NOUVELLE COMPOSITION ET SES APPLICATIONS, NOTAMMENT COSMETIQUES, POUR TRAITER LA DESHYDRATATION DE LA PEAU

L'invention concerne une nouvelle composition et ses applications, notamment cosmétiques, pour améliorer la qualité de la peau en agissant sur la fonction « barrière » de la peau.

Les compositions de l'invention servent notamment à traiter la déshydratation de la peau.

Les fonctions principales de la peau sont notamment de maintenir une protection mécanique, chimique, contre les radiations et les pathogènes de l'environnement et de prévenir la perte en eau. Cette « fonction barrière » de la peau est assurée par la couche supérieure de l'épidémie : le Stratum Corneum (SC), correspondant au stade final de maturation des kératinocytes. Ainsi la stimulation de la différenciation des kératinocytes améliore la physiologie de la peau et notamment l'hydratation en limitant les pertes en eau au niveau de la peau.

De nombreuses substances et notamment l'acide gamma-linolénique (GLA) et les polyphénols de thé vert (GTP) sont connus pour leurs effets bénéfiques sur la peau. Les effets de l'acide gamma-linolénique (GLA) sur la peau peuvent être déclinés sous 3 aspects. En premier lieu, les GLA peuvent s'intégrer dans les membranes cellulaires et la matrice extracellulaire du Stratum Corneum (SC) composée de substances telles que des acides gras et des céramides et peuvent ainsi agir sur le contrôle de l'hydratation de la peau. Par ailleurs, le GLA participe à la régulation de la balance des eicosanoïdes de série 1 qui jouent un rôle anti-inflammatoire et anti-allergique. Enfin, par l'activation du récepteur PPAR (récepteur activé par les proliférateurs de péroxysomes) qui favorise l'expression de différentes protéines de maturation et l'inhibition de la synthèse d'ADN (et donc de la prolifération), le GLA pourrait stimuler la maturation du kératinocyte basai en cornéocyte. Les polyphénols de thé vert (GTP) améliorent la fonction « barrière » de la peau via la stimulation de la maturation du kératinocyte basai en cornéocyte. Par ailleurs, k GTP et particulièrement Pépigallocatéchine gallate (EGCG) apporte une protection contre le stress oxydatif, contre les radicaux libres et une stabilisation de la membrane du lysozome réduisant la fuite de médiateurs ou d'enzymes pro-inflammatoires.

La présente invention a pour but de fournir de nouvelles compositions ayant ^' un effet synergique sur la physiologie de la peau et en particulier sur la différenciation des kératinocytes.

La présente invention concerne l'utilisation d'une combinaison comprenant de l'acide gamma-linolénique et au moins un polyphénol de thé vert, dans laquelle le rapport entre l'acide gamma-linolénique et le polyphénol de thé vert varie d'environ 1 à environ

10, et en particulier varie d'environ 2 à environ 8 et encore plus particulièrement d'environ

4 à environ 6, pour augmenter la différenciation in vitro et ex vivo de kératinocytes.

Il a été constaté de manière inattendue que la combinaison d'acide gamma- linolénique et de polyphénols de thé vert agit de façon bénéfique et synergique sur la physiologie de la peau, et notamment vis-à-vis de la différenciation des kératinocytes.

Par effet synergique, on définit l'effet de la combinaison de deux ingrédients qui dépasse l'addition des effets qu'aurait eu individuellement chacun de ces ingrédients.

Par « acide gamma-linolénique » on entend l'isomère gamma de l'acide linolénique, qui appartient à la famille des acides gras oméga 6. Ces acides gras oméga 6 sont dits

« essentiels » car ils sont indispensables à notre corps et ne pouvant être synthétisés par le corps, doivent donc être apportés par l'alimentation. L'acide gamma-linolénique peut être produit à partir de l'acide linoléique par une succession de réactions enzymatiques provoquées par des désaturases et des élongases et est un intermédiaire essentiel du métabolisme des acides gras polyinsaturés. La δ6 désaturase, qui est une enzyme indispensable à la fabrication du GLA, est une enzyme absente dans les cellules de la peau

(kératinocytes et cornéocytes notamment).

Par « polyphénols de thé vert » on entend des catéchines dont la plus importante dans le thé vert est l'épigallocatéchine gallate (40%), suivie de Pépigallocatéchine (18%) puis de l'épicatéchine (8%). D'autres catéchines mineures sont présentes dans les extraits de thé telles que la gallocatéchine (GC), l'épicatéchine gallate (ECG), la gallocatéchine gallate

(GCg) et la catéchine (C).

L'expression « pour augmenter la différenciation in vitro et ex vivo de kératinocytes » signifie que la composition permet de faire progresser le kératinocyte dans son processus de maturation lui permettant d'assurer au mieux ses fonctions spécifiques.

L'expression « différenciation de kératinocytes » est à distinguer de « prolifération » qui correspond au renouvellement des cellules souches de la couche basale. Les ^* cellules basales par leurs mitoses asymétriques, assurent à la fois leur renouvellement (maintien

d'un contingent de cellules souches non différenciées) et la formation d'autres cellules basales destinées au processus de différenciation.

Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne .l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une combinaison dans laquelle le polyphénol de thé vert est sélectionné parmi des composés de la classe des fiavan-3-ol des flavonoïdes.

Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une combinaison dans laquelle le polyphénol de thé vert est sélectionné parmi l'épigallocatéchine gallate (EGCg), Pépigallocatéchine (EGC), l'épicatéchine (EC), la gallocatéchine (GC), la gallocatéchine gallate (GCg), l'épicatéchine gallate (ECg) et la catéchine (C).

Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une combinaison dans laquelle le polyphénol de thé vert est contenu dans un extrait végétal tel que l'extrait de thé vert (GTE).

L'extrait de thé vert est obtenu selon des méthodes totalement connues de l'homme du métier (voir entre autre la norme NF ISO 6079 de septembre 1991).

Selon un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une combinaison dans laquelle l'acide gamma- linolénique est contenu dans une huile végétale telle que l'huile de bourrache, l'huile de primevère ou l'huile de pépins de cassis. Les GLA apportés par l'huile de bourrache se présentent sous une forme plus biodisponible, que les GLA apportés par l'huile d'onagre. Dans l'huile de bourrache, le GLA est concentré en position sn-2 des triglycérides, alors que dans l'huile d'onagre, le GLA est concentré en position sn-1 et sn-3 des triglycérides. Les enzymes ont donc plus de facilité à cliver les GLA de l'huile de bourrache qui sont sous une forme plus biodisponible.

La présente invention concerne également une combinaison comprenant de l'acide gamma-linolénique et au moins un polyphénol de thé vert, dans laquelle le rapport entre l'acide gamma-linolénique et le polyphénol de thé vert varie d'environ 1 à environ 10, et en particulier varie d'environ 2 à environ 8 et encore plus particulièrement d'environ 4 à environ 6.

Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une combinaison comprenant de l'acide gamma-linolénique et au moins un polyphénol de thé vert, dans laquelle le rapport entre l'acide gamma-linolénique et le polyphénol de thé vert varie d'environ 1 à environ 10, et en particulier varie d'environ 2 à environ 8 et encore plus

particulièrement d'environ 4 à environ 6, et dans laquelle la quantité totale d'acide gamma- linolénique et de polyphénol est comprise d'environ 100 à environ 500 mg, en particulier d'environ 150 à environ 400 mg, plus particulièrement d'environ 350 mg.

La présente invention concerne une composition comprenant une combinaison telle que définie ci-dessus, dans laquelle :

- la concentration en acide gamma-linolénique est comprise d'environ 0,1 à environ 0,5%, plus particulièrement d'environ 0,1 à environ 0,3%, encore plus particulièrement d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition et

- la concentration en polyphénol de thé vert est comprise d'environ 0,01 à environ 0,1%, plus particulièrement d'environ 0,02 à environ 0,07%, encore plus particulièrement d'environ 0,045% en poids par rapport au poids de la composition.

Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle le polyphénol de thé vert est sélectionné parmi des composés de la classe des flavan-3-ol des flavonoïdes. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle le polyphénol de thé Vert est sélectionné parmi Pépigallocatéchine gallate (EGCg), Pépigallocatéchine (EGC), l'épicatéchine (EC), la gallocatéchine (GC), la gallocatéchine gallate (GCg), l'épicatéchine gallate (ECg) et la catéchine (C). Selon un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle le polyphénol de thé vert est contenu dans un extrait végétal tel que l'extrait de thé vert.

Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle l'acide gamma-linolénique est contenu dans une huile végétale telle que l'huile de bourrache, l'huile de primevère ou l'huile de pépins de cassis.

Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle la concentration en acide gamma- linolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition.

En dehors de ces gammes, soit aucun effet n'est obtenu (pour des concentrations inférieures à 0,15%), soit des problèmes liés à l'équilibre nutritionnel et organoleptique du produit apparaissent.

Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition.

Cette valeur permet d'obtenir un effet avantageux. Selon un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle la concentration en acide gamma- linolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition et la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,C45% en poids par rapport au poids total de la composition. La présente invention concerne également une composition orale comprenant une combinaison telle que définie ci-dessus, ladite composition se présentant sous la forme d'un produit alimentaire, d'un complément alimentaire, ou d'une composition cosmétique. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition orale telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que le produit alimentaire est sélectionné dans le groupe constitué par un produit laitier frais, un yoghourt, un fromage frais, un produit laitier fermenté, un dessert, une boisson, un liquide, une crème, une purée de fruits et/ou de légumes.

L'expression « lait fermenté » ou « yoghourt » doit être comprise comme étant notamment en accord avec les normes officielles du Codex alimentarius (notamment son volume 12 et la norme « Codex Stan 1-1 1 (a)- 1975) ou le décret français n°88-1203 du 31 décembre 1988.

Selon un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition orale telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que le complément alimentaire est sélectionné dans le groupe constitué par des dragées, des pilules, des gélules, du sirop, du gel, de la poudre à reconstituer.

Selon un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition orale telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la composition cosmétique est sélectionnée dans le groupe constitué par des crèmes, des émulsions, des lotions, de la pâte, de la gomme. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition orale telle que définie ci-dessus, dans laquelle la concentration en acide gamma-linolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition et la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition.

Les doses journalières recommandées de cette composition orale sont de 1 à 2 portions, c'est à dire correspondant aux gammes de 150 à 300 mg de GLA et de 45 à 90 mg de GTP.

La présente invention fait également état d'un produit cosmétique comprenant une combinaison telle que définie ci-dessus, en association avec un excipient approprié pour l'administration par voie topique.

On entend par « excipient approprié pour l'administration par voie topique », des excipients permettant à l'ingrédient actif d'atteindre le Stratum Corneum.

Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne un produit cosmétique telle que définie ci-dessus, dans lequel la concentration en acide gamma- linolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition et la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition.

La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une combinaison telle que définie ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

On entend par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », des excipients permettant de conduire l' ingrédients actif à sa cible.

La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement cosmétique, comprenant l'absorption par voie orale d'une composition cosmétique telle que définie ci- dessus.

La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement cosmétique, comprenant l'application topique d'un produit cosmétique tel que défini ci-dessus.

La présente invention concerne l'utilisation d'une combinaison telle que définie ci- dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à améliorer la qualité de la peau en agissant sur la fonction « barrière » de la peau.

La présente invention concerne l'utilisation d'une combinaison telle que définie ci- dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de pathologies impliquant une altération, notamment une diminution, de la différenciation des kératinocytes.

Les pathologies impliquant une altération, notamment une diminution de la différenciation des kératinocytes peuvent être par exemple, une dermatite atopique ou du psoriasis.

FIGURES :

Figure 1 : La Figure 1 représente le pourcentage d'expression de la

Transglutaminase K (TGK) dans les kératinocytes préalablement traités avec du GLA et du

GTP seul et en combinaison. La colonne A correspond au traitement des kératinocytes avec 1,25 μg/ml de GLA. La colonne B correspond au traitement des kératinocytes avec

3,75 μg/ml de GLA. La colonne C correspond au traitement des kératinocytes avec 0,5 μg/ml de GTP. La colonne D correspond au traitement des kératinocytes avec 2,5 μg/ml de

GLA et 0,5 μg/ml de GTP. La colonne E correspond au traitement des kératinocytes avec du calcium à une concentration de 1,5 mM bien connu pour stimuler la différenciation des kératinocytes.

Figure 2 : La Figure 2 représente le pourcentage d'expression de l'involucrine dans les kératinocytes (NHEK) de sujets femmes et provenant de l'épithélium abdominal (Groupe 1) ou de l'épithélium de la poitrine (Groupe 2), préalablement traités avec une faible quantité de Ca ²⁺ (A et C) ou une forte quantité de Ca ²⁺ (B et D) et avec du GLA et des extraits de thé vert (GTE) seul et en combinaison. La colonne hachurée correspond au contrôle positif. Les colonnes noires correspondent au traitement des kératinocytes avec uniquement du GLA à différentes concentrations (1, 3 et 10 mg/ml). Les colonnes blanches correspondent au traitement des kératinocytes avec uniquement du GTE à différentes concentrations (1, 3 et 10 mg/ml). Les colonnes grises correspondent au traitement des kératinocytes avec un mélange de GLA et de GTE à différentes concentrations (en mg/ml) (sous chaque colonne grise, le chiffre de gauche indique la concentration en GTE et le chiffre de droite la concentration en GLA). L'axe des abscisses correspond aux concentrations de GLA, de GTE et de mélange GLA/ GTE en mg/ml. L'axe des ordonnées correspond au pourcentage d'expression par rapport au contrôle de Ca ²⁺ à faible (A et C) ou à forte (B et D) concentration.

EXEMPLES :

Exemple 1 : Fabrication d'un produit laitier contenant une combinaison d'acide gamma-linolénique et de polyphénols de thé vert Le produit laitier est fabriqué par un procédé classique de préparation d'un yaourt brassé.

Dans une première étape, le lait écrémé, préalablement enrichi en protéines par l'ajout de poudre de lait ou de lait concentré est pré-chauffé (95 °C, 4 à 8 minutes) afin d'éliminer les contaminants bactériens. Puis une étape d'incorporation en ligne d'huile de bourrache a lieu avant l'homogénéisation (50-300 bars, 40 à 95°C). Un traitement thermique, un chambrage et un refroidissement sont réalisés successivement. Puis, des ferments sont ajoutés et la fermentation (30 à 45°C, 5 à 10 heures) a lieu en cuve. Un décaillage est ensuite effectué suivi d'un refroidissement.

A ce stade, est ajouté l'extrait de thé vert, la vitamine E et éventuellement une préparations de fruits. Le mélange obtenu est ensuite conditionné et stocké en chambre froide.

Exemple 2 : Etude de biodisponibilité

Si du GLA ou des catéchines sont absorbés par voie orale, leurs effets ne peuvent s'exercer sur la peau que par l'intermédiaire du sang qui est le seul véhicule permettant d'amener ces ingrédients au niveau de la totalité des tissus concernés (en l'occurrence, la peau).

Cette étude évalue la biodisponibilité de la combinaison des catéchines avec du GLA, et notamment la biodisponibilité de cette combinaison dans un yaourt contenant des probiotiques (voir Tableau 1).

Pour évaluer cette biodisponibilité, les concentrations plasmatiques de GLA et de catéchines sont suivies à différents moments après ingestion des produits 1, 2 , 3 ou 4.

D'après les données de la littérature, une dose d'environ 300 mg /jour de GLA permet d'avoir un effet. De façon à évaluer l'absorption du GLA et sa concentration sérique correspondante, deux doses de GLA ont été utilisées : 300 et 150 mg/jour.

Produits testés

Trois types de produits ont été développés et testés tel que décrit dans le tableau 1. Tableau 1: Composition des produits testés dans l'étude de biodisponibilité

*Les produits 1 et 2 ont été fabriqués selon le procédé de fabrication décrit dans l'exemple 1.

