[0001] La présente invention concerne le domaine des formulations ostéogéniques et plus particulièrement des formulations des protéines ostéogéniques appartenant à la famille des Bone Morphogenetic Proteins, BMPs.

[0002] Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes d'ostéoinduction. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965; 150, 893).

[0003] Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139 résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent 6 résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant un « cystéine knot » (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ; Schlunegger MP,J. Mol. Biol. 1993; 231, 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à l'origine de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287: 103.).

[0004] Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire en hétérodimères comme cela a été décrit par Israël et al. (Israël DI, Growth Factors. 1996; 13(3-4), 291). Les BMPs dimériques interagissent avec les récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de signalisation intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à l'activation ou à la répression des gènes cibles.

[0005] Les BMPs, à l'exception des BMP 1 et 3, jouent un rôle direct et indirect sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A 1544-1552). Elles possèdent en outre des propriétés de chimiotactisme et induisent la prolifération, la différentiation et l'angiogénèse.

[0006] Certaines BMPs recombinantes humaines et notamment la rhBMP-2 et la rhBMP-7 ont clairement montré une capacité à induire la formation d'os in vivo chez l'homme et ont été approuvées pour certaines applications médicales. Ainsi, la BMP-2 recombinante humaine, dibotermine alfa selon la dénomination commune internationale, est formulée dans les produits commercialisés sous le nom de InFUSE® aux Etats-Unis et de InductOs® en Europe. Ce produit est prescrit dans la fusion des vertèbres lombaires et la régénération osseuse du tibia pour les fractures dites non-union. Dans le cas d'InFUSE® pour la fusion des vertèbres lombaires, l'intervention chirurgicale consiste tout d'abord, à imbiber une éponge de collagène avec une solution de rhBMP-2, puis à placer l'éponge dans une cage creuse, LT Cage, préalablement implantée entre les vertèbres.

[0007] La BMP-7 recombinante humaine, eptotermine alpha selon la dénomination commune internationale, a les mêmes indications thérapeutiques que la BMP-2 et constitue la base de deux produits : OP-I Implant pour les fractures ouvertes du tibia et OP-I Putty pour la fusion des vertèbres lombaires. OP- 1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-I Putty se présente sous la forme de deux poudres : l'une contenant la rhBMP-7 et du collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une intervention chirurgicale, la CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et mélangée avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le site à traiter.

[0008] , L'administration des protéines ostéogéniques est un problème majeur en raison de leur instabilité et de la nécessité qui apparaît d'obtenir des formulations ostéogéniques contenant une quantité minimale de protéine ostéogénique. Ceci afin d'éviter les effets secondaires générés par des concentrations importantes de ces protéines et également en raison du prix de ces protéines. [0009] De nombreuses formulations ont été et sont développées comme par exemple celles citées dans la revue de Seeherman (Seeherman, H. et al., Spine 2002, 27 (16 Suppl 1), S16-S23.), dans laquelle l'importance de la nature du système de délivrance est soulignée.

[00010] Les systèmes de délivrance utilisés doivent permettre d'augmenter le temps de rétention des protéines au site d'administration, d'obtenir une libération totale de la quantité de protéine mise en œuvre et d'éviter une libération trop brutale pouvant entraîner une diffusion hors du site d'administration. [00011] Le système de délivrance utilisé doit également pouvoir servir de matrice à la croissance osseuse sur le site à traiter tout en permettant de circonscrire cette croissance osseuse sur le site à traiter. [00012] Quatre types de matériaux sont employés dans les systèmes de délivrance à ce jour, les polymères naturels, les polymères synthétiques, les matériaux inorganiques et les mélanges de ces matériaux. [00013] Aucun des systèmes développés n'a néanmoins permis de réduire significativement la dose de BMP. Cela est lié entre autres, soit à l'instabilité de la protéine dans la formulation, soit à la mauvaise biodisponibilité de celle-ci en raison de la structure du support. [00014] S'agissant des polymères naturels le collagène, les hyaluronanes, la fibrine, les chitosans, les alginates et d'autres polysaccharides naturels sont utilisés.

[00015] Si les éponges à base de collagène recombinant permettent d'éïiminer la plupart des inconvénients connus de ce polymère naturel, l'introduction dans les éponges de la protéine ostéogénique n'est pas à ce jour satisfaisante.

[00016] Les autres polysaccharides naturels sous forme d'hydrogels présentent essentiellement le défaut d'être trop rapidement résorbés, sauf à être préalablement réticulés sous forme de gels, ce qui conduit aux mêmes inconvénients que ceux précités pour les éponges de collagène. [00017] S'agissant des polymères synthétiques, les plus couramment utilisés sont des polymères de poly(α-hydroxyacides) comme le polylactide (PLA), le polyglycolide (PLG) et leurs copolymères (PLGA).

[00018] Les inconvénients majeurs de ces polymères sont les abaissements de pH dus à leur dégradation et les réactions inflammatoires qu'ils peuvent induire. [00019] S'agissant des matériaux inorganiques, des systèmes de délivrance combinant des phosphates de calcium avec une protéine ostéoinductrice ont été développés.

[00020] Parmi ceux-ci, on citera les céramiques à base de phosphate de calcium, comme l'hydroxyapatite (HAP) et le phosphate tricalcique (TCP) et les phosphates de calcium « non-céramiques », comme les ciments à base de phosphates de calcium (CPCs).

[00021] II est connu depuis les années 1970 que les céramiques de phosphate de calcium peuvent avoir un intérêt pour la reconstruction osseuse comme cela est rappelé dans la revue de M. Bohner (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl 4, 37- 47.).

[00022] Mais il est admis que la dose de BMP-2 efficace est plus importante dans une céramique que dans une éponge de collagène. Une étude clinique de fusion postérolatérale chez l'homme (Boden, S. D. et al., Spine 2002, 27 (23), 2662-2673.) rapporte que la dose de BMP-2 (40 mg) est plus importante avec des granules de BCP (60 % HAP et 40 % TCP) produit développé par la société

MEDTRONIC SOFAMOR, que dans une éponge de collagène qui ne contient pas de phosphate de calcium (12 mg). [00023] Afin de pallier cet inconvénient, un très grand nombre de systèmes ont été développés à base de phosphate de calcium non-céramique et parmi ceux-ci figurent les ciments de phosphate de calcium. Les ciments ont été découverts dans les années 1980 par Brown et Chow et répondent à la définition suivante : « Les ciments de phosphate de calcium sont constitués d'une solution aqueuse et de un ou plusieurs phosphates de calcium. Lorsque le mélange est effectué, le(s) phosphate(s) de calcium se dissolve(nt) et précipite(nt) en un sel de phosphate de calcium moins soluble. Au cours de la précipitation, les cristaux de phosphate de calcium grossissent et s'enchevêtrent, ce qui conduit à la rigidité mécanique du ciment. » (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl 4, 37-47.).

[00024] Un article de Kim (Kim, H. D. et al., Methods Mol Biol 2004, 238, 49- 64.) décrit l'emploi d'un ciment développé par la société Etex, l'aplha-BSM, avec de la BMP-2. Ce nouveau produit conduit bien à une acivité ostéoinductrice de la matrice. [00025] Cependant, la BMP-2 introduite dans cette matrice perd une partie importante de son activité ce qui conduit à devoir augmenter la quantité de BMP-2 embarquée. Ainsi une dose de 40 μg de BMP-2 est employée dans le modèle de la formation d'os ectopique chez le rat au lieu des 20 μg de BMP-2 employés dans une éponge de collagène. [00026] En effet, les ciments présentent deux inconvénients. Tout d'abord, le ou les phosphates de calcium qui en sont les précurseurs doivent être synthétisés au préalable dans des conditions incompatibles avec des protéines. Ainsi dans le brevet US 5650176 sont décrites les conditions réactionnelles nécessaires pour la préparation du phosphate de calcium amorphe qui est un des composés de l'alpha-BSM. Ces conditions sont incompatibles avec les protéines car une quantité très importante de soude est employée. De plus, ces produits nécessitent une purification poussée puisque des composés toxiques tels que le calcium nitrate sont utilisés. [00027] D'autres exemples de ciments tels que ceux décrits par la société Graftys dans le brevet EP1891984A1 sont obtenus dans des conditions incompatibles avec les protéines puisque du dichlorométhane est employé lors de la synthèse du phosphate de calcium. Les ciments décrits par la société Lisopharm dans le brevet US2009/0155320 sont obtenus en présence d'hydroxide de calcium ce qui est également incompatible avec les protéines. [00028] De plus, d'une façon générale, la formation de ciment s'obtient en faisant réagir un sel de phosphate de calcium soluble avec un sel de phosphate de calcium solide traité à plus de 400 ⁰ C afin de rendre celui-ci réactif. La réaction entre ces deux composés est incontrôlée, la plupart du temps exothermique et conduit à un ciment à structure monolithique qui séquestre dans sa masse la protéine.

[00029] Dans le brevet US563461 il est mentionné la présence de « lacunes réactives » dans le solide sans que l'on sache si cela est néfaste à la stabilité chimique de la BMP-2.

[00030] Afin de réduire les pertes de protéine dans la masse de solide formé, il a été décrit dans le brevet US5650176 qu'il est avantageux d'ajouter au mélange réactif des composés effervescents susceptibles de réduire le caractère « monolithique » du ciment. [00031] Malgré ces améliorations, force est de constater que les quantités en protéine nécessaires pour obtenir une formation d'os dans le modèle de rat ectopique, restent importantes.

[00032] S'agissant des systèmes mixtes, ceux-ci n'ont pas permis à ce jour de résoudre les problèmes ci-dessus évoqués. [00033] En résumé, les systèmes décrits dans l'art antérieur concernant l'emploi de polymères synthétiques, des polymères naturels ou encore des matériaux inorganiques tels que les céramiques ou les ciments de phosphates de calcium ne permettent pas de répondre complètement au cahier des charges imposé pour les applications de la réparation osseuse. [00034] II est du mérite de la demanderesse d'avoir développé une approche originale qui consiste à mettre en présence la protéine ostéogénique avec des sels solubles de calcium et des sels solubles de phosphate qui permettent de répondre au cahier des charges imposé pour les applications de la réparation osseuse. [00035] Cette approche originale permet d'une part de précipiter la protéine, en évitant toute dégradation chimique au contact des réactifs présents, et d'autre part de la co-précipiter avec un sel insoluble de calcium, de préférence le phosphate de calcium, ledit coprécipité étant sous forme divisée, ce qui limite très nettement les pertes dans la masse de solide telles que constatées avec les ciments. [00036] Ainsi, la demanderesse a mis au point de nouvelles compositions ostéogéniques composées d'un coprécipitat qui contient au moins un sel insoluble de calcium et au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide, ledit coprécipitat étant sous forme divisée. [00037] La conjonction de ces deux événements permet d'obtenir des formulations très ostéogéniques contenant des quantités beaucoup plus faibles de protéine. [00038] Ces nouvelles compositions présentent ainsi l'avantage de contenir de plus faibles quantités de protéines qui est l'objectif majeur ceci afin de réduire les effets secondaires après administration chez les patients.

