La présente invention concerne le domaine général des substituts biodégradables, voire bioassimilables, et cellularisables pour application biomédicale. En particulier, l'invention concerne de nouveaux substituts vasculaires à base de polymères biodégradables que sont les polysaccha rides et le collagène.

Il existe actuellement plusieurs types de substituts vasculaires utilisables en conditions cliniques qui s'appuient sur deux technologies différentes :

les substituts artificiels (à base de PTFE expensé ou PET Dacron).

les greffons de veines ou d'artères humaines d'origine autologue ou allogène,

Au delà des applications cliniques, il existe les substituts artificiels à l'étude, certains sont non biodégradables, d'autres sont biodégradables, comme par exemple ceux décrits dans le brevet EP 0850073, notamment à base de polymères naturels comme le collagène, carbohydrates de la famille des polysaccharides tels que le chitosane, la cellulose, les alginates ...

La publication de Zhang et al. dans J. Biomed. Mater. Res. A. vol 77, n°2, 6 janvier 2006, pages 277-284 décrit la réalisation d'un tricot à base de fils solides de chitosane noyé dans un film solide de chitosane. Pour cela, le tricot de fils de chitosane lui-même déposé sur un support tubulaire est trempé dans une solution d'acétate de chitosane et séché pour obtenir un tube renforcé par le tricot. La mise en œuvre d'un tricot, non-directement obtenu par filage mais par tricotage/assemblage de fils solides permet de réaliser des tubes dont les propriétés mécaniques sont compatibles avec leur utilisation en tant que substitut vasculaire. Dans une variante de réalisation, les auteurs envisagent de couvrir la partie interne du tube (et/ou externe) par une solution contenant du chitosane et de la gélatine qui est ensuite lyophilisée. Un procédé nécessitant l'utilisation de toluène est décrit pour obtenir le lyophilisât. Les différentes couches à base de chitosane obtenues sont donc sous forme solide sèche, compte tenu des différentes étapes de séchage/lyophilisation.

La demande de brevet WO 2009/027537 décrit un procédé de réalisation d'une association de deux tubes de chitosane dont l'un est un matériau étanche aux fluides de l'organisme et l'autre est en un matériau à porosité micronique interconnectée pour permettre l'infiltration cellulaire.

Des travaux antérieurs de certains inventeurs de la présente demande de brevet ont porté sur l'élaboration de fibres creuses de polysaccharides et notamment de chitosane, travaux ayant fait l'objet de la demande de brevet WO 2009/044053. Les fibres creuses multi-membranaires, en particulier celles à base de chitosane, apparaissent d'excellents candidats pour l'élaboration de biomatériaux grâce à leur biocompatibilité, biodégradabilité, bioactivité et le coût modéré du chitosane. La demande de brevet WO 2009/04405 indique que les fibres creuses, en particulier les fibres creuses de chitosane peuvent servir de bioréacteurs pour l'ingénierie tissulaire puisque le système multi-membranaire est très bien adapté à la régénération de tissus multicouches à géométrie cylindrique comme les vaisseaux sanguins. Néanmoins, les inventeurs ont pu constater que les fibres creuses obtenues selon le procédé décrit dans la demande de brevet WO 2009/044053 ne présentaient pas des propriétés mécaniques suffisantes pour résister à la pression sanguine et pour être compatibles avec des opérations de suture sur les vaisseaux sanguins, opération requise pour l'implantation. Il convient également de souligner que le procédé décrit dans cette demande de brevet est basé sur la neutralisation interrompue d'un collodion aqueux dont les caractéristiques sont déterminées (Degré d'acétylation du chitosane, Masse du chitosane, Concentration du collodion), de sorte que les hydrogels des différentes membranes du tube multi- membranaire décrit sont tous identiques.

Dans ce contexte, les inventeurs proposent, selon l'invention, de nouveaux substituts vasculaires biodégradables dont les propriétés mécaniques sont compatibles avec leur application, mais également dont le comportement vis-à-vis des cellules permet de régénérer un assemblage tissulaire tubulaire, et même selon certaines variantes de réalisation, un assemblage tissulaire tubulaire multicouche complexe.

Aussi, la présente invention concerne un substitut vasculaire biodégradable comportant une structure tubulaire interne et une enveloppe externe, chacune constituée d'un hydrogel d'un polysaccharide, de collagène ou d'un mélange de tels polymères, caractérisé en ce que les deux hydrogels formant la structure tubulaire interne et l'enveloppe externe sont différents et présentent, notamment, des propriétés mécaniques et une vitesse de colonisation par des cellules, différentes. En particulier, un des hydrogels présente des propriétés de résistance mécanique supérieures à celles de l'autre hydrogel, mais l'autre hydrogel présente une vitesse de colonisation supérieure.

En comparaison à l'utilisation de couches solides sèches de polysaccharide, la mise en œuvre des hydrogels conformément à l'invention permet d'obtenir une structure suturable comportant au moins 80% en masse d'eau, et de préférence, au moins 90% et préférentiellement au moins 95% en masse d'eau. De plus, la dégradabilité des hydrogels par le milieu vivant dans lequel le substitut vasculaire va être implanté est davantage modulable que dans des systèmes secs, en particulier pour les temps de biodégradation courts.

Selon un mode de réalisation préféré, la structure tubulaire interne présente des propriétés de résistance mécaniques supérieures à celles de l'enveloppe externe. Selon un autre mode de réalisation préféré pouvant être combiné au précédent, l'hydrogel formant l'enveloppe externe présente une vitesse de colonisation par des cellules supérieure à celle de la structure tubulaire interne.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un tel substitut vasculaire comprenant les étapes suivantes : a) formation d'un tube, éventuellement multi-membranaire, constitué d'un hydrogel de polysaccharide, de collagène ou d'un mélange de ces polymères, par filage puis coagulation interrompue d'une solution hydro-alcoolique coagulable du polymère ou mélange de polymères sélectionné pour former le tube,

b) formation sur la paroi interne ou externe du tube obtenu à l'étape a) d'une couche d'hydrogel d'un polysaccharide, de collagène ou d'un mélange de ces polymères à partir d'une solution aqueuse exempte d'alcool du polymère ou mélange de polymères sélectionné pour former la couche.

Selon un mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention, la couche est déposée sur la paroi externe du tube obtenu à l'étape a).

Selon une autre mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention, pouvant être combiné au précédent, l'étape a) est réalisée à partir d'une solution hydro-alcooli ue de chitosane, la coagulation étant réalisée en milieu alcalin.

Selon une autre mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention, pouvant être combiné aux précédents, l'étape b) est réalisé à partir d'une solution aqueuse de chitosane exempte d'alcool, qui après dépôt sur les parois externes de la structure tubulaire interne est neutralisée.

