NUEVOS DERIVADOS DE AMINOáCIDOS DICARBOXILICOS Y SU APLICACIóN EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

SECTOR DE LA TéCNICA

La presente invención se incluye en el campo de Ia investigación e industria farmacéutica. En particular, se centra en Ia síntesis de nuevos derivados de aminoácidos dicarboxílicos y su aplicación para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

ESTADO DE LA TéCNICA

El término demencia describe una alteración crónica o progresiva de funciones corticales o subcorticales del cerebro, con el resultado de fallos cognitivos más o menos complejos, normalmente acompañados de perturbaciones del estado general, comportamiento y personalidad. Muchas de las variaciones de las funciones cerebrales son procesos patológicos conocidos como enfermedades neurodegenerativas, EN en Io sucesivo, cuya característica común principal es Ia pérdida de neuronas en ciertas áreas del sistema nervioso central que varían según Ia EN de que se trate y están, en gran medida, relacionadas con Ia edad. En los últimos años, como consecuencia de Ia mejora en las condiciones higiénicas y sanitarias, Ia esperanza de vida ha aumentado de manera espectacular (Eurostat Pocketbooks. Living conditions in Europe. Data 2002-2005. 2007 edition.), trayendo consigo Ia indeseada consecuencia de un aumento de las EN y demencias seniles. Entre estas, Ia enfermedad de Alzheimer, EA en Io sucesivo, es Ia EN más común, responsable de aproximadamente dos tercios del total de casos de demencia (variando entre 42 y 81 % según distintos estudios), con una prevalencia muy relacionada con Ia edad, que se aproxima al 50% en Ia población mayor de 85 años (N. Enal. J. Med.

2003, 348, 1356-1364).

Hasta la fecha, y pese a Ia gran cantidad de esfuerzo y dinero invertidos, aun no se conoce que mecanismo o mecanismos son los desencadenantes de los distintos procesos (progresiva desaparición de tejido neuronal, agregación del péptido beta amiloide, hiperfosforilación de Ia proteína tau, procesos oxidativos e inflamatorios, mutación de ciertos genes, etc.,) que componen Ia patología de EA, existiendo varias hipótesis que relacionan varios de estos procesos entre si. Lo que sí parece probado es que Ia EA es consecuencia de Ia combinación de mas de uno de estos procesos patológicos, y que Ia formación aberrante de agregados del péptido amiloide (oligómeros y protofibrillas hasta las placas seniles) junto con procesos oxidativos incontrolados se encuentra muy en el origen de Ia patología de Ia EA (Pharmacol. Sci. 1991 , 12, 383-388).

Igualmente, en Ia EA y otras EN se producen una serie de fallos cognitivos debidos a Ia disminución de niveles de los neurotransmisores que dan lugar a Ia transmisión sináptica. En el caso de Ia EA es especialmente significativo el fallo de Ia neurotransmisión colinérgica, con niveles de acetilcolina (ACh en Io sucesivo) fuertemente disminuidos (Clin. Neuropharmacol. 2004, 27, 141-149).

Se conoce además que Ia acetilcolinesterasa (AChE en Io sucesivo) ejerce una doble función biológica pues, además de ser responsable de Ia hidrólisis de ACh en su centro catalítico, favorece Ia agregación del péptido amiloide hacia especies neurotóxicas mediante actividad centrada en un sitio aniónico periférico situado a Ia entrada de Ia garganta que conduce al centro catalítico (FEBS Lett. 2005, 579, 5260-5264). Ante esta situación, y sabiendo que Ia pérdida masiva de neuronas es prácticamente irreversible, resulta obvia Ia conveniencia de disponer de fármacos capaces de actuar en las primeras fases de Ia enfermedad o, mejor aun, que produzcan una actividad neuroprotectora capaz de detener el avance de Ia enfermedad al aparecer los primeros síntomas e incluso antes, en un caso ideal, si se dispusiera de un sistema de diagnóstico precoz adecuado. Asimismo, y teniendo en cuenta los diferentes procesos

que componen Ia patología de Ia EA, sería muy deseable que esas moléculas fueran capaces de actuar sobre más de una diana terapéutica como, por ejemplo, inhibir Ia AChE con Ia consiguiente mejora de Ia neurotransmisión colinérgica y por tanto, alivio de los fallos cognitivos; inhibir Ia agregación de péptido amiloide que tendría el efecto de hacer mas lento el progreso de Ia enfermedad, o reducir el llamado estrés oxidativo que se produce como consecuencia de Ia pérdida del equilibrio entre las especies oxidantes generadas por el metabolismo cerebral y los mecanismos protectores antioxidantes. Son los llamados fármacos o drogas de acción multifuncional.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN Descripción breve

El objeto de esta invención se refiere a nuevos compuestos, derivados de aminoácidos dicarboxílicos hasta ahora no descritos en Ia literatura científica, que presentan en una sola molécula una o mas actividades biológicas que los convierten en productos potencialmente útiles para el tratamiento de EN, y en particular de Ia EA.

Descripción detallada

La presente invención se basa en que los inventores han sintetizado una familia de nuevos compuestos, de fórmula general I, hasta ahora no descritos. Estos nuevos compuestos, sometidos a evaluación farmacológica, han presentado interesantes actividades biológicas: • Antioxidación y neuroprotección.

• Inhibición de AChE.

• Desplazamiento de ioduro de propidio del sitio aniónico periférico de Ia enzima acetilcolinesterasa

• Penetración en el sistema nervioso central. Así pues, son productos potencialmente útiles como agentes terapéuticos. Los resultados obtenidos muestran que nos hallamos ante

una familia de productos con acción multifuncional, tal como han sido descritos anteriormente.

Por Io tanto, en un primer aspecto, Ia presente invención se refiere a los mismos productos de fórmula general (I):

donde:

Ri representa un átomo de hidrógeno o un grupo arilo o heteroarilo, alquilo, haloalquilo, aminoalquilo, amonioalquilo y, en general, grupos alquilos lineales o ramificados, sustituidos por cualquier grupo químico.

R2, R3 representa un átomo de hidrógeno o grupos arilo o heteroarilo, alquilos lineales o ramificados, insustituidos o sustituidos con cualquier grupo químico, carbamatos en los que R2 representa -

O-arilos u -O-alquilos, lineales o ramificados, insustituidos o sustituidos por cualquier grupo químico, derivados de urea en los que R ₂ representa -NH-arilos o -NH-alquilos, lineales o ramificados, insustituidos o sustituidos por cualquier grupo químico, imidas. En general, cualquier grupo químico capaz de generar Ia molécula representada en Ia fórmula general I. n tiene el valor 1 o 2. señala el carbono quiral del aminoácido, y puede ser el enantiómero R, el enantiómero S, o Ia mezcla en cualquier proporción de ambos enantiómeros.

Gi representa O, N mono o disustituido, CH ₂ , S o, en general, cualquier grupo o estructura química que pueda utilizarse como unión entre el aminoácido y R ₄ .

R ₄ representa cualquier estructura química combinación de grupos alquilo, arilo o heteroarilo, sustituidos o insustituidos. o un isómero, sal farmacéuticamente aceptable y/o solvato del mismo.

En un segundo aspecto, Ia presente invención se refiere al uso de los compuestos representados con Ia fórmula general (I) en Ia elaboración de un medicamento o composición farmacéutica con actividad neuroprotectora, útiles para el tratamiento de patologías o enfermedades neurodegenerativas o, en general, de enfermedades susceptibles de beneficiarse de las actividades biológicas mostradas por los productos descritos en Ia presente invención, o bien de una sal, derivado, profármacos o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo. Los compuestos de Ia invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas están dentro del alcance de Ia presente invención. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en Ia elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en Ia preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica, siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos por los técnicos en Ia materia.

Para su aplicación en terapia, los compuestos de fórmula (I), sus isómeros, sales, profármacos o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable

excluyendo los aditivos farmacéuticos habituales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo materiales considerados tóxicos a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, más preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% del compuesto de fórmula (I), o de sus sales, solvatos o profármacos.