Protocole de l'étude

Cette étude est une étude normocentrée, randomisée, ouverte. Elle a été réalisée avec 12 sujets féminins volontaires (âge moyen 30.8 ans- Indice de Masse Corporelle (BMI) moyen de 21.4).

Pour chaque sujet, l'étude a duré entre 2 et 3 semaines.

Chaque sujet a fait quatre visites de 24h à la clinique : une première étant la visite d'inclusion (Vl) (1 semaine avant la première visite d'évaluation) et les trois autres étant des visites d'évaluation à JO (V2), à J+4 (V3) et J+8 (V4).

A chaque visite, un examen clinique a été réalisé et un prélèvement de sang a été effectué de manière à mesurer la concentration sanguine de GLA et de catéchines et à suivre les cinétiques d'absorption.

Après la première visite d'inclusion (Vl), les sujets ont passé la première semaine à mettre en pratique les recommandations alimentations qui les sensibilisaient au fait de réduire leur consommation en produits alimentaires contenant beaucoup des ingrédients testés (pour limiter toute interférence avec les dosages effectués). Les trois évaluations ont été séparées par au moins 4 jours et au maximum 7 jours.

Protocole pour les visites d'évaluation

Durant chaque visite d'évaluation (V2, V3, V4), les sujets ont consommé un produit au hasard (parmi les 4 produits). Ainsi à la fin de la troisième visite d'évaluation, ils avaient consommé chacun des trois produits testés. Sept prises de sang ont été faites dans les 6 heures suivant l'ingestion du produit. La concentration plasmatique des ingrédients actifs a été mesurée à 6 moments (TO, TIh, T2h, T3h, T4h, T6h) pour mesurer les cinétiques plasmatiques du GLA et des catéchines.

Deux prélèvements ont été faits en plus afin de mieux prendre en compte les différences en terme d'absorption des ingrédients actifs : - T0,5h a été utilisé pour la détermination de la biodisponibilité des catéchines dans le plasma.

- T5h a été utilisé pour la détermination de la biodisponibilité du GLA dans le plasma.

Analyses plasmatiques

Les concentrations plasmatiques en catéchines et spécifiquement en épicatéchine (la EC), en épigallocatéchine (EGC), et d'épigallocatéchine gallate (EGCG) ont été déterminées par CLHP comme décrit par Lee et al. (Lee MJ, Prabhu S, Meng X, Li C, Yang CS. An improved method for the détermination of green and black tea polyphenols in biomatrices by high-performance liquid chromatography with coulometric array détection. Anal Biochem. 2000 ;279: 164-9) et en se basant sur les connaissances générales de l'homme du métier. Les résultats sont exprimés en μmol/mL.

Les concentrations en GLA ont été obtenues sur la fraction des chylomicrons obtenue par isolement par ultracentrifugation. L'extraction des lipides des chylomicrons a été faite selon le protocole de Moilanen et al. (Moilanen T, Nikkari T. The effect of storage on the fatty acid composition of human sérum. Clin Chim Acta. 1981 ;114:111-6). Les mesures ont été réalisées en utilisant la chromatographie en phase gazeuse. L'identification de GLA a été faite par des méthodes connues par l'homme du métier notamment par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats sont exprimés en μg/mL.

Analyses statistiques

Pour évaluer la biodisponibilité du GLA et des catéchines, les paramètres suivants ont été analysés :

- l'aire sous la courbe (AUC) qui donne une information sur la cinétique de biodisponibilité (g/mL/h),

- la concentration maximale pendant l'analyse de cinétique (Cmax) (μg/mL),

- le temps pour lequel la concentration est maximale (Tmax) (h).

Un test t de Student a été utilisé. L'analyse a été effectuée sur la population per protocol (PP) (n=l 1) parce qu'un des 12 sujets inclus n'a pas accompli toutes les visites.

Résultats

• Résultats de la biodisponibilité du GLA

La biodisponibilité du GLA mis dans un yaourt (Produit 1 ou 2) ou comme simple ingrédient administré par l'intermédiaire de l'huile (Produit 3), a été mesurée de deux manières :

- AUC, Cmax et Tmax

- la cinétique de GLA sur les 6 heures suivant la consommation pour 11 sujets.

Les résultats de l'analyse d'AUC, de Cmax et de Tmax de GLA sont montrés dans le tableau 2. Tableau 2: GLA AUC, C _max and T _max analyses pour chaque produit.

Produit 1

(GLA 300 mg + Catéchines 45 mg dans 27,9 + 9,1 ^* 12,1 ± 7,03 ^** 2,00 ± 1,00 ^** un produit laitier fermenté)

Produit 2

(GLA 150 mg+ Catéchines 45 mg dans 12,3 + 3,1 6,5 ± 2,7 1,91 + 1,58 ^**' un produit laitier fermenté)

Produit 3 : Huile de bourrache seule 15,2 ± 10,5 9,4 ± 5,2 4,55 ± 1,29

(équivalent à 300 mg GLA)

Résultats .-moyenne ± SD (déviation standard) ^* statistiquement différente des produits 2 et 3 (p<0.001). ^** statistiquement différent des produits 2 (p<0.01). ^*** statistiquement différent du produit 3 (p<0.01).

Ces résultats montrent une augmentation de la biodisponibilité du GLA absorbé via un produit laitier fermenté fabriqué selon le procédé mis en œuvre par les inventeurs.