La description ci-après, en référence aux Figures annexées permet de mieux comprendre l'invention.

La Figure 1 est une vue schématique en perspective d'un exemple de substitut vasculaire conforme à l'invention.

Les Figures 2A et 2B respectivement sont des vues schématiques en perspective et en coupe selon B-B d'un autre exemple de substitut vasculaire conforme à l'invention.

Les Figures 3A et 3B respectivement sont des vues schématiques en perspective et en coupe selon B-B d'un autre exemple de substitut vasculaire conforme à l'invention.

Les Figures 4A et 4B comparent les propriétés mécaniques de différents hydrogels de chitosane obtenus par voie aqueuse ou voie hydroalcoolique. Les Figures 5 et 6 sont des photographies partielles en microscopie optique d'un exemple de substitut vasculaire selon l'invention recouvert dans la lumière interne par des cellules vivantes.

La Figure 7 est une photographie partielle en microscopie optique d'un exemple de substitut vasculaire selon l'invention habité dans un espace inter- membranaire par des cellules vivantes.

Par hydrogel, on entend un matériau visco-élastique comportant au moins 80%, et de préférence, au moins 90% en masse d'eau et préférentiellement au moins 95% en masse d'eau. Dans le cadre de l'invention, la structure interne et l'enveloppe externe peuvent être constituées d'un hydrogel physique, ou d'un hydrogel chimique encore nommé hydrogel réticulé. Un hydrogel est dit physique, lorsque les interactions responsables de la réticulation inter-chaînes sont de type physique, et sont notamment des liaisons hydrogène et/ou des interactions hydrophobes par opposition à un hydrogel dit chimique dans lequel les interactions inter-chaines sont de type liaison covalente.

L'hydrogel constitutif de la structure interne, ainsi que l'hydrogel constitutif de l'enveloppe peuvent être à base d'un ou plusieurs polysaccha rides ou bien de collagène ou d'un mélange polysaccharide/collagène. Les polymères sélectionnés sont biodégradables, c'est-à-dire qu'ils sont aptes à subir, sous l'action d'un milieu vivant contenant divers réactifs comme l'eau, le monoxyde d'azote, et des enzymes, un processus de décomposition pour conduire à des composés de plus faible masse qui sont excrétés ou métabolisés par l'organisme. A titre d'exemple de polysaccharides, on peut citer les glycosaminoglycanes, tels que la chitine, le chitosane, l'acide hyaluronique, les alginates et notamment les alginates de calcium, et la carboxyméthyl cellulose, ainsi que les polysaccharides polyanioniques tels que le sulfate de dextrane, le dermatane sulfate, le kératane sulfate et l'héparine. Il existe également différentes formes de collagène, on peut notamment citer l'atélocollagène extrait par voie enzymatique, le collagène fibreux issu du tendon ou de peau. On distingue également de nombreux types de collagène qui ont une structure propre et que l'on retrouve dans des organes particuliers. Par exemple, les collagènes de type I, III et IV sont présents dans la paroi des vaisseaux sanguins, le collagène de type I est le plus fréquent et il est présent dans de nombreux tissus conjonctifs. La structure tubulaire interne sera, de préférence, en un hydrogel de chitosane, et notamment en un hydrogel physique. L'enveloppe externe pourra également être constituée d'un hydrogel de chitosane, et notamment d'un hydrogel physique. Le chitosane, est un dérivé partiellement voire totalement désacétylé de la chitine. Ses différentes formes sont notamment caractérisées par leur degré d'acétylation (DA) et par leur masse molaire.

Les propriétés mécaniques du substitut vasculaire selon l'invention sont importantes, car le substitut vasculaire doit d'une part résister à la pression sanguine physiologique (« burst pressure ») et d'autre part être suturable. Conformément à L'Heureux N., et al., Nature 2007, Vol 4. n°7, 389-395 et Konig, G., et al, Biomaterials 2009, 30, 1542-1550, un substitut vasculaire doit, de préférence, résister à la pression sanguine physiologique avec un coefficient de sécurité au moins de l'ordre de 8, c'est-à-dire que le substitut vasculaire doit résister à une pression correspondant à au moins 8 fois la pression physiologique maximale de l'ordre de 220 mm de mercure. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont identifié qu'il est difficile de trouver un même hydrogel biodégradable, qui présente de telles propriétés mécaniques, mais également qui puisse être facilement colonisé de telle sorte que, lorsque le substitut vasculaire est implanté, il y ait reconstitution d'un tissu de soutien avant dégradation du substitut et affaiblissement subséquent de ses propriétés mécaniques.

C'est pourquoi, dans le cadre de l'invention, il est prévu d'utiliser un assemblage constitué d'au moins deux couches différentes d'hydrogels, en particulier des hydrogels physiques de chitosane (que l'on nomme dans la suite de la description: structure tubulaire interne et enveloppe externe), chacune de ces couches présentant des propriétés différentes et complémentaires. La Figure 1 représente une telle structure I avec une structure tubulaire interne 1 et une enveloppe externe 2. Dans le cadre de l'invention, il est donc prévu d'associer deux tubes coaxiaux, chacun des tubes étant formé d'un hydrogel différent d'un ou plusieurs polysaccharides ou bien d'un ou plusieurs collagènes ou d'un mélange polysaccharide/collagène. Chacun des deux tubes pourra présenter une structure multi-membranaire. L'hydrogel constitutif de la structure tubulaire interne et l'hydrogel constitutif de l'enveloppe externe peuvent être de nature chimique différente, par exemple l'un constitué de collagène et l'autre de chitosane, ou bien de même nature chimique, par exemple, tous deux constitués de chitosane, mais d'un chitosane différent en terme de degré d'acétylation (DA), masse molaire moyenne en masse Mw, et/ou porosité, de manière à posséder des propriétés de résistance mécanique et de vitesse de colonisation par des cellules différentes. Dans le cadre de l'invention, il est prévu d'utiliser deux hydrogels coaxiaux, l'un de résistance mécanique plus élevé et l'autre de résistance mécanique plus faible mais de vitesse de colonisation par des cellules plus rapide.