A menos que se indique Io contrario, los compuestos de Ia invención también incluyen compuestos que difieren sólo en Ia presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos que tienen dicha estructura, a excepción de Ia sustitución de un hidrógeno por un deuterio o por tritio, o Ia sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C o un nitrógeno enriquecido en 15N, están dentro del alcance de esta invención. Los compuestos descritos en Ia presente invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y/o solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de Ia misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a Ia de Ia composición farmacéutica que incluye un compuesto de fórmula (I), o un profármaco, solvato, derivado o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Los compuestos de Ia presente invención de formula (I) pueden ser obtenidos o producidos mediante una vía sintética química u obtenidos a partir de una materia natural de distinto origen. En otro aspecto de Ia presente invención se describe una procedimiento de obtención de los compuestos de Ia invención de fórmula (I) o un isómero, sal farmacéuticamente aceptable y/o solvato del mismo caracterizado por las siguientes etapas:

a) reacción de un producto de fórmula (II)

en el que PGi representa un grupo protector de grupos hidroxilos y PG2 representa un grupo protector de grupos amino y un alcohol de fórmula RrOH en un disolvente anhidro para obtener los compuestos de fórmula

b) desprotección del grupo hidroxilo en los compuestos de fórmula (III) mediante Ia eliminación del grupo protector de grupos hidroxilos PG2 para dar el compuesto de fórmula (IV)

c) reacción del compuesto de fórmula (IV) con un compuesto de fórmula H-G1-R4 en presencia de un agente de condensación para dar los compuestos de fórmula (Ia)

opcionalmente Ia hidrólisis del compuesto (Ia) en el que R2 es un grupo terc-butiloxicarbonilo por tratamiento con un ácido fuerte y posterior

acilación del producto resultante por reacción con un cloruro de ácido de fórmula R2COCI o con un anhídrido de fórmula (R2CO)2θ en un disolvente apolar anhidro.

En una ejecución particular de Ia presente invención en los compuestos de fórmula (I) Ri es un grupo alquilo C2-C8 lineal o ramificado, preferiblemente un grupo alquilo C5-C7 lineal, más preferiblemente un grupo n-hexilo.

En otra ejecución de Ia presente invención en los compuestos de fórmula (I) R3 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C3, más preferiblemente un átomo de hidrógeno.

En otra ejecución de Ia presente invención en los compuestos de fórmula (I) el grupo Gi es un grupo amino opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos alquilo C ₁ -C ₃ , más preferiblemente un grupo -NH-.

En todavía otra ejecución de Ia presente invención en los compuestos de fórmula (I) n tiene el valor de 2.

Es asimismo una ejecución de Ia presente invención aquella en que en los compuestos de fórmula (I) R ₄ representa un grupo piperidin-4-il-etilo opcionalmente sustituido, preferiblemente un grupo piperidin-4-il-etilo que está sustituido en su átomo de nitrógeno con un grupo arilalquilo, preferiblemente un grupo bencilo opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados de C1-C3 alquilo, C1-C3 alcoxi, ciano, nitro y átomos de halógeno, más preferiblemente un grupo bencilo no sustituido.

Los siguientes compuestos son ejemplos de compuestos según Ia presente invención: • Ester n-hexílico del ácido 2-Benciloxicarbonilamino-4-[2-(1- bencil-piperidin-4-il)-etilcarbamoil]-butírico

• Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1-Bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-terc-butoxicarbonilamino-butírico

• Ester n-hexílico del ácido 2-Benzoilamino-4-[2-(1-bencil- piperidin-4-il)-etilcarbamoil]-butírico • Ester n-hexílico del ácido 2-[(Benzo[b]tiofen-2-carbonil)-amino]-

4-[2-(1-bencil-piperidin-4-il)-etilcarbamoil]-butírico

• Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1 -bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-[2-(6-cloro-benzo[b]thiophen-2-il)-acetilam ino]-butírico

• Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1 -bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-[(tieno[2,3-b]piridin-2-carbonil)-amino]-bu tírico

• Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1 -bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-[(tieno[2,3-b]tiofen-2-carbonil)-amino]-but írico

• Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1 -bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-[(tiofen-2-carbonil)-amino]-butírico • Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1 -bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-[(4-bromo-tiofen-2-carbonil)-amino]-butíri co donde GIn significa glutamina, es decir, Ia 5-amida del ácido glutámico (2- aminopentanodioico) y Hex significa el grupo hexilo, siendo todos los demás nombres de grupos habituales en química orgánica. Otro objeto adicional de Ia presente invención Io constituye una composición farmacéutica útil para el tratamiento de patologías o enfermedades neurodegenerativas o, en general, de enfermedades susceptibles de beneficiarse de las actividades biológicas mostradas por los productos descritos en Ia presente invención, en adelante composición farmacéutica de Ia invención, que comprende un compuesto, en cantidad terapéuticamente efectiva, de fórmula (I), o mezclas de los mismos, una sal, profármaco, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, para Ia administración a un paciente. Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el uso de Ia composición farmacéutica de Ia invención para el tratamiento o prevención

de una enfermedad neurodegenerativa tal como : enfermedad de Alzheimer, Creutzfeldt-Jakob, Parkinson o Huntington, Ia demencia con cuerpos de Lewy o, en general, las enfermedades susceptibles de beneficiarse de las actividades biológicas mostradas por los productos descritos en Ia presente invención.

Otro objeto particular de Ia invención Io constituye Ia composición farmacéutica de Ia invención en Ia que el compuesto de formula (I) es un compuesto, o mezcla de compuestos, perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: • Ester n-hexílico del ácido 2-Benciloxicarbonilamino-4-[2-(1- bencilpiperidin-4-il)-etilcarbamoil]-butírico

• Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1-Bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-terc-butoxicarbonilamino-butírico

• Ester n-hexílico del ácido 2-Benzoilamino-4-[2-(1- bencilpiperidin-4-il)-etilcarbamoil]-butírico

• Ester n-hexílico del ácido 2-[(Benzo[b]tiofen-2-carbonil)-amino]- 4-[2-(1-bencil-piperidin-4-il)-etilcarbamoil]-butírico

• Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1 -bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-[2-(6-cloro-benzo[b]thiophen-2-il)-acetilam ino]- butírico

• Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1 -bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-[(tieno[2,3-b]piridin-2-carbonil)-amino]-bu tírico

• Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1 -bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-[(tieno[2,3-b]tiofen-2-carbonil)-amino]-but írico • Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1 -bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-[(tiofen-2-carbonil)-amino]-butírico

• Ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1 -bencil-piperidin-4-il)- etilcarbamoil]-2-[(4-bromo-tiofen-2-carbonil)-amino]-butíri co

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y

vehículos conocidos por los técnicos en Ia materia y utilizados habitualmente en Ia elaboración de composiciones terapéuticas.

En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar Ia acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo Ia edad, estado del paciente, Ia severidad de Ia alteración o trastorno, y de Ia ruta y frecuencia de administración.

En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para Io cual dicha composición se formulará en Ia forma farmacéutica adecuada a Ia vía de administración elegida. En una realización particular, Ia administración de Ia composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía oral, tópica, rectal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intravenosa, etc.). Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para Ia obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid, u en otros habituales o similares de Ia Farmacopeas Española y en Estados Unidos.

El uso de los compuestos de Ia invención es compatible con su uso en protocolos en que los compuestos de Ia fórmula (I), o sus mezclas se usan por sí mismos o en combinaciones con otros tratamientos o cualquier procedimiento médico. En otro aspecto, esta patente presenta un método para el tratamiento de pacientes afectados por enfermedades neurodegenerativas,

consistente en Ia administración a los individuos afectados por estas enfermedades de cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto de fórmula (I), o una composición farmacéutica que Io incluya. A título de ejemplo, enfermedades neurodegenerativas contempladas en esta invención son las enfermedades de Alzheimer, Creutzfeldt-Jakob, Parkinson o Huntington, Ia demencia con cuerpos de Lewy o, en general, las enfermedades susceptibles de beneficiarse de las actividades biológicas mostradas por los productos descritos en Ia presente invención.

