Die Erfindung betrifft neue Benzaldehyd-Derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Behandlung einer Krankheit, welche durch eine HIV-Infektion hervorgerufen wird.

Die Erkrankungen des menschlichen Körpers, die durch den Human Immunodeficiency Virus (HIV) hervorgerufen, werden, sind lebensbedrohend und gehen mit einer Vielzahl von Sekundär-Erkrankungen einher. Die Stärke der Erkrankung ist direkt mit dem Virus-Titer, also der Zahl der im Körper vorhandenen Viren, verbunden. Eine Reduzierung des Virus-Titers stellt eine Möglichkeit dar, den Ausbruch der Krankheit zu verhindern oder den Verlauf der Erkrankung positiv zu beeinflussen. Essentiell für die Vermehrung des Virus ist das Enzym Reverse Transkriptase. Mit Inhibitoren dieses Enzyms konnte gezeigt werden, daß die Virus-Vermehrung deutlich verlangsamt (z.B. Azidothymidin)

Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Anmeldung, Inhibitoren der HIV Reversen Transkriptase und damit zur Behandlung von Erkrankungen, welche durch HIV-Infektionen hervorgerufen werden, bereitzustellen.

Von verschiedensten synthetischen und natürlichen Stoffen ist bekannt, daß sie die HIV Reverse Transkriptase inhibieren (vgl z. B. die Übersicht von G.T.Tan et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 185, 370-378) und damit eine Grundvorraussetzung für die Behandlung von HIV-Infektionen erfüllen. Darüberhinaus ist bekannt, daß Basisiomyceten Sekundärmetabolite mit biologischer Wirkung wie z. B. die Strobilurine (vgl. z. B. S. Zapf et al. Angew. Chemie (1995), 107, 255) bilden. Speziell der Fruchtkörper des Basisiomyceten Hericeum erinaceus bildet als Sekundärmetabolite die Hericenone und das

BESTATIGUNGSKOPIE

Hericerin, deren Wirkungen mit cytotoxisch bzw. das Auswachsen von Neuriten aus Nervenzellend stimulieren beschrieben wird (vgl H. Kawagishi et al, Tetrahedr. Lett. (1990), 31 , 373).

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß auch aus dem Mγcel des Basisiomyceten Hericeum erinaceus Sekundärmetabolite isoliert werden können, die die HIV Reverse Transkriptase inhibieren und sich deshalb zur Behandlung von HIV Infektionen eignen. Die Verbindungen und deren physiologisch verträglichen Salze sind bislang unbekannt und sind durch folgende Struktur (Formel I) gekennzeichnet

worin R ¹ bis R ¹⁰ Wasserstoff oder Methyl bedeuten, wobei zwei sich an benachbarten Kohlenstoffatomen befindende R ¹ bis R ¹⁰ zusammen mit einer C- C-Einfachbindung für eine C-C-Doppelbindung stehen können, mit der Maßgabe, daß in der mit R ¹ bis R ¹⁰ substituierten Kohlenstoffkette jeweils nur einer der Substituenten R ¹ bis R ¹⁰ Methyl bedeutet und jeweils nur ein benachbartes Paar dieser Substituenten zu einer C-C-Doppelbindung beiträgt.

Vorzugsweise bedeutet R ⁵ in Formel I Methyl.

Besonders bevorzugt bedeuten R ³ und R ⁶ (beispielsweise Formel 1 ) oder R ⁶ und R ⁷ (beispielsweise Formel 2) zusammen mit der zwischen den von ihnen

substituierten Kohlenstoffatomen liegenden C-C-Einfachbindung eine C-C- Doppelbindung.

Vorzugsweise liegt die Doppelbindung dieser Verbindungen in Z-Konfiguration vor.

Formel 1 Hericenal A Formel 2 Hericenal B

Die neue Verbindung der Formel I, insbesondere die Verbindungenl und 2, und deren physiologisch verträglichen Salze zeichnen sich durch ihre Wirkung gegen die HIV Reverse Transkriptase aus, die derjenigen von anderen Metaboliten aus Basisiomyceten deutlich überlegen ist.

