Seit Einführung der Synthese von Biopolymeren an festen Oberflächen durch Merryfield im Jahr 1965 ist eine Vielzahl an Publikationen über diese Technik erschienen. Eine neuere Entwicklung auf diesem Gebiet ist die Herstellung von so genannten Biopolymer-Arrays, bei denen eine Vielzahl unterschiedlicher Biopolymere wie etwa Nukleinsäuren oder Peptide in definierten Flächenbereichen auf einem Träger immobilisiert sind.

Bei der Synthese von Biopolymeren an einer Festphase wird im Allgemeinen ein Abstandhalter, ein so genannter Spacer zwischen dem Träger und dem eigentlichen Biopolymer verwendet. Die Verwendung eines Spacers hat den Vorteil, dass das Biopolymer weiter von der Oberfläche des festen Trägers entfernt ist, so dass dessen Einflüsse zurückgedrängt werden, so dass das immobilisierte Biopolymer quasi homogene Reaktionen eingehen kann. Die Natur des Spacers, sein Länge, Polarität und seine anderen physikochemischen Eigenschaften, haben demzufolge einen entscheidenden Einfluss auf die Kopplungsausbeute bei der Polymersysthese auf dem Träger, damit auf die Qualität des Polymers und auf dessen spätere Anwendung.

Für den Spaceraufbau werden im Allgemeinen Strategien verwendet, die auf der Polykondensation von im weitesten Sinne Aminosäuremonomeren oder Cyanoethyl-oder anderweitig geschützten Phosphoramiditen bzw. H- Phosphonaten beruhen. Dabei werden üblicherweise Verbindungen mit der folgenden allgemeinen Struktur verwendet :

worin R'eine geschützte Linkergruppe darstellt, R den Vorgänger- Synthesebaustein oder die funktionelle Gruppe einer festen Phase darstellt und Q H oder eine organische Schutzgruppe wie Cyanoethoxy oder Methoxy darstellt, die bei der Verankerung auf der Oberfläche keine Rolle spielt.

Ein wesentlicher Nachteil der bisher bekannten Spacermoleküle sind die negativen Ladungen, die im Rahmen der Abspaltung der Schutzgruppen an den Phosphatgruppen auftreten. Diese zusätzlichen potentiellen Kopplungszentren verhindern ein mögliches Recycling durch geeignete chemische oder enzymatische Vorgehensweisen der Spacer.

Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe bestand somit darin, neue Spacerbausteine für die Synthese von Polymeren auf festen Trägern bereitzustellen. Gelöst wird diese Aufgabe durch eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) (I)

worin R1 und R2 jewiels unabhängig einen C1-C10-Kohlenwasserstoffrest, z. B. einen C1-C6-Alkylrest der C3-C4-Cycloafkyirest, darstellen oder miteinander verbunden sind, z. B. um einen 5-oder 6-gliedrigen Ring zu ergeben und R3 und R4 jeweils unabhängig eine geschützte Linkergruppe der allgemeinen Formel (II) sind : -L-(X)n worin L einen Linker, X eine Schutzgruppe und n eine ganze Zahl von 1-3 darstellt.

In den Verbindungen (I) sind R'und R'vorzugsweise jeweils Methyl-, Ethyl -oder i-Propylreste oder sie bilden zusammen einen Morpholinrest. Es können jedoch selbstverständlich auch andere Alkyl-oder Cycloalkylreste verwendet werden.

Die Linkergruppe (II) enthält im Aligemeinen lineare oder verzweigte aliphatische, olefinische oder/und aromatische Kohlenwasserstoffgruppen, die ggf. durch Heteroatome substituiert sind. Sie enthält vorzugsweise eine Alkylenkette, in der ggf. ein oder mehrere CH2-Gruppen durch Heteroatome wie 0, S oder NH ersetzt sein können. Die Kettenlänge des Linkers beträgt vorzugsweise 1-100 Atome, vorzugsweise 10-45 Atome und besonders bevorzugt 10-25 Atome. Die Kette kann weiterhin eine oder mehrere Verzweigungen enthalten, wobei eine Linkergruppe vorzugsweise bis zu

drei Verzweigungen enthalten kann. Die Verzweigungen können in die Linkergruppe beispielsweise durch w-Bis-oder Trishydroxyverbindungen wie etwa Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan eingeführt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Linkergruppe (II) eine Struktur, ausgewählt aus (a) (CH2) n-X, worin n = 1-12, vorzugsweise 3- 6, oder (b) [(CH2) rO] s-X worin r = 1-4, vorzugsweise 2-3 und s = 1-100, vorzugsweise 3-9 beträgt.