[00039] De plus, elles permettent de réduire les coûts des traitements en réduisant la quantité de protéine car ces protéines sont très chères.

[00040] On connaît au nom de la demanderesse les demandes provisoires numéros 61/129023 et 61/129617 dont les entiers contenus sont incorporés dans la présente par référence qui décrivent et revendiquent des compositions ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, un sel soluble de cation divalent et une matrice.

[00041] On connaît au nom de la demanderesse les demandes provisoires numéros 61/129011 et 61/129618 dont les entiers contenus sont incorporés dans la présente par référence qui décrivent et revendiquent des compositions ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, au moins une protéine angiogénique, un sel soluble de cation divalent, éventuellement un polysaccharide anionique et éventuellement une matrice.

[00042] On connaît au nom de la demanderesse les demandes provisoires numéros 61/129616 et 61/129012 dont les entiers contenus sont incorporés dans la présente par référence qui décrivent et revendiquent des compositions ostéogéniques comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique /polysaccharide anionique un sel soluble de cation au moins divalent et une matrice.

[00043] On connait au nom de la demanderesse la demande provisoire numéro US61/193216 dont l'entier contenu est incorporé dans la présente par référence qui décrit et revendique des compositions ostéogéniques comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique/polysaccharide anionique, un sel soluble de cation au moins divalent et un polymère formant un hydrogel. [00044] On connait au nom de la demanderesse la demande provisoire numéro US61/193217 déposée le 6 novembre 2008 dont l'entier contenu est incorporé dans la présente par référence qui décrit et revendique des compositions ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, un sel soluble de cation au moins divalent et un polymère formant un hydrogel. [00045] S'agissant de la présente invention, la demanderesse a également mis au point le procédé de préparation du coprécipitat, sous forme divisée, contenant au moins un sel insoluble de calcium et au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide.

[00046] L'invention concerne également les formulations, les produits pharmaceutiques et les dispositifs médicaux comprenant ledit coprécipitat. [00047] Les compositions et les kits permettant de mettre en œuvre ce procédé et d'obtenir le coprécipitat sont également des inventions ci-après décrites.

[00048] La coprécipitation est obtenue par :

[00049] - la précipitation du complexe entre le polymère anionique et la protéine ostéogénique par addition de la solution de sel d'ions calcium,

[00050] - la précipitation des ions calcium par l'addition d'une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium à un pH déterminé.

[00051] Dans un mode de réalisation, le coprécipitat résulte de précipitations simultanées.

[00052] Dans un mode de réalisation, le coprécipitat résulte de précipitations séquentielles.

[00053] Le complexe entre le polymère anionique et la protéine ostéogénique étant obtenu par addition de la solution de polysaccharide anionique à la solution de protéine ostéogénique.

[00054] Dans un mode de réalisation, la précipitation du sel de calcium est effectuée sous forme de phosphate de calcium, par addition d'une solution de phosphate soluble.

[00055] La nature et la forme du coprécipitat peuvent varier en fonction du pH des solutions mises en présence car les sels de phosphates de calcium présentent différentes phases solides en fonction du pH et en fonction du polysaccharide anionique et de la protéine constituant le complexe.

[00056] L'invention concerne un coprécipitat consistant en au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide sous sa forme insolubilisée et au moins un sel de calcium insoluble, ledit coprécipitat étant sous forme divisée.

[00057] Dans un mode de réalisation, il comprend en outre au moins un facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique.

[00058] Dans un mode de réalisation, le sel de calcium insoluble est choisi dans le groupe consitué par les orthophosphates de calcium sous forme anhydre ou hydratée seuls ou en mélange.

[00059] Dans un mode de réalisation, le coprécipitat comprend en outre au moins un sel de calcium insoluble choisi dans le groupe constitué par l'oxalate de calcium, l'ascorbate de calcium, le carbonate de calcium ou le sulfate de calcium. [00060] Lesdits sels de calcium insolubles peuvent être des sels mixtes formés entre les ions calcium cationiques et les ions anioniques tels que les phosphates, mono, di ou tribasiques, les carboxylates des polysaccharides, les carbonates, les hydroxydes et les éventuels anions portés par les bases. [00061] Les orthophosphates de calcium sont des sels qui résultent de la neutralisation des différentes acidités de l'acide phosphorique par les sels de calcium et selon la littérature les pKa varient de 2,12 à 12,67 à 25°C.

[00062] Les principaux orthophosphates de calcium insolubles sont les phosphates dicalciques, DCP, anhydre ou dihydraté, les phosphates octacalciques,

OCP, les phosphates tricalciques, TCP, les hydroxyapatites phosphacalciques, HAP ou PCA, et le phosphate tétracalcique, TTCP.

[00063] Les complexes polymère anionique/protéine ostéogénique consistent en les complexes décrits dans la demande PCT/EP2008/059832 au nom de la demanderesse.

[00064] Ils sont insolubilisés par addition d'un sel de calcium soluble tel que décrit dans les demandes FR 08 54621 et 61/129616 .

[00065] Cette coprécipitation en fonction de l'effet recherché est effectuée éventuellement en présence d'une base permettant d'ajuster le pH à une valeur prédéterminée.

[00066] Elle permet d'obtenir une composition chimique solide, à l'état divisé, qui permet notamment de contrôler la délivrance de la protéine ostéogénique contenue dans la composition.

[00067] Cette composition chimique solide, à l'état divisé, est obtenue spontanément dans des conditions de température ambiante, et son état divisé est stable en conditions physiologiques in vitro.

[00068] Dans un mode de réalisation, l'invention consiste en un kit pour la préparation d'un implant ostéogénique comprenant au moins : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium,

[00069] Dans un mode de réalisation, le kit comprend en outre, une composition supplémentaire comprenant au moins une base.

[00070] Dans un mode de réalisation, une deuxième base peut être additionnée aux compositions b, c ou d.

[00071] Certaines de ces compositions sont susceptibles d'être réunies avant la formation du coprécipitat afin de diminuer le nombre de flacons. [00072] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant la protéine ostéogénique peut comprendre également le polysaccharide pour former le complexe. [00073] La composition comprenant la protéine ostéogénique ou la composition comprenant le complexe peut également comprendre le sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base. [00074] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant le polysaccharide peut comprendre également le sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.

[00075] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant le sel de calcium soluble peut comprendre également une base. [00076] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins une base.

[00077] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition d peut être additionnée aux compositions b et c.

[00078] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium.

[00079] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition c peut être additionnée aux compositions b et d.

[00080] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins une base, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium.

[00081] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition b peut être additionnée aux compositions c et d. [00082] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins une base.

[00083] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition d peut être additionnée aux compositions b et c.

[00084] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base.

[00085] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition d peut être additionnée aux compositions b et c. [00086] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins une base.

[00087] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition d peut être additionnée aux compositions b et c. [00088] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique, au moins une base et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble.

[00089] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, c - une composition comprenant au moins une base.

[00090] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition c peut être additionnée aux autres compositions.

[00091] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base.

[00092] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition c peut être additionnée à la composition b. [00093] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble. [00094] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base, c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium.

[00095] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition b peut être additionnée aux autres compositions.

[00096] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium. [00097] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base. [00098] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition c peut être additionnée aux autres compositions. [00099] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble. [000100] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base. [000101] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble. [000102] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base.

[000103] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant au moins une protéine ostéogénique comprend en outre au moins un facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique, [000104] Dans un mode de réalisation, le kit, comprend en outre au moins une matrice organique ou une matrice minérale ou une matrice mixte. [000105] Dans un mode de réalisation, les compositions constituant le kit sont des solutions aqueuses. [000106] Dans un mode de réalisation, les compositions constituant le kit sont des lyophilisats.

[000107] Dans un mode de réalisation, certaines des compositions constituant le kit sont des lyophilisats. [000108] Dans ce mode de réalisation, les lyophilisats sont réhydratés avant réaction, par de l'eau ou une des autres compositions en solution.

[000109] Ainsi par exemple, la composition comprenant la protéine ostéogénique sous forme de lyophilisât peut être réhydratée avec la solution comprenant un polysaccharide anionique, ou avec la solution comprenant un polysaccharide anionique et un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.

[000110] Dans un mode de réalisation, les formulations, les dispositifs médicaux et produits pharmaceutiques comprenant ledit précipitât sont des suspensions aqueuses.

[000111] Dans un mode de réalisation, les formulations et produits pharmaceutiques comprenant ledit précipitât sont des lyophilisats.

[000112] Dans ce mode de réalisation, les lyophilisats sont réhydratés avant emploi, au moyen de sérum physiologique ou de sang.

[000113] On entend par protéine ostéogénique un facteur de croissance ostéogéniques ou BMP seuls ou en combinaison avec une BMP choisie dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives.

[000114] Plus particulièrement les protéines ostéogéniques sont choisies dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison. [000115] Les BMPs utilisées sont des BMPs recombinantes humaines, obtenues selon les techniques connues de l'homme de l'art ou achetées auprès de fournisseurs comme par exemple la société Research Diagnostic Inc. (USA). [000116] On entend par facteur de croissance ayant un pouvoir chémo- attractant et angiogénique des protéines telles que les PDGF, notamment le PDGF- BB, les VEGF ou les FGF, notamment le FGF-2. [000117] Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le PDGF.

[000118] Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins de la

BMP-2 et du PDGF-BB. [000119] Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins de la

BMP-7 et du PDGF-BB.

[000120] Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins du

GDF-5 et du PDGF-BB.

[000121] Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7

(Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le VEGF.

[000122] Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7

(Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le FGF.

[000123] Le sel soluble de calcium est un sel de calcium dont l'anion est choisi dans le groupe constitué par le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le

D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate ou l'aspartate.

[000124] Dans un mode de réalisation, le sel soluble de calcium est du chlorure de calcium.

[000125] On entend par sel soluble d'un anion susceptible de former un précipité avec l'ion calcium un sel soluble dont l'anion est choisi dans le groupe constitué des anions phosphates comprenant l'ion phosphate PO ₄ ^3" l'ion hydrogénophosphate HPO ₄ ^2" et l'ion dihydrogénophosphate H ₂ PO ^4" .

[000126] Dans un mode de réalisation, un deuxième anion choisi dans le groupe constitué par les anions oxalate, ascorbate, carbonate ou sulfate est en outre ajouté à la composition comprenant un anion phosphate.