Untersuchung der Substanzen auf Hemmung der HIV-"Reverse Transkriptase"

Die Aktivität der Reversen Transkriptase (RT) wurde mit Hilfe eines "Scintillation Proximity Assay" (SPA) bestimmt. Das Reagenzkit für den RT-SPA wurde von Amersham/Buchler (Braunschweig) bezogen. Das Enzym RT (aus HIV in E. coli cloniert) stammte von der Firma HT-Biotechnology LTD, Cambridge, UK.

Ansatz:

Der Test wurde nach dem Methoden-Manual des Herstellers Amersham durchgeführt - mit folgenden Modifikationen:

Dem "Assay"-Puffer wurde Rinderserumalbumin zu der Endkonzentration 0,5 mg/ml zugesetzt.

Der Test wurde in Eppendorf-Reaktionsgefäßen mit 100 I Ansatzvolumen durchgeführt.

Das RT-Konzentrat des Herstellers (5000 U/ml) wurde in Tris-HCl Puffer 20 mM; pH 7,2; 30 % Glycerin auf eine Aktivität von 15 U/ml verdünnt. Die Inkubationszeit für die Ansätze betrug 60 min (37 C). Nach Abstoppen der Reaktion und "Entwicklung" mit der Perlen-Suspension wurden 130 ml Ansatz in 4,5 ml Tris-HCl Puffer, 10 mM; pH 7,4; 0, 1 5 M NaCl transferiert und die Tritium-Aktivität in einem ß-Counter gemessen.

Substanzprüfung:

Für eine Vorprüfung der Inhibitoraktivität wurden die Substanzen in Wasser gelöst {Stammlösung c == 1 mg/ml) und in verschiedenen Verdünnungen (10 ^" , 10 ^~2 , 10 ^" 3 usw.) getestet.

Zur Bestimmung von ICso-Werten wurden die Inhibitor-Stammlösungen in Wasser weiterverdünnt und in geeigneten Konzentrationen getestet. Aus der graphischen Darstellung RT-Aktivität gegen den Logarithmus der Konzentration der jeweiligen Testsubstanz wurde die einer 50 %igen Enzymhemmung zugehörige Konzentration ermittelt.

Substanz IC ₅₀ UvM]

(HIV-RT)

Hyphodontal 77

Mniopetal B 91

Mniopetal D 54

Hericenal A 0,37

Weiterhin gehören zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen. Ein Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Hericeum erinaceus , vorzugsweise Hericeum erinaceus DSM 10600, in einem wäßrigen Medium kultiviert wird und die Zielverbindungen anschließend isoliert und gereinigt werden.

Der Mikroorganismus Hericeum erinaceus DSM 10600 ist am 20. März 1996 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Marscheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, nach den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt worden.

Anstelle des Stammes DSM 10600 können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie Verbindungen der Formel I synthetisieren können. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise surch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), 2-Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (MOB) oder N- Methγl-N ^' -nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) erzeugt werden.

Die im folgenden beschriebenden Fermentationsbedingungen gelten für Hericeum erinaceus und das hinterlegte Isolat. Die Fermentation kann im Labormaßstab (Milliliter- und Litermaßstab) oder im industriellen Maßstab (Kubikmetermaßstab) erfolgen.

In einer Nährlösung, die eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze enthält, produziert Henricium erinaceus, insbesondere H. erinaceus DSM 10600, die Verbindung der Formel I.

Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose oder D- Mnanit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie z. B. Malzextrakt. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phasphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.