PROCEDIMENTOS DE PREPARACIóN

Los compuestos de fórmula (I) según Ia presente invención en los que R1 , R2, R3, R4, G1 y n tienen los significados definidos en Ia reivindicación 1 , pueden ser preparados según se describe a continuación a partir de productos accesibles comercialmente o cuya preparación se encuentra suficientemente descrita en el estado de Ia técnica.

En Ia presente memoria se utilizan las siguientes abreviaciones con los significados que se detallan:

Cbz se refiere al grupo benciloxicarbonilo, también llamado carbobenzoxi, Boc se refiere al grupo terc-butiloxicarbonilo, tBu representa el grupo tere-butilo,

Bn representa el grupo bencilo,

I y d indican Ia configuración del enantiómero empleado,

PyBOP se refiere a hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il- oxi)tripirrolidinio fosfonio,

EDC se refiere a N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, HOBT se refiere a N-hidroxibenzotriazol, DMAP se refiere a dimetilaminopiridina, DMF se refiere a dimetilformamida y TFA al ácido trifluoroacético

todos ellos grupos, reactivos o disolventes habituales en síntesis orgánica, especialmente en el campo de Ia síntesis de los aminoácidos.

En una primera etapa los aminoácidos dicarboxílicos de fórmula (II), en los que PGi representa un grupo protector de grupos hidroxilos tal como benciloxicarbonilo (Cbz) y terc-butiloxicarbonilo (Boc), PG ₂ representa un grupo protector de grupos amino tal como tere-butilo (t-Bu) o bencilo (Bn), se esterifican por reacción con un alcohol de fórmula RrOH en un disolvente anhidro tal como cloruro de metileno y en presencia de una base tal como trietilamina y un catalizador tal como PyBOP para obtener los compuestos de fórmula (III). La reacción se realiza en atmósfera inerte a preferiblemente a O ⁰ C durante el tiempo que requiera Ia reacción, habitualmente entre 15 y 20 horas según indique el control por cromatografía en capa fina. Una vez finalizada Ia reacción se evapora el disolvente y el residuo se purifica por cromatografía a presión en gel de

sílice empleando como eluyente , por ejemplo, mezclas de hexano/acetato de etilo.

A continuación se elimina el grupo protector de grupos hidroxilos PG2 siguiendo procedimientos conocidos por el experto en Ia materia para obtener los productos de fórmula (IV). Así por ejemplo cuando el grupo protector es un grupo benciloxicarbonilo se tratan los compuestos de fórmula (III) con ácido fuerte tal como el ácido trifluoroacético en presencia de un disolvente tal como cloruro de metileno. Cuando el grupo protector es un grupo terc-butiloxicarbonilo se someten los compuestos de fórmula (III) a hidrogenación catalizada, por ejemplo, por paladio sobre carbón activo.

Seguidamente se condensa a temperatura ambiente con agitación el compuesto de fórmula (IV) en solución de dimetilformamida anhidra con un compuesto de fórmula H-G1-R4 en presencia de un agente de condensación tal como EDC, HOB, trietilamina y cantidades catalíticas de DMAP para dar los compuestos de fórmula (Ia). Se deja reaccionar con agitación a temperatura ambiente controlando Ia reacción mediante cromatografía en capa fina. Una vez concluida Ia reacción se evapora el disolvente y el producto se purifica pasando el residuo resultante por una columna de cromatografía de gel de sílice, por ejemplo, empleando una mezcla 95:5 de cloruro de metileno:metanol como eluyente. Este último paso puede no ser necesario cuando se desea continuar con el procedimiento de síntesis tal como se indica en el siguiente párrafo.

Los compuestos de fórmula (Ia), además de ser intermedios de reacción para Ia obtención de compuestos de fórmula (I), son asimismo compuestos particulares de fórmula (I) en los que el grupo R2 es benciloxi o terc-butiloxi.

En el caso en que se desee obtener un compuesto de fórmula (I) en el que el grupo R2 sea distinto de benciloxi o terc-butiloxi Ia síntesis prosigue mediante Ia hidrólisis del compuesto (Ia) en el que R2 es un grupo terc-butiloxicarbonilo por tratamiento con un con ácido fuerte tal como el

ácido trifluoroacético en presencia de un disolvente tal como cloruro de metileno para dar los compuestos de fórmula (V).

Finalmente los compuestos de fórmula (V) se acilan mediante su tratamiento con un cloruro de ácido de fórmula R ₂ COCI o un anhídrido de fórmula (R ₂ CO) ₂ O en un disolvente apolar anhidro tal como el cloruro de metileno y en presencia de Ia menos dos equivalentes de una base tal como trietilamina, en frío y con agitación.

EJEMPLOS DE REALIZACIóN Ejemplo 1.- Síntesis de los compuestos de Ia invención

Ejemplo 1.1.- Síntesis del ester n-hexílico del ácido 2- Benciloxicarbonilamino-4-[2-(1-bencilpiperidin-4-il)-etilcar bamoil]- butírico.Este compuesto fue sintetizado según el método descrito en el apartado anterior, Ejemplo 1 , siguiendo el esquema de síntesis representado en Ia Figura 1. Sólido incoloro. Punto de fusión: 88-90 ⁰ C. EM (ES): m/z = 566 [M+H] ⁺ . ¹ H-RMN (300 MHz, MeOD) δ: 7.43 (s, 1OH, H ₃ -H ₇ -, H ₁₀ -H ₁₄ ), 5.10 (s, 2H, H ₁ -) 4.50 (m, 1 H, H _α ), 4.14 (m, 2H, H ₁ ), 4.13 (s, 2H, H ₈ ), 3.34-3.29 (m, 3H, H ₅ -βcu, H ₃ ), 3.16 (m, 2H, H ₁ ), 2.74 (m, 2H, H ₆ < _ax , Hs-ax), 2.35 (m, 2H, H _γ ), 2.28 (m, 1 H, H _β ), 2.06 (m, 1 H, H _β ) 1.87 (m, 2H, H ₇ . _eC u, H ₄ <ecu), 1.64 (m, 2H, H ₂ ), 1.42 (m, 2H, H ₂ ), 1.34-1.26 (m, 8H, H ₇ <aχ, H _49x , H ₃ , H ₄ , H ₅ ), 0.86 (t, 3H, J = 7.0 Hz, H ₆ ) ppm. ¹³ C-RMN (75 MHz, MeOD) δ: 174.6 (COC _Y ), 173.3 ( COC ₀ ), 164.5 (CONHC _α ), 139.6 (C ₂ -, C ₉ ), 132.2 (C ₃ -, C ₇ ), 132.0 (C ₁₀ , C ₁₄ ), 130.5 (C ₅ -), 130.2 (C ₁₂ ), 130.1 (C ₁₁ , C ₁₃ ), 128.9 (C ₄ -, C ₆ -), 66.5 (C ₁ -), 65.3 (C ₁ ), 62.2 (C ₈ ), 54.0 (C _α , C ₃ ), 53.7 (C _{5 1} C ₆ ), 37.4 (Cr), 36.2 (C ₂ ), 33.2 (C _γ ), 32.5 (C ₄ , C ₇ ), 30.7 (C ₃ ), 29.6 (C ₂ ),

27.8 (Cp), 26.7 (C ₄ ), 23.6 (C ₅ ), 14.3 (C ₆ ) ppm. HPLC: Pureza (97%).