[000127] Les sels solubles d'un anion susceptibles de former un précipité avec l'ion calcium sont choisis dans le groupe constitué par les phosphates de sodium, d'oxalate de sodium, l'ascorbate de sodium, le carbonate de sodium, le sulfate de sodium et l'hydrogénocarbonate de sodium. [000128] On entend par polysaccharide anionique un polysaccharide choisi dans le groupe des polysaccharides fonctionnalisés par des dérivés hydrophobes.

[000129] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe des dérivés de polysaccharides, comportant majoritairement des liaisons glycosidiques de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2), fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane tels que décrits dans la demande FR08/55567. [000130] Ces polysaccharides sont constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2). Ils peuvent être neutres, c'est-à-dire ne pas être porteur de fonctions acides ou anioniques et porteurs de fonctions acides.

[000131] Ils sont fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane, noté Trp : ledit dérivé du tryptophane étant greffé ou lié aux polysaccharides par couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide pouvant être une fonction acide d'un polysaccharide anionique et/ou une fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, - F étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,

R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N et/ou S, et ayant au moins une fonction acide, [000132] Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique.

[000133] Selon l'invention, le polysaccharide comportant majoritairement des liaisons glycosidiques de type (1,4), (1,3) et/ou (1,2), fonctionnalisé par au moins un dérivé du tryptophane peut répondre à la formule générale I suivante :

Polysaccharide

F

[ Trp 1 R [ Trp ] n i

Formule I le polysaccharide étant constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2), • F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,

• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide

• Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du dérivé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique. n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. - i représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et

1, - (i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2, lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ou K. - lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na ⁺ ou K ⁺ , lesdits polysaccharides étant amphiphiles à pH neutre. [000134] Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.

[000135] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).

[000136] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe constitué par le pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau. [000137] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un pullulane.

[000138] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un alginate.

[000139] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un hyaluronane.

[000140] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane. [000141] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un galacturonane.

[000142] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une cellulose soluble dans l'eau.

[000143] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3). [000144] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdlane.

[000145] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).

[000146] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline.

[000147] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3).

[000148] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane. [000149] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2).

[000150] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le mannane.

[000151] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :

ou leurs sels de cations alcalins.

[000152] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.

[000153] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi parmi les esters du tryptophane de formule II.

Formule II [000154] E étant un groupement pouvant être :

- un alkyle linéaire ou ramifié en Cl à C8. un alkylaryle ou un arylalkyle linéaire ou ramifié en C6 à C20. [000155] Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.

[000156] Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.

[000157] Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.

[000158] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe des dextranes fonctionnalisés avec des acides aminés hydrophobes tels que le tryptophane et les dérivés du tryptophane tels que décrits dans la demande FR 07/02316.

[000159] Selon l'invention, le dextrane fonctionnalisé peut répondre à la formule générale III suivante :

Dextran

Formule III

R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide

F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé, • AA étant un reste amino-acide hydrophobe, L ou D, produit du couplage entre l'aminé de l'amino-acide et un acide porté par le groupement R. t représente la fraction molaire de substituant F-R-[AA]n par unité glycosidique et est comprise entre 0,1 et 2, p représente la fraction molaire des R substitués par AA et est comprise entre 0,05 et 1, et, lorsque R n'est pas substitué par AA, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+, K+, ledit dextrane étant amphiphile à pH neutre.

[000160] Dans un mode de réalisation, le cation alcalin est Na+.

[000161] Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.

[000162] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est un carboxymethyl dextrane de formule IV.

Formule IV ou l'acide correspondant.

[000163] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est un ester monosuccinique de dextrane de formule V :

Formule V ou l'acide correspondant.

[000164] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :

ou leurs sels de cations alcalins.

[000165] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est choisi parmi les dérivés du tryptophane, tels que le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2- indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.

[000166] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est caractérisé en ce que les dérivés du tryptophane sont choisis parmi les esters du tryptophane de formule II tels que définis précédemment. [000167] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est un ca :

Formule VI [000168] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est un ester monosuccinique de dextrane modifié par le tryptophane de formule VII :

Formule VII

[000169] Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est choisi parmi la phenylalanine, la leucine, l'isoleucine et la valine et leurs dérivés alcool, amide ou décarboxylés. [000170] Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est caractérisé en ce que les dérivés de la phenylalanine, de la leucine, de l'isoleucine et de la valine sont choisis parmi les esters de ces acides aminés de formule VIII.

Formules VIII

E étant défini comme précédemment. [000171] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est la phénylalanine, et ses dérivés alcool, amide ou décarboxylés.

[000172] Le dextrane peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.

[000173] Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.

[000174] Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500. [000175] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles tels que ceux décrits dans la demande FR 08/05506 dont au moins un est substitué par un dérivé d'alcool hydrophobe, noté Ah : ledit alcool hydrophobe (Ah) étant greffé ou lié au polysaccharide anionique par un bras de couplage R, ledit bras de couplage étant lié au polysaccharide anionique par une fonction F' ladite fonction F' résultant du couplage entre la fonction aminé du bras de liaison R et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique, et ledit bras de couplage étant lié à l'alcool hydrophobe par une fonction G résultant du couplage entre une fonction carboxyle, isocyanate, thioacide ou alcool du bras de couplage et une fonction de l'alcool hydrophobe, les fonctions carboxyles du polysaccharide anionique non substituées étant sous forme de carboxylate de cation, alcalin de préférence comme Na ⁺ ou K ⁺ .

• F' étant une fonction amide, « G étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate,

• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,

Ah étant un reste d'un alcool hydrophobe, produit du couplage entre la fonction hydroxyle de l'alcool hydrophobe et au moins une fonction électrophile portée par le groupement R, ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre. [000176] Le polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles en partie substitués par des alcools hydrophobes est choisi parmi les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles de formule générale IX :

Polysaccharide + carboxyle

F ¹

I R

I G

Ah

" Formule IX

- dans laquelle, q représente la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est comprise entre 0,01 et 0,7,

- F', R, G et Ah répondant aux définitions données ci-dessus, et lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F'-R-G-Ah, alors la ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ⁺ ou K ⁺ . [000177] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides naturellement porteurs de groupes fonctionnels carboxyles et sont choisis dans le groupe constitué par l'alginate, le hyaluronane, le galacturonane.

[000178] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus à partir de polysaccharides comportant naturellement des groupes fonctionnels carboxyles ou à partir de polysaccharides neutres sur lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été greffées de formule générale X.

Polysaccharide

Q x

- les polysaccharides naturels étant choisis dans le groupe des polysaccharides constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) et/ou (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2), - L étant une liaison résultant du couplage entre le bras de liaison Q et une fonction -OH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate ou éther,

- r représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité saccharidique du polysaccharide,

- Q étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et comportant au moins un groupe fonctionnel carboxyle, - CO ₂ H [000179] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6).

[000180] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) est le dextrane.

[000181] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).

[000182] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe constitué par le pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau. [000183] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un pullulane.

[000184] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un alginate.

[000185] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un hyaluronane.

[000186] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane.

[000187] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un galacturonane. [000188] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une cellulose soluble dans l'eau.

[000189] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3).

[000190] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdlane.

[000191] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).

[000192] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline. [000193] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3)

[000194] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane. [000195] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2). [000196] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le mannane. [000197] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ts :

[000198] Dans un mode de réalisation, r est compris entre 0,1 et 2.

[000199] Dans un mode de réalisation, r est compris entre 0,2 et 1,5. [000200] Dans un mode de réalisation, le groupement R selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides aminés.

[000201] Dans un mode de réalisation, les acides aminés sont choisis parmi les alpha acides aminés.

[000202] Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés sont choisis parmi les alpha acides aminés naturels.

[000203] Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés naturels sont choisis parmi la leucine, l'alanine, l'iso-leucine, la glycine, la phénylalanine, le thryptophane, la valine.

[000204] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools gras.

[000205] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée comprenant de 4 à 18 carbones.

[000206] Dans un mode de réalisation, l'alcool gras est choisi parmi le méristyl, le cétyl, le stéaryl, le cétéaryl, le butyl, l'oléyl, la lanoline.

[000207] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les dérivés du cholestérol.

[000208] Dans un mode de réalisation, le dérivé du cholestérol est le cholestérol.

[000209] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe Ah est choisi parmi les tocophérols.

[000210] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'alpha tocophérol.

[000211] Dans un mode de réalisation, l'alpha tocophérol est le racémique de l'alpha tocophérol. [000212] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools porteurs de groupe aryle.

[000213] Dans un mode de réalisation, l'alcool porteur de groupe aryle est choisi parmi l'alcool benzylique, l'alcool phenéthylique. [000214] Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.

[000215] Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.

[000216] Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.

[000217] Dans un mode de réaliastion le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par le dextran fonctionnalisé par le tryptophane, le dextran fonctionnalisé par le phénylalaninate d'octanol, le dextran fonctionnalisé par le glycinate d'octanol, le dextran fonctionnalisé par le glycinate de dodécanol ou le dextran fonctionnalisé par l'ester éthylique du tryptophane.

[000218] Afin de neutraliser les composés acides présents dans le mélange, les bases sont choisies parmi les bases minérales ou organiques.

[000219] Parmi les bases minérales, on citera la soude, l'hydrogénocarbonate de sodium ou le carbonate de sodium.

[000220] Parmi les bases organiques, on citera les aminés et les acides aminés déprotonés.

[000221] Parmi les bases organiques, on citera l'imidazole et ses dérivés notamment l'histidine, la proline, l'éthanolamine ou la serine. [000222] Dans un mode de réalisation, une matrice organique peut être utilisée afin de favoriser la réparation, elle est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, stérilisé et réticulé.

[000223] Les polymères naturels comme le collagène sont des composants de la matrice extracellulaire qui favorisent l'attachement, la migration et la différentiation cellulaire. Ils présentent l'avantage d'être extrêmement biocompatibles et sont dégradés par des mécanismes de digestion enzymatique. Les matrices à base de collagène sont obtenues à partir de collagène fibrillaire de type I ou IV extraits à partir de tendon ou d'os de bœuf ou de porc. Ces collagènes sont d'abord purifiés avant d'être réticulés puis stérilisés. [000224] Elles peuvent également être obtenues par résorption en milieu acide d'os autologue, conduisant à la perte de la majorité des composants minéralisés mais à la préservation des protéines collagéniques on non-collagéniques, incluant les facteurs de croissance. Ces matrices déminéralisées peuvent également être préparées sous forme inactive après extraction avec des agents chaotropiques. Ces matrices sont essentiellement composées de collagène de Type I insoluble et réticulé.

