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1 명세서 발명의 명칭:체세포로부터 분화된 신규한유사신경교세포, 이의 제조방법, 이의 제조용칵테일 조성물, 이를포함하는신경 질환 예방또는치료용세포 치료제 및 이를투여하여 신경 질환을 예방및 치료하는방법

[0001] 기술분야

[0002] 본 발명은 체세포로부터 분화된 신규한유사신경교세포, 이의 제조방법 , 이의 제조용 칵테일 조성물, 이를 포함하는신경 질환치료용세포 치료제 및 이를투여하여 신경 질환을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

[0003] 배경기술

[0004] 임상 등급의 세포를 얻는 것은 질병 모델링 및 약물 효능 검사 뿐만 아니라 여러 신경 질환에 대한 치료에서의 그 세포의 적용의 점에서 다수의 중요성이 있다. 인간 및 묘 세포로부터 상이한계통들에 해당하는생리 활성 세포들을얻는것이 가능하지만, 이들세포의 광범위한적용은 입수가능성, 면역 감수성 , 기능적 완전성, 종양발생 위험 및 효율성 문제와 관련한 문제들로 인해 저해된다 (1-3) . 따라서, 적당한 면역형 칠치 공여체 ( ½01111101 ?6- 0131；(土6 ₍ 1 (101101·) 유래 세포의 이식이 극히 중요한도전과제가된다.

[0005] 슈반 세포 (洗)는 말초 신경계의 주요한 신경교세포로서， 몇몇의 신경영양인자들을 분비하면서 신경 건강을 촉진하여 효율적인 신경 전도에 도움을 주는데 있어서 극히 중요한 역할을 한다. 또한, 洗 세포는 말초 신경 손상 후의 신경 재생 과정에 필수적인 역할을 하므로, 손상된 신경 부위에의 엤 세포의 이식은 축삭 재생을 강화하여 손상 환자에게 치료적 이점을 제공하는데 있어서의 유일한실행가능한치료법일 수 있다.

[0006] 슈반세포가많은신경 질환에서 유일한선택일수있지만, 이식 가능한슈반세포를충분히 얻는데 있어서의 주요한 어려움은 그러한 치료를 위한 자가조직 또는 동종이형 슈반 세포가 부족하다는것이다. 많은경우환자또는동종이형 공여자의 건강한신경이 이식 가능한슈반 세포의 소스로서 절제되어야한다. 또한, 최종분화세포인 배양된 슈반세포는증식 능력이 제한되므로， 임의의 장기간의 치료 효과를 달성하기에 충분한세포의 양이 제한된다.

[0007] 세포의 경우, 유도된 슈반 세포는 신경 능선의 효율적인 유도 및 이후의, 복잡한 배지 조건 및 성장 인자들을 갖는 슈반 세포로의 분화에 의존한다. 반면에, 신경 줄기 세포 및 기능성 뉴런으로의 체세포의 분화는 마스터 전사 인자인 50X10및 壯0)(20와 강제 발현을 2020/141648 1»（：1^1 ^{ 2019/000705

2 통해 달성된다. 이에 , 대한민국 공개공보 제 10-2017-0045356호 에서는유전자 발현 산물을 도입하여 제조된슈반세포에 대한기술이 개시되어 있지만, 이러한유전자발현산물의 도입은 일부의 국면에서는 효과적일 수 있지만, 바이러스 벡터 매개 유전자 전달， 후속 유전자 조작 및 부작용의 위험 때문에 임상에서 광범위하게 사용되는데 있어서 문제가 있어왔다.

[0008] 또한, 저분자화합물을 이용한직접분화기술또한개발되고 있으나, 종래 저분자화합물을 적용하여 분화된 세포의 경우, 저분자 물질이 제거되면 다시 원래 세포로 돌아갈 가능성이 있어서， 세포치료제로 개발하는데 한계가 있다는 점이 지적되고 있다.