Die Bildung der Verbindung der Formel I mit H. erinaceus, bevorzugt DSM 10600, verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die 0,1 bis 2 %, bevorzugt 0,5 - 1 %, Cornstep, 0,5 bis 10 % bevorzugt 1 bis 5 % Tomatenpaste, 0, 1 bis 5 % bevorzugt 0,5 bis 3 % Hafermehl 0,1 bis 5 % bevorzugt 0,5 bis 3 % Glucose sowie Spurenelemente (% Angaben jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung) enthält. Die Spurenelementlösung kann folgende Zusammensetzung aufweisen:

FeSO ₄ x 7 H ₂ O 0,01 - 1 % bevorzugt 0,05 - 0,2 %

MuSO ₄ x 1 H ₂ O 0,01 - 1 % bevorzugt 0,05 - 0,2 %

CuCI ₂ x 2 H ₂ O 0,0005 - 0,01 % bevorzugt 0,001 - 0,005 %

CaCI ₂ x 2 H ₂ O 0,001 - 0,1 % bevorzugt 0,005 - 0,05 %

H ₃ BO ₃ 0,005 - 0,01 % bevorzugt 0,002 - 0,0075 %

(NH ₄ )6 Mo ₇ O ₂₄ x 4 H ₂ O 0,0005 - 0,01 % bevorzugt 0,001 - 0,005 %

ZnSO ₄ x 7 H ₂ 0 0,001 - 0,1 % bevorzugt 0,001 - 0,05 %

Die Kultivierung erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren oder in Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Wasserstoff. Sie wird in einem Temperaturbereich von 15 bis 30 ° C, vorzugsweise von 20 bis 30 ° C, insbesondere von 23 bis 28 ° C, durchgeführt werden. Der pH-Wert liegt von pH 1 bis 7, vorteilhaft von pH 2,5 bis 4,5. Man kultiviert den Pilz unter diesen Bedingungen über einen Zeitraum von 100 bis 300 Stunden, bevorzugt 120 bis 168 Stunden.

Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 :10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man z. B., indem man Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 100 bis 200 Stunden, bevorzugt 120 bis 168 Stunden, wachsen läßt. Das Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm 7 bis 40 Tage, bevorzugt 10 bis 20 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz- Agar oder Kartoffel-Dextrose-Agar, wachsen läßt.

Der Fermentationsverlauf kann jeweils anhand des pH-Wertes der Kultur oder des Mycelvolumens sowie durch chromatographische Methoden, wie z. B. Dünnschichtchromatographie oder High Pressure Liquid Chromatography, überwacht werden. Die Verbindung der Formel I ist überwiegend im Kulturfiltrat enthalten.

Die Isolierung der Verbindung der Formal I aus dem jeweiligen Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Es können z. B. das Adsorptions-, lonenaustausch- oder Gelfiltrationsverfahren angewendet werden.

Ethylacetat/Methanol/Wasser-Mischungen werden als Laufmittel in dem Fachmann bekannten Konzentrationen, angewandt. Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann beispielswiese auch UV- Löschung und Färbereagentien wie Anisaldehyd, Tetraozolblau oder Orcin gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffe in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.

In den sich anschließenden Beispielen wird die Erfindung weiter erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht wurden.

Die Hericenale können sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat vorkommen, gewöhnlich befindet sich die Hauptmenge im Kulturfiltrat. Es ist deshalb zweckmäßig, die Zellmasse durch Filtration oder Zentrifügation vom Filtrat zu trennen. Das Filtrat wird lyophilisiert und das Lyophilisat mit einem Lösungmittel wie Methanol oder Acetonitrii oder 1 -Butanol extrahiert. In gleicher Weise können Hericenale aus dem Mycel extrahiert werden. Die Extraktionen können über einen weiten pH-Bereich durchgeführt werden, zweckmäßig ist ein Bereich von pH 3.0 - pH 7.5.

Eine andere Methode der Isolierung ist die Lösungs- Verteilung in an sich bekannter Weise.