On peut aussi noter qu'il y a une réponse du type « effet-dose » : la quantité de GLA absorbé était environ deux fois plus importante dans le cas où 300 mg de GLA ont été consommés par rapport au cas où 150 mg ont été consommés.

De ces résultats, on peut déduire que pour une ingestion entre 150 et 300 mg de GLA, une concentration d'environ 6 à environ 12 μg/mL se retrouve au niveau des chylomicrons ce qui équivaut à une concentration entre environ 3 et environ 6 μg/ml dans le sérum. Grâce à une ultracentrifugation du sérum, la séparation du culot constitué par les chylomicrons et du surnageant comprenant le reste du sérum est réalisée. La proportion du culot par rapport au reste du sérum est de 50/50. Un facteur ¹ A peut donc être appliqué entre la concentration de GLA dans les chylomicrons et la concentration de GLA dans le sérum. • Résultats de la bio disponibilité des catéchines

Les concentrations plasmatiques des trois principales catéchines ont été mesurées à différents moments. Pour rappel, ces catéchines étaient les suivantes : epicatéchine (EC), epigallocatéchine (EGC) et epigallocatéchine gallate (EGCG).

L'analyse statistique a montré des différences significatives de concentrations plasmatiques d'EGC à TIh entre les produits 1 et 2 et le produit 4. Pour les deux autres catéchines, aucune différence significative n'a été montrée. Cela montre que les catéchines sont autant biodisponibles dans une matrice laitière que seules dans de l'eau.

De ces résultats, on peut déduire que pour une ingestion de 45 mg de catéchines (EC, EGC, EGCG), une concentration d'environ 0,5 à environ 2 μmol/L se retrouve _^ dans le sérum (EGCG : 0,04-0,33 μmol/1 soit 0,018-0,152 μg/ml, EGC : 0,05-0,14 μmol/1 soit

0,022-0,061 μg/ml, EC : 0,02-0,05 μmol/1 soit 0,005-0,014 μg/ml).

Les inventeurs ont pu rapprocher ces résultats de données bibliographiques (voir notamment Navarro-Peran E. et al. : «The antifolate activity of tea catechins », Grupo de Investigacion de Enzimologia, Departamento de Bioquimica y Biologia Molecular A, Facultad de Biologia, Universidad de Murcia, Espagne). Dans cette publication, il est dit que l'on retrouve de l'EGCG entre 0,1 et 1 μmol/1 (soit environ 0,03 à environ 0,5 μg/ml de GTP) dans le sérum et les tissus des buveurs de thé. La consommation de GTP via le yaourt décrit ci dessus est donc quasiment équivalente à celle d'un buveur quotidien de thé.

Exemple 3 : Etude clinique

Le processus de maturation (ou processus de différenciation épidermique) est très contrôlé et l'équilibre de la prolifération épidermique, de la différentiation et de la desquamation sont des éléments clés pour le fonctionnement de la peau. La peau protège le corps de la perte excessive d'eau, cette perte étant exprimée en perte d'eau transépidermique (TEWL ou TransEpidermal Water Loss).

Le TEWL pourra être un indicateur de la santé de la peau. Sa valeur dépend de l'endroit où il est mesuré, et dépend de la saison (elle est plus haute pendant les mois d'hiver). Mais pour un individu donné et pour une saison donnée, on peut très bien corréler cette valeur à la santé de la peau de cet individu.

La peau peut être malmenée du fait de conditions environnementales défavorables ou des habitudes personnelles (nettoyage...) ce qui peut conduire à son dessèchement et à l'augmentation de sa sensibilité.

Cette étude évalue les effets sur la fonction « barrière » de la peau de la consommation de deux portions par jour pendant 6 mois d'un produit contenant une combinaison de GLA et de catéchines par rapport à un produit contrôle (lait acidifié ne contenant ni probiotique, ni GLA ₅ ni catéchines).

La perte d'eau est provoquée par l'évaporation qui peut être déterminée en mesurant le gradient de pression de la couche de vapeur d'eau au dessus de la peau. La technique de mesure du TEWL permet d'évaluer l'effet « barrière » du stratum corneum et du film hydrolipidique.

Méthodologie

Cette étude est une étude normocentrée, randomisée, en double aveugle et réalisée en parallèle chez des sujets féminins volontaires en bonne santé avec une peau sèche et sensible. Des sujets (72) sont répartis en deux groupes de 36 sujets avec un âge moyen de 29,4±7,9 ans et un Indice de Masse Corporelle (BMI) moyen de 22,43±2,8.

Un groupe a reçu le produit testé tandis que l'autre a reçu le produit contrôle (sans probiotique, sans huile de bourrache ni catéchines) de façon à permettre la comparaison des effets de ces ingrédients sur la fonctionnalité de la peau.

Les compositions de produits sont résumées dans le tableau 3.

Tableau 3: composition des produits dans l'étude d'efficacité

L'étude a duré 7 mois. Elle a été divisée en deux parties : une phase de sélection (4 semaines) et une phase de consommation (24 semaines). Les sujets ont effectué 4 visites d'évaluation séparées de 6 semaines durant la période de consommation du produit. Une période de consommation de 6 mois permet la comparaison de l'effet du produit, sur une période de temps étendue et cela permet aussi la comparaison de l'effet en fonction des saisons. Le premier objectif de cette étude était de déterminer si la consommation d'un produit laitier fermenté durant 12 semaines permettait d'améliorer la fonction « barrière » de la peau sur l'avant-bras du sujet. Cette évaluation a été mesurée par le TEWL avec du laurylsulfate de sodium (SLS). Le TEWL a été mesuré sur la partie interne de l'avant bras avec un EVAPORIMETER EP2 ^® et exprimé en g/m ² /h. ( SERVOMED, Sweden). Le second objectif de cette étude était de déterminer si la consommation du produit laitier contenant la combinaison de l'invention permettait d'améliorer la fonction

« barrière » de Ia peau sur l'avant-bras au cours du temps et cela, en mesurant le TEWL dans du SLS.