Selon un mode de réalisation préféré, c'est la structure tubulaire interne qui donne sa structure et ses propriétés de résistance mécanique au substitut selon l'invention et lui permet notamment d'être suturable et de ne pas éclater sous la pression sanguine. En particulier, la structure tubulaire interne présente une contrainte à la rupture σ _Γ supérieure à 0,05 MPa, de préférence supérieure à 0,2 MPa. De préférence, la structure tubulaire interne présente également un module d'élasticité en traction E (module de Young) supérieur à 0,01 MPa, de préférence supérieur à 0,05 MPa et, par exemple, de l'ordre de 0,1 MPa. L'évaluation des paramètres mécaniques est réalisée comme décrit dans les exemples ci-après. La contrainte à la rupture peut être comparée à la pression interne équivalente P= σ _Γ *(R1-R2)/R2 où RI est le rayon externe et R2 est le rayon interne du tube. Pour une contrainte à rupture supérieure à 0,2 MPa, la pression interne dans un tube de 10mm de diamètre externe et 5mm de diamètre interne est proche de 1500 mmHg, ce qui est bien supérieur à la gamme de pressions physiologiques (<240mmHg). Les inventeurs ont constaté que les hydrogels de chitosane formés selon le procédé décrit dans la demande de brevet WO 2009/044053 ne possédaient pas de telles propriétés. La demande de brevet WO 2009/044053 décrit un procédé de préparation de fibres creuses par filage voie humide sous coagulation comprenant une étape de filage au travers d'une filière normale, par exemple tabulaire, d'une solution de polysaccharide (notamment de chitosane) ou de collagène coagulable dans un bain coagulant, qui sera, notamment dans le cas du chitosane, une solution alcaline, suivie d'au moins un cycle de coagulation partielle lors de laquelle la coagulation est interrompue. Dans la demande de brevet WO 2009/044053, la solution coagulable, nommée collodion, est une solution aqueuse contenant de l'eau mais pas d'alcool. Le cycle de coagulation interrompue est réalisé en introduisant la solution aqueuse de chitosane coagulable extrudée dans un bain ou une chambre de coagulation, dans des conditions permettant d'obtenir une fibre qui, en section transversale, présente une section partiellement coagulée, puis en interrompant la coagulation. Le bain ou la chambre de coagulation contient un agent coagulant tel qu'un gaz alcalin comme l'ammoniac ou une solution alcaline de soude, potasse (par exemple à une concentration de lmol/L) ou d'ammoniaque dont la diffusion dans le collodion permet de le faire passer localement à l'état gel ou coagulé. L'arrêt de la coagulation, se fait notamment en sortant la fibre formée du bain de coagulation et en effectuant un rinçage, notamment à l'eau. Le fait d'arrêter la coagulation de la fibre de polysaccharide ou de collagène permet, notamment, de former le canal central de la fibre creuse en arrêtant la coagulation avant la prise en hydrogel du cœur de la fibre, sans avoir besoin de préformer la cavité à l'aide d'un élément central à diamètre fixe comme dans une filière annulaire. Cette coagulation séquencée permet également de contrôler l'épaisseur du tube formé, ou de l'épaisseur de chaque membrane dans le cas d'une structure multi-membranaire lorsque plusieurs coagulations interrompues successives sont réalisées. Les inventeurs ont mis en évidence que lorsque ce procédé était mis en œuvre, non pas avec une solution aqueuse de polysaccharide (et par exemple de chitosane), mais avec une solution hydroalcoolique, la fibre creuse d'hydrogel physique de polysaccharide (et par exemple de chitosane) obtenue, qui peut être multi-membranaire présentait les propriétés mécaniques requises pour l'application en tant que substitut vasculaire. En particulier, il est possible d'utiliser une solution hydroalcoolique du type mélange eau/alcool dans laquelle l'alcool est de préférence un poly-alcool, par exemple choisi parmi les 1,2- et 1,3- propanediol, les 1,2-, 1,3- et 1,4-butanediol et le 1,2,3-propanetriol (glycérol), avec une proportion eau/alcool (v/v), par exemple de (20/80) à (95/5), et de préférence de 40/60 à 90/10(v/v). La mise en œuvre d'un tel collodion hydro-alcoolique permet la formation d'une fraction significative d'un allomorphe ou d'une forme cristalline anhydre du polysaccharide ce qui n'est pas le cas avec un collodion aqueux qui conduit à l'allomorphe hydraté seul. La concentration en polysaccharide, et notamment en chitosane, ou en collagène au sein de cette solution est, par exemple, de 0,5 à 6% (g/g), de préférence de 1,5 à 4%. La masse molaire moyenne en masse du polysaccharide ou du collagène du tube obtenu est sensiblement identique à sa valeur initiale dans le polysaccharide ayant servi à la préparation de la solution extrudable. Il en va de même du degré d'acétylation dans le cas d'un chitosane.

S'agissant plus particulièrement du chitosane ou du collagène, de préférence la solution hydroalcoolique extrudable est obtenue en partant de chitosane en solution aqueuse d'acide, notamment en milieu acide acétique, et en ajoutant le polyalcool retenu. Pour l'obtention d'un tube d'acide hyaluronique ou d'alginate, la solution extrudable est obtenue en partant du hyaluronane ou de l'alginate en solution aqueuse à pH neutre et l'opération de coagulation se fait dans un bain neutralisant acide.

Sinon, le procédé de préparation de la structure tubulaire interne, éventuellement multi-membranaire est conforme au procédé décrit dans la demande de brevet WO 2009/044053 à laquelle on pourra se référer pour plus de détails. L'opération de coagulation par neutralisation est suivie d'une opération de lavage, de manière à éliminer les sels formés et éventuellement l'alcool résiduel. Selon un mode de réalisation particulier, la structure tubulaire interne des substituts vasculaires selon l'invention est constituée d'un hydrogel physique de chitosane présentant une fraction significative de l'allomorphe cristallin anhydre, éventuellement en mélange avec une forme cristalline hydratée. La forme cristalline anhydre représente au moins 5%, de préférence au moins 10% en masse du chitosane cristallin présent. Un tel hydrogel peut être préparé grâce au procédé en milieu hydro-alcoolique tel que précédemment détaillé. Il est également possible d'utiliser un procédé dérivé de celui décrit dans le brevet FR2882665. Notamment, il est possible de réaliser un hydrogel physique de chitosane à partir d'une solution hydroalcoolique telle que précédemment décrite par évaporation de l'eau dans un moule cylindrique permettant d'avoir un gel alcoolique de forme cylindrique et, ensuite immerger ce gel alcoolique ainsi formé dans un bain alcalin et structurer un hydrogel multi-membranaire tubulaire par neutralisation interrompue à partir de cette préforme. Un exemple est donné sur la figure 4a de la publication : Multi-membrane hydrogels, Sébastien Ladet, Laurent David & Alain Domard Nature 452, 76-79(6 arch 2008) doi:10.1038/nature06619 accessible à l'adresse: http://www.nature.com/nature/journal/v452/n7183/fig_tab/natu re06619_F4. html.