Eine weitere Methode der Reinigung ist die Chromatographie an Adsorptionsharzen wie z.B. an Diaion* HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokyo) an Amberlite ^® XAD 7 (Rohm und Haas, USA) an Amberchrom ^® CG (Toso Haas, Philadelphia, USA) oder an ähnlichen Trägern. Geeignet sind darüberhinaus zahlreiche reversed-phase Träger, z.B. RP-18, wie sie in der Hopchdruckflüssigkeits-Chromatographie allgemein verwendet werden. Eine weitere Reinigungsmöglichkeit für die Hericenale besteht in der Verwendung sogenannter straight-Phase Träger wie z. B. Kieselgel oder Aluminiumoxid, oder anderen in an sich bekannter Weise. Geeignet zur Elution sind viele Lösungsmittel wie z.B. Chloroform/Methanol- oder Dichlormethan/n-Butanol- Gemische.

Ein alternatives Verfahren zur Isolierung der Texenomycine ist die Verwendung sog. Molekularsiebe, wie z.B. Fractogel ^® TSK HW-40, Sephadex ^® LH-20 und andere in an sich bekannter Weise. Es ist darüberhinaus auch möglich, die Texenomycine aus angereichertem Material durch Kristallisation zu gewinnen. Geeignet hierzu sind z.B. organische Lösungsmittel und ihre Gemische, wasserfrei oder mit Wasserzusatz. Ebenso können Zusätze von Säuren, wie z.B. Trifluoressigsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Ameisensäure oder andere von Vorteil sein.

Die Verbindungen der Formel I und deren physiologisch verträglichen Salze sind ferner als Therapeutikum gegen Krankheiten geeignet, welche durch eine HIV- Infektion hervorgerufen werden. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung betrifft ferner auch die Verbindung der Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz derselben zur Verwendung als Arzneimittel, vorzugsweise zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit welche durch eine HIV-Infektion hervorgerufen wird.

Die Arzneimittel können eine oder mehrere Verbindungen der Formel I oder deren physiologisch verträglichen Salze sowie pharmazeutische Hilfsstoffe enthalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Hericeum erinaceus DSM 10600 sowie dessen Mutanten und Varianten.

Beispiele

1. a) Herstellung von Mycel des Produzentenstammes H. erinaceus DSM 10600

100 ml Nährlösung (20 g Malzextrakt, 2 g Hefeextrakt, 10 g Glucose, 0,5 g (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ in 1 I Leitungswasser, pH-Wert vor der Sterilisation 6,0) in einem 500 ml sterilen Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm DSM 7427 beimpft und 240 Stunden bei 25 °C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. Anschließend werden 20 ml Kulturflüssigkeit in einem sterilen 500 ml Erlenmeyerkolben mit dem Nährboden [Kartoffelinfus 4,0 g/1 (Infus aus 200 g Kartoffel in 1000 ml H ₂ O), 20,0 g D-Glucose, pH vor der Sterilisation 5,6] dem zusätzlich 15 g Agar/I zur Verfestigung zugegeben wurde, gleichmäßig verteilt und dekantiert. Die Kulturen werden 10 bis 21 Tage bei 25 °C inkubiert. Das nach diesr Zeit entstandene Mycel eines Kolben wird mit einer sterilen Impfnadel abgenommen, sofort weiterverwendet oder bei - 4°C in Wasser aufbewahrt.

b) Herstellung einer Vorkultur des Produzentestammes

Ein steriler 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der unter a) beschriebenen Nährlösung wird mit einer auf einem Schrägröhrchen gewachsenen Kultur oder mit einem 1 Quadratzentimeter großen Agarstück angeimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25 °C inkubiert. Die maximale Produktion

einer Verbindung der Formel I ist nach ca. 168 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 4 (500 ml in 200 ml Erlenmeyer) genügt eine 1 68 Stunden alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 5 %) aus der gleichen Nährlösung.

2. Herstellung der Verbindungen der Formeln 1 und 2

Ein 2000 ml Erlenmeyer Schüttelkolben wird unter folgenden Bedingungen betrieben:

5 g/l Cornsteep 10 g / 1 Glucose

4 g/l Tomatenpaste 10 ml / 1 Spurenelementlösung

10 g/l Hafermehl pH 6,8 (vor der Sterilisation)

Der pH-Wert wird mit wäßriger 2 N NaOH oder HCI eingestellt.

