía solo en individuos adultos. En el caso de los kits de métodos bioquímicos o inmuno- enzimáticos (Chu Koo et al., 2009), empleados habitualmente en Perú y Brasil, se realizan mediante una prueba de ELISA o a través de un kit comercial que tiene una vida útil de 3 meses, de muy alto costo y que, además, debe ser importado desde Francia.

[003] En el ámbito de patentes, se conoce el documento CN104808005 el cual describe un método para identificar mero gigante macho (Epinephelus lanceolatus). El método comprende los pasos de selección del mero gigante en la temporada de reproducción; obtener suero del mismo: seleccionar sangre de la vena caudal del mero gigante y realizar una centrifugación para obtener el suero; medir el contenido de vitelogenina en el suero mediante ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas); medir el contenido de 1 1 -KT (11 - cetotestosterona) en el suero con ELISA; e identificación del mero gigante macho en combinación con el contenido de vitelogenina y el contenido de 11 -KT en el suero del mero gigante. El método es rápido, eficiente y de alta precisión y no causa daños al espécimen.

[004] También se sabe del documento CN1 13528676 que divulga un método para usar el gen ARNr 5S para identificar el sexo fisiológico de los peces en la etapa inicial del desarrollo que incluye los pasos: uso de kits de extracción de ARN total o reactivos TRIzol y otros métodos convencionales para extraer ARN total de células animales, extraer ARN total de tejido gonadal de peces y usar un analizador de ácidos nucleicos (Nanodropl OOO, etc.) para determinar la proporción de la densidad óptica 260/280. Se utiliza para valorar preliminarmente la pureza del ARN; separar el ARN total mediante electroforesis en gel de agarosa, observar el brillo y la distribución de las bandas pertenecientes a ARNr 5S, ARNr 5.8S, ARNr 18S y ARNr 28S. El tamaño del ARNr 5S está entre 130 y 150 nucleótidos El valor máximo de la electroforesis microcapilar suele estar cerca de 140 nt, y el valor del ARN total se refiere al tamaño del área generada por todas las áreas cubiertas. Además, el tejido gonadal del pez, se puede muestrear de manera no letal por disección o con una herramienta de muestreo micro gonadal (u oviductor) y se toma una sección de tejido micro gonadal de 1 mg a 100 mg.

[005] De otra parte, el documento de patente EP3620536 proporciona un conjunto de biomarcadores epigenéticos útiles para predecir el sexo en peces, siendo dichos biomarcadores epigenéticos dinucleótidos citosina-guanina específicos (CpG) que están metilados diferencialmente en machos frente a hembras. Se encontró que los niveles de metilación de los promotores de los genes dmrtl y cyp19a1 a son suficientes para agrupar los peces por sexo, donde el gen cyp19a1 a está hipometilado en los ovarios con respecto a los testículos, mientras que el gen dmrtl está hipometilado en los testículos con respecto a los ovarios.

[006] La patente CN108998545 hace referencia a la aplicación de p¡R-mmu- 31018127 de Cynoglossus semilaevis. La etiqueta sexual piR-mmu-31018127 se deriva de un exosoma del plasma seminal del pez. A través del análisis de secuenciación de ARN, se obtiene una etiqueta de piARN significativamente diferente en expresión en dos tipos de peces mediante cribado, adoptándose como candidato, un biomarcador de piARN que tiene una función indicativa para los dos tipos de peces. Se determina finalmente a través de la verificación adoptando medidas cuantitativas en PCR tiempo real (qPCR). El piRNA de la etiqueta es p¡R-mmu-31018127 con una secuencia de GCATGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCG, y se desarrolla un kit basado en la etiqueta. El método proporcionado es no invasivo y eficiente con un resultado de identificación confiable y se determina el sexo genético de Cynoglossus semilaevis mediante determinación cuantitativa.