Une fibre creuse formée d'un tel hydrogel physique de chitosane présentant une fraction significative de l'allomorphe cristallin anhydre, bien que satisfaisante au regard de ses propriétés mécaniques, n'est pas envahie rapidement par les cellules (dans la structure du matériau) une fois implantée en tant que substitut vasculaire, même si une telle fibre creuse peut être habitée (dans les espaces inter-membranaires) et/ou recouverte par des cellules, en particulier dans la lumière interne. Si une telle fibre creuse était utilisée seule, il y aurait dégradation du substitut avant reconstruction du canal vasculaire souhaité.

C'est pourquoi, il est prévu dans le cadre de l'invention de mettre en œuvre un tube formé d'au moins deux couches d'hydrogel différent. Selon un mode de réalisation préféré, la présence d'une enveloppe externe, autour d'une structure tubulaire interne telle que ci-dessus définie va alors permettre d'assurer la reconstruction d'un canal conjonctif externe de soutien avant complète dégradation du substitut. Cette enveloppe externe quant à elle, est constituée d'un hydrogel, et en particulier d'un hydrogel physique, par exemple, de chitosane, de collagène, d'un mélange chitosane/collagène, d'un mélange chitosane/acide hyaluronique, ou d'un alginate. L'enveloppe externe ne présente pas d'aussi bonnes propriétés mécaniques que la structure tubulaire interne, et va plus rapidement se dégrader et être colonisée par les cellules du tissu conjonctif au contact desquelles le substitut vasculaire est implanté. En particulier, l'enveloppe externe présente, de préférence, une colonisation cellulaire rapide, c'est-à-dire qu'une fois que l'enveloppe externe est en contact avec un tissu conjonctif environnant in vivo, en quelques jours, notamment en moins de 10 jours, l'hydrogel qui la constitue va être envahi dans son volume par des cellules, notamment des cellules recrutées lors de la réaction inflammatoire et ou des cellules du tissu conjonctif, et notamment des fibroblastes, observables par analyse anatomo- pathologique (coupes histologiques, colorations spécifiques immuno- histologiques). De préférence, cette vitesse de colonisation rapide doit être observée avec des cellules du tissu conjonctif dont la régénération tissulaire est souhaitée après implantation du substitut vasculaire dans l'organisme. La vitesse de colonisation des hydrogels constituant un substitut vasculaire selon l'invention pourra être appréciée après implantation sur un animal, sacrifice de ce dernier et observation par analyse anatomo-pathologique. Un hydrogel sera considéré comme colonisé, lorsque des cellules seront visibles à l'intérieur de ce dernier et pas uniquement en surface. A titre de comparaison, l'hydrogel constitutif de la structure tubulaire interne pourra présenter un temps de colonisation supérieur à 2 semaines, voire de l'ordre de plusieurs mois. C'est notamment le cas des hydrogels de chitosane précédemment décrits préparés à partir d'une solution hydro-alcoolique de polysaccharide, éventuellement en mélange avec du collagène. Par conséquent, la reconstruction d'un tissu périphérique de soutien va pouvoir se produire avant complète dégradation de la structure tubulaire interne, grâce à la colonisation rapide de l'enveloppe externe qui s'accompagne de sa dégradation rapide. Selon un mode de préparation d'un substitut selon l'invention, l'enveloppe externe est obtenue à partir d'une solution aqueuse de polysaccharide, de collagène ou de leur mélange, qui après dépôt sur la paroi externe de la structure tubulaire interne est coagulée par voie gazeuse ou liquide. La solution aqueuse utilisée est une solution dans l'eau et ne contient pas d'alcool, contrairement à la solution hydro-alcoolique utilisée pour la formation de la structure tubulaire interne. Selon un mode de réalisation particulier, l'enveloppe externe est obtenue à partir d'une solution aqueuse de chitosane exempte d'alcool, qui après dépôt sur les parois externes de la structure tubulaire interne est neutralisée. Le dépôt sur la paroi externe de la structure tubulaire interne peut être réalisé par trempage de l'assemblage tubulaire interne dans une solution aqueuse de chitosane. Lors de ce trempage, les extrémités de la structure tubulaire interne auront pu être obturées par des moyens temporaires. Pour la réalisation de l'enveloppe externe, il est possible d'utiliser une solution aqueuse d'acétate ou chlorhydrate de chitosane caractérisée par une concentration en chitosane assez faible (préférentiellement inférieure à 2% m/m par rapport à la masse totale de la solution) pour obtenir un hydrogel à faible concentration en polymère et donc plus facilement dégradable pour favoriser la colonisation cellulaire. Cette solution, encore appelée collodion, peut contenir en plus des sels ajoutés, tel que du chlorure de sodium, qui contribuent à l'écrantage des charges dans la solution polyélectrolytique, et donc au des-enchevêtrement des chaînes de polysaccharide pendant la neutralisation et la formation d'un gel plus poreux. La neutralisation pourra être réalisée grâce à une solution aqueuse alcaline, par exemple contenant de la soude, de la potasse ou de l'ammoniaque à une concentration de 0,05 à 10M, préférentiellement entre 0,05M et 2M. Cette neutralisation sera, le plus souvent, suivie d'un rinçage à l'eau pour éliminer l'excès de base et de sels.

De préférence, l'enveloppe externe est constituée d'un hydrogel physique de chitosane présentant quasi-exclusivement une forme cristalline hydratée, et de préférence exempte de forme cristalline anhydre. Par la suite de tels hydrogels de chitosane pourront être nommés gels aqueux de chitosane, par opposition aux gels hydroalcooliques de chitosane. Par quasi- exclusivement, on entend que plus de 95%, voire plus de 98% en masse de la fraction cristalline présente sont constitués de cristaux d'une forme cristalline hydratée. Il a été constaté par les inventeurs que les cellules du système immunitaire dégradent in vivo de façon sélective les gels aqueux de chitosane et ne dégradent que beaucoup plus lentement les hydrogels de chitosane présentant une fraction significative de l'allomorphe cristallin anhydre tels que précédemment décrits, et notamment ceux obtenus par la voie hydroalcoolique. Cette différence est due à la densité d'enchevêtrement qui est plus forte dans les hydrogels de chitosane présentant une fraction significative de l'allomorphe cristallin anhydre (et notamment ceux obtenus par la voie hydroalcoolique), que les hydrogels aqueux. Les hydrogels acqueux de chitosane sont également particulièrement avantageux puisqu'ils autorisent également une diffusion des messages intercellulaires, de l'oxygène et des nutriments. Après un temps de dégradation de quelques jours (<7jours), ces hydrogels sont dégradés et ensuite envahis par des cellules du système immunitaire, puis envahis par divers types cellulaires recrutés localement. Les hydrogels présentant une fraction significative de l'allomorphe cristallin anhydre tels que précédemment décrits, et notamment ceux obtenus par la voie hydroalcoolique permettent également une diffusion des messages intercellulaires, de l'oxygène et des nutriments, mais offrent, en plus, la possibilité (i) de cultiver les cellules in vitro (ii) de se développer in vivo dans un espace clos sans autoriser rapidement la migration cellulaire comme c'est, par contre, le cas dans les structures poreuses solides décrites Zhang et al. et WO 2009/027537, notamment.