Ejemplo 1.2.- Síntesis del ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1- Bencil-piperidin-4-il)-etilcarbamoil]-2-terc-butoxicarbonila mino- butírico. Este compuesto, igual que los otros ejemplos que Ie siguen, fue sintetizado según el método descrito en el apartado anterior, Ejemplo 1 , siguiendo el esquema de síntesis representado en Ia Figura 2. Aceite

incoloro. EM (ES): m/z = 532 [M+H] ⁺ . ¹ H-RMN (400 MHz, CDCI ₃ ) δ: 7.40 (m, 5H, H10-H14 ), 6.46 (m, 1 H, NHCOC _Y ), 4.18-4.07 (m, 3H, H _α , Hi), 5.37 (m, 1 H, NHC _α ), 3.37 (s, 2H, H ₈ ), 3.22 (m, 2H, H _r ), 2.85 (m, 2H, H ₆ ^ _u , Hsecu), 2.40-2.22 (m, 4H, H _β , H _γ ), 1.90 (m, 2H, H _69x , H _59x ), 1.61-1.52 (m, 4H, H ₇ <ecu, H ₄ <ecu, H ₂ ), 1.40 (s, 9H, Boc), 1.34-1.27 (m, 11 H, H _{7 ax} , H _{4 ax} , H ₂ -, H ₃ ', H ₃ , H ₄ , H ₅ ), 0.87 (t, 3H, J = 6.8 Hz, H ₆ ) ppm. ¹³ C-RMN (100 MHz, CDCI ₃ ) δ: 172.6 (COC _Y ), 172.3 (COC _α ), 155.9 (CONHC _α ), 131.8 (C ₉ ), 130.8 (Oí*, C10 ), 129.8 (Ci ₃ , Cu-), 129.2 (Ci ₂ ), 80.0 (C-Boc), 65.7 (Ci), 61.3 (C ₈ ), 53.1 (C _{5 1} C ₆ ), 52.6 (C _α ), 37.5 (Cr), 36.6 (C ₂ ), 34.7 (C ₃ ), 32.2 (C _γ ), 31.3 (C ₄ ', C ₇ ), 30.7 (C ₃ ), 28.6 (C _β ), 28.4 (C ₂ ), 28.2 (3CH ₃ -Boc), 25.4 (C ₄ ), 22.4 (C ₅ ), 14.0 (C ₆ ) ppm. HPLC: Pureza (96%).

Ejemplo 1.3.- Síntesis del ester n-hexílico del ácido 2- Benzoilamino-4-[2-(1-bencilpiperidin-4-il)-etilcarbamoil]-bu tírico. Sólido incoloro. Punto de fusión: 89-91 ⁰ C. EM (ES): m/z = 536 [M+H] ⁺ . ¹ H-RMN (400 MHz, CDCI ₃ ) δ: 7.85 (m, 3H, H ₃ -, H ₅ -, NHC ₀ ), 7.46 (m, 3H, H ₂ ", H ₆ -, H ₄ -), 7.30 (m, 5H, H10-H14 ), 6.09 (m, 1 H, NHCOC _Y ), 4.69 (m, 1 H, H _α ), 4.16 (td, 2H, J = 6.33, 1.93 Hz, Hi), 3.54 (s, 2H, H ₈ ), 3.26-3.19 (m, 2H, Hr), 2.90 (m, 2H, H _ffθ cu, H ₅ e _CU ), 2.38-2.17 (m, 4H, H _β , H _γ ), 2.12-1.98 (m, 2H, H _69x , H _59x ), 1.66-1.60 (m, 4H, H ₇ . _ecu , H ₄ -ecu, H ₂ ), 1.40-1.25 (m, 11 H, H _79x , H _49x , H ₂ , H ₃ -, H ₃ , H ₄ , H ₅ ), 0.87 (t, 3H, J = 7.02 Hz, H ₆ ) ppm. ¹³ C-RMN (100 MHz, CDCI ₃ ) δ: 172.2 (COC _Y ), 172.0 ( COC ₀ ), 167.4 (CONHC _a ), 133.5 (Cr), 131.9 (C ₄ -), 129.5 (C ₉ ), 128.6 (Ci ₄ , C10O, 128.3 (C ₂ -, C ₆ -, Ci ₂ ), 127.3 (Ci ₃ ., Cn-), 127.1 (C ₃ -, C ₅ -), 65.9 (Ci), 63.0 (C ₈ ), 53.4 (C ₅ ,C ₆ ), 52.7 (C ₀ ), 37.3 (Cr), 35.9 (C ₂ ), 33.1 (C ₃ ), 32.8 (C _γ ), 31.6 (C ₄ -, C ₇ ), 31.3 (C ₃ ), 28.5 (C ₂ ), 28.1 (C _β ), 25.4 (C ₄ ), 22.5 (C ₅ ), 14.0 (C ₆ ). HPLC: Pureza (96%).

Ejemplo 1.4.- Síntesis del ester n-hexílico del ácido 2- [(Benzo[b]tiofen-2-carbonil)-amino]-4-[2-(1-bencil-piperidin -4-il)- etilcarbamoil]-butírico. Sólido amarillo. Punto de fusión: 101-103 ⁰ C. EM (ES): m/z = 592 [M+H] ⁺ . H-RMN (400 MHz, CDCI ₃ ) δ: 7.84-7.81 (m, 2H, H ₃ -, H ₇ -), 7.76 (d, J = 7.1 , NCH _α ), 7.39-7.35 (m, 3H, H ₄ -, H ₅ -, H ₆ -), 7.27 (m, 5H, H ₁₀ -H ₁₄ ), 5.96 (m, 1 H, NHCOC _Y ), 4.66-4.64 (m, 1 H, H ₀ ), 4.14 (m,

2H, H ₁ ), 3.5 (s, 2H, H ₈ ), 3.25-3.17 (m, 2H, Hr), 2.83 (m, 2H, H ₅ ^< ecu, H ₆ -ecu), 2.40-2.14 (m, 4H, H _β , H _γ ), 1 .92 (m, 2H, H _59x , H _69x ), 1 .64-1 .53 (m, 4H, H ₄ <ecu, H ₇ <ecu, H ₂ ), 1.39-1.22 (m, 11 H, H _{4 ax} , H _79x , H ₂ , H ₃ -, H ₃ , H ₄ , H ₅ ), 0.85 (t, 3H, J = 6.78 Hz, H ₆ ) ppm. ¹³ C-RMN (100 MHz, CDCI ₃ ) δ: 172.6 (COC _Y ), 171.0 (COCα), 162 (CONHCα), 141.4 (C ₂ -, C ₉ -), 139.4 (C ₈ -), 138.3 (C ₉ ), 129.6 (Cío-, Ci ₄ ), 128.5 (Cn-, Ci ₃ ), 127.5 (Ci ₂ ), 126.6 (C ₄ -), 125.7 (C ₆ -), 125.4 (C ₅ -), 125.1 (C ₇ -), 123.0 (C ₃ -), 66.1 (Ci), 63.4 (C ₈ ), 53.7 (C _α ), 53.2 (C _{5 1} C ₆ ), 37.6 (Cr), 36.2 (C ₂ ), 33.3 (C ₃ ), 33.0 (C _γ ), 31.9 (C ₄ , C ₇ ), 31.6 (C ₃ ), 28.7 (C ₂ ), 27.7 (Cp), 25.7 (C ₄ ), 22.7 (C ₅ ), 14.2 (C ₆ ) ppm. HPLC: Pureza (94%).