[007] El documento de patente WO14129982 reporta sistemas de determinación del sexo en los peces mediante un método y kit de sexado conveniente y preciso que puede usarse en arawanas rojas para establecer la proporción de sexos óptima de las poblaciones reproductoras que se emplearán durante la cría en cautiverio con fines de conservación y producción, en donde el método y el kit comprende un cebador que tiene una secuencia de oligonucleótidos de 5 'TAACTCAAAAGTAGAATAGAACAATG 3' y un segundo cebador que tiene una secuencia de oligonucleótidos de 5’ AATTCAAGGGAACTGATGACTCTA 3' para identificar el sexo en una o más muestras de ADN genómico que pueden aislarse de una fuente de ADN, tal como músculo, branquias, aletas, mucus, heces o una combinación de uno o más de los mismos.

[008] Por su parte, el documento MX2013001464 reporta un método de obtención de una tira reactiva para el reconocimiento del sexo de lepisosteidos que comprende la purificación de vitelogenina a partir de plasma de especímenes de machos inducidos con estradiol, producción, purificación y mareaje de anticuerpos y elaboración de las tiras reactivas para el sexado de otras especies. Las tiras de nitrocelulosa o nylon con la vitelogenina inmovilizada en su superficie se emplean para el sexado de especies de peces que no presentan dimorfismo sexual, principalmente de lepisosteidos tanto a nivel de laboratorio como en campo. [009] La patente ES239881 1 reporta un método para la identificación del sexo en peces mediante el uso de una molécula asociada al ARN ribosómico 5s (ARNr 5s), o de una molécula involucrada en el transporte de proteínas que intervienen en la regulación de la transcripción del gen que codifica el ARN 5s como marcador para identificar el sexo en peces. La invención también se refiere a un método para clasificar por sexos una población de peces que comprende la determinación del nivel de expresión de una molécula asociada con 5s ARNr, o una molécula involucrada en el transporte de proteínas implicadas en la regulación de la transcripción del gen que codifica ARNr 5s. Los cebadores específicos son del gen ARNr 5S, número de acceso al Gen Bank AM706461 fw (SEQ ID NO: 1 ): 5’-CTTACGGCCATACCACCCTG 3’ (SEQ ID NO: 2) y Rv 5’- GTATCCCAGGCGGTCTCC-3’ (SEQ ID NO: 3) mediante reacciones de qPCR con ADN complementario (ADNc) a una concentración de 5 ng/pl.

[010] Por su parte, el documento US5480774 proporciona un método para determinar el sexo genómico de un salmónido mediante la detección de la presencia o ausencia del pseudogen de la hormona del crecimiento GH-PSI. El pseudogen se detecta mediante la amplificación de una subsecuencia seleccionada específica del pseudogen, o por formación dúplex de un ácido nucleico que se híbrida específicamente con el pseudogen y con ningún otro gen en el genoma de la especie de salmónidos. El método es útil en varios salmónidos, en particular en Oncorhynchus tshawytscha y Oncorhynchus kisutch.

[011] Desde el punto de vista de documentos científicos, se conoce el artículo “A duplicated copy of id2b is an unusual sex-determining candidate gene on the Y chromosome of arapaima (Arapaima gigas) de Mateus C. Adolfi et al. (2021 ) el cual indica que al incorporar un mapa de contacto cromosómico Hi-C se mejora el ensamblaje del genoma de Arapaima a nivel cromosómico, revelando un alto grado inesperado de reordenamientos cromosómicos durante la evolución de los Osteoglossiformes, y al combinar el nuevo reordenamiento con un pool de secuenciación de genomas masculinos y femeninos, se logra identificar el gen id2bbY que corresponde a una copia duplicada del inhibidor del gen 2b (id2b) de unión al ADN en el cromosoma Y como gen candidato determinante del sexo masculino.

[012] El artículo titulado “The genome of the Arapaima (Arapaima gigas) provides insights into gigantism, fast growth and chromosomal sex determination system” de Kang Du et al. (2019) indica que se generó un draft de la secuencia del genoma con buena contigüidad que proporciona una referencia útil para análisis filogenómico y evolutivo genómico comparativo. Con este fin, se identifica genes candidatos que pueden estar relacionados con rasgos específicos de Arapaima, por ejemplo: rápido crecimiento, gran tamaño corporal, adaptaciones a un estilo de vida carnívoro y función del órgano secretor similar a una glándula que se encuentra en la superficie de la cabeza de machos y hembras. En este contexto, se encontró una expresión génica específica masculina en el órgano secretor, que asigna tanto una función de nutrición de alevines y también una función de señalización de tipo feromona para las hembras locales. Por primera vez, se infiere de los datos genómicos, un posible sistema genético que determina el sexo de la heterogeneidad masculina en esta especie que presenta cromosomas homomórficos para ambos sexos.