Pour toutes ces raisons, selon des modes particulièrement avantageux, il est envisagé d'utiliser une enveloppe externe constituée d'un hydrogel physique de chitosane présentant quasi-exclusivement une forme cristalline hydratée, et de préférence exempte de forme cristalline anhydre et une structure tubulaire interne constituée d'un hydrogel physique de chitosane présentant une fraction significative de l'allomorphe cristallin anhydre, éventuellement en mélange avec une forme cristalline hydratée. Il est également possible que l'enveloppe externe soit constituée, non pas d'un hydrogel aqueux de chitosane, mais d'un mélange polysaccharide/collagène, et par exemple d'un mélange acide hyaluronique/collagène ou chitosane/collagène, la présence de collagène permettant d'obtenir une vitesse de dégradation plus rapide. Il est également possible d'utiliser un mélange polysaccharide/polysaccharide, par exemple chitosane/acide hyaluronique, la fraction d'acide hyaluronique permettant d'obtenir une vitesse de dégradation plus rapide. Le mélange de polysaccharides présente l'intérêt de pouvoir moduler la réponse inflammatoire (recrutement de cellules favorisant la dégradation de l'hydrogel, par exemple dans le cas de la présence d'une fraction d'alginates ou d'un mélange de chitosane contenant un chitosane de haut degré d'acétylation comme expliqué ci-après) et la vitesse de biorésorption, en particulier dans le cas où le composant associé au chitosane est présent dans la matrice extracellulaire (collagène, acide hyaluronique).

Pour favoriser l'obtention de propriétés de résistance mécanique plus élevées caractérisées notamment par une contrainte à la rupture plus élevée, voire un module d'élasticité plus élevé, le polysaccharide choisi pour la structure interne peut être un polysaccharide susceptible de développer un taux de cristallinité important, par exemple un chitosane de bas degré d'acétylation, de préférence de degré d'acétylation inférieur à 10%. On pourra également sélectionner une concentration en masse en polymère supérieure à 2% (m/m par rapport à la masse totale d'hydrogel) dans l'hydrogel constituant la structure interne. Il est également avantageux de choisir un polysaccharide de haute masse moléculaire. En particulier, un chitosane présentant une masse molaire moyenne en masse Mw supérieure à 300 000 g/mol pourra être utilisé, pour favoriser la formation de molécules de liaisons inter-cristallines et entre sites d'interactions hydrogène et hydrophobes, ainsi que la formation d'une forte densité de nœuds d'enchevêtrement à divers niveaux d'échelle de la morphologie de l'hydrogel. Dans le cadre de l'invention, les masses molaires moyennes en masse sont déterminées par la technique de mesure décrite dans la publication «Physico- chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic médium » A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005. Pour l'enveloppe externe, les caractéristiques idéales de l'hydrogel sont différentes. De manière avantageuse, on pourra choisir un chitosane de plus haut degré d'acétylation pour limiter le taux de cristallinité et augmenter la vitesse de biorésorption. En particulier, on pourra sélectionner un chitosane présentant un degré d'acétylation supérieur à 30% qui conduit à un hydrogel de faible taux de cristallinité. Un chitosane de DA plus élevé possède également une vitesse de biorésorption plus élevée. Il peut être également intéressant, mais pas obligatoire, de choisir un chitosane de masse suffisante pour réaliser un gel, mais de masse assez faible pour favoriser sa biorésorption : notamment une masse molaire moyenne en masse Mw inférieure à 300 000 g/mol et, de préférence, supérieure à 20 000 g/mol, pourra être sélectionnée. Pour la couche externe ou la structure interne, on peut également choisir de faire des mélanges de chitosane de bas (par exemple inférieur à 10%) et haut DA (par exemple supérieur à 30%) et/ou des mélanges de chitosane de basse et haute masse molaire moyenne en masse Mw. Par exemple, on pourra choisir une fraction de chitosane de bas DA et de haute masse pour assurer la formation d'un gel, et un chitosane de plus haut DA et de plus faible masse pour favoriser la colonisation cellulaire. La structure interne peut, par exemple, être réalisée à partir d'un collodion contenant une fraction massique majoritaire (>50%) de chitosane de haute masse et bas DA, alors que l'enveloppe externe peut être composée d'une fraction majoritaire (>50%) de chitosane de DA plus élevé et de plus faible masse. Il convient de noter que les DA et masse molaire Mw donnés précédemment pour les hydrogels constitutifs du substitut vasculaire correspondent sensiblement aux DA et masse molaire Mw du chitosane présent dans les solutions utilisées pour leur préparation.

Selon le mode de réalisation préféré tel que détaillé précédemment, la structure tubulaire interne présente des propriétés de résistance mécanique supérieures à celles de l'enveloppe externe. L'enveloppe externe, quant à elle présente une vitesse de colonisation par des cellules supérieure à celle de la structure tubulaire interne. Une configuration inversée, bien que non préférée, pourrait également être prévue. Dans ce cas, par exemple, la structure tubulaire interne pourrait être obtenue par filage puis coagulation interrompue d'une solution aqueuse coagulable de chitosane et l'enveloppe externe, à partir d'une solution hydro-alcoolique de chitosane. Dans ce cas, l'enveloppe externe serait formée d'un hydrogel obtenu par voie hydroalcoolique, éventuellement multi-membranaire et la structure tubulaire interne d'un hydrogel obtenu par voie aqueuse sur lequel l'endothélium pourrait se développer de façon plus efficace compte tenu de ses propriétés physico-mécaniques (module d'élasticité inférieur, dégradabilité plus importante au contact du milieu vivant), alors qu'une capsule fibreuse se formerait autour de l'hydrogel de temps de résorption plus long.