[0009]

발명의요약

[0()1이 본 발명은 체세포로부터 분화된 신규한 유사신경교세포, 이의 제조 방법, 이의 제조용 칵테일 조성물, 이를 포함하는 신경 질환 치료용 세포 치료제 및 이를 투여하여 신경 질환을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다. 기술적과제

[0011] 본 발명은 종래 기술상의 문제점을 해결하여 유전자 조작 없이도 분화 가능하며, 체세포로부터 화합물 칵테일의 처리만으로 인간 및/동물에서 유래된 신경교세포 (neuroglial cell)와 같이 손상된 신경의 재생 및/또는 회복뿐만 아니라 신경자체의 보호 활성을 갖는 신규한 유사신경교세포 (glia-1 ike cell, GLC)를 제공한다. 여기서 신경교세포라 함은 돌기교세포 혹은 희돌기교세포 (oligodendroglia), 별교세포 혹은 성상교세포 (astrocyte) , 슈반세포 (Schwann cells), 소교세포혹은미소교세포 (microglia) , 위성세포 (satellite cell) 및 상의교세포 (ependymal cell) 등을 포함한다.

[0012]

과제해결수단

[0013] 본 발명은 체세포로부터 분화되어 HGF 20000pg/ml 이상을 분비하는 유사신경교세포를 제공한다.

[0014] 또한, 본 발명은 히스톤 디아세틸라제 억제제, GSK 억제제, ALK-5 키나아제 억제제, cAMP 작용제 및 히스톤 디메틸라제 억제제를포함하는 제 1화합물 칵테일을상기 체세포에 처리하여 유도하는 분화 유도 단계를 포함하는 것인, 체세포로부터 분화된 유사신경교세포를 제공한다.

[0015] 또한, 본 발명은 본 발명은 히스톤 디아세틸라제 억제제, GSK 억제제, ALK-5 키나아제 억제제 , cAMP작용제 및 히스톤 디메틸라제 억제제를 포함하는 유사신경교세포 제조용 칵테일 조성물을 제공한다. () 2020/141648 1»(：1/10公019/000705

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[0016] 또한, 본 발명은 히스톤 디아세틸라제 억제제, 況억제제, 此1(-5키나아제 억제제, 작용제 및 히스톤디메틸라제 억제제를포함하는제 1화합물칵테일을상기 체세포에 처리하여 유도하는분화유도단계를포함하는것인, 체세포로부터 분화된유사신경교세포의 제조방법을 제공한다.

[0017] 또한, 본 발명은 상술한 체세포로부터 분화된 신규한 유사신경교세포를 유효성분으로 포함하는신경 질환치료용세포 치료제를제공한다.

[0018] 또한, 본 발명은 상술한 체세포로부터 분화된 유사신경교세포를 투여하여 신경 질환을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다.

[0019]

발명의효과

[002이 본 발명에서 신경교세포라 함은 돌기교세포 혹은 희돌기교세포 (ol igodendrogl i a) , 별교세포 혹은 성상교세포 (astrocyte) , 슈반세포 (Schwann cel l s) , 소교세포 혹은 미소교세포 (mi crogl i a) , 위성세포 (sate l l i te cel l ) 및 상의교세포 (ependy al cel l ) 등을의미한다. 본 발명이 제공하는신규한유사신경교세포는 생체 내에 존재하는신경교세포의 신경 재생, 복구 및/또는 보호 기능을 갖는 것이다.

[0021] 또한본 발명은 분화능이 없는 체세포를 직접 분화시키기 때문에 종래 세포치료제 개발에 사용되고 있는 배아줄기세포, 역분화줄기세포와같은 전분화능 세포에 비해 암발생가능성이 없는신규한유사신경교세포를 제공하는 것을목적으로 한다.

[0022] 또한, 본 발명은 저분자 화합물만을 사용하기 때문에 종래 유전자 조작들에 의해 이루어지는분화방법 대비 유전체 변형 가능성이 적고, 그분화기간이 단축되며, 분화가격이 저렴하며, 우수한 효율로 체세포로부터 분화된 유사신경교세포를 제공 가능한 신규한 유사신경교세포를 제조하는 방법을 제공하는 것을목적으로 한다.

[0023] 또한본 발명은 분화된 세포를 저분자화합물 없는 일반 배양액에서 계대 배양이 가능한 안정된 세포로 유지할 수 있는 재배양 기술을 제공함으로써, 종래 저분자 화합물을 이용한 직접분화의 단점 중 하나인 분화세포의 불안정성을 극복하는 것을목적으로 한다.