[013] Otro artículo relacionado es el titulado “De novo transcriptome based on next-generation sequencing reveals candidate genes with sex-specific expression in Arapaima gigas (Schinz, 1822), an ancient amazonian Freshwater fish” de Luciana Watanabe et al. (2018) el cual hace referencia al establecimiento de cuatro bibliotecas de A. gigas: hígado masculino, hígado femenino, piel masculina y piel femenina. Las bibliotecas de ADN complementario (ADNc) se restringieron en dos pasos, en primer lugar, la fragmentación del ARN total y luego la síntesis del ADNc bicatenaño. La cantidad inicial del ARN utilizado en la fragmentación fue de 600 ng/pl, con cloruro de zinc (ZnCl2) y Tris. Se agrega HCI para iniciar el proceso de fragmentación. Las muestras de ARN se analizaron luego en un bioanalizador 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.), utilizando el kit RNA 6000 Pico (Agilent Technologies). A continuación, se obtuvo ADNc bicatenaño, utilizando el kit ADNc Synthesis System (Roche), con los siguientes cuatro pasos: desnaturalización del ARN, síntesis de la segunda cadena de ADNc y purificación de las hebras de ADNc dobles. Los extremos irregulares de los fragmentos de ADNc generados por este proceso, se repararon y se incorporaron adaptadores en ambos extremos de las cadenas de ADNc. Finalmente, los fragmentos de ADNc se cuantificaron utilizando un fluorómetro TBS 380 QuantiFluor (Promega, EE. UU.). Se verificó el tamaño de los fragmentos de cADN en el bioanalizador (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) utilizando un chip de alta sensibilidad de ADN.

[014] El artículo “Bulked segregant analysis of the pirarucu (Arapaima gigas) genoma for identification of sex-specific molecular markers” de I.G. Almeida et al. (2013) en donde se indica que se analizaron pooles de DNA de machos y hembras de A. gigas con cebadores 566 RAPD (Análisis Segregante Masivo con ADN polimórfico al azar) generando 2609 fragmentos con un estimado de 1341 marcadores polimórficos segregantes y un promedio estimado de espacios de 714 kb que corresponde a menos del 0.1 % del genoma de la especie. Se identificaron dos fragmentos sexo-específicos putativos en todas las muestras y se sugiere que Arapaima gigas ha desarrollado un sistema no cromosomal de determinación de sexo o de manera alternativa, la especie ha experimentado una pérdida reciente del cromosoma que lleva el sitio de determinación del sexo.

[015] Finalmente, el artículo “Non-invasive sex genotyping of paiche Arapaima gigas by qPCR: An applied bioinformatic approach to identify sex differences” de López-Landavery et al. (2021 ) muestra el desarrollo de una herramienta molecular para sexado genotipico de paiche a Io largo de su ciclo de vida. Se recolectaron muestras de gónadas, aletas y mucus de branquias de especímenes juveniles de instalaciones locales para análisis histológico y molecular. Basado en la reciente secuencia del genoma de paiche disponible, y utilizando el método actual NGS, se implemento un enfoque novedoso, llamado “Diferencias del genoma por lecturas no asignadas”, para identificar marcadores sexuales de ADN. Se encontró una Región Específica del macho (MSR), identificado como MSR_3728, por estar presente solo en machos. A continuación, se diseñó dos conjuntos específicos de cebadores en esta región para identificar el sexo genotipico mediante ensayos de qPCR. Ambos conjuntos de cebadores, MSR_107 y MSR_129, detectaron machos con 100% de exactitud.