Am Ende bzw. an den Enden der Linkergruppe befinden sich eine oder mehrere Schutzgruppen X, die aus für die Festphasensynthese von Nukleinsäuren bzw. Peptiden bekannten Schutzgruppen ausgewähft werden können. Vorzugsweise ist X eine Schutzgruppe, die durch chemische oder enzymatische Reaktionen vom Linker abgespalten werden kann, wobei durch die Abspaltung eine reaktive Gruppe z. B. eine Hydroxyl-oder Aminogruppe freigesetzt wird. Beispiele für geeignete Schutzgruppen sind säurelabile Schutzgruppen wie etwa Dimethoxytrityl (DMT), MMT, Pixyl, Fpmp, basenlabile Schutzgruppen, wie etwa Benzyl, Benzoyl, Isobutyryl, Phenoxyacetyl, Laevulinyl etc., oxidations-oder/und reduktionslabile Schutzgruppen, photolabile Schutzgruppen, wie etwa NVOC, NPPOC, katalytisch, z. B. durch Pd abspaltbare Schutzgruppen, wie etwa Allyl, AOC und durch Fluorid abspaltbare Schutzgruppen, wie etwa TMS und Derivate davon, z. B. TBDMS.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind hervorragend als Spacer oder Spacerbausteine zur Synthese von Polymeren auf festen Trägern geeignet.

Für die Synthese eines Polymermoleküls können ein oder mehrere Moleküle der Verbindungen (1) eingesetzt werden. Dabei werden die Verbindungen ( !) üblicherweise zuerst zum Aufbau des Spacers an den Träger gekoppelt und anschließend unter Verwendung geeigneter Synthesebausteine das Polymer auf dem Spacer synthetisiert. Als feste Phasen kommen anorganische oder organische Träger in Betracht, z. B. funktionalisiertes Controlled-Pore-Glas (CPG), andere Gläser wie Foturan, Pyrex oder gewöhnliche Kalk-Natron-

Gläser, metallische Träger wie etwa Silizium, oder organische Harze wie etwa Tentagel. Besonders bevorzugt ist der Träger ein Chip, der zur Synthese von Polymer-Arrays eingesetzt wird.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Träger zur Festphasensynthese der aligemeinen Formel (la) (la) worin T ein fester Träger wie zuvor angegeben ist und R3 und R4 wie zuvor definiert sind. Der Träger (la) wird durch Kopplung einer Verbindung (I) an eine reaktive Gruppe des Trägers, z. B. eine Hydroxygruppe, unter Abspaltung der-NR1NR2 Gruppe hergestelit. Ggf. kann eine Oxidation des Trägers (la) z. B. mit molekularem 12 erfolgen, wobei das P-Atom von der Oxidationsstufe ill in die Oxidationsstufe V überführt wird.

An den Linkern R3 und R4 kann mindestens eine der Schutzgruppen X abgespalten werden. Auf die nach Abspaltung der Schutzgruppen X freigesetzten reaktiven Gruppen können ein oder mehrere Polymere synthetisiert werden, wobei diese Polymere aus z. B. Nukleinsäuren wie DNA oder RNA, Nukleinsäurenanaloga wie etwa PNA oder LNA, Peptiden und Sacchariden ausgewählt sein können.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen (I) zeichnen sich dadurch aus, dass sie keine P (V)-Schutzgruppe benötigen und nach Deblockierung und ggf. Oxidation zum Phosphat keine negative Ladung tragen. Auf diese Weise

können die erfindungsgemäßen Verbindungen im Zusammenspiel mit anderen. Synthesebausteinen, z. B. trifunktionellen Zucker-oder Nukleotideinheiten, die mit orthogonalen Schutzgruppen versehen sind, zum Aufbau von Polymeren und zum zerstörungsfreien Recycling der Oberflächen eingesetzt werden, ohne dass bei nachfolgenden Synthesen störende Ladungen auftreten.

Dabei wird zunächst die erfindungsgemäße Verbindung (I) an eine reaktive Gruppe, z. B. eine Hydroxygruppe des festen Trägers gekoppelt.

Anschließend wird die Schutzgruppe X gespalten, wobei die Schutzgruppe X zu einer Schutzgruppe Y auf dem Polymersynthesebaustein orthogonal ist. Nach Beendigung der Polymersynthese und ggf. Deblockierung der resultierenden Polymeren wird die zu den bisher verwendeten Synthesebedingungen orthogonale Schutzgruppe Y abgespalten. Ein Beispiel für einen derartigen Synthesebaustein mit der aligemeinen Formel (ici) ist wie folgt : worin X und Y zueinander orthogonale Schutzgruppen sind, wobei X z. B. eine säure-oder/und photolabile Schutzgruppe ist und Y eine durch Katalyse abspaltbare Schutzgruppe ist und R eine Nukleobase oder einen Fluorophor, einen Chromophor oder eine andere Markierungsgruppe darstellt. Nach Abspaltung von Y im basischen Milieu wird dann das 3'- Phosphat von der 2'-Hydroxygruppe unter Ausbildung eines zyklischen Phosphats angegriffen, was einer Hydrolyse gleichkommt und zur Wiederherstellung der ursprünglichen Hydroxygruppe führt.