Ejemplo 1.5.- Síntesis del ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1-bencil- piperidin-4-il)-etilcarbamoil]-2-[2-(6-cloro-benzo[b]thiophe n-2-il)- acetilamino]-butírico. Sólido amarillo. Punto de fusión: 84-86 ⁰ C. EM (ES): m/z = 641 [M+H] ⁺ . ¹ H-RMN (300 MHz, MeOD) δ: 7.80 (m, 3H, H ₄ -, H ₅ -, H ₇ -), 7.55 (s, 1 H, H ₃ -), 7.34 (m, 5H, Hi ₀ -Hi ₄ ), 4.39 (m, 1 H, H _α ), 4.08 (m, 2H, Hi), 3.81 (s, 2H, Hi ₀ -), 3.72 (s, 2H, H ₈ ), 3.18 (m, 2H, H _r ), 3.00 (m, 2H, H ₆ -ecu, Hg-ecu), 2.31 (m, 3H, H _γ , H _β ), 2.17 (m, 2H, H _{5 ax} , H _{6 ax} ), 1.93 (m, 1 H, H _β ) 1.73 (m, 2H, H _{4 ecu} , H ₇ -ecu), 1.54 (m, 1 H, H ₂ ), 1.39 (m, 2H, H ₂ ), 1.33-1.25 (m, 9H, H ₅ , H ₃ , H ₄ , H ₃ -, H _{4 ax} , H _{7 ax} ), 0.84 (t, 3H, J = 7.0 Hz, H ₆ ) ppm. ¹³ C-RMN (75 MHz, MeOD) δ: 174.3 (COC _Y ), 173.2 (COC _α ), 172.7 (CONHCα), 141.5 (C ₂ -), 140.0 (C ₉ -), 135.2 (C ₈ -), 131.6 (C ₆ -), 131.4 (C ₉ '),

130.0 (Ci ₄ ., Cío-), 129.6 (Ci ₃ , Cn-), 129.5 (Ci ₂ -), 128.0 (C ₅ -), 125.8 (C ₄ -),

125.1 (C ₇ -), 122.8 (C ₃ -), 66.4 (Ci ), 63.1 (C ₈ ), 54.0 (C ₀ ), 53.0 (C ₅ , C ₆ ), 37.6 (Cr), 36.3 (C ₃ ), 33.0 (C _γ ), 32.5 (C ₂ ), 31 .6 (C ₄ , C ₇ ), 29.6 (C ₅ ), 28.3 (C _β ), 26.7 (C ₄ ), 26.5 (C ₃ ), 23.6 (C ₂ ), 14.4 (C ₆ ) ppm. HPLC: Pureza (98%).

Ejemplo 1.6.- Síntesis del ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1-bencil- piperidin-4-il)-etilcarbamoil]-2-[(tieno[2,3-b]piridin-2-car bonil)-amino]- butírico. Aceite amarillo. EM (ES): m/z = 593 [M+H] ⁺ , 616 [M+Na] ⁺ . ¹ H- RMN (400 MHz, CDCI ₃ ) δ: 8.61 (dd, 1 H, J = 4.6, 1.6 Hz, H ₆ -), 8.09 (dd, 1 H, J = 8.2, 1.6 Hz, H ₄ -), 8.00 (d, 1 H, J = 6.8 Hz, NHC ₀ ), 7.78 (s, 1 H, H ₃ -), 7.32-7.22 (m, 6H, Hi ₀ -Hi ₄ ', H ₅ -), 5.88 (m, 1 H, NHCOC _Y ), 4.65 (m, 1 H,

CHa), 4.15 (m, 2H, Hi), 3.46 (s, 2H, H ₈ ), 3.23 (m, 2H, H _r ), 2.81 (m, 2H, Hsecu, Hβ-βcu), 2.41-2.17 (m, 4H, H _β , H _γ ), 1.89 (m, 2H, H _59x , H _69x ), 1.65-1.55 (m, 4H, H ₄ ^< ecu, H ₇ ^< ecu, H ₂ ), 1.39-1.24 (m, 11 H, H _49x , H _79x , H ₂ -, H ₃ -, H ₃ , H ₄ , H ₅ ), 0.85 (t, 3H, J = 6.8 Hz, H ₆ ) ppm. ¹³ C-RMN (100 MHz, CDCI ₃ ) δ: 172.5 (COC _Y ), 171.6 (COCa), 162.2 (CONHC _a ), 162.1 (C ₇ -), 148.7 (C ₆ -), 138.4 (C ₂ -), 132.7 (C ₄ -, C ₉ ), 129.3 (Ci ₄ , Ci ₀ -), 128.2 (Ci ₃ , dr), 127.1 (Ci ₂ -), 123.0 (C ₈ -, C ₃ -), 120.1 (C ₄ -, C ₅ -), 65.9 (Ci), 63.2 (C ₈ ), 53.5 (C ₅₁ C ₆ ), 53.1 (Ca), 37.5 (Cr), 36.0 (C ₂ ), 33.3 (C ₃ ), 32.7 (C _γ ), 31.9 (C ₄ , C ₇ ), 31.3 (C ₃ ), 28.4 (C ₅ ), 27.2 (Cp), 25.4 (C ₄ ), 22.5 (C ₂ ), 14.0 (C ₆ ) ppm. HPLC: Pureza (95%).

Ejemplo 1.7.- Síntesis del ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1-bencil- piperidin-4-il)-etilcarbamoil]-2-[(tieno[2,3-b]tiofen-2-carb onil)-amino]- butírico. Sólido amarillo. Punto de fusión: 100-102 ⁰ C. EM (ES): m/z = 598 [M+H] ⁺ . ¹ H-RMN (400 MHz, CDCI ₃ ) δ: 7.74 (s, 1H, H ₃ -), 7.68 (d, 1H, J = 7.1 Hz, NHC ₀ ), 7.36 (d, 1H, J = 5.5 Hz, H ₅ -), 7.29 (m, 5H, H _I0 -H _I4 ), 7.23 (d, 1H, J= 5.5 Hz, H ₄ -), 5.99 (m, 1H, NHCOC _Y ), 4.65 (m, 1H, H ₀ ), 4.14 (m, 2H, Hi), 3.5 (s, 2H, H ₈ ), 3.23 (m, 2H, H _r ), 2.90 (m, 2H, H _5ecu , H ₆ -ecu), 2.39- 2.16 (m, 4H, H _β , H _γ ), 2.00 (m, 2H, H _5ax , H _6ax ), 1.65-1.59 (m, 4H, H _4ecu , H ₇ < _ecu , H ₂ ), 1.39-1.24 (m, 11 H, H _4ax , H _7ax , H ₂ , H ₃ -, H ₃ , H ₄ , H ₅ ), 0.85 (t, 3H, J = 7.0 Hz, H ₆ ) ppm. ¹³ C-RMN (100 MHz, CDCI ₃ ) δ: 172.5 (COC _Y ), 171.8 (COCα), 162.3 (CONHCα), 146.3 (C ₂ -), 141.6 (C ₇ -), 141.3 (C ₉ ), 129.5 (C ₃ -), 129.0 (Cío-, Ci ₄ ), 128.3 (C ₈ -, Cn-, Ci ₃ ,), 127.4 (Ci ₂ -), 120.9 (C ₅ -), 125.5 (C ₄ -), 65.9 (Ci), 63.0 (C ₈ ), 53.4 (C ₅ , C ₆ ), 53.0 (C ₀ ), 37.4 (Cr), 36.0 (C ₂ ), 33.1 (C ₃ ), 32.8 (C _γ ), 31.5 (C ₄ , C ₇ ), 31.3 (C ₃ ), 28.4 (C ₅ ), 27.5 (C _β ), 25.4 (C ₄ ), 22.5 (C ₂ ), 14.0 (C ₆ ) ppm. HPLC: Pureza (98%).