[016] En este sentido, es claro que existe la necesidad aún no satisfecha de proporcionar un kit y un método de determinación temprana del sexo del paiche (Arapaima gigas) que pueda ser aplicado en cualquier etapa del ciclo de vida de esta especie en donde el kit y el método sea un método molecular rápido, económico, sensible y eficiente mediante un muestreo no invasivo; en donde el kit y el método proporcione una notable mejoría respecto de los métodos actuales para la identificación del sexo en A. gigas y que ofrezca ventajas principalmente frente a métodos conocidos en relación con la rapidez y determinación del sexo del animal en cualquier etapa de su ciclo de vida.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[017] La presente invención se encuentra dirigida a un kit y un método no invasivo de terminación temprana del sexo en tiempo real para paiche (Arapaima gigas) que se basa en la la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) para la identificación no invasiva del sexo genético de ejemplares de cualquier edad de Arapaima gigas, a partir del ADN genómico extraído de muestras de mucus presente en sus branquias o de un pequeño segmento de su aleta caudal, mediante su interacción con dos pares de cebadores (oligonucleótidos) desarrollados en esta invención para tal fin y diseñados sobre una región del genoma específica de machos (MSR) y un juego de cebadores diseñados para amplificar el gen TATA-Box Binding Protein Like 1 (TBPL1_205) que actúa como control o housekeeping gene (HKG) de la técnica.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[018] La Figura 1 muestra las curvas de disociación obtenidas a partir de los amplicones generados por método molecular de acuerdo con la presente invención a través del ensayo de PCR en tiempo real para los picos generados con el marcador de la región específica del macho MSR_107 y el gen de referencia TBPL1 en paiche Arapaima gigas en donde se pone en contacto una muestra con los cebadores sexo-específico MSR_107 y el control endógeno TBPL1_205.

[019] La Figura 2 muestra las curvas de disociación obtenidas a partir de los amplicones generados por método molecular de acuerdo con la presente invención a través del ensayo de PCR en tiempo real para los picos generados con el marcador de la región específica del macho MSR_129 y el gen de referencia TBPL1 en paiche arapaima gigas, en donde se pone en contacto una muestra con los cebadores sexo-específico MSR_129 y control endógeno TBPL_205. La presencia de la curva de disociación para los cebadores MSR_107 y MSR_129 determina el sexo masculino del individuo analizado (primer pico de izquierda a derecha en la figura 2) y a su vez la ausencia de esta curva de disociación indica el sexo femenino de la muestra analizada.

[020] La Figura 3 muestra el gel de agarosa para los productos PCR de regiones específicas de macho. Se muestra que los machos (M) presentan dos bandas: una perteneciente a la región específica de macho MSR_107 y la otra banda perteneciente al TBPL1_205, mientras que la hembra (FM) sólo presenta la banda perteneciente al TBPL1_205.

[021] La Figura 4 muestra el gel de agarosa para los productos PCR de regiones específicas de macho. Se muestra que los machos (M) presentan dos bandas: una perteneciente a la región específica de macho MSR_129 y la otra banda perteneciente al TBPL1_205, mientras que la hembra sólo presenta la banda perteneciente al TBPL1_205.

[022] La Figura 5 muestra las regiones en A. gigas desde donde se colectó tejido para la extracción de ADN. A. extracción de AND genómico de gónadas, aleta caudal y moco para análisis de qPCR; B. fijación gonadal para análisis histológico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[023] En un primer aspecto, la presente invención hace referencia a un kit de sexado no invasivo mediante PCR en tiempo real para paiche (Arapaima gigas) como solución a los problemas antes mencionados, el cual se desarrolló en la presente invención, mediante la implementación de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) para la identificación no invasiva del sexo genético de ejemplares de cualquier edad de Arapaima gigas, a partir de ADN genómico extraído de muestras de mucus presente en sus branquias o de un segmento de su aleta caudal, mediante el empleo de dos pares de cebadores desarrollados en esta invención para tal fin y diseñados sobre una Región del Genoma Específica de Machos (MSR) y un juego de cebadores diseñados para amplificar el gen TATA-Box Binding Protein Like 1 (TBPL1 ) que actúan como control de la técnica (reference gene o housekeeping gene, HKG).