D'autres paramètres ont été mesurés tels que l'hydratation, l'élasticité, les marqueurs sanguins de l'inflammation et la qualité globale de la peau par une évaluation clinique et un questionnaire personnel.

L'étude a été initiée en automne et poursuivie jusqu'au printemps de manière à comparer l'effet du produit à différents moments de l'année. Pour rappel, la fonction « barrière » de la peau est censée se détériorer pendant les mois d'hiver. L'analyse a été réalisée sur tous les sujets.

Analyse statistique

Les données ont été analysées de deux façons :

- comparaison entre deux groupes à différents moments (6, 12, 18 et 24 semaines) en utilisant un test d'ANOVA (analyse de la variance) non-paramétrique (en raison de la distribution, les valeurs sont exprimées en médianes plutôt qu'en moyenne) ;

- comparaison de l'évolution de l'effet au cours du temps ; cette analyse plus globale de la cinétique de réponse permet de tenir compte des différences entre les deux produits et des variations environnementales ; un test d'ANOVA basé sur des mesures répétées sur deux périodes de temps (étude totale de 24 semaines et jusqu'à 12 semaines (premier critère de l'étude)) a été utilisé.

Ces analyses tiennent compte des niveaux de références dans chaque cas.

Résultats

• Population à traiter (Intend to treat population ou (ITT)) L'analyse de la population ITT (n=67) a montré une amélioration chiffrée de Ia fonction « barrière » de la peau évaluée par le TEWL (sans SLS), pour des sujets ayant consommé le produit testé par rapport à ceux qui ont consommé le produit contrôle et cela, tout au long de l'étude.

Il y a une variation naturelle de la fonction « barrière » (par exemple une faible détérioration en hiver montre une valeur augmentée du TEWL) mais le produit actif a tendance à être supérieur au contrôle à 6 semaines, et, à 8 semaines, les différences sont statistiquement très significatives. Il n'y a pas de différences significatives à 12 et 24 semaines entre les traitements avec le produit testé et le produit contrôle (valeurs moyennes). La comparaison des pourcentages relatifs de l'augmentation des valeurs du TEWL dans les deux groupes montre la différence la plus importante (27,5%) à 18 semaines.

A 24 semaines, une amélioration de la fonction « barrière » du groupe test a été observée (valeur négative du TEWL comparée au niveau de référence) suggérant un effet d'accumulation globale de la consommation du produit.

L'analyse des effets au cours du temps révèle que le produit testé réduit significativement le TEWL pendant l'étude (24 semaines de consommation [p=0,02]) et aussi dans la phase jusqu'à 12 semaines de consommation (^=0,036]).

En moyenne, pendant la période globale de l'étude, la différence du TEWL entre les deux groupes est 14%, indiquant que la consommation du produit provoque 14% d'augmentation de la rétention d'eau par la peau.

• Sous groupe BMI<25

Pour le sous groupe ayant un Indice de Masse corporelle (BMI) <25 (n=23), des variations du TEWL dues au changement de saison ont été observées. Ces résultats sont similaires à ceux observés dans la population ITT.

Le TEWL du produit testé a été comparé significativement avec celui du produit contrôle à 6, 12 et 18 semaines. Une tendance positive a également été observée après 24 semaines de consommation. Exprimés en pourcentage du TEWL, les résultats révèlent

15% et 25% d'augmentation dans la fonction « barrière » du groupe test par rapport au groupe contrôle après respectivement, 6 et 18 semaines de consommation.

L'analyse de l'effet au cours du temps montre des différences significatives pendant la période jusqu'à 24 semaines [P=O ₅ OOS l] et aussi pendant la période jusqu'à 12 semaines [p=0,0039]. En moyenne, pendant la période totale de l'étude, la différence dans le TEWL entre les deux groupes est 22,3% indiquant que la consommation du produit provoque 22,3% d'augmentation de la rétention d'eau par la peau.

• Paramètres secondaires

Parmi les paramètres secondaires (hydratation, élasticité, marqueurs inflammatoires du sang...), l'analyse statistique révèle des améliorations de la qualité globale de la peau comme évalué par un questionnaire d'auto-évaluation de la fermeté et de la santé de la peau à 12 semaines.

- fermeté : 46,2% des sujets dans le groupe test ont senti que leur peau était plus ferme ; par comparaison au 11,5% des sujets dans le groupe contrôle ;

- santé : 46,2% des sujets dans le groupe test ont décrit leur peau comme étant plus saine que les sujets du groupe contrôle (7,7%). Afin de voir l'effet direct de ces doses de GTP et de GLA sur les cellules de la peau, les inventeurs ont testé des gammes de concentrations de ces ingrédients actifs in vitro.