Ejemplo 1.8.- Síntesis del ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1-bencil- piperidin-4-il)-etilcarbamoil]-2-[(tiofen-2-carbonil)-amino] -butírico. Sólido amarillo. Punto de fusión: 48-50 ⁰ C. EM (ES): m/z = 542 [M+H] ⁺ . ¹ H-RMN (400 MHz, MeOD) δ: 7.85 (dd, 1H, J = 3.9, 1.2 Hz, H ₃ ), 7.67 (dd, 1H, J = 5.1, 1.2 Hz, H ₅ ), 7.43 (s, 5H, Hi ₀ -Hi ₄ -), 7.13 (dd, J = 5.1, 3.9 Hz, H ₄ -), 4.50 (m, 1H, H _α ), 4.14 (m, 2H, Hi), 4.13 (s, 2H, H ₈ ), 3.34-3.29 (m, 3H,

Hβ-βcu, Hsecu, H ₃ ), 3.16 (m, H, H ₁ ), 2.74 (m, 2H, H _{6 ax} , H _59x ), 2.35 (m, 2H, H _γ ), 2.28 (m, 1 H, H _β ), 2.06 (m, 1 H, H _β ) 1.87 (m, 2H, H ₇ -ecu, H ₄ <ecu), 1 -64 (m, 2H, H ₂ ), 1.42 (m, 2H, H ₂ ), 1.34-1.26 (m, 8H, H _79x , H _{4 ax} , H ₃ , H ₄ , H ₅ ), 0.86 (t, 3H, J = 7.0 Hz, H ₆ ) ppm. ¹³ C-RMN (100 MHz, MeOD) δ: 174.6 (COC _Y ), 173.3 (COCα), 164.5 (CONHC _α ), 139.6 (C ₂ -, C ₉ ), 132.2 (C ₃ ), 132.0 (Cio<,Ci ₄ .), 130.5 (C ₅ "), 130.2 (Ci ₂ ), 130.1 (Cn-, Ci ₃ ), 128.9 (C ₄ ), 66.5 (Ci), 62.2 (C ₈ ), 54.0 (C _α , C ₃ ), 53.7 (C ₅ ,C ₆ <), 37.4 (C _r ), 36.2 (C ₂ ), 33.2 (C _γ ), 32.5 (C ₄ , C ₇ ), 30.7 (C ₃ ), 29.6 (C ₂ ), 27.8 (Cp), 26.7 (C ₄ ), 23.6 (C ₅ ), 14.3 (C ₆ ) ppm. HPLC: Pureza (96%). Ejemplo 1.9.- Síntesis del ester n-hexílico del ácido 4-[2-(1-bencil- piperidin-4-il)-etilcarbamoil]-2-[(4-bromo-tiofen-2-carbonil )-amino]- butírico. Aceite amarillento. EM (ES): m/z = 622, 620 [M+H] ⁺ . ¹ H-RMN (400 MHz, MeOD) δ: 7.74 (d, 1 H, J = 1.4 Hz, H ₅ -), 7.68 (d, J = 1.4 Hz, H ₃ -), 7.36 (s, 5H, Hio<-Hi4<), 4.48 ( m, 1 H, H _α ), 4.14 (m, 2H, Hi), 3.73 (s, 2H, H ₈ ), 3.30 (m, 2H, H _{5 ecu} ,), 3.13 (m, 2H, H _r ), 2.40-2.36 (m, 3H, H _{6 ax} , H _{5 ax} , H ₃ ), 2.32 (m, 1 H, H _β ), 2.07 (m, 1 H, H _β ), 1.77-1.74 (m, 2H, H ₇ -ecu, H _{4 ecu} ), 1.40 (m, 2H, H ₂ ), 1.32 (m, 2H, H ₂ ), 1.31-1.27 (m, 8H, H _{7 ax} , H _{4 ax} , H ₃ , H ₄ , H ₅ ), 0.87 (t, 3H, J = 7.02 Hz, H ₆ ) ppm. ¹³ C-RMN (100 MHz, MeOD) δ: 174.6 (COC _Y ), 173.1 (COC _α ), 164.5 (CONHC _α ), 141.0 (C ₂ -, C ₉ ), 132.2 (C ₃ -), 131.4 (Cio ^< ,Ci ₄ .), 129.9 (C ₅ -), 129.6 (Ci ₂ -). 129.3 (d _r> Ci ₃ ), 111.0 (C ₄ -), 66.6 (Ci), 63.5 (C ₈ ), 54.2, (C _α ), 54.1 (C ₃ ), 53.8 (C ₅ ,C ₆ ), 37.7 (Cr), 36.6 (Cz), 33.5 (C _γ ), 32.5 (C ₄ -, C ₇ ), 31.8 (C ₃ ), 29.6 (C ₂ ), 27.8 (C _β ), 26.7 (C ₄ ), 23.6 (C ₅ ), 14.3 (C ₆ ) ppm. HPLC: Pureza (97%).

Ejemplo 2.- Propiedades neuroprotectoras de los compuestos objeto de Ia invención.

Las causas primarias o desencadenantes de Ia EA en particular y de muchas de las EN en general no están completamente aclaradas. Si existe un gran número de evidencias de que fenómenos de tipo oxidativo están implicados en esta etiología, en particular el llamado estrés oxidativo, producido por cantidades superiores a las controlables de las llamadas

especies radicálicas de oxígeno. Estas especies pueden ser tanto de procedencia externa (fotooxidaciones, emisiones,...) como interna (metabolismo mitocondrial, activación neutrófila,...). Desde el punto de vista químico estas especies pueden ser radicales libres tipo superóxido o hidroxilo, oxígeno no radical como el agua oxigenada o el peroxinitrito o bien moléculas reactivas como los cetoaldehidos o el hidroxinonenal (Mutat. Res. 1999, 428, 17-22). En estado normal el cerebro posee mecanismos capaces de eliminar estas especies oxidativas transformándolas en otras inocuas, pero en situaciones patológicas o simplemente ante factores de riesgo como el envejecimiento, estas especies pueden escapar a los sistemas de control y dar lugar a procesos bioquímicos aberrantes (J. Neurosci. 2001 , 21, 4183-4187). Esto indica que moléculas capaces de suplir o complementar los mecanismos cerebrales encargados de mantener a niveles aceptables las especies reactivas de oxígeno, incapaces de cumplir plenamente su función, tendrían un efecto neuroprotector al eliminar o reducir dichas especies radicálicas y los daños que puedan causar.

A tal fin, se evaluó el efecto citoprotector de los compuestos en células de neuroblastoma humano, concretamente el potencial neuroprotector de estos compuestos frente al estrés oxidativo producido en dos modelos de estudio diferentes, por una parte con peróxido de hidrógeno como generador exógeno de radicales libres, y por otra con rotenona y oligomicina A, bloqueantes de Ia cadena respiratoria de Ia mitocondria según se describe en J. Neurochem. 1992, 59, 1609-1623 y en Toxicological Sciences 2004, 79, 137-146, respectivamente. El parámetro de viabilidad que se midió en ambos modelos era Ia actividad catalítica de Ia enzima lactatodeshidrogenasa, LDH en Io sucesivo, una enzima que se libera al medio extracelular cuando muere Ia célula (J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 315, 1346-1353). El método experimental utilizado, siguiendo un procedimiento previamente descrito (Neuropharmacology 2004, 46, 103-114) es el

siguiente: células SH-SY5Y de neuroblastoma humano fueron sembradas y cultivadas en un medio DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium) conteniendo 15 aminoácidos no esenciales y suplementada con un 10% de suero fetal de ternera, glutamina 1 milimolar, 50 unidades por mililitro de penicilina y 50 microgramos por mililitro de estreptomicina, manteniéndolas a 37 ⁰ C en aire humidificado conteniendo 5% de dióxido de carbono. En los ensayos, las células SH-SY5Y fueron subcultivadas en placas de 48 pocilios con una densidad de sembrado de 5x10 ⁵ células por pocilio, o bien en placas de 96 pocilios con una densidad de sembrado de 2x10 ⁵ células por pocilio. En los experimentos de citotoxicidad, las células así preparadas fueron tratadas con los compuestos a medir, en DMEM libre de suero.

Para estudiar Ia acción citoprotectora de los diferentes compuestos contra Ia muerte celular inducida por peróxido de hidrógeno 60 micromolar o una combinación de rotenona 30 micromolar con oligomicina A 10 micromolar, los compuestos fueron añadidos al medio y mantenidos durante 24 horas. Después, los medios fueron reemplazados por medios frescos que aún contenían el compuesto más el agente citotóxico, y fueron así mantenidos por un período adicional de 24 horas. La viabilidad celular fue comprobada midiendo Ia actividad de Ia enzima LDH, como se ha explicado anteriormente, mediante el kit "Cytotoxicity CeII Death" (Roche- Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante de dicho kit. La actividad LDH total fue definida como Ia suma de las actividades LDH intra y extracelular. La actividad LDH liberada por las células al morir fue definida como el porcentaje de Ia actividad LDH extracelular frente a Ia actividad LDH total.