[0024] 또한, 본 발명은 손상된 신경세포들을 우수한 효율로 복구, 재생 및/또는 회복 가능하며, 신경세포 자체를 보호하는 활성을 갖는 체세포로부터 분화된 신규한신경재생보호기능세포를 포함하는신경질환 예방및/또는 치료용세포 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

[0025] 또한본발명은환자의 체세포를직접분화시켜서 신경질환에 대한세포치료제로사용할수 있기 때문에 기존에 사용 혹은 연구되고 있는 줄기세포를 이용한 세포치료제와는 달리 면역 거부반응 없는 세포 치료제를 제공하는 것을목적으로 한다. 2020/141648 1»（그1^¾2019/000705

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[0026] 본 발명은 화합물 칵테일을 사용한 체세포의 분화, 역분화 및/또는 교차분화는 전달, 재현성 및 효율적인 확장성을포함하는적용의 용이한장점이 있으며 , 또한, 가장중요한것은 임의의 유전자 조작이 없이도 임상 목적으로 쉽게 외삽 (extrapolation)가능한 효과를 제공할 수 있다.

[0027] 또한, 본발명은종래유전자조작들에 의해 이루어지는분화방법 대비 그기간이 단축되며 , 우수한 효율로 체세포로부터 분화된 유사신경교세포를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 효과로 한다.

[0028] 도면의간단한설명

[0029] 도 1은섬유아세포 (fibroblast)가신규한유사신경교세포 (이하실시 예 및 이에 대응되는 도면에서는 구체적으로, “Glia-like Cell” 라고 함. 혹은 줄여서 “GLC” )로 분화되는 화학기반 전환 방식의 개요에 관한 도이다. 분화는 3단계 (Step I： Induction, Step II： Maturation, StepIII: Reculture)로 이루어지는데 첫번째 분화 유도 단계에서 제 1 화합물 칵테일 을 사용하여 섬유아세포를 유사신경교세포로 전환시키고, 두번째 성숙 (maturation)단계에서 제 2화합물칵테일을사용하여 전환된유사신경교세포가성숙되게 한다. 마지막 세번째 단계인 재배양 단계에서는 분화에 사용되는 화합물 (chemical)이 없는 배양액에서 안정된 세포를 배양한다. 이 때 두번째 maturat ion단계가 반드시 필요한 것은 아니다.

[0030] 도 2는유사신경교세포로의 분화에 사용된 화합물에 관한도이다.

[0031] 도 3 은 현미경에 의해 관찰된 사진에 관한 것으로, 체세포에서 분화된 신규한 유사신경교세포의 형태학적 특징에 관한 도이다 (도 2 의 VCRFPT 6개의 화합물을 포함하는， 제 1 화합물 칵테일로 분화 유도된 후, CRF 3개의 화합물을 포함하는 제 2 화합물 칵테일로 성숙된 신규한유사신경교세포의 형태학적 특징에 관한 것임; Scale bar=100pm).

[0032] 도 4는 제 1화합물 칵테일의 구성 중 VCRFT만으로구성된 칵테일 화합물로분화유도된 , 신규한 유사신경교세포의 형태학적 특성에 관한 것이며 (Scale bar=100ym), 분화효율이 저하됨을 확인함.

[0033] 도 5는 제 1화합물 칵테일의 구성 중 CRFPT만으로구성된 칵테일 화합물로분화유도된， 신규한 유사신경교세포의 형태학적 특성에 관한 것이며 (Scale bar=100um), 분화효율이 저하됨을 확인함.

[0034] 도 6은제 1화합물칵테일의 구성 중 VRFPT만으로구성된 칵테일 화합물로분화유도된 , 신규한 유사신경교세포의 형태학적 특성에 관한 것이며 (Scale bar=100pm), 분화효율이 저하됨을 확인함. \¥0 2020/141648 1 ^> (71'/10?2019/000705

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[0035] 도 7은 제 1화합물 칵테일의 구성 중 만으로 구성된 칵테일 화합물로 분화유도된 , 신규한 유사신경교세포의 형태학적 특성에 관한 것이며（ 근 5^=100 11 111）, 분화효율이 저하됨을 확인함.

[0036] 도 8은 제 1화합물 칵테일의 구성 중 만으로 구성된 칵테일 화합물로 분화유도된 , 신규한유사신경교세포의 형태학적 특성에 관한것이며（ 크 ^=100나 III） , 분화가이루어지지 않은 것으로, “ ” 0¾대1¥ 1 1）가 없는 경우 분화가 전혀 이루어 지지 않음을 확인 함으로써 “ ’ 가 분화에 필요함을 확인하였다.