Exemple 4 : Etude in vitro de l'induction de la différenciation de kératinocytes

L'effet du GLA et du GTP, ainsi que de leur combinaison sur la différenciation du kératinocyte, est quantifié grâce à des marqueurs protéiques de maturation :

- la Transglutaminase K (TGK) (Lee YS et al. "Differentiation of cultured human epidermal kératinocytes at high cell densities is mediated by endogenous activation of the protein kinase C signaling pathway". J Invest Dermatol. 1998 Nov;l 11(5):762-6 ; Eckert et al. R.L. Transglutaminase function in epidermis J. Invest. Dermatol. 124 :481-492, 2005), et

- l'involucrine (Candi et al. « The Cornified envelope: a model of cell death in the skin », Nature Publishing Group. April 2005, vol. 6).

La Transglutaminase K est fortement exprimée dans le kératinocyte lorsqu'il atteint une phase avancée de maturation (correspondant au début de la transformation en coraéocyte). La Transglutaminase K participe à la synthèse des céramides de la matrice extra-cellulaire du Stratum Corneum, participant ainsi au maintien de la bonne hydratation de la peau.

L'involucrine est une protéine entrant dans la composition du Stratum Corneum. Elle est donc une protéine structurale de l'enveloppe cornée.

Le GLA et le GTP seuls et en combinaison sont testés dans un modèle in vitro afin de : - soutenir leur effet bénéfique sur la maturation des kératinocytes à travers l'expression de la TGK, et de l'involucrine, et évaluer leur potentiel effet synergique à travers l'expression de la TGK. et de l'involucrine.

1) Effet de l'acide gamma-linolénique (GLA) et des polyphénols de thé vert

(GTP) ainsi que leur combinaison sur l'expression de la Transglutaminase K.

Nature des principes actifs testés :

Le GLA utilisé est le produit L2378 de la société SIGMA. Les 4 principales formes de catéchines formant le polyphénol de thé vert sont mélangées dans les proportions naturelles: EGCG, EGC, ECG et EC (Références respectives SIGMA E4143, E3768, E3893 et E4018).

La gamme de concentration de GLA testée in vitro était de 1 à 4 μg/ml et celle de GTP était de 0,3 à 0,7 μg/ml.

Conditions de culture des NHEK :

Les essais sont réalisés sur des kératinocytes humains normaux (NHEK) en monocouche. Les NHEK sont ensemencés à 10 ⁴ / puits en milieu SFM (milieu sans sérum) sans calcium, dans des conditions de température de 37 ⁰ C, de CO ₂ de 5% et d'humidité relative RH > 95%. Les NHEK sont ainsi incubés pendant 24 heures. Le milieu est ensuite éliminé. Puis les NHEK sont incubés pendant 48 heures en présence soit :

- du milieu SFM (milieu sans sérum) additionné d'acide gamma-linolénique et des polyphénols de thé vert à la concentration del,25 ; 2,5 ou 3,75 μg/mL pour le GLA et à la concentration de 0,5 μg/ml pour le GTP ;

- du milieu SFM (milieu sans sérum) sans calcium qui sert de contrôle négatif ;

- du milieu SFM (milieu sans sérum) additionné de calcium (1,50 mM) qui sert de contrôle positif.

Une élimination des milieux est réalisée et une seconde incubation en présence des 3 types de milieux est effectuée.

Test de cvtotoxieité

Tout d'abord, afin de pouvoir évaluer la concentration maximale des deux principes actifs tolérée par les NHEK dans ces conditions, un test de cytotoxicité est entrepris. La viabilité cellulaire des NHEK est évaluée après un marquage au 3-[4,5-

Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (SIGMA).

Ainsi, pour le GLA la concentration maximale sans perte de viabilité des NHEK est 5,00 μg/mL.

Pour le mélange de GTP, la concentration maximale sans perte de viabilité des NHEK est 1,00 μg/mL.

Quantification du marqueur de différenciation cellulaire

Le milieu de culture est éliminé puis un rinçage avec du PBS est réalisé. Les cellules sont ensuite perméabilisées et fixées par du méthanol absolu pendant 10 minutes à -20 ⁰ C. Puis un séchage et une saturation non spécifique avec un mélange PBS-Tween 20- Protéines de lait sont réalisés, suivi d'un rinçage avec du PBS. Les cellules NHEK sont marquées avec un anticorps monoclonal anti-TGK (Référence : TEBU 0175003), puis incubées 1 heure à température ambiante et rincées avec du PBS.

La révélation est réalisée avec un anticorps secondaire conjugué GAM-FITC (Référence : Life Technologie A 11001) et la fluorescence est mesurée grâce à un logiciel (Référence : NIKKON ; LICIA Software).

Le marquage et le comptage des noyaux se fait grâce à la technique de Hoechst. En premier lieu, le milieu est éliminé et un rinçage avec du PBS est réalisé. Un marquage de Hoechst (Référence : bis-benzimide Sigma Bl 155) est ensuite utilisé et l'incubation se fait pendant 1 heure à température ambiante. Suivent un rinçage avec du PBS, une saisie d'image et une quantification des fluorescences.

Les résultats sont exprimés en fluorescence spécifique de la TGK c'est à dire qu'ils sont rapportés au nombre de noyaux de façon à s'affranchir des variations de croissance des cellules.

De plus, tous ces résultats sont également rapportés aux résultats du contrôle négatif (qui représente une différentiation normale) et qui est fixé à 100%.

Analyse statistique des résultats :

L'analyse statistique des résultats est effectué à l'aide du logiciel JUMP 6 SAS Institute.