[000225] Des matériaux mixtes peuvent également être utilisés, par exemple une matrice qui associe le collagène et des particules inorganiques. Ces matériaux qui peuvent se présenter sous la forme d'un matériau composite aux propriétés mécaniques renforcées ou encore sous la forme d'un « putty » ou la collagène joue un rôle de liant. [000226] Les matériaux inorganiques utilisables comprennent essentiellement des céramiques à base de phosphate de calcium telles que l'hydroxyapatite (HA), le phosphate de calcium tricalcique (TCP), le phosphate de calcium biphasique (BCP) ou le phosphate de calcium amorphe (ACP) qui présentent comme principal intérêt une composition chimique très proche de celle de l'os. Ces matériaux possèdent de bonnes propriétés mécaniques et sont immunologiquement inertes. Ces matériaux peuvent se présenter sous différentes formes comme des poudres, des granulats ou des blocs. Ces matériaux présentent des vitesses de dégradation très différentes en fonction de leurs compositions. Ainsi l'hydroxyapatite se dégrade très lentement (plusieurs mois) alors que le phosphate de calcium tricalcique se dégrade plus rapidement (plusieurs semaines). C'est dans ce but que les phosphates de calcium biphasiques ont été développés car ils présentent des vitesses de résorption intermédiaires. Ces matériaux inorganiques sont connus pour être principalement ostéoconducteurs.

[000227] Dans un mode de réalisation, la matrice organique est un hydrogel réticulé. [000228] Un hydrogel réticulé est obtenu par réticulation de chaînes de polymères. Les liaisons covalentes inter-chaînes définissant une matrice organique. Les polymères pouvant être employés pour la constitution d'une matrice organique sont décrits dans la revue de Hoffman intitulée Hydrogels for biomédical applications (Adv. Drug Deliv. Rev, 2002, 43, 3-12). [000229] Dans un mode de réalisation, l'implant peut comprendre un hydrogel non réticulé.

[000230] On entend par hydrogel non réticulé un réseau tri-dimensionel hydrophile de polymère capable d'adsorber une quantité importante d'eau ou de liquides biologiques (Peppas et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-46). Cet hydrogel est constitué d'interactions physiques et n'est donc pas obtenu par réticulation chimique des chaînes de polymère.

[000231] La liste des polymères formant des hydrogels est très large et une liste importante mais non exhaustive est donnée dans la revue de Hoffman intitulée Hydrogels for biomédical applications (Adv. Drug Deliv. Rev., 2002, 43, 3-12). Parmi ces polymères, on peut trouver des polymères synthétiques ainsi que des polymères naturels. Une autre revue couvrant les polysaccharides formant des hydrogels permet de choisir un polymère utile pour l'invention (Alhaique et al. J. Control. Release, 2007, 119, 5-24).

[000232] Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques.

[000233] Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, le pullulane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.

[000234] Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, la pectine, la cellulose et ses dérivés, le pullulane, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.

[000235] Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables. [000236] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé juste avant l'implantation ou l'injection.

[000237] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé et conservé dans une seringue pré-remplie afin d'être ensuite implanté ou injecté. [000238] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé par réhydratation d'un lyophilisât juste avant l'implantation ou l'injection, ou être implanté sous forme déshydraté.

[000239] Parmi les différentes matrices utilisables on citera à titre d'exemples les éponges de collagène comme Helistat ^® (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey), les DBM (Demineralized Bone Matrix) seules ou en mélange avec d'autres matériaux organiques comme des polysaccharides, du glycérol ou des gélatines comme Osteofil ^® (Medtronic), Allomatrix ^® (WRIGHT), Grafton ^® (Osteotech), DBX ^® (MTF/Synthes), Bioset ^® (Régénération Technologies), les matrices constituées de phases minérales comme Vitoss ^® (Orthivista), Osteoset ^® (Wright) ou les matrices mixtes comme MasterGraft ^® (Medtronic), Healos ^® (Depuy Spine)CopiOs ^®

(Zimmer), Sunnmax Collagen Bone Graft Matrix (Sunmax).

[000240] Le système après formation du coprécipitat est constitué de deux phases, une phase liquide et une phase solide. [000241] Dans la suite de l'exposé lorsque la notion de volume est employée, il s'agit du volume total comprenant les deux phases.

[000242] Les quantités par unité de volume dans le produit résultant après mélange des compositions des différentes formes du kit sont données ci-après et ne comprennent pas les quantités d'ions calcium ou d'ions phosphate provenant de la matrice lorsque des matrices minérales ou mixtes sont utilisées..

[000243] Dans un mode de réalisation, les quantités totales des différentes protéines par unité de volume sont comprises entre 0,01 mg et 2 mg, de préférence entre 0,05 mg et 1,5 mg, et encore de préférence entre 0,1 mg et 1,5 mg par ml de suspension obtenue. [000244] Les quantités totales de phosphates par unité de volume sont comprises entre 0,02 mmol à 0,5 mmol, de préférence entre 0,05 à 0,25 mmol par ml de suspension obtenue.

[000245] Les quantités totales de calcium par unité de volume sont comprises entre 0,01 mmol et 1 mmol, de préférence entre 0,05 et 1 mmol et encore de préférence entre 0,1 mmol et 0,5 mmol, par unité de volume.

[000246] Le pourcentage des ions calcium dans la phase solide est compris entre

60 et 95 % des ions calcium introduits.

[000247] Les quantités totales de polysaccharides par unité de volume sont comprises entre 1 et 100 mg, de préférence entre 2 et 40 mg par ml de suspension obtenue. Le pourcentage de polysaccharides dans la phase solide est supérieur à 80 % du polysaccharide introduit.

[000248] Les quantités de base mises en œuvre correspondent à environ 0,1 à 2 équivalents par rapport aux protons apportés par les ions phosphates.

[000249] En fonction des volumes mis en œuvre et du nombre de compositions, on peut déterminer par le calcul les quantités mises en œuvre dans les compositions de départ. Cela peut être réalisé pour les différents modes de réalisation des kits.

[000250] Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral, les doses de facteur de croissance ostéogénique seront comprises entre 0,01 mg et 20 mg, de préférence entre 0,05 mg et 8 mg de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg, alors que les doses couramment admises dans la littérature sont comprises entre 8 et 12 mg. [000251] Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral, les doses de facteur de croissance angiogénique seront comprises entre 0,05 mg et 8 mg, de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg. [000252] Dans un mode de réalisation, pour la formulation d'un implant comprenant le coprécipitat selon l'invention, on réalise un kit comprenant trois flacons, lesdits flacons contenant :

[000253] le premier entre 2 et 10 mg de protéine ostéogénique sous forme lyophilisée, [000254] le second entre 2 et 6 ml d'une solution d'un polysaccharide à une concentration comprise entre 10 et 50 mg/ml et d'un mélange équimolaire d'hydrogénophosphate de sodium Na ₂ HPO ₄ et de dihydrogénophosphate de sodium NaH ₂ PO ₄ de concentration comprise entre 0,15 et 0,50 M, [000255] le troisième entre 2 et 6 ml d'une solution de chlorure de calcium à une concentration comprise entre 0,25 et 0,90 M. [000256] Dans un mode de réalisation, le deuxième flacon contient en outre une solution de bicarbonate de sodium à une concentration comprise entre 0,05 et 0,8 M.

[000257] Dans un mode de réalisation, le deuxième et le troisième flacon contiennent en outre une solution d'histidine à une concentration comprise entre 0,02 et 0,2 M.

[000258] Dans un mode de réalisation, le troisième flacon contient en outre une solution de proline à une concentration comprise entre 0,05 et 0,3M. [000259] Les solutions sont additionnées simultanément ou successivement avant implantation sur une éponge de collagène d'un volume compris entre 15 et 30 ml.

[000260] Dans un mode de réalisation, pour la formulation d'un implant comprenant le coprécipitat selon l'invention on mélange trois solutions comprenant : [000261] la première d'un volume entre 1 et 3 ml contenant une protéine ostéogénique à une concentration comprise entre 0,33 et 2 mg/ml.

[000262] la seconde d'un volume entre 1 et 3 ml contenant un polysaccharide à une concentration comprise entre 5 et 15 mg/ml et un mélange équimolaire d'hydrogénophosphate de sodium Na ₂ HPO ₄ et de dihydrogénophosphate de sodium NaH ₂ PO ₄ de concentration comprise entre 0,05 et 0,15 M, [000263] la troisième d'un volume entre 1 et 3 ml contenant du chlorure de calcium à une concentration comprise ente 0,25 et 0,50 M. [000264] Dans un mode de réalisation, une solution de bicarbonate de sodium à une concentration comprise entre 0,20 et 0,4 M est additionnée au mélange obtenu.

[000265] Dans un mode de réalisation, une solution d'histidine à une concentration comprise entre 0,02 et 0,15 M est additionnée au mélange obtenu.

[000266] Dans un mode de réalisation, une solution de proline à une concentration comprise entre 0,05 et 0,3M est additionnée au mélange obtenu.

[000267] Le mélange comprenant le coprécipitat selon l'invention est ensuite lyophilisé. [000268] Au moment de la mise en œuvre celui-ci est réhydraté avec de l'eau injectable et/ou du sang à environ 35 % du volume initial.

[000269] L'invention concerne également l'utilisation des compositions de l'invention par implantation, par exemple, pour combler des défauts osseux, pour effectuer des fusions vertébrales ou des réparations maxillo-faciales ou pour le traitement des fractures osseuses en particulier du type pseudarthrose.

[000270] L'invention concerne également l'utilisation des compositions de l'invention par injection pour le traitement des défauts osseux, notamment ceux causés par l'ostéoporose et pour toute autre pathologie pouvant être traitée par voie percutanée. [000271] L'invention concerne également l'utilisation des compositions selon l'invention comme implant osseux.

[000272] Dans un mode de réalisation, les compositions pourront être utilisées en combinaison avec un dispositif prothétique du type prothèse vertébrale ou cage de fusion vertébrale. [000273] L'invention concerne également les méthodes thérapeutiques et chirurgicales utilisant les compositions dans la reconstruction osseuse.

[000274] Dans ces différentes utilisations thérapeutiques, la taille de la matrice et la quantité de facteur de croissance ostéogénique sont fonction du volume du site à traiter. [000275] Des exemples des différents modes de réalisation de l'invention sont donnés ci-après.

[000276] Des exemples de kits sont donnés à titre indicatif et non limitatif.

Exemple 1 : Préparation d'un kit contenant S flacons [000277] Kit 1 : Un kit de 5 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant une base lyophilisée ou en solution.

Exemple 2 : Préparation d'un kit contenant 4 flacons

[000278] Kit 2 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution.

Exemple 3 : Préparation d'un kit contenant 4 flacons [000279] Kit 3 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant une base lyophilisée ou en solution. Exemple 4 : Préparation d'un kit contenant 4 flacons

[000280] Kit 4 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution et un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution.

Exemple S : Préparation d'un kit contenant 4 flacons

[000281] Kit 5 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant le complexe entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant une base lyophilisée ou en solution.

Exemple 6 : Préparation d'un kit contenant 3 flacons

[000282] Kit 6 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère et un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution.