[024] El kit de sexado temprano no invasivo mediante PCR en tiempo real para paiche (Arapaima gigas) de la presente invención permite identificar machos de A. gigas mediante la detección de la MSR usando uno de los pares de cebadores MSR_107 directo (TGGAAATCAGGGTGAAACTGT) y MSR_107 reverso (GTCGTCCCTAAGCTGGTTATTATC) o MSR_129 directo

(GATAATAACCAGCTTAGGGACGAC) y MSR_129 reverso

(CGCTGTAATACACCTATACCATCC), observado como un pico a 76,6°C o 77,5°C respectivamente en la curva de disociación junto a un pico a 84,7°C correspondiente al HKG que comprende los cebadores del gen presente en machos y hembras TATA-Box Binding Protein like 1 (HKG): TBPL1 directo (CTCTGGCTTGTAGATGACATTGG) y TBPL1 reverso (TTTGTTGCGTGTCTCTGTGG). Las hembras se identifican por la ausencia de los picos a 76,6°C/77,5°C en la curva de disociación y la presencia del pico a 84,7°C del HKG.

[025] El kit de sexado temprano no invasivo mediante PCR en tiempo real del paiche (Arapaima gigas) comprende además hisopos estériles, solución amortiguadora de lisis, solución acuosa de NaOH para la extracción del ADN genómico y una mezcla maestra (Master Mix) que comprende los reactivos necesarios para el ensayo qPCR los cuales son solución amortiguadora (buffer), enzima, nucleótidos, los cebadores sexo específicos, un control positivo y un control negativo. El kit comprende uno de los pares de cebadores MSR_107 directo (TGGAAATCAGGGTGAAACTGT) y MSR_107 reverso (GTCGTCCCTAAGCTGGTTATTATC) o MSR.129 directo

(GATAATAACCAGCTTAGGGACGAC) y MSR.129 reverso

(CGCTGTAATACACCTATACCATCC).

[026] El kit puede incluir además otros materiales/componentes deseables entre los que incluyen lancetas, soluciones amortiguadoras, por ejemplo, Solución amortiguadora de muestra, diluyentes, filtros, capilares, agujas y/o jeringas, entre otros.

[027] En un segundo aspecto, la presente invención hace referencia a un método no invasivo de determinación temprana del sexo mediante POR en tiempo real para paiche (Arapaima gigas), el cual comprende las siguientes etapas: a) Proporcionar una muestra de mucus de branquias de Arapaima gigas o un segmento de la aleta caudal; b) Extraer ADN genómico e incubar en bloque térmico; c) Preparar y realizar qPCR agregando el ADN genómico extraído en la etapa b) a una solución A y agregar una premezcla de uno de los pares de cebadores MSR107 o MSR 129 y cebadores del HKG y hacer la reacción; y d) Analizar las curvas de disociación.

[028] En la etapa a) la muestra se realiza mediante la colección de una muestra de mucus mediante un hisopo de las branquias de un ejemplar de A. gigas, luego, el cual se sumerge en 1 ml de solución amortiguadora de lisis. En estadios de alevinos, juveniles o cuando no fuera posible colectar mucus, se corta un segmento de entre 2 mm a 4 mm de sección máxima de la aleta caudal y se lo sumerge en 1 mi de etanol 96 %.

[029] En la etapa b) la extracción del ADN genómico se realiza mediante la adición a la muestra en solución amortiguadora de lisis de 180pl de NaOH 50 mM, y 0.2 mM EDTA, se incuba en bloque térmico por 5 minutos a 95°C, al que luego se le agrega 180pl de Tris-HCI 300 mM pH 8.0. [030] En la etapa c) la preparación y realización de PCR en tiempo real (qPCR) se realiza mediante la adición de 2pl de ADN genómico extraído en la etapa b) a una solución A (1 Opl), la cual comprende la enzima Taq-polimerasa, el fluoróforo intercalante SYBR Green de fórmula química C32H37N4S, dNTPs (desoxirhbonucleótidos trifostato), solución amortiguadora y Mg ²⁺ . Inmediatamente, se agregan 1.5pl (0.1 uM) de una premezcla de uno de los pares de cebadores MSR107 o MSR 129 y 1.5pl (0.05 uM) de los cebadores del HKG. Los tubos de reacción son puestos en el equipo termociclador, el cual debe contar con los filtros específicos para detectar la emisión del fluoróforo utilizado. Se procede a comenzar la reacción con 5 minutos a 95°C. Seguidamente, se realizan 35 ciclos de amplificación, cada ciclo consiste en 15 segundos a 95°C y 60 segundos a 62°C. Posteriormente, se realiza la curva de disociación incrementando la temperatura de reacción de 60°C a 95° con pasos crecientes de 2.2°C/s.