Dans le substitut vasculaire selon l'invention, la structure tubulaire interne et l'enveloppe externe sont, de préférence, solidarisées l'une à l'autre, notamment par enchevêtrement physique des hydrogels qui les constituent, au niveau de leur surface de contact 3 représentée sur la Figure 1. Un tel enchevêtrement est notamment obtenu par trempage de la structure tubulaire interne dans une solution aqueuse de polysaccharide ou de collagène, éventuellement en mélange, et en particulier de chitosane, comme décrit précédemment, dans le cas où la structure interne présente des propriétés de résistance mécanique supérieures par rapport à l'enveloppe externe et est notamment formée d'un hydrogel obtenu par voie hydro-alcoolique. Il est également possible de procéder à un remplissage d'une fibre creuse formée d'un hydrogel obtenu par voie hydro-alcoolique, avec une solution aqueuse de polysaccharide ou de collagène dans le cas où la structure tubulaire interne présente des propriétés de résistance mécanique inférieures, par rapport à l'enveloppe externe.

Par ailleurs, les substituts vasculaires selon l'invention ont l'avantage d'être totalement biodégradables, voire totalement bioassimilables dans le cas où les polymères sélectionnés sont du chitosane, de l'acide hyaluronique ou du collagène. Par «bioassimiiables», on entend qu'ils vont se dégrader dans le milieu vivant dans lequel ils vont être implantés, en l'occurrence le corps humain, et que les produits de dégradation vont être métabolisés par l'organisme. Les substituts vasculaires selon l'invention sont constitués de biomatériaux et allient les avantages que présentent le chitosane, le collagène, l'acide hyaluronique, les alginates, en termes de biocompatibilité, biodégradabilité, voire de bioactivité et de coût modéré.

Les substituts vasculaires selon l'invention pourront être élaborés avec différentes dimensions, notamment avec un diamètre interne de 1 à 15 mm, en particulier de 2 à 6 mm, correspondant à des petites artères pour lesquelles la demande en nouveaux substituts vasculaires fonctionnels à long terme (au delà de 3 ans) est la plus forte.

Avant leur implantation dans un organisme, les substituts vasculaires selon l'invention seront soumis à une opération de stérilisation, de préférence réalisée en autoclave pendant 20 minutes à une température de 120°C. Les propriétés mécaniques et biologiques ne sont pas significativement affectées par la stérilisation. Une telle stérilisation sera effectuée avant toute fonctionnalisation du substitut vasculaire avec des cellules vivantes, comme détaillé ci-après. Il est aussi possible de réaliser l'élaboration à partir de produits solides et liquides stérilisés, puis mis en forme en conditions stériles.

Selon un mode de réalisation avantageux, les parois internes de la structure tubulaire interne sont tapissées (préalablement à leur implantation) de cellules endothéliales vivantes. De tels substituts vasculaires I dans lesquels la surface de la lumière interne de la structure tubulaire interne 1 est tapissée de cellules endothéliales 4 sont notamment illustrés Figures 2A et 2B. Les inventeurs ont mis en évidence que les parois internes d'un tube d'hydrogel physique de chitosane tel que précédemment défini pouvaient être tapissées de cellules endothéliales de différents types, tels que des cellules endothéliales extraites de la veine saphène humaine, de la veine du cordon ombilical humain, ou des cellules endothéliales issues de progéniteurs extraits du sang circulant, et que ces cellules ne se dé-différenciaient pas et restaient intactes (établissement de jonctions endothéliales caractéristiques, 1 expression de facteurs fonctionnels) après la constitution du tapis cellulaire. De préférence, les parois de la structure tubulaire interne seront tapissées de cellules endothéliales fonctionnelles, c'est-à-dire semblables aux cellules endothéliales des tissus natifs et présentant les marqueurs spécifiques de ces tissus natifs, en exprimant des protéines comme la VE-Cadherine, CD31, le facteur de von Willbrand. La présence d'une telle couche de cellules endothéliales vivantes sur les parois de la structure tubulaire interne, notamment sous la forme d'un tapis du type monocouche cellulaire, permet d'éviter la formation d'un thrombus, qui aurait tendance à se former si le substitut vasculaire était utilisé seul pour remplacer des vaisseaux sanguins de petit diamètre, en particulier de diamètre interne inférieur à 6 mm. De tels substituts peuvent être préparés en ensemençant des cellules endothéliales dans la lumière de la structure tubulaire interne, une fois que la structure tubulaire interne et l'enveloppe externe ont été formées. Selon un mode de réalisation, la cellularisation de la structure tubulaire interne peut être réalisée de façon « statique » par injection d'une suspension de cellules endothéliales même à densité modérée, notamment avec de 50 000 à 100 000 cellules par cm ² , afin d'obtenir une monocouche couche cellulaire confiuente sur la paroi de la lumière du tube, en un temps qui peut correspondre de quelques heures à 48h. Selon un autre mode de réalisation, la cellularisation de la structure tubulaire interne peut-être réalisée de façon «dynamique» par injection d'une suspension de cellules endothéliales à densité modérée et en faisant tourner lentement le tube à cellulariser autour de l'axe du tube interne.