Exemple 7 ; Préparation d'un kit contenant 3 flacons

[000283] Kit 7 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère et un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution. Exemple 8 : Préparation d'un kit contenant 3 flacons

[000284] Kit 8 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant le complexe entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution.

Exemple 9 : Préparation d'un kit contenant 3 flacons

[000285] Kit 9 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant le complexe entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisés ou en solution.

Exemple 10 : Préparation d'un kit contenant 2 flacons [000286] Kit 10 : Un kit de 2 flacons comprend un flacon contenant le complexe entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé et un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution.

Exemple 11 : Préparation d'un kit contenant 2 flacons [000287] Kit 11 : Un kit de 2 flacons comprend un flacon contenant le complexe entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé et un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution.

[000288] Des exemples de synthèses de polymères sont donnés à titre indicatif et non limitatif.

Exemple 12 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le tryptophane

[000289] Le polymère 1 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par le tryptophane, soit t dans la formule III de la présente demande est de 1,03. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par le tryptophane, soit p dans la formule III de la présente demande est de 0,36.

Exemple 13 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le phénylalaninate d'octanol.

[000290] Le polymère 2 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester octanoique de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet PCT/IB2009007054. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester octanoique de la L-phénylalanine, soit r dans la formule X de la présente demande, est de 1,11. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester octanoique de la L-phénylalanine, soit q dans la formule IX de la présente demande est de 0,09. [000291] La solution de polymère 2 en fin de production est à 30,45 mg/mL.

Exemple 14 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le glycinate d'octanol [000292] Le polymère 3 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester octanoique de la L-glycine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR08.05506. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester octanoique de la L-glycine, soit r dans la formule X de la présente demande est de 1,09. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester octanoique de la L-glycine, soit q dans la formule IX de la présente demande est de 0,22.

Exemple IS : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le tryptophane [000293] Le polymère 4 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 70 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par le tryptophane, soit t dans la formule III de la présente demande est de 1,14. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par le tryptophane, soit p dans la formule III de la présente demande est de 0,41.

Exemple 16 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le phénylalaninate d'octanol [000294] Le polymère 5 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester octanoique de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR08.05506. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester octanoique de la L-phénylalanine, soit r dans la formule X de la présente demande, est de 1,12. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester octanoique de la L-phénylalanine, soit q dans la formule IX de la présente demande est de 0,22. Exemple 17 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le glycinate de dodécanol.

[000295] Le polymère 6 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester dodécanoique de la L-glycine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR08.05506. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester dodécanoique de la L-glycine, soit r dans la formule X de la présente demande est de 1,04. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester dodécanoique de la L-glycine, soit q dans la formule IX de la présente demande est de 0,13.

Exemple 18 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par l'ester éthylique du tryptophane [000296] Le polymère 7 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester éthylique du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester éthylique du tryptophane, soit t dans la formule III de la présente demande est de 1,09. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester éthylique du tryptophane, soit p dans la formule III de la présente demande est de 0,47.

Exemple 19 : Préparation d'une solution d'un dextran fonctionnalisé par le tryptophane [000297] Une solution concentrée de polymère 1 est préparée en solubilisant 9.13 g de lyophilisât de polymère 1 (teneur en eau d'environ 25%) dans 35,24 g d'eau. La solution est mise sous agitation pendant 30 minutes. La concentration en polymère 1 est de 162,9 mg/g déterminée par extrait sec. La densité est de 1.08. La concentration en polymère 1 est donc de 175,9 mg/mL.

Exemple 20 : Préparation d'une solution d'un dextran fonctionnalisé par le phénylalaninate d'octanol

[000298] Une solution de polymère 2 à 40 mg/g est préparée en solubilisant 3,12 g de lyophilisât de polymère 2 (teneur en eau de 14%) dans 64 g d'eau.

Exemple 21 : Préparation d'une solution d'un dextran fonctionnalisé par le glycinate d'octanol [000299] Une solution de polymère 3 à 38 mg/g est préparée en solubilisant

3,95 g de lyophilisât de polymère 3 (teneur en eau de 4%) dans 100 g d'eau. [000300] Des exemples de solution ou de lyophilisât de protéines ostéogéniques sont donnés à titre indicatif et non limitatif. Exemple 22 : Solution de rhBMP-2 en tampon HCI 1 mM

[000301] 10 ml_ d'une solution de rhBMP-2 à 0,15 mg/ml sont préparés par ajout de 10 ml_ d'une solution d'HCI 1 mM à 1,5 mg de rhBMP-2 lyophilisée. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 23 : Solution de rhBMP-2 en tampon InFUSE

[000302] 1 L de tampon InFUSE est préparé en solubilisant dans une fiole jaugée de 1 L remplie de 800 ml_ d'eau 5 g de sucrose, 25 g de glycine, 3,72 g d'acide glutamique, 0,11 g de chlorure de sodium et 0,11 g de polysorbate 80. Le pH de cette solution est ensuite ajusté à 4,5 par ajout de 16,8 mL de soude 1 N. La fiole jaugée est enfin remplie au trait pour obtenir le tampon InFUSE. 1 mL d'une solution de rhBMP-2 à 1,5 mg/ml dans le tampon InFUSE est préparé par ajout de 1 mL de tampon à 1,5 mg de rhBMP-2 lyophilisée. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm. [000303] Cette solution peut en outre être lyophilisée. Exemple 24 : Solution de rhBMP-7 en tampon HCI 10 mM

[000304] Une solution de rhBMP-7 à 3,8 mg/ml est préparée par ajout de 1 mL d'une solution d'HCI 1 mM à 3,8 mg de rhBMP-7 lyophilisée. Le pH de cette solution est de 2,2. Cette solution est laissée à incuber 15 minutes à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 25 : Solution de rhBMP-7 en tampon lactose 5% pH 3,5

[000305] Une solution de rhBMP-7 à 3,8 mg/ml est préparée par ajout de 7,8 mL d'une solution de lactose à 5% dont le pH a été fixé à 3,5 par ajout d'HCI 1 M à 30,3 mg de rhBMP-7 lyophilisée. Le pH de cette solution est de 3,5. Cette solution est laissée à incuber 15 minutes à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 26 : Solution de rhGDF-5 en tampon HCI 10 mM [000306] 1 mL d'une solution de rhGDF-5 à 1,5 mg/ml est préparé par ajout de 1 mL d'une solution d'HCI 10 mM à 1,5 mg de rhGDF-5 lyophilisé. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm. [000307] Des exemples de préparation de solutions de sels de phosphates solubles sont donnés à titre indicatif et non limitatif.

Exemple 27 : Solution de phosphate de sodium

[000308] Une solution de phosphate de sodium à 1 M est préparée en fiole jaugée à partir d'un mélange équimolaire d'hydrogénophosphate de sodium anhydre et de dihydrogénophosphate de sodium (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. [000309] Des solutions plus diluées de phosphate de sodium sont préparées à partir de la solution mère décrite ci-dessus.

[000310] Des exemples de préparation de solutions de sels de calcium solubles sont donnés à titre indicatif et non limitatif.

Exemple 28 : Solution de chlorure de calcium à 2 M

[000311] Solution 1 : Une solution de chlorure de calcium à 2 M est préparée en fiole jaugée à partir de chlorure de calcium anhydre ou dihydrate (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 29 : Solution de chlorure de calcium à 0,75 M [000312] Solution 2 : Une solution de chlorure de calcium à 0,75 M est préparée par dilution à partir de la solution de chlorure de calcium 2 M décrite dans l'exemple précédent. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 30 : Solution d'acétate de calcium à 0,75 M

[000313] Solution 3 : Une solution d'acétate de calcium à 0,75 M est préparée en fiole jaugée à partir d'acétate de calcium (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 31 : Solution de gluconate de calcium à 0,75 M

[000314] Solution 4 : Une solution de gluconate de calcium à 0,75 M est préparée en fiole jaugée à partir de gluconate de calcium (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

[000315] Des exemples de préparation de solutions de bases sont donnés à titre indicatif et non limitatif.

Exemple 32 : Solution d'histidine à 1 M [000316] Solution 5 : Une solution d'histidine à 1 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en solubilisant 155,2 g de L-histidine (Sigma) dans le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 33 : Solution de proline à 2 M [000317] Solution 6 : Une solution de proline à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 230,2 g de L-proline (Sigma), 200 ml_ de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 34 : Solution de serine à 2 M

[000318] Solution 7 : Une solution de serine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 210,2 g de L-serine (Sigma), 200 ml_ de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur

0,22 μm.

Exemple 35 ; Solution de glycine à 2 M

[000319] Solution 8 : Une solution de glycine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 150,1 g de L-glycine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur

0,22 μm.

Exemple 36 : Solution d'alanine à 2 M

[000320] Solution 9 : Une solution de alanine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 178,2 g de L-alanine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur

0,22 μm.

Exemple 37 : Solution de lysine à 2 M [000321] Solution 10 : Une solution de lysine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 292,4 g de L-lysine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur

0,22 μm. [000322] Des solutions de concentration plus faible de ces différentes bases sont obtenues par dilution soit avec de l'eau, soit avec une solution de sels de calcium décrites précédemment.

Exemple 38 : Solution d'hydrogénocarbonate de sodium

[000323] Une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M est préparée en fiole jaugée à partir d'hydrogénocarbonate de sodium anhydre (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

[000324] Des solutions plus diluées d'hydrogénocarbonate de sodium sont préparées à partir de la solution mère décrite ci-dessus. Exemple 39 : Solution de TRIS

[000325] Une solution de tris(hydroxymethyl)aminomethane à 0,5 M est préparée en fiole jaugée à partir de tris(hydroxymethyl)aminomethane ultrapure

(Sigma) et ajustée à pH 7,4 avec de l'acide chlorhydrique 1 M. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

[000326] Des exemples de préparation de solutions comprenant un polymère et un sel de phosphate soluble sont donnés à titre indicatif et non limitatif.