Un test de Dunnett (test spécialisé pour la comparaison multiple par exemple des comparaisons faites qu'avec le groupe témoin contre tous les autres groupes) permet de confirmer la significativité des résultats en comparaison à la condition contrôle non-traitée.

Résultats :

Les résultats sont exprimés dans la Figure 1.

L'expression moyenne de la TGK correspond à la mesure de la quantité de fluorescence rapporté au nombre de noyaux après marquage de Hoechst.

Le terme p _dunnett TGK correspond à la probabilité de commettre une erreur en disant qu'une valeur est significativement différente de la valeur du contrôle négatif (si p<5%, cela signifie qu'il y a une différence significative, si 5<p<10% cela signifie qu'il y a une tendance). Les valeurs testées in vitro sont des valeurs représentatives de la gamme de concentrations trouvées de GLA et de GTP au niveau du sérum. Les résultats sont exprimés dans la Figure 1.

Conclusions : GLA seul :

L'expression de la TGK après un traitement par du GLA semble être activée. Cette activation semble être similaire pour les deux concentrations testées. Cet effet positif de la GLA est en concordance avec les données de la littérature.

GTP seul :

Le traitement avec le GTP ne semble pas augmenter de façon significative la maturation naturelle dans ce modèle et à la concentration testée.

(Une donnée relatée dans la littérature est l'effet d' activation du promoteur de l'involucrine par l'EGCG à la forte dose de 20μg/mL).

Combinaison GLA et GTP :

L' activation de la TGK par un traitement contenant GLA et GTP est plus importante que celle apportée par le GLA seul. Il y a donc un effet synergique dans la mesure où l'addition d'une concentration de GTP, a priori sans impact observable dans ces conditions, augmente fortement l'activation de la TGK par le GLA seul.

Ces résultats sont à relier à ceux de l'étude clinique (résultats sur le TEWL).

2) Effet de l'acide gamma-linolénique (GLA) et des extraits de thé vert (GTE) ainsi que leur combinaison sur l'expression de l'involucrine.

Nature des principes actifs testés :

Le GLA utilisé est le produit L2378 de la société SIGMA. Le GLA a été dissous dans du DMSO et du BSA dépourvu d'acides gras libres (Fatty Free Acid).

L'extrait de thé vert utilisé est le produit Taiyo Chemicals. Il a été dissous dans de l'eau stérile.

Conditions de culture des NHEK : Les essais sont réalisés sur des kératinocytes humains normaux (NHEK) en monocouche.

Les kératinocytes sont prélevés chez des sujets femmes et proviennent soit de l'épithélium abdominal (groupe 1) soit de l'épithélium de la poitrine (groupe 2).

Les NHEK des deux groupes sont incubés pendant 48 heures en présence d'une faible (0,3 μg/ml) ou d'une forte (1,2 μg/ml) concentration de calcium, et en présence soit :

- du milieu SFM (milieu sans sérum) additionné de 0, 1, 3 et 10 μg/mL d'acide gamma-linolénique et/ou d'extraits de thé vert dont la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 88 % par poids ;

- du milieu SFM (milieu sans sérum) additionné de calcium qui sert de contrôle positif.

La dynamique du calcium dans les kératinocytes est un des facteurs qui conditionne leur différenciation à partir des cellules souches.

Après 48 heures de culture, les cellules sont récoltées puis elles sont lysées. Les protéines sont récupérées puis dosées grâce à la technique ELISA.

Test de cytotoxicité

La viabilité cellulaire des NHEK est évaluée après un marquage au 3-[4,5- Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diρhenyrtetrazolium bromide (MTT) (SIGMA).

Les valeurs testées in vitro sont des valeurs représentatives de la gamme de concentrations trouvées de GLA et de GTP au niveau du sérum.

Les résultats de cytotoxicité montrent que les concentrations en GTE et GLA ne sont pas toxiques pour les NHEK jusqu'à 10 μg/mL, quelque soit la concentration en calcium.

Quantification de l'expression de rinvolucrine Les expériences décrites ci-dessous ont été répétées 6 fois.

L'expression de l'involucrine a été déterminée grâce à un test ELISA. La gamme de concentration de GLA testée in vitro est de 0 à 10 μg/ml et celle de GTE est également de 0 à 10 μg/ml.

Cette gamme est choisie en fonction de la courbe de validation (absorbance en fonction de la concentration) mise au point préalablement sur un standard interne (involucrine dosée) fourni dans le kit.

Les absorbances des lysats cellulaires obtenus précédemment sont à relier aux concentrations d' involucrine, en fonction de la courbe standard.

Résultats :

Les résultats sont exprimés dans la Figure 2.

GLA seul :

L'expression de l'involucrine est augmentée après un traitement des NHEK des groupes 1 et 2 par du GLA seul (0 à 10 μg/mL) dans les conditions de forte ou faible concentration en calcium, telles que définies ci-dessus.

GTE seul :

L'expression de l'involucrine est augmentée après un traitement des NHEK des groupes 1 et 2 par du GTE seul (0 à 10 μg/mL) dans des conditions de forte ou faible concentration en calcium, telles que définies ci-dessus.

Combinaison GLA et GTE :

La combinaison de GLA et de GTE a un effet synergique sur l'expression de l'involucrine.

En effet, l'activation de l'expression de l'involucrine par le traitement contenant GLA et GTE est plus importante que celle obtenue par le GLA seul ou le GTE seul. Cet effet synergique est observable aussi bien dans le groupe 1 que dans le groupe 2, ce qui atteste de la pertinence des résultats observés.