En todos los ensayos farmacológicos se utiliza un control positivo como comparación y para evaluar Ia bondad del método empleado. En este caso se utilizó Trolox, un bien conocido captador de radicales libres, núcleo activo del antioxidante natural vitamina E (New. Engl. J. Med. 2005,

352, 2379-2388). Los resultados obtenidos para los compuestos descritos

como Ejemplos 1.1 a 1.9 que se muestran a continuación, vienen expresados en porcentaje de Ia actividad neuroprotectora.

2.1 Neuroprotección frente a un estímulo tóxico de peróxido de hidrógeno 60 micromolar, referido a porcentaje de protección inducida por cada compuesto, a Ia concentración que se expresa, y que fue Ia que dio lugar a Ia máxima protección en cada caso:

• Ejemplo 1.1 : 39,1 % a 10 micromolar

• Ejemplo 1.2: 24,9% a 1 micromolar

• Ejemplo 1.3: 68,1 % a 3 micromolar • Ejemplo 1.4: 28,7% a 1 micromolar

• Ejemplo 1.5: 32,5% a 3 micromolar

• Ejemplo 1.6: 48,8% a 30 micromolar

• Ejemplo 1.7: 46,4% a 10 micromolar

• Ejemplo 1.8: 73% a 10 micromolar • Ejemplo 1.9: 84,3% a 3 micromolar

• Trolox: 57,7% a 30 micromolar

2.2 Neuroprotección frente a un estímulo tóxico de una combinación de rotenona 30 micromolar y oligomicina 10 micromolar, referido a porcentaje de protección inducida por cada uno de los compuestos que se seleccionaron para esta prueba, a Ia concentración que se expresa, y que fue Ia que dio lugar a Ia máxima protección en cada caso:

• Ejemplo 1.3: 47,9% a 0,3 micromolar

• Ejemplo 1.7: 46,1 % a 0,3 micromolar • Ejemplo 1.8: 48,9% a 0,1 micromolar

• Ejemplo 1.9: 35,9% a 3 micromolar

• Trolox: 52,9% a 3 micromolar

Estos resultados indican que los productos objeto de Ia presente invención son capaces de reducir Ia presencia de especies radicálicas, tanto exógenas como endógenas, con el consiguiente efecto

neuroprotector, lo que las convierte en potenciales fármacos para el tratamiento de patologías generadas o favorecidas por estrés oxidativo o presencia de especies radicálicas en general.

Ejemplo 3.- Propiedades como inhibidores de Ia enzima acetilcolinesterasa de los compuestos objeto de Ia invención.

La EA, como todas las EN, es un proceso muy lento con un tiempo medio de 8 años entre Ia aparición de los primeros síntomas y Ia muerte. Los primeros síntomas aparecen como pérdidas de memoria a corto plazo, que llegan hasta el no reconocimiento de familiares o el olvido de habilidades normales para el individuo, problemas del lenguaje, alteraciones cognitivas, pérdida de Ia capacidad de aprendizaje y dificultades de orientación, que se aumentan hasta Ia pérdida total de las capacidades cognitivas según avanza Ia enfermedad (Ann. Intern. Med. 2004, 140, 501-509).

La causa inmediata de estos fallos cognitivos, al menos en las primeras etapas, es Ia disminución de los niveles de neurotransmisores que constituyen Ia comunicación sináptica. El cuadro clínico de Ia EA se correlaciona con Ia pérdida de neuronas colinérgicas en el núcleo basal de Meynert, siendo Ia sinapsis colinérgica, que utiliza acetilcolina como neurotransmisor, Ia más afectada en esta enfermedad. Teniendo en cuenta los efectos devastadores de Ia enfermedad, se entiende Ia importancia que han tenido y tienen los tratamientos sintomáticos capaces de reponer, aun temporalmente y con eficacia limitada, las capacidades cognitivas de los pacientes EA. De ahí que los inhibidores de Ia AChE, que previenen Ia degradación de Ia acetilcolina y elevan sus niveles sinápticos, hayan sido los únicos fármacos utilizados durante los últimos años en el tratamiento de Ia EA, e incluso en Ia actualidad sigan siendo casi los únicos fármacos existentes en mercado para el tratamiento de esta enfermedad.

Por ello, se consideró de interés evaluar Ia capacidad inhibidora de AChE de los compuestos objeto de Ia presente invención. Esta evaluación se llevó a cabo mediante el llamado método de Rappaport (Clin. Chim. Acta 1959, 4, 227), usando AChE purificada de Electrophorus electrícus y cloruro de acetilcolina (29,5 milimolar) como sustrato. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 2,5 mililitros de una solución acuosa que contenía 0,78 unidades de AChE y m-nitrofenol a Ia concentración de 1 ,9 milimolar para producir un color amarillo, que se pierde en función de Ia actividad de Ia enzima. Se realizaron curvas de inhibición incubando con los compuestos de Ia invención durante 30 minutos y se preparó una muestra sin compuesto alguno para determinar el 100% de Ia actividad enzimática. Tras los 30 minutos de incubación, se evaluó Ia pérdida del color amarillo midiendo absorbancia a 405 nanometros en un lector espectrofotométrico para placas (iEMS Reader MF, Labsystems). La concentración de compuesto que produce el 50% de inhibición de Ia actividad de AChE (CI ₅₀ ) se calculó transformando los valores de absorbancia a unidades de actividad enzimática Rappaport extrapolando a partir de una curva de calibración obtenida previamente.

Los resultados de inhibición de AChE, expresados como Ia concentración que inhibe el 50% de Ia actividad (Cl ₅₀ ) para los compuestos de Ia invención, son los siguientes:

• Ejemplo 1.1 : 1 ,4 micromolar

• Ejemplo 1.2: 5 micromolar

• Ejemplo 1.3: 1 ,9 micromolar • Ejemplo 1.4: 2,5 micromolar

• Ejemplo 1.5: 2,3 micromolar

• Ejemplo 1.6: 3,25 micomolar

• Ejemplo 1.7: 3,5 micromolar

• Ejemplo 1.8: 3,5 micromolar • Ejemplo 1.9: 1 ,2 micromolar

Estos resultados muestran que Ia familia de compuestos objeto de esta patente pueden también ser fármacos útiles para el tratamiento sintomático de Ia EA.

Ejemplo 4.- Propiedades como desplazantes de yoduro de propidio del sitio periférico del Ia enzima acetilcolinesterasa de los compuestos objeto de Ia invención.

Numerosas enfermedades neurodegenerativas tienen en común cambios conformacionales de determinadas proteínas que finalmente conducen a su aberrante polimerización y acumulación. La EA comparte esta característica, pues el péptido beta amiloide, soluble y fisiológicamente normal cambia de conformación y forma pequeños oligómeros lineales solubles que aumentan de tamaño a fibrillas y finalmente precipitan en agregados extracelulares de gran tamaño llamadas placas seniles. Tal vez por ser histológicamente tan llamativas, las placas seniles ocupaban el centro de Ia hipótesis amiloide original pero en Ia actualidad se plantea mas bien Ia capacidad neurotóxica de formas intermedias prefibrilares, oligómeros solubles y protofibrillas producidas durante Ia formación de las placas (J. Neurochem. 2007, 101, 1172-1184), por Io que resulta evidente que Ia inhibición de Ia polimerización y agregación de los monómeros del péptido amiloide pasa a ser un importante blanco terapéutico.