[031] En la etapa d), el análisis se realiza mediante la evaluación de la presencia de los picos correspondientes a las temperaturas de disociación (melting) (Tm) de los productos de amplificación generados por los pares de cebadores MSR107/MSR129 según corresponda, y al par de cebadores control HKG. La presencia de dos picos a las Tm correspondientes indica que el ejemplar es macho (Figura 1 ). La presencia de un solo pico, correspondiente al HKG, indica un ejemplar hembra (Figura 2). En caso de no haber un pico correspondiente al HKG, la identificación es indeterminada y la reacción debe repetirse.

[032] En este sentido, el método no invasivo de determinación temprana del sexo mediante PCR en tiempo real para paiche (Arapaima gigas) de cualquier edad es implementado por la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real sobre ADN genómico extraído de muestras de mucus presente en las branquias del animal o de un segmento de su aleta caudal o de cualquier otro tejido del animal, mediante la etapa de poner en contacto dicha muestra con un par de cebadores sexo específicos que híbrida y amplifica una región genómica específica de machos (MSR) y un par de cebadores que híbrida y amplifica una región presente en machos y hembras (HKG) y de esta forma con ambos pares de cebadores presentes en el tubo de reacción y luego de concluida la reacción se identifica como macho si se detectan el producto de amplificación de la MSR y el HKG o hembras si solo se verifica la presencia del HKG.

[033] Por lo anterior, el método no invasivo de determinación temprana del sexo mediante POR en tiempo real para paiche (Arapaima gigas) de acuerdo con la presente invención comprende en la etapa c) las secuencias de los pares de cebadores sexo específicos MSR_107 directo:

(TGGAAATCAGGGTGAAACTGT) y MSR_107 reverso:

(GTCGTCCCTAAGCTGGTTATTATC) y MSR129 directo

(GATAATAACCAGCTTAGGGACGAC) y MSR129 reverso

(CGCTGTAATACACCTATACCATCC), en donde el producto de amplificación para el par de cebadores MSR_107 tiene una temperatura de disociación de 76.6°C y el producto de amplificación para el par de cebadores MSR_129 es de 77.5°C.

[034] El método no invasivo de determinación temprana del sexo mediante PCR en tiempo real para paiche (Arapaima gigas) de acuerdo con la presente invención comprende en la etapa c) la secuencia de pares de cebadores para amplificar el gen presente en machos y hembras TATA-Box Binding Protein like 1 (HKG): TBPL1 directo (CTCTGGCTTGTAGATGACATTGG) y TBPL1 reverso (TTTGTTGCGTGTCTCTGTGG), el cual tiene una temperatura de disociación (Tm) de 84.7°C.

[035] Adicionalmente, mediante el método de acuerdo con la presente invención los productos de amplificación de los cebadores anteriormente indicados, pueden ser además diferenciados mediante electroforesis en gel de agarosa, gel de poliachlamida o una mezcla de ambos.