Exemple 40 : Solution comprenant le polymère 1 et du phosphate de sodium à pH 6.5

[000327] Solution 11 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL et du phosphate à 0,45 M est préparée par mélange de 8,6 mL de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/mL décrite dans l'Exemple 15, de 17 mL de la solution

1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et de 11,9 mL d'eau. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 41 : Solution comprenant le polymère 1 et du phosphate de sodium

[000328] Solution 12 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL et du phosphate de sodium à 0,23 M est préparée par mélange de 5,5 mL de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15, de 5,5 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et de 13,0 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 42 : Solution comprenant le polymère 2 et du phosphate de sodium à pH 6.5 [000329] Solution 13 : Une solution comprenant le polymère 2 à 20 mg/mL et du phosphate à 0,45 M est préparée par mélange de 10 mL de la solution de polymère 2 à 40 mg/g décrite dans l'Exemple 20, de 9 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et de 1 mL d'eau. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 43 : Solution comprenant le polymère 1, du phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate

[000330] Solution 14 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M est préparée par mélange de 5,5 mL de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15, de 5,5 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27, de 12,4 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 0,6 M obtenue par dilution de la solution mère décrite dans l'exemple 38 et de 0,6 ml_ d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 44 : Solution comprenant le polymère 1, du phosphate de sodium et de l'histidine [000331] Solution 15 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'histidine à 0,09 M est préparée par mélange de 5,5 ml_ de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15, de 5,5 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27, de 10,8 mL d'une solution d'histidine à 0,2 M obtenue par dilution de la solution mère décrite dans l'Exemple 32 et de 2,2 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 45 : Solution comprenant le polymère 2, du phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate [000332] Solution 16 : Une solution comprenant le polymère 2 à 10 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M est préparée par mélange de 3,45 mL de la solution de polymère 2 à 30,45 mg/mL décrite dans l'Exemple 13, de 2,0 mL de la solution 1,2 M de phosphate de sodium obtenue selon l'Exemple 27, de 2,7 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38 et de 2,4 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 46 : Solution comprenant le polymère S, du phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate [000333] Solution 17 : Une solution comprenant le polymère 5 à 20 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M est préparée par mélange de 1,3 mL de la solution de polymère 5 à 36,87 mg/mL décrite dans l'Exemple 16, de 0,45 mL de la solution 1,2 M de phosphate de sodium obtenue selon l'Exemple 27 et de 0,6 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 47 : Solution comprenant le polymère 6, du phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate [000334] Solution 18 : Une solution comprenant le polymère 6 à 20 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M est préparée par mélange de 1,0 mL de la solution de polymère 6 à 46,7 mg/mL décrite dans l'Exemple 17, de 0,45 mL de la solution 1,2 M de phosphate de sodium obtenue selon l'Exemple 27, de 0,6 ml_ d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38 et de 0,3 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 48 : Solution comprenant le polymère 7, du phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate

[000335] Solution 19 : Une solution comprenant le polymère 7 à 40 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M est préparée par mélange de 1,26 ml_ de la solution de polymère 7 à 75,9 mg/mL décrite dans l'Exemple 18, de 0,45 mL de la solution 1,2 M de phosphate de sodium obtenue selon l'Exemple 27, de 0,6 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38 et de 0,06 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

[000336] Des exemples de préparation de complexes entre des protéines ostéogéniques et des polymères sont donnés à titre indicatif et non limitatif.

Exemple 49 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1

[000337] Solution 20 : 22 μl d'une solution de rhBMP-2 à 1,46 mg/ml sont ajoutés à 267 μl d'une solution de polymère 1 à 60,0 mg/ml et à 351 μL d'eau stérile. Cette solution de rhBMP-2 et de polymère 1 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple SO : Préparation d'un complexe rhBMP-7/ Polymère 1

[000338] Solution 21 : 50 μl d'une solution de rhBMP-7 à 1,5 mg/ml est mélangé à 100 μl d'une solution de polymère 1 à 60,6 mg/ml. Cette solution de rhBMP-7 et de polymère 1 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple Sl : Préparation d'un complexe rhBMP-7/ Polymère 2

[000339] Solution 22 : 50 μl d'une solution de rhBMP-7 à 0,15 mg/ml est mélangé à 100 μl d'une solution de polymère 2 à 22,7 mg/ml. Cette solution de rhBMP-7 et de polymère 2 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 52 : Préparation d'un complexe rhGDF-S/ Polymère 2

[000340] Solution 23 : 50 μl d'une solution de rhGDF-5 à 1,5 mg/ml est mélangé à 100 μl d'une solution de polymère 2 à 22,7 mg/ml. Cette solution de rhGDF-5 et de polymère 2 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 53 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de phosphate de sodium

[000341] Solution 24 : 184,0 mg de lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFUSE contenant seulement 7,85 mg de rhBMP-2 sont repris par 19 ml_ de la solution décrite dans l'Exemple 41. La solution est laissée à incuber deux heures à 4°C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 54 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000342] Solution 25 : 165,5 mg de lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFUSE contenant seulement 6,95 mg de rhBMP-2 sont repris par 17,1 mL de la solution décrite dans l'Exemple 43. La solution est laissée à incuber deux heures à 4°C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 55 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de phosphate de sodium et d'histidine [000343] Solution 26 : 165,5 mg de lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon

InFUSE contenant seulement 6,95 mg de rhBMP-2 sont repris par 17,1 mL de la solution décrite dans l'Exemple 44. La solution est laissée à incuber deux heures à 4°C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 56 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000344] Solution 27 : 1,98 mL d'une solution de rhBMP-2 à 1,55 mg/mL dans le tampon InFuse sont ajoutés à 3,5 mL de la solution de polymère 1 à 174,7 mg/g. Puis, 9,6 mL d'une solution contenant 0,74 M de phosphate de sodium et 1,2 M d'hydrogénocarbonate de sodium et 0,28 mL d'eau stérile sont également ajoutés. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 0.2 mg/mL en rhBMP- 2, de 40 mg/mL en polymère 1, de 0,45 M en phosphate de sodium et de 0,75 M en hydrogénocarbonate de sodium.

Exemple 57 : Préparation d'un complexe rhBMP-7/ Polymère 1 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000345] Solution 28 : 1,71 mL d'une solution de rhBMP-7 à 3,69 mg/mL dans un tampon 10 mM HCI sont ajoutés à 3,4 mL de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15. Puis, 3,3 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et 7,5 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 0,6 M obtenue par dilution de la solution mère décrite dans l'exemple 38 et 14,1 mL d'eau stérile sont ajoutés. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 0.2 mg/mL en rhBMP-7, de 20 mg/mL en polymère 1, de 0,11 M en phosphate de sodium et de 0,15 M en hydrogénocarbonate de sodium.

Exemple 58 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 2 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000346] Solution 29 : 65,2 mg d'un lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFuse sont repris avec 10,5 mL de la Solution 16. Cette solution est laissée à incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 0.4 mg/mL en rhBMP-2, de 10 mg/mL en polymère 2, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en hydrogénocarbonate de sodium.

Exemple 59 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 5 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000347] Solution 30 : 25,7 mg d'un lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFuse sont repris avec 2,4 mL de la Solution 17. Cette solution est laissée à incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 1.5 mg/mL en rhBMP-2, de 20 mg/mL en polymère 5, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en hydrogénocarbonate de sodium.

Exemple 60 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 6 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000348] Solution 31 : 24,8 mg d'un lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFuse sont repris avec 2,4 mL de la Solution 18. Cette solution est laissée à incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 1.5 mg/mL en rhBMP-2, de 20 mg/mL en polymère 6, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en hydrogénocarbonate de sodium.

Exemple 61 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 7 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000349] Solution 32 : 25,6 mg d'un lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFuse sont repris avec 2,4 mL de la Solution 19. Cette solution est laissée à incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 1.5 mg/mL en rhBMP-2, de 40 mg/mL en polymère 7, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en hydrogénocarbonate de sodium. [000350] Des exemples de préparation de solutions comprenant un sel de calcium soluble et une base sont donnés à titre indicatif et non limitatif.

Exemple 62 : Solution de chlorure de calcium et d'histidine [000351] Solution 33 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de l'histidine à 0,4 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 120 mL d'une solution d'histidine à 1 M et 67,5 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 63 ; Solution de chlorure de calcium et de proline [000352] Solution 34 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de proline à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de proline à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 64 : Solution de chlorure de calcium et de glycine

[000353] Solution 35 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de glycine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de glycine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 65 : Solution de chlorure de calcium et d'alanine [000354] Solution 36 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et d'alanine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution d'alanine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 66 : Solution de chlorure de calcium et de lysine [000355] Solution 37 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de lysine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de lysine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.

Exemple 67 : Solution de chlorure de calcium et de serine [000356] Solution 38 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de serine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de serine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. [000357] Des exemples de préparation de suspensions injectables comprenant une BMP, un polymère, un sel de calcium soluble, un sel de phosphate soluble et/ou une base sont donnés à titre indicatif et non limitatif. Exemple 68 : Préparation d'une suspension injectable d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate

[000358] Une suspension ostéogénique basée sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium a été obtenue par mélange de 400 μl_ de la Solution 29 contenant de la rhBMP-2 à 0,4 mg/mL, soit 160 μg de rhBMP-2, le Polymère 2 à 10 mg/mL, soit 4 mg de polymère 2, du phosphate de sodium à 0,23 M, soit 92 μmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M, soit 124 μmol, et de 400 μl_ d'une solution de chlorure de calcium à 0,38 M, soit 153 μmol. La suspension obtenue est conservée 15 minutes à température ambiante avant injection. Cette suspension est injectable avec des aiguilles de 27 gauges.

Exemple 69 : Préparation d'une suspension injectable d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000359] Une suspension ostéogénique basée sur une coprécipitation du complexe BMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium a été obtenue par mélange de 1250 μl_ d'une solution contenant de la BMP-2 à 0,52 mg/mL soit 650 μg de BMP-2, le Polymère 1 à 20 mg/mL, soit 25 mg de Polymère 1, du phosphate de sodium à 0,23 M, soit 288 μmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M, soit 388 μmol, et de 1250 μL d'une solution à 0,38 M de chlorure de calcium, soit 477 μmol. La suspension obtenue est conservée 15 minutes à température ambiante avant injection. Cette suspension est injectable avec des aiguilles de 27 gauges.

[000360] Des exemples de préparation d'implants comprenant une BMP, un polymère, un sel de calcium soluble, un sel de phosphate soluble et/ou une base sont donnés à titre indicatif et non limitatif.

[000361] Les implants décrits dans les exemples suivants sont préparés avec une éponge de collagène de type-I réticulée stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). Le volume de cette éponge varie selon l'application, 200 μL pour une application en site ectopique chez le rat, 4,5 mL pour une application de fusion vertébrale chez le lapin. Exemple 70 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés

[000362] Implant 1 : 40 μl de la Solution 20 sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile. La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 10 μl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 1,64 M. Enfin, 90 μl_ d'une solution de phosphate de sodium neutralisée à une concentration de 0,053 M obtenue par mélange de 80 μl_ de phosphate de sodium (22,5 mg/mL) et 10 μl_ d'acide chlorhydrique 1 N sont ajoutés à l'éponge. L'éponge est alors congelée et lyophilisée stérilement. La dose de rhBMP-2 dans l'éponge est de 2 μg.

Exemple 71 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés [000363] Implant 2 : 40 μl de la Solution 20 sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile. La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 10 μl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 6,85 M. Enfin, 90 μL d'une solution de phosphate de sodium neutralisée à une concentration de 0,22 M obtenue par mélange de 80 μL de phosphate de sodium (93,8 mg/mL) et 10 μL d'acide chlorhydrique 1 N sont ajoutés à l'éponge. L'éponge est alors congelée et lyophilisée stérilement. La dose de rhBMP-2 est de 2 μg.