Varios estudios han demostrado que Ia enzima acetilcolinesterasa se une a dicho péptido beta amiloide induciendo Ia formación de fibrillas (Neurochem Res. 1998, 23, 135) y que el sitio aniónico periférico de Ia enzima está implicado en esa adhesión (Biochem. Pharmacol. 2003, 65, 407-416).

Es sabido que algunos ligandos como el ioduro de propidio, que se une al sitio periférico de Ia enzima, inhiben Ia agregación de beta amiloide (Mo/. Psychiatry 1996, 1, 359). Por Io tanto se consideró de interés conocer si alguno de los compuestos objeto de Ia invención sería capaz de

unirse al sitio periférico, Io cual podría ser indicativo de un posible efecto antiagregante de beta amiloide.

Se llevó a cabo un ensayo de competición por el sitio periférico de Ia acetilcolinesterasa con los compuestos a las concentraciones de 0,3 1 y 3 micromolar. El propidio, ligando específico del sitio aniónico periférico, origina un aumento de fluorescencia al unirse a dicho sitio (Mo/. Pharmacol. 1987, 31, 610). Una disminución en Ia fluorescencia debida a propidio en presencia de los compuestos objeto de Ia invención podría interpretarse como un desplazamiento de propidio del sitio periférico. Se utilizó una solución de acetilcolinesterasa de eritrocito bovino a Ia concentración de 5 micromolar en tampón Tris 0,1 mM y pH 8. Se añadieron alícuotas de los compuestos objeto de Ia invención, Ejemplos 1.1 a 1.9, a una concentración final de 0,3 micromolar, y las soluciones se mantuvieron a temperatura ambiente durante 6 horas al menos. Tras este periodo de tiempo, se incubaron las muestras durante 15 minutos con propidio a una concentración final de 20 micromolar y se midió Ia fluorescencia en un lector de fluorescencia para microplacas (Fluostar óptima, BMG, Alemania) a las longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 620 nm respectivamente. Los resultados obtenidos, que a continuación se exponen, se expresan como porcentaje de Ia disminución de fluorescencia inducida por cada compuesto a Ia concentración indicada, y que fue Ia que dio lugar a Ia máxima disminución en cada caso. Como control positivo para comparación y evaluación de Ia bondad del método empleado se utilizó el compuesto BW284c51 (Sigma-Aldrich, España) a Ia concentración de 1 milimolar.

• Ejemplo 1.1 : 29,3% a 3 micromolar

• Ejemplo 1.2: 43,6% a 1 micromolar

• Ejemplo 1.3: 37,3% a 3 micromolar • Ejemplo 1.4: 39,7% a 3 micromolar

• Ejemplo 1.5: 23,4% a 3 micromolar

• Ejemplo 1.6: 37,4% a 0,3 micromolar

• Ejemplo 1.7: 42,2% a 0,3 micromolar

• Ejemplo 1.8: 15% a 3 micromolar

• Ejemplo 1.9: 11 ,3% a 0,3 micromolar • BW284c51 : 24,5% a 1 milimolar

Los datos obtenidos muestran que los compuestos objeto de esta patente son capaces de unirse al sitio periférico de Ia enzima acetilcolinesterasa, Io que los convierte en potenciales fármacos con efecto antiagregante del péptido beta amiloide.

Ejemplo 5.- Capacidad de penetración en el sistema nervioso central.

Teniendo en cuenta el papel central que juega el cerebro en el organismo, cabe esperar que Ia propia evolución Io haya protegido de forma especial. En efecto todo el sistema nervioso central, pero en particular el cerebro, aparece como un órgano blindado, un sistema aparte dentro del conjunto del organismo, separado por una membrana de características especiales llamada barrera hematoencefálica (BHE en Io sucesivo) que selecciona el paso de determinadas moléculas en ambos sentidos. Es decir, de nada sirve obtener un producto que muestre una alta actividad in vitro, con un gran potencial para el tratamiento de, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas si in vivo no es capaz de alcanzar su diana terapéutica. Resulta entonces de gran importancia conocer si Ia molécula o familia de moléculas objeto de una investigación del tipo de Ia que se presenta en esta patente son capaces de atravesar Ia BHE antes de alcanzar fases posteriores del desarrollo del potencial fármaco, en orden a introducir nuevas modificaciones en Ia molécula o, incluso, detener Ia línea de investigación si se confirma Ia incapacidad de los productos para penetrar en el sistema nervioso central a través de Ia BHE, con el consiguiente ahorro de unas inversiones cada vez mas elevadas.

Existen algunos métodos in vitro para evaluar dicha capacidad de penetración, siendo Ia llamada metodología PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeation Assay, descrita en Eur. J. Med. Chem. 2003, 38, 223-232) Ia mas empleada debido a Ia máxima precisión y verosimilitud que ofrecen sus resultados. En el caso de los productos objeto de esta invención, se eligieron tres compuestos representativos de esta familia de compuestos y se estudió su capacidad de atravesar Ia BHE utilizando dicha metodología PAMPA en Ia forma que se describe a continuación. Los experimentos se realizaron empleando dos microplacas de 96 pocilios en un montaje tipo sandwich. La microplaca superior (Millipore Ref. MAIPS4510) está provista de 96 filtros hidrófobos de PVDF, donde se deposita una disolución de extracto lipídico de cerebro de cerdo (Avanti Polar Lipids) en dodecano. La microplaca inferior posee 96 pocilios con forma de lágrima (Millipore Ref. MAMCS9610). La microplaca receptora se rellenó con 180 μL por pocilio de una mezcla compuesta por buffer fosfato salino de pH 7.4 (PBS) y EtOH en proporción 90:10. El filtro de Ia placa donadora se cubrió con 4 μL de una disolución del extracto lipídico de cerebro de cerdo en dodecano (20 mg mL ^"1 ). A continuación, se añadieron 180 μL de una disolución PBS:EtOH (90:10) de los compuestos a evaluar sobre Ia microplaca donadora, que se situó de forma cuidadosa sobre Ia placa receptora. Después de 120 minutos de incubación a 25 ⁰ C Ia placa donadora se separó cuidadosamente y se determinó Ia concentración de los compuestos en Ia placa receptora mediante espectroscopia UV. El método mide Ia permeabilidad, expresando como tal Ia velocidad de paso de una barrera de un grosor dado en millonésimas de centímetro (cm x 10 ^~6 ) por segundo. Los resultados se expresan como el valor medio mas/menos Ia desviación estándar de tres ensayos independientes conteniendo cada uno de ellos cuatro repeticiones de cada compuesto a analizar. Previamente, el método fue validado con Ia evaluación de 15 fármacos comerciales: testosterona, verapamilo, imipramina, desipramina, progesterona, promazina,

clorpromazina, clonidina, piroxicam, cafeína, aldosterona, lomefloxazina, enoxazina, atenolol y ofloxazina, que ofrecieron valores comprendidos entre 9,7±0,1 (testosterona) y 0,7±0,01 (ofloxazina), coherentes con los valores de permeabilidad descritos para dichos compuestos. Los resultados obtenidos fueron:

Permeabilidad ⁸ Clasificación ¹³

Ejemplo 1.2 4,4 ± 0,1 SNC +

Ejemplo 1.6 3,2 ± 0,01 SNC +

Ejemplo 1.8 5,3 ± 0,01 SCN +

^a Permeabilidad experimental, expresada en paso del producto por una membrana de un grosor dado en millonésimas de centímetro (cm x 10 ^~6 ) por segundo, siguiendo el método descrito en Eur. J. Med. Chem. 2003, 38, 223-232. ^b SNC+ significa que penetra en el SNC y SNC- significa que no penetra en el SNC.

La conclusión que se extrae de estos resultados es que los productos objeto de Ia presente invención, al ser capaces de atravesar Ia barrera hematoencefálica, son también capaces de alcanzar sus dianas terapéuticas en el cerebro, una condición casi imprescindible para formar parte de fármacos útiles para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso en general y neurodegenerativas en particular, tales como Ia enfermedad de Alzheimer.