Bei Verwendung eines RNA-Teilabschnitts als Sonden-"Sockel"kann eine chemische Regeneration des Reaktionsträgers erfolgen. Dabei wird zunächst die Synthese unter Verwendung von 2'-OH-geschützten Phosphitamidbausteinen durchgeführt. Nach Hybridisierung wird die Schutzgruppe des RNA-Teilabschnitts abgespalten, woraus eine freie 2'- OH-Gruppe resultiert. Daraufhin kann in einem folgenden chemischen Reaktionsschritt mit Hilfe von Perjodat oder anderen Oxidationsmitteln der Ribosezucker gespalten und die Sonde durch ß-Eliminierung vom Reaktionsträger entfernt werden.

Die erfindungsgemäße Verbindung la fässt sich auch durch geeignete biochemische Ansätze ohne das Einkoppeln eines speziellen Moleküls zum zerstörungsfreien Recycling der Oberflächen einsetzen. Hierbei werden die mit dem Reaktionsträger verknüpften Polymer-bzw. Oligomersonden mit einem DNA-bzw. RNA-abbauenden Enzym oder einem Peptid-spaltenden Enzym gespalten, wodurch es zu einem teilweisen oder vollständigen Abbau der Sonden kommt. Im Anschlug kann der Reaktionsträger erneut zur Synthese neuer Sonden verwendet werden.

Als Enzyme kommen Nucleasen wie Exonucleasen oder Endonucleasen in Frage, die einen Nucleinsäurestrang von den Enden bzw. innerhalb des Sondenstrangs angreifen und Nucleotide bzw. Nucleoside als Spaltprodukte hinterlassen. Im Falle von RNA ist die Verwendung von RNAsen (wie RNAse H usw.) möglich, die bei Ausbildung eines RNA-DNA-Doppelstrangs selektiv den RNA-Teil zerschneiden, wodurch bei RNA-Sonden die gesamte Sonde und bei RNA-Teilabschnitten als Sollbruchstelle der RNA-Abschnitt gespalten wird. Die Regeneration eines Reaktionsträgers mit DNA-Sonden kann ebenfalls durch Einsatz von DNAsen (DNAse I, DNAse II, etc.) erreicht werden, wodurch sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige DNA abgebaut werden kann.

Ebenfalls können Peptid-spaltende Enzyme für den Abbau von Peptidsonden bzw. Peptid-Sequenzabschnitten als Sollbruchstelle eingesetzt werden.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, dass auf Grund der Verzweigung eine Signalamplifikation erfolgt, da die Dotierungsdichte der funktionellen Gruppen auf der Oberflache erhöht wird.

Weiterhin zeichnen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen dadurch aus, dass sie eine kostengünstigere Polymersynthese ermöglichen und sich ohne weiteres in die DNA-Festphasensynthese integrieren lassen bei gleichzeitiger Verringerung der benötigten Amiditports gegenüber der Verwendung kommerziell erhältlicher Amidite.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt durch Umsetzung der monogeschützten Spacergrundmoleküle mit Phosphortrichlorid zum bisubstituierten Monochlorderivat. Anschließend wird dann das sekundäre Amin in das Molekül eingeführt.

Weiterhin soll die Erfindung durch das nachfolgende Beispiel erläutert werden.

Beispiel 1 : Herstellung von Bis (9-0-dimethoxytrityltriethylenglykol)-[N, N-diisopropyl]- phosphoramidit 1,37 g (10 mmol) Pic13 und 5 Äquivalente N-Ethyldiisopropylamin oder Pyridin werden unter Schutzgas in absolutem Ether aufgenommen. Zu dieser gekühlten Lösung wird monotrityliertes Triethylenglykol, gelöst in Ether und N-Ethyldiisopropylamin, langsam zugetropft. Nach zweistündigem Rühren bei Raumtemperatur werden 3 Äquivalente Diisopropylamin, gelost in Ether, langsam zu dem Reaktionsansatz getropft.

Anschließend lassai man den Ansatz weitere 12 h bei Raumtemperatur

rühren. Nach dem Einengen wird der Ansatz in Methylenchlorid aufgenommen und mehrfach mit den üblichen Lösungen extrahiert, bevor die Substanz dann durch Chromatographie an Kieselgel isoliert wird.

Das Syntheseschema ist in Abb. 1A dargestellt.

Beispiel 2 : Alternativ von der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise kann PCI3 auch mit heterocyclischen Stickstoffbasen, wie Pyrrol, Triazol oder Imidazol, umgesetzt und dann erst mit monotrityliertem Triethylenglykol gegebenenfalls in Gegenwart eines Aktivators, wie etwa Tetrazol, umgesetzt werden.

Die entsprechenden Syntheseschemata sind in Abb. 1 B und 1 C dargestellt.