Inkubationszeit: 168 Stunden

Inkubationstemperatur: 25 °C Schüttelgeschwindigkeit: 140 Rpm

Spurenelementlösung

Zusammensetzung: Menge in Prozent

FeSo^ H ₂ O 0,100

MnSO ₄ _1 H ₂ O 0,100

CuCI ₂ _2 H ₂ O 0,0025

CaCI ₂ _2 H ₂ O 0,010

H3BO ₃ 0,0056

(NH ₄ ) 6Mo7024_4 H ₂ O 0,0019

ZnSO ₄ _7 H ₂ O 0,020

3. Isolierung der Hericenale

Die nach Beispiel 2 gewonnene Kulturlösung wird abzentrifugiert und die Zellmasse wird gefriergetrocknet. Das klare Kulturfiltrat wird an Mitsubishi Diaion ^® CHP20 adsorbiert Säulenmaße 30 x 6 cm) und mit einem Isopropanol Gradienten 0 - 70 % Isopropanol eluiert (Fluß 50 ml/min). Die die Hericenale enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bis auf die Wasserphase eingeengt und lyophilisiert.

4. Reinigung der Hericenale

270 mg des in Beispiel 3 erhaltenen Rohgemisches werden in 20 % wäßrigem Acetonitrii gelöst und zunächst an einer Säule mit Nucleosil ^® 100-12 C ₁₈ mit einem Gradienten von 25 - 40 % Acetonitrii in Wasser mit 0.05 % Trifluoressigsäure (Säulenmaße 250 x 32 mm, Fluß 50 ml/min) chromatographiert. Die Fraktionen, die die Hericenale enthalten, werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und an Nucleosil ^® 100-10 C ₁₈ AB mit dem gleichen Gradienten endgereinigt (Säulenmaße 250 x 20 mm, Fluß 25 ml/min). Nach Konzentration der Fraktionen und Lyophilisation werden 17,6 mg eines Gemisches aus Hercenal A und Hericenal B. Das Gemisch wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (Merck, 0,015 - 0,040 mm, Säulenvolumen 5 ml) mit Dichlormethan /n-Butanol 20:1 als Eluens in die Einzelkomponenten getrennt.

INTERNATIONALES FORMBLATT

Hoechst AG

Zentrale Pharma Forschung

Gebäude H 780

65926 Frankfurt/Main EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHΓNTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER:

HAG 000 951

DSM 10600

II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG

Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde

( ) eine wissenschaftliche Beschreibung

(X ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen).

III. EINGANG UND ANNAHME

Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter 1 bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1996 - 03 - 20 (Datum der Ersthinterlegung) ¹ eingegangen ist.

IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG

Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst¬ hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung ui eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).

V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE

Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschriften) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle

MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Ferson(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:

Anschrift Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig L>. UJ^ύ*

Datum: 1996 - 03 - 26

' Falls Regel 64 Buchstabe d zutπfft, ist dies der Zeitpunkt zu dem der Status einer intemaüonalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196

INTERNATIONALES FORMBLATT

Hoechst AG

Zentrale Pharma Forschung

Gebäude H 780

65926 Frankfurt/Main LEBENSFÄKGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 102 von der unten angegebenen

INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I. HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Name: Hoechst AG Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

Zentrale Pharma Forschung zugeteilte EINGANGSNUMMER: Anschrift: Gebäude H 780 DSM 10600

65926 Frankfurt /Main Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung': 1996 - 03 - 20

in. LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG

Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 1996 - 03 - 20 ^* geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus

(X) ¹ lebensfähig

( )' nicht mehr lebensfähig

(V. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKErrSPRUFUNC DURCHGEFÜHRT WORDEN IST ^*

V. INTERNATIONALE HttπΕRLEGUNGSSTELLE

Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der intemaüonalen Hinterlegungsstelle

MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:

Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig

Datum: 1996 - 03 -26

Angabe des Datums der Ersthinteriegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleiiung vorgenommen worden ist Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.

In den in Regei 102 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkeitsprufung.

Zutreffendes ankreuzen.

Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.

Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 0196