Selon un autre mode de réalisation, il est également possible que les parois internes de la structure tubulaire interne soient revêtues d'un polysaccharide polyanionique, éventuellement sous la forme d'une association polyélectrolyte avec l'hydrogel formant la structure tubulaire interne. Un tel polysaccharide polyanionique a l'avantage d'être antithrombogène. A titre d'exemple de tels polysaccharides polyanioniques, on peut citer le sulfate de dextrane, le dermatane sulfate, le kératane sulfate et l'héparine. Par ailleurs, les substituts vasculaires selon l'invention peuvent être multi-compartimentés, afin de reconstituer un substitut vasculaire cellularisé multicouche dont la structure est similaire à celle d'un vaisseau sanguin natif. En particulier, la structure tubulaire interne peut être multi-membranaire, c'est-à-dire formée de deux ou plusieurs membranes pouvant librement glisser les unes par rapport aux autres. De telles structures multi- membranaires peuvent, par exemple, être préparées en s'inspirant du procédé décrit dans la demande de brevet WO 2009/044053 mais en milieu hydro-alcoolique comme décrit plus haut, et en effectuant plusieurs cycles successifs de coagulation partielle. Les conditions opératoires de chaque cycle de coagulation interrompue et leurs conditions d'enchaînement détermineront la constitution de chaque membrane, notamment son épaisseur, et la taille de l'espace inter membranaire séparant deux membranes adjacentes. En particulier, selon une variante de réalisation, l'invention concerne des substituts vasculaires tels que précédemment définis, dans lesquels la structure tubulaire interne comprend au moins deux membranes séparées par un espace inter-membranaire contenant des cellules vivantes d'un même type ou de types différents. Par exemple, il est possible que l'espace inter-membranaire contienne des cellules musculaires lisses, ou un neo-tissu musculaire lisse constitué in vitro avant implantation. De tels substituts vasculaires sont notamment illustrés Figures 3A et 3B. La configuration présentée Figures 3A et 3B comporte une enveloppe externe 2, une structure tubulaire interne comportant deux membranes li et I2. L'espace inter-membranaire 5 entre les membranes li et I2 renferme des cellules 6, par exemple, des cellules musculaires lisses, et les parois internes de la membrane li, délimitant le tube interne de l'ensemble tubulaire creux, sont tapissées de cellules endothéliales 4. L'avantage d'introduire une couche de cellules d'un type donné dans un espace inter-membranaire est de préserver l'intégrité d'une couche riche en cellules d'un type donné (par exemple, musculaires lisses) et d'ainsi favoriser le développement d'une couche de tissu spécifique (par exemple, du tissu musculaire lisse) dans la paroi du tissu vasculaire en reconstruction jusqu'à la résorption de la structure interne. Les types cellulaires choisis pour leur introduction dans les espaces inter-membranaires de la structure interne peuvent apporter une fonctionnalité biologique pour le développement et le maintien fonctionnel du tissu en reconstruction, en particulier pour l'endothélium (les cellules en co- culture séparées dans la structure multi-membranaire échangent des messages chimiques de part et d'autre d'une membrane d'hydrogel) ou apporter une fonction pour le substitut vasculaire implanté. Par exemple, un effet de renfort peut être apporté avec une couche de fibroblastes synthétisant un tissu riche en collagène. Il est également possible d'apporter une fonctionnalité spécifique au tissu reconstruit, après dégradation de l'implant, notamment la contractilité avec une couche musculaire lisse. De préférence, les cellules sont prélevées chez le patient sur lequel le substitut est destiné à être implanté (cellules d'origine autologues). Si nécessaire, les cellules peuvent être mises en culture pour une période de multiplication et/ou de différentiation pour ensuite, être injectées à l'aide d'une seringue à travers les membranes ou entre les membranes à l'extrémité d'un tube multi- membranaire pour réaliser un substitut autologue. Il est possible de guérir un défaut résultant d'une injection à travers la paroi d'une membrane en le colmatant avec une solution aqueuse ou hydro-alcoolique du polymère utilisé, et notamment de chitosane, puis en neutralisant cette solution par ajout de quelques gouttes de solution basique ou en trempant le matériau dans un tampon biologique (ou milieu de culture tamponné).

L'ajout de cellules sur ou dans la structure interne à temps de biorésorption longs permettra le développement d'un tissu au sein du substitut vasculaire, in vivo, ou éventuellement d'abord in vitro puis in vivo. Après la dégradation de la partie interne, il reste donc les néo-tissus formés in vivo et in vitro sous la forme d'un agencement tissulaire tubulaire multicouche ressemblant à la structure d'un vaisseau sanguin.

Les ensembles tubulaires creux tels que précédemment définis ont été développés par les inventeurs, pour leur utilisation en tant que substituts vasculaires. Les substituts vasculaires selon l'invention pourront être directement implantés chez l'homme ou, dans le cas où des cellules vivantes sont présentes sur ou dans la structure tubulaire interne, les substituts pourront être implantés après un temps de culture cellulaire in vitro pour développer un tissu dans les espaces inter-membranaires et /ou un tapis endothélial dans la lumière interne du tube. L'implantation peut avoir lieu notamment au niveau d'une artère ou d'un vaisseau sanguin à réparer, lors d'opérations de chirurgie en remplacement ou en dérivation (pontage) d'un vaisseau lésé. En outre, les substituts selon l'invention pourront être utilisés en tant que dispositif à relargage de principe ou molécule actifs encapsulés ou insérés dans la structure de l'hydrogel constituant les membranes ou dans les chambres inter-membranaires. Les substituts vasculaires selon l'invention pourront donc être destinés à la réparation des lésions du tissu vasculaire dans des situations cliniques comme pontage, ou angioplastie, et notamment inhiber les mécanismes impliqués dans la resténose d'un vaisseau sanguin. Ils pourront être utilisés pour réparer des vaisseaux artériels suite à la chirurgie de résection d'un anévrisme.

D'autres applications biomédicales peuvent également être envisagées, notamment en tant que fistule artério-veineuse chez les patients dialysés ne disposant plus de solutions pour l'accès vasculaire.

Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif.

Préparation de la structure tubulaire interne

a) Tube monomembrane

Un tube de 5mm de diamètre externe et de 5cm de long est obtenu après extrusion par un pousse seringue d'un coliodion hydroalcoolique 50/50 eau/l,2-propanediol, v/v, à la concentration en acétate de chitosane (DA= 1,5% et Mw=350 000 g/mol) de 2% g/g d'eau, et coagulation dans une solution aqueuse de soude 1 . La coagulation est interrompue par extraction du gel de forme tubulaire du bain de coagulation après 5 minutes et rinçage à l'eau. La fin de la neutralisation est ensuite réalisée dans un bain de soude de concentration 4M, ce qui conduit à la formation d'un cœur gélifié. L'extraction du gel de c ur est effectuée manuellement puis un rinçage dans 5L d'eau permutée pendant 12h est réalisé pour enlever les sels et l'alcool résiduel.

L'intérêt de l'introduction d'un alcool (de préférence choisi dans le groupe 1,2- et 1,3-propane- diol, 1,2-, 1,3- et 1,4-butane-diol, 1,2,3- propane-triol (glycérol)) dans un collodion de polysaccharide (ex: chitosane) pour obtenir un hydrogel de concentration 0,02g chitosane /g d'eau est illustré sur les Figures 4A, 4B et 4C. Ces Figures mettent en évidence les propriétés mécaniques comparées d'hydrogels physique de chitosane obtenus par neutralisation dans un bain de soude de concentration 1M, d'un collodion d'un chitosane de DA 1,5 % et de Mw 350 000 g/mol de concentration 2%g/g et contenant dans le solvant 100% d'eau (H ₂ 0), 50% eau et 50% 1,2 propane diol (H ₂ 0/Propanediol), et 50% eau et 50% glycérol (H ₂ 0/glycérol). Les hydrogels sont lavés après neutralisation et contiennent in fine pour l'analyse mécanique uniquement de l'eau et le polysaccharide (chitosane).