Exemple 72 : Préparation d'implants éponge collagène / complexe BMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et d'ascorbate de sodium lyophilisés

[000364] Implant 3 : 40 μl de la Solution 20 sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile. La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 10 μl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 1,64 mg/ml. Enfin, 80 μL d'une solution d'ascorbate de sodium à une concentration de 0,41 M sont ajoutés à l'éponge. L'éponge est alors congelée et lyophilisée stérilement. La dose de rhBMP-2 est de 2 μg.

Exemple 73 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés

[000365] Implant 4 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 ml_. Sur cette éponge, sont ajoutés 2 mL d'une solution à 0,325 mg/mL de rhBMP-2, soit 650 μg de rhBMP-2, à 64,5 mg/mL de Polymère 1, soit 129 mg Polymère 1, et à 0,18 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 500 μl_ d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 M soit 600 μmol de chlorure de calcium et enfin de 500 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 μmol d'hydroxyde de sodium. Ces implants sont ensuite congelés à -80 ⁰ C et lyophilisés. Chacune des éponges lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation.

Exemple 74 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés

[000366] Implant 5 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 2 mL d'une solution à 0,163 mg/mL de rhBMP-2, soit 326 μg de rhBMP-2, à 32,5 mg/mL de Polymère 1, soit 65 mg de Polymère 1, et à 0,18 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 500 μL d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 M soit 600 μmol et enfin 500 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 μmol d'hydroxyde de sodium. Ces implants sont ensuite congelés à -80 ⁰ C et lyophilisés. Chacune des éponges lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation.

Exemple 75 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés

[000367] Implant 6 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 2 mL d'une solution à 0,081 mg/mL de rhBMP-2, soit 162 μg de rhBMP-2, à 16,3 mg/mL de Polymère 1, soit 32,5 mg et à 0,18 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 500 μL d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 M, soit 600 μmol et enfin 500 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 μmol d'hydroxyde de sodium. Ces implants sont ensuite congelés à -80 ⁰ C et lyophilisés. Chacune des éponges lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation. Exemple 76 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés

[000368] Implant 7 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 ml_. Sur cette éponge, sont ajoutés 2 ml_ d'une solution à 0,040 mg/mL de rhBMP-2, soit 80 μg de rhBMP-2, à 8 mg/mL de Polymère 4, soit 16 mg, et à 0,18 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 500 μL d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 M, soit

600 μmol et enfin 500 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 μmol d'hydroxyde de sodium. Ces implants sont ensuite congelés à -80 ⁰ C et lyophilisés. Chacune des éponges lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation. Exemple 77 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium

[000369] Implant 8 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 1060 μL d'une solution à 0,311 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 μg de rhBMP-2, à 62,3 mg/mL de Polymère 4, soit 66 mg et à 0,34 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 270 μL d'une solution de chlorure de calcium à 3,4 M, soit 920 μmol, et enfin 270 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à

1,37 M, soit 370 μmol d'hydroxyde de sodium.

Exemple 78 ; Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium [000370] Implant 9 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 1060 μL d'une solution à 0,151 mg/mL de rhBMP-2, soit 160 μg de rhBMP-2, à 30,2 mg/mL de Polymère 4, soit 32 mg, et à 0,34 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 270 μL d'une solution de chlorure de calcium à 3,4 M, soit 920 μmol, et enfin 270 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 1,37 M, soit 370 μmol d'hydroxyde de sodium. Exemple 79 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium

[000371] Implant 10 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 ml_. Sur cette éponge, sont ajoutés 1060 μl_ d'une solution à 0,311 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 μg de rhBMP-2, à 62,3 mg/mL de Polymère 4, soit 66 mg et à 0,34 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, et enfin 540 μl_ d'une solution de chlorure de calcium à 1,7 M, soit 920 μmol.

Exemple 80 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés [000372] Implant 11 : Un implant ostéogénique basé sur une précipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium a été obtenu à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 ml_. Sur cette éponge, sont ajoutés 1500 μl_ d'une solution à 0,107 mg/mL de rhBMP-2, soit 160 μg de rhBMP-2, à 21.3 mg/mL de Polymère 1, soit 32 mg, puis 500 μL d'une solution à 1,2 M de chlorure de calcium soit 600 μmol, puis 500 μL d'une solution à 0,72 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol et enfin 500 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 μmol d'hydroxyde de sodium. L'implant est ensuite congelé à -80 ⁰ C et lyophilisé. L'éponge lyophilisée est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation.

Exemple 81 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'histidine [000373] Implant 12 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 800 μL d'une solution à 0,413 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 μg de rhBMP- 2, à 20,65 mg/mL de Polymère 4, soit 16,5 mg et à 0,115 M de phosphate de sodium à pH 7,4, soit 92 μmol, et enfin 800 μL d'une solution à 0,3 M de chlorure de calcium, soit 240 μmol, et à 0,2 M d'histidine, soit 160 μmol. Exemple 82 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'histidine

[000374] Implant 13 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 800 μl_ d'une solution à 0,413 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 μg de rhBMP- 2, à 20,65 mg/mL de Polymère 4, soit 16,5 mg et à 0,24 M de phosphate de sodium à pH 7,4, soit 192 μmol, et enfin 800 μl_ d'une solution à 0,4 M de chlorure de calcium, soit 320 μmol et à 0,4 M d'histidine soit 320 μmol.

Exemple 83 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000375] Implant 14 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 800 μL d'une solution à 0,2 mg/mL de rhBMP-2, soit 160 μg de rhBMP-2, à 40 mg/mL de Polymère 1, soit 32 mg, à 0,45 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, et à 0,75 M d'hydrogénocarbonate de sodium, soit 600 μmol, et enfin 800 μL d'une solution à 0,75 M de chlorure de calcium soit 600 μmol.

Exemple 84 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate

[000376] Implant 15 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 800 μL d'une solution contenant de la BMP-2 à 0,2 mg/mL, soit 160 μg de rhBMP-2, le Polymère 1 à 8 mg/mL, soit 6,4 mg, du phosphate de sodium à 0,45 M, soit 360 μmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,75 M, soit 600 μmol, et enfin 800 μL d'une solution de chlorure de calcium à 0,75 M, soit 600 μmol.

Exemple 85 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate

[000377] Implant 16 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 ml_. Sur cette éponge, sont ajoutés 800 μl_ d'une solution contenant de la BMP-2 à 0,2 mg/mL, soit 160 μg de rhBMP-2, le Polymère 1 à 20,6 mg/mL, soit 16,5 mg, du phosphate de sodium à 0,24 M, soit 192 μmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,75 M, soit 600 μmol, et enfin 800 μl_ d'une solution de chlorure de calcium à 0,4 M, soit 320 μmol.

Exemple 86 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-7/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate

[000378] Implant 17 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe BMP-7/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'une éponge de collagène de type-I réticulée cylindrique de 198 μL par 70 μL d'une solution à 0,071 mg/mL de BMP-7 soit 5 μg de BMP-7, à 31,3 mg/mL de Polymère 1, soit 1,5 mg de Polymère 1, à

0,24 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 16,8 μmol, et à 0,4 M d'hydrogénocarbonate de sodium soit 28 μmol, puis par 70 μL d'une solution à 0,4 M de chlorure de calcium, soit 28 μmol. Les implants sont ensuite congelés à - 80 ⁰ C et lyophilisés. Les éponges lyophilisées sont imbibées par 45 μL de sang autologue 30 min avant implantation.

Exemple 87 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000379] Implant 18 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de volume d'épongé de 2.25 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 400 μL de la Solution 29 contenant de la rhBMP-2 à 0,4 mg/mL, soit 160 μg de rhBMP-2, le Polymère 2 à 10 mg/mL, soit 4 mg, du phosphate de sodium à 0,23 M, soit 92 μmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M, soit 124 μmol, et enfin 400 μL d'une solution de chlorure de calcium à 0,38 M, soit 153 μmol. Chaque solution est laissée 15 minutes en contact avec l'éponge après ajout. Après ces durées d'imprégnation, l'éponge est prête pour l'implantation.

Exemple 88 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-7/ Polymère 3 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate

[000380] Implant 19 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe BMP-7/Polymère 3 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'une éponge de collagène de type-I réticulée d'un volume de 4520 μl_ par 800 μl_ d'une solution contenant de la BMP-7 à 0,41 mg/mL, soit 330 μg de BMP-7, le Polymère 3 à 17,5 mg/mL, soit 14 mg de Polymère 3, du phosphate de sodium à 0,45 M, soit 360 μmol, puis par 800 μL d'une solution contenant du chlorure de calcium à 0,4 M, soit 648 μmol et de la proline à 0.61 M, soit 488 μmol. Chaque solution est laissée 15 minutes en contact avec l'éponge après ajout. Après ces durées d'imprégnation, l'éponge est prête pour l'implantation.

Exemple 89 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhGDF-5/ Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'histidine lyophilisés

[000381] Implant 20 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe GDF-5/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'une éponge de collagène de type-I réticulée d'un volume de 4520 μL par 1500 μL d'une solution contenant du GDF-5 à 0,5 mg/mL, soit 750 μg de GDF-5, le Polymère 2 à 20 mg/mL, soit 30 mg de Polymère 2, puis par 750 μL d'une solution contenant du chlorure de calcium à 0,8 M, soit 600 μmol et de l'histidine à 0.38 M, soit 285 μmol et enfin par une solution contenant du phosphate de sodium à 0,48 M, soit 360 μmol. Chaque solution est laissée 15 minutes en contact avec l'éponge après ajout. Après ces durées d'imprégnation, les éponges sont congelées à -80 ⁰ C et lyophilisées. Les éponges lyophilisées sont imbibées par 1,5 mL de sang autologue 30 min avant implantation.

[000382] Les implants décrits dans les exemples suivants sont préparés avec une matrice résistante à la compression, CRM pour Compressive Résistant Matrix. Ce matériau est une matrice mixte composée de collagène bovin de type I et d'une phase minérale de phosphate de calcium composée à 15% d'hydroxyapatite et à 85% de beta-tricalcium phosphate commercialisé par Medtronic sous le nom de MasterGraft Matrix. Le volume de cette matrice varie selon l'application, 140 μL pour une application en site ectopique chez le rat, 5 mL pour une application de fusion vertébrale chez le lapin. Exemple 90 : Préparation d'implants éponge de collagène entourant un CRM contenant un complexe rhBMP-2/ Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000383] Implant 21 : L'Implant 16 est enroulé autour d'un CRM sec de volume

5.0 mL (5,0 * 1,0 * 1,0 cm) avant implantation chez le lapin.