[036] El método de acuerdo con la presente invención en la etapa c) tiene un perfil de temperaturas de la qPCR característico el cual comprende 5 minutos iniciales a 95°C, seguidos de 35 ciclos de 15 segundos a 95°C y 60 segundos a 62°C, seguidos del perfil de la curva de disociación que comprende el aumento escalonado de temperaturas de 2.2°C desde 60°C a 95°C. [037] En un tercer aspecto, la presente invención hace referencia al uso del kit de sexado no invasivo mediante PCR en tiempo real para paiche (Arapaima gigas) a través de la identificación de machos de A. gigas mediante la detección de la MSR usando uno de los pares de cebadores MSR_107 directo

(TGGAAATCAGGGTGAAACTGT) y MSR_107 reverso

(GTCGTCCCTAAGCTGGTTATTATC) o MSR_129 directo

(GATAATAACCAGCTTAGGGACGAC) y MSR_129 reverso

(CGCTGTAATACACCTATACCATCC).

EJEMPLOS DE LA MEJOR MANERA DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

Ejemplo 1

[038] Según lo mencionado anteriormente, la presente invención comprende un método molecular no invasivo para la determinación del sexo del paiche Arapaima gigas y un kit con los reactivos necesarios para el ensayo PCR (Buffers, nucleótidos, enzima, cebadores sexo específico).

[039] Se utilizaron hisopos estériles para la obtención de mucus de las branquias de 35 individuos juveniles de A. gigas de una piscigranja local. Los hisopos que contuvieron el mucus fueron preservados en microtubos de 2ml conteniendo 1 ml de solución amortiguadora de lisis hasta su análisis molecular, transportados al laboratorio en un enfriador (cooler) a 4°C. El ADN genómico fue extraído agregando al microtubo 180pl de NaOH 50 mM, agitados en un vértex y colocados en una placa térmica para microtubos por 5 minutos a 95°C. Luego se procedió a retirar el hisopo y se realizó una breve centrifugación. La integridad del ADN genómico extraído fue evaluada por electroforesis en gel de agarosa al 1 % (migración 100V por una hora). La pureza y concentración fueron obtenidas usando un espectrofotómetro Epoch Microplate y un fluorómetro Qubit.

[040] Los cebadores sexo-específico que participan en el kit y en el método de acuerdo con la presente invención fueron sintetizados por encargo a la compañía Integrated DNA Technologies (IDT, USA). Para la preparación de la mezcla de qPCR se utilizó el kit LightCycler 480 SYBR-Green I Master (Roche). El volumen final de las reacciones fue de 20pl y cada reacción consta de: 1 Opl de la mezcla maestra (master mix) LightCycler 480 SYBR-Green I Master (2X), 0.1 pM de los cebadores sexo específico MSR107, 0.05 pM de los cebadores control endógenos TBPL1 y 30ng de ADN genómico total, la diferencia en volumen se completó utilizando agua para PCR. Para la amplificación por qPCR se utilizó un termociclador en tiempo real LightCycler 480 II (Roche) con un paso de denaturación inicial a 95°C por 5 minutos y 35 ciclos de amplificación que consisten de una denaturación a 95°C por 15 segundos seguido de hibridación/extensión a 62°C por 60 segundos. Una vez terminada la amplificación por qPCR, se realizó la creación de las curvas de disociación en el mismo equipo LightCycler 480 II, que consiste en elevar la temperatura gradualmente desde 60°C hasta 95°C con una rampa de temperatura de 2.2°C/s.

[041] Se observó que usando los oligonucleótidos sintéticos MSR_107 (cebadores sexo específico) y TBPL1 (cebador control endógeno) todos los individuos machos (22 individuos) produjeron un amplicón sexo-específico de 107 pb (curva de disociación con un valor de 76.6°C) y un segundo amplicón con un tamaño de 205 pb (curva de disociación con un valor de 84.7°C). Por otro lado, todos los individuos hembras (13 individuos) solamente amplificaron el amplicón producido por el cebador para el control endógeno (HKG) de 205 pb (TBPL1_205).

[042] De este modo, la utilización simultánea de ambos juegos de cebadores (sexo específico y control endógeno) en una sola reacción asegura una identificación precisa del sexo en el paiche A. gigas con una tasa de identificación del 100%.

[043] La realización de esta técnica supone una notable mejoría respecto de los métodos actuales para la identificación del sexo en A. gigas dado que el kit y el método de la presente invención es no invasivo, es un método rápido y finalmente, porque puede ser utilizado para identificar el sexo genético en ejemplares de A. gigas de cualquier edad.