Les échantillons analysés peuvent être des tubes pleins de diamètre 2mm et d'une longueur de gauge de 1,2cm ou des tubes creux de diamètre plus important (3 à 6 mm). Les tests de traction sont réalisés sur une machine de traction (modèle Adamel-Lhomargy DY22) avec un capteur de force de capacité maximale de 5 N et des mors à ressorts adaptés à des échantillons de faibles rigidité. Les échantillons sont extraits de leur eau de conservation et sont placés rapidement (en 1 minute) dans le dispositif de traction, et les essais sont assez courts afin de prévenir la déshydratation du gel. La surface de la fibre étant très lisse, deux bouts de scotch double face (scotch 3M 12mm de large, réf. 3M 34-8501-8644-5) sont collés aux extrémités de la fibre, pour ainsi éviter le glissement au cours du test de traction. Les fibres sont placées entre des mors constituées de petites pinces à ressort ajustable, et bien adaptées pour ces échantillons de faible rigidité. Les essais consistent en un chargement simple à une vitesse de déplacement de traverse constante de 2 mm/min jusqu'à rupture. Il est également possible de réaliser des cycles de chargement/déchargement pour apprécier la composante élastique et plastique de la déformation. Tous les essais ont 2 été réalisés à température ambiante, et à l'air ambiant. La loi de comportement mécanique est obtenue en traçant la courbe de la contrainte (σ =F/So; F est la force appliquée à l'échantillon, So est la section initiale de l'échantillon) en fonction de la déformation OU LO est la longueur initiale de la partie utile de l'échantillon, AL est la variation de la longueur utile de l'éprouvette). D'autre part, le module dYoung (E) est déterminé par régression linéaire de la loi de comportement mécanique dans la gamme des faibles déformations, c'est-à-dire dans le domaine de déformation élastique (déformation < 10%).

La Figure 4A montre l'évolution du module d'élasticité obtenu par régression linéaire de la loi de comportement nominale (contrainte nominale - déformation nominale) dans le domaine élastique (déformation < 10%). La Figure 4B montre l'évolution de la déformation à la rupture des hydrogels physiques de chitosane (moyenne de 5 échantillons). Les hydrogels sont capables d'une forte déformation avant rupture. La Figure 4C montre l'évolution de la contrainte à la rupture des hydrogels physiques de chitosane (moyenne de 5 échantillons). Les résultats présentés sur les Figures 4A, 4B et 4C montrent que l'ajout de propanediol dans le collodion augmente à la fois le module, la déformation à la rupture et la contrainte à la rupture. L'ajout de glycérol dans le collodion augmente les propriétés mécaniques de façon plus importante que le 1,2 propanediol.

b) Tube multi-membranaire

De la même manière que précédemment, le gel alcoolique est élaboré à partir d'une solution alcoolique de chitosane à la concentration en chitosane de 2%g/g et dont le solvant est 50/50 eau 1,2 propanediol. La solution est placée dans un moule cylindrique, séchée 12h à 45°C dans une étuve pour former un gel alcoolique.

Le gel obtenu est neutralisé dans un bain de soude 1M pendant 3 minutes, puis extrait du bain coagulant pendant 3minutes, puis replacé dans le bain de coagulation 3minutes, etc jusqu'à obtenir 3 membranes et 2 espaces intermembranaires. Le gel multimembranaire obtenu est lavé 12h dans l'eau permutée (10 litres) et le c ur gélifié est alors ôté. Préparation de l'enveloppe externe

Le tube (mono ou multi-membranaire) de la structure interne est immergé, en bouchant ses extrémités, dans une solution aqueuse d'acétate de chitosane de DA 46,2% et de masse Mw 300 000 g/mol. avec une concentration en mase de 1,5%. Après immersion, l'hydrogei revêtu est neutralisé dans un bain de soude 1M pendant 15 minutes. Puis, l'assemblage ainsi obtenu est lavé dans de l'eau permutée et renouvelée 6 fois pendant 12 h.

Avant toute expérimentation biologique, tous les échantillons d'hydrogels de chitosane obtenus sont stérilisés dans l'eau par autoclave pendant 20 minutes à une température de 120°C.

Constitution d'un tapis de cellules endothéliales sur les parois internes de la structure tubulaire interne ou dans un espace inter- membranaire

Des cellules endothéliales progénitrices (EPC) sont isolées du sang circulant humain par récupération de la fraction cellulaire mononucléée sur gradient de densité puis mises en culture (Clinicell Treated - Laboratoires MABIO) dans un milieu spécifique pour la différenciation des EPC en cellules endothéliales matures (Milieu EGM2-MV - Clonetics).

Les cellules endothéliales de veine saphène humaine sont isolées par traitement enzymatique et mises en culture selon le protocole décrit par Fernandez et ai. (Tissue Engineering, Volume 12 (1), 2006).

A l'issue de leur caractérisation phénotypique (expression de vWF, VE- cadhérine et CD31 en particulier) les cellules endothéliales matures sont ensemencées à la surface d'un hydrogel, dans un hydrogel en forme de tube creux ou dans un hydrogel multimembranaire à la densité moyenne de 10 ⁵ cellules/cm ² et dans leurs milieux de différenciation respectifs pendant au minimum 5h afin de former la monocouche cellulaire. Les cellules adhérentes à l'hydrogei sont maintenues en culture entre 24 heures et quelques jours sans modification de la qualité de la monocouche cellulaire (confluence et expression des marqueurs phénotypiques maintenus). La Figure 5 présente une photographie en microscopie optique, 24 heures après ensemencement et coloration Live-Dead, d'une culture cellulaire de cellules endothéliales issues de progéniteurs endothéliaux du sang circulant, et cultivées dans un tube d'hydrogel physique de chitosane tel que précédemment préparé. La mise au point est effectuée sur le fond du tube, ce qui met en évidence la formation du tapis endothélial. La Figure 6, quant à elle, présente une photographie avec une mise au point dans un plan supérieur, ce qui met en évidence la monocouche endothéliale sur les parois du tube.

Culture de cellules musculaires lisses dans l'espace inter- membranaire de la structure tubulaire interne

Des cellules musculaires lisses (SMC) sont obtenues de la veine du cordon ombilical humain par traitement enzymatique (collagénase) et cultivées en milieu pour SMC (SMC-Media 2 - PromoCell). Les cellules sont caractérisées phénotypiquement en culture (expression de la Smooth-Muscle α-actine) puis injectées dans l'espace inter-membranaire de structures de chitosane. La construction est gardée en culture pendant quelques jours à plusieurs semaines (jusqu'à 50 jours) sans mort cellulaire (analysée par coloration Live-Dead) ni disparition du marqueur phénotypique des SMC (expression de la Smooth-Muscle -actine).

La Figure 7 présente une photographie en microscopie optique d'une culture de cellules musculaires lisses (hSMC-human Smooth muscle cells) après marquage de la α-actine et marquage des noyaux cellulaires. Les cellules on été disposées dans la chambre inter-membranaire la plus externe d'un hydrogel physique multi-membranaire de chitosane tel que précédemment préparé.

En situation clinique, les EPC comme les SMC pourront être obtenues à partir d'un patient qui constitue alors une source autologue.