Exemple 91 : Préparation d'implants CRM / complexe rhBMP-2/ Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000384] Implant 22 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe BMP-2/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'un CRM d'un volume de 140 μl_ par 35 μl_ d'une solution à 0,14 mg/mL de BMP-2 soit 5 μg de BMP-2, à 14 mg/mL de Polymère 2, soit 0,5 mg de Polymère 2, à 0,23 M de phosphate de sodium soit 8 μmol, et à 0,31 M d'hydrogénocarbonate de sodium soit 11 μmol pendant 15 minutes, puis par 35 μl_ d'une solution à 0,38 M de chlorure de calcium, soit 13 μmol pendant 15 minutes. Les CRM sont prêts pour l'implantation.

Exemple 92 : Préparation d'implants CRM / complexe rhG DF-S /Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'histidine lyophilisés

[000385] Implant 23 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe GDF-5/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'un CRM d'un volume de 140 μL par 35 μL d'une solution à 0,86 mg/mL de GDF-5 soit 30 μg de GDF-5, à 14 mg/mL de Polymère 2, soit 0,5 mg de Polymère 2, à 0,23 M de phosphate de sodium soit 8 μmol pendant 15 minutes, puis par 17,5 μL d'une solution d'histidine à 0,34 M, soit 6 μmol pendant 15 minutes et enfin par 17,5 μL d'une solution de chlorure de calcium à 0,74 M, soit 13 μmol. Les CRM sont ensuite congelés à -80 ⁰ C et lyophilisés. Les CRM lyophilisés sont imbibés par 45 μL de sang autologue 30 min avant implantation.

Exemple 93 : Préparation d'implants CRM / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000386] Implant 24 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe BMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'un CRM d'un volume de 5.0 mL par 1250 μL d'une solution à 0,52 mg/mL de BMP-2 soit 650 μg de BMP-2, à 20 mg/mL de Polymère 1, soit 25 mg de Polymère 1, à 0,23 M de phosphate de sodium soit 288 μmol, et à 0,31 M d'hydrogénocarbonate de sodium soit 388 μmol pendant 15 minutes, puis par 1250 μL d'une solution à 0,38 M de chlorure de calcium, soit 477 μmol pendant 15 minutes. Les CRM sont prêts pour l'implantation.

Contre-exemple 1 : Préparation d'implants éponge de collagène contenant 20 μg de rhBMP-2

[000387] Implant 25 : 40 μl d'une solution de rhBMP-2 à 0,5 mg/ml dans un tampon de type INFUSE sont introduits stérilement dans une éponge de collagène réticulée, de 200 mm3, stérile. La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant implantation. [000388] La dose de rhBMP-2 dans l'implant 25 est de 20 μg.

Contre-exemple 2 : Préparation d'implants éponge de collagène contenant 2 μg de rhBMP-2 [000389] Implant 26 : 40 μl d'une solution de rhBMP-2 à 0,05 mg/ml dans un tampon de type INFUSE sont introduits stérilement dans une éponge de collagène réticulée, de 200 mm3, stérile, de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant implantation. [000390] La dose de rhBMP-2 dans l'implant 26 est de 2 μg.

Contre-Exemple 3 : Préparation d'implants éponge de collagène contenant S μg de rhBMP-7

[000391] Implant 27 : Des implants ostéogéniques lyophilisés à base de BMP-7 ont été obtenus après imprégnation d'une éponge de collagène de type-I réticulée cylindrique de 198 μL par 140 μL d'une solution à 0,036 mg/mL de BMP-7 soit 5 μg. Les implants sont ensuite congelés à -80 ⁰ C et lyophilisés. Les éponges lyophilisées sont imbibées par 45 μL de sang autologue 30 min avant implantation.

Contre-Exemple 4 : Préparation d'implants éponge de collagène contenant 2,3 mg de rhBMP-2

[000392] Implant 28 : Des implants ostéogéniques ont été obtenus par imprégnation d'une éponge de collagène de type-I réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm soit un volume d'épongé de 4.52 mL par 1600 μL d'une solution à 1,45 mg/mL de rhBMP-2 soit 2,3 mg. La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant implantation. Contre-Exemple S : Préparation d'implants éponge de collagène contenant 1,3 mg de rhBMP-2

[000393] Implant 29 : Des implants ostéogéniques ont été obtenus par imprégnation d'une éponge de collagène de type-I réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm soit un volume d'épongé de 4.52 mL par 1600 μl_ d'une solution à

0,80 mg/mL de rhBMP-2 soit 1,3 mg. La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant implantation.

Exemple 94 : Evaluation du pouvoir osteoinductif des différentes formulations

[000394] L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir osteoinductif des différentes formulations dans un modèle de formation ectopique d'os chez le rat. Des rats mâles de 150 à 250 g (Sprague Dawley OFA - SD, Charles River Laboratories France, B. P. 109, 69592 l'ArbresIe) sont utilisés pour cette étude. [000395] Un traitement analgésique (buprenorphine, Temgesic®, Pfizer, France) est administré avant l'intervention chirurgicale. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un mélange 02 isoflurane (1-4%). La fourrure est éliminée par rasage sur une large zone dorsale. La peau de cette zone dorsale est désinfectée à l'aide d'une solution de povidone iodine (Vetedine® solution, Vetoquinol, France). [000396] Des incisions paravertébrales d'environ 1 cm sont effectuées afin de dégager les muscles dorsaux paravertébraux droit et gauche. L'accès aux muscles est effectué par incision transfaciale. Chacun des implants est placé dans une poche de telle manière qu'aucune compression sur celles-ci ne puisse être exercée. Quatre implants sont implantés par rat (deux implants par site). L'ouverture des implants est ensuite suturée au moyen d'un fil polypropylene (Prolene 4/0, Ethicon, France). La peau est refermée au moyen d'une suture non- absorbable. Les rats sont ensuite replacés dans leurs cages respectives et gardés en observation durant leur rétablissement. [000397] A 21 jours, les animaux sont anesthésiés par une injection de tiletamine-zolazepam (ZOLETILΘ25-50 mg/kg, IM, VIRBAC, France).

[000398] Les animaux sont ensuite euthanasiés par injection d'une dose de pentobarbital (DOLETHAL®, VETOQUINOL, France). Une observation macroscopique de chaque site est ensuite réalisée, tout signe d'intolérance locale (inflammation, nécrose, hémorrhagie) et la présence de tissu osseux et/ou cartilagineux est enregistrée et cotée selon le barème suivant : 0: absence, 1 : faible, 2: modéré, 3: marqué, 4: important.

[000399] Chacun des explants est retiré de son site d'implantation et des photographies macroscopiques sont prises. La taille et le poids des explants sont ensuite déterminés. Chaque explant est ensuite conservé dans une solution de formol à 10% tamponnée.

Résultats :

[000400] Cette expérience in vivo permet de mesurer l'effet ostéoinducteur de la rhBMP-2 placée dans un muscle du dos d'un rat. Ce site non osseux est dit ectopique. Les résultats des différents exemples sont résumés dans le tableau suivant.

[000401] Une dose de 20 μg de rhBMP-2 dans une éponge de collagène (Implant 25, Contre-exemple 1) conduit à l'obtention d'expiants ossifiés de 38 mg de masse moyenne après 21 jours.

[000402] Une dose de 2 μg de rhBMP-2 dans une éponge de collagène (Implant

26, Contre-exemple 2) n'a pas un pouvoir ostéoinducteur suffisant pour qu'on puisse retrouver les implants collagéniques au bout de 21 jours. [000403] En présence de complexe rhBMP-2/polymère 1, de chlorure de calcium et de phosphate de sodium, une dose de rhBMP-2 de 2 μg lyophilisée dans l'éponge de collagène (Implant 1, Exemple 70 et Implant 2, Exemple 71) permet de générer des explants ossifiés contrairement à la rhBMP-2 seule à la même dose. De plus, ces explants sont de masse 4 fois supérieure avec un score osseux équivalent à ceux avec la rhBMP-2 seule. Cette formulation permet donc d'améliorer l'activité ostéogénique de la rhBMP-2. [000404] De façon équivalente, l'ajout d'ascorbate de sodium à l'éponge de collagène contenant le complexe rhBMP-2/polymère 1 et du chlorure de calcium (Implant 3, Exemple 72) permet également d'obtenir des explants ossifiés de masse 4 fois supérieure avec un score osseux équivalent à ceux avec la rhBMP-2 seule. Cette formulation permet également d'améliorer l'activité ostéogénique de la rhBMP-2. Exemple 95 : Evaluation du pouvoir osteoinductif des différentes formulations en fusion postéro-latérale

[000405] L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir osteoinducteur des différentes formulations dans un modèle de fusion postérolatérale chez le lapin. Cette étude est menée suivant le protocole expérimental décrit dans la publication de JP Lawrence (Lawrence, J. P. et al., Spine 2007, 32 (11), 1206- 1213.) à l'exception du traitement à la nicotine puisque Pinduction d'une pseudarthrose n'est pas souhaitée.

[000406] La fusion des vertèbres est évaluée par palpation manuelle de la colonne vertébrale explantée. L'absence de mobilité entre les vertèbres est synonyme de fusion. La colonne vertébrale est également analysée par micro-CT à 12 semaines pour évaluer la présence d'os au niveau des vertèbres. Les résultats obtenus pour les différents implants sont résumés dans le tableau suivant.

1.

[000407] De ces études de fusion postérolatérale chez le lapin, il ressort que le complexe BMP-2 polymère co-précipités avec le sel de phosphate de calcium permet de réduire les doses de BMP-2 d'un facteur 4 à 8 par rapport la BMP-2 seule à 1,3 mg de BMP-2 seule, dose efficace dans ce modèle d'après la littérature, avec des résultats de fusion équivalents. Même à des doses de BMP-2 de 0,16 mg, la fusion postérolatérale est observée chez tous les lapins dans le cas du complexe BMP-2 polymère co-précipité avec le sel de phosphate de calcium. [000408] Les implants contenant le complexe BMP-7 polymère co-précipités avec le sel de phosphate de calcium conduisent également à la fusion des vertèbres pour des doses faibles de BMP-7, 0,33 mg de BMP-7 par implant. Les résultats de la littérature démontrent qu'une fusion vertébrale chez le lapin de 100% n'est pas atteinte même à une dose de 3.5 mg de BMP-7, dose bien supérieure à celle étudiée (Yao, G. et al., Spine 2008, 33 (18), 1935-1942.)-

[000409] Les implants contenant le complexe GDF-5 polymère co-précipités avec le sel de phosphate de calcium conduisent également à 100% de fusion vertébrale pour des doses faibles de GDF-5, 750 μg de GDF-5 par implant. Les résultats de la littérature démontrent qu'une fusion vertébrale chez le lapin de 100% n'est pas atteinte même à une dose de 2.5 mg de GDF-5, dose bien supérieure à celle étudiée (Magit, David P. ét al., Spine 2006, 31 (19), 2180-2188.).