[0037] 도 9는 제 1화합물 칵테일의 구성 중 0¾ 만으로 구성된 칵테일 화합물로 분화유도된 , 신규한 유사신경교세포의 형태학적 특성에 관한 것이며 31"=100 11 !11）, 분화효율이 저하됨을 확인함.

[0038] 도 10 은 현미경에 의해 관찰된 사진에 관한 것으로, 체세포에서 분화된 신규한 유사신경교세포의 형태학적 특징에 관한 사진이며 , 화합물 칵테일 의 조합으로 진행하여 체세포에서 유사신경교세포로의 분화 효율이 떨어짐을 확인하였다.

[0039] 도 11 은 현미경에 의해 관찰된 사진에 관한 것으로, 체세포에서 분화된 신규한 유사신경교세포의 형태학적 특징에 관한 사진으로, 제 1 칵테일화합물의 조합인 班甲를 포함하여 체세포에서 유사신경교세포로의 분화가 잘 이루어 짐을 확인 하였다. 따라서 섬유아세포의 유사신경교세포의 분화는 ” 없이도 일어날 수 있음을 확인하였다（ 3 =100 ） .

[004이 도 12는유사신경교세포로의 분화에 사용되는 다른 종류의 화합물에 관한도이다. 도 2의 화합물과 같은 기능을 갖는 화합물을 사용하였다.

[0041 ] 도 13 은 현미경에 의해 관찰된 사진에 관한 것으로， 체세포에서 분화된 신규한 유사신경교세포의 형태학적 특징에 관한 도아다. 도 6의 화합물의 조합에 의한 제 1 화합물 칵테일로 섬유아세포로부터 분화 유도된 신규한 유사신경교세포의 형태학적 특징을 보여준다（ 3 =100 11 11）.

[0042] 도 14는 인간섬유아세포를유사신경교세포로분화시키 기 위한화합물 기반의 전환방식에 대한프로토콜에 관한 것으로, 분화유도 단계를 3일로 고정 후 성숙 시키는 단계를 변화하는 방식에 대한 것이다.

[0043] 도 15는 인간섬유아세포를유사신경교세포로분화시키 기 위한화합물기반의 전환방식에 대한 프로토콜에 관한 것으로, 분화 유도 단계 일수를 변화하는 방식 후 성숙 시키는 단계를 포함하는 방식에 관한 것이다. 2020/141648

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[0044] 도 16은인간섬유아세포를유사신경교세포로분화� ��키기 위한화합물기반의 전환방식에 대한 프로토콜에 관한 것으로, 화합물 칵테일 처리 없이 재배양 (re-cul ture)하는 단계를 포함하는 방식에 관한 것이다.

[0045] 도 17은 현미경사진으로써 인간의 슈반세포의 형태에 관한사진이다.

[0046] 도 18 은 프로토콜 1 로 제조된 유사신경교세포에 (C1-GLC) 관한 사진이며, 제 1칵테일화합물로 VCRFPT조합, 제 2화합물칵테일로 CRF처리 하였고, 인간의 슈반세포 (도 17)와거의 유사한형태를갖췄으나, 섬유아세포 (도 21)와는다른형태를가짐을확인하였다.

[0047] 도 19 는 프로토콜 2 로 제조된 유사신경교세포에 (C2-GLC) 관한 사진이며, 제 1칵테일화합물로 VCRFPT조합, 제 2화합물칵테일로 CRF처리 하였고， 인간의 슈반세포 (도 17)와거의유사한형태를갖췄으나, 섬유아세포 (도 21)와는다른형태를가짐을확인하였다.

[0048] 도 20 은 프로토콜 3 으로 제조된 유사신경교세포에 (C3-GLC) 관한 사진이며, 제 1칵테일화합물로 VCRFPT조합， 제 2화합물칵테일로 CRF처리 하였고, 인간의 슈반세포 (도 17)와거의 유사한형태를갖췄으나, 섬유아세포 (도 21)와는다른형태를가짐을확인하였다.

[0049] 도 21은 현미경사진으로써 체세포인 섬유아세포에 대한사진이다.

[005이 도 22는 현미경에 의해 관찰된 사진에 관한 것으로， 22A는분화에 사용한 섬유아세포 (Human Fibrobl ast ) , 22B 는분화된 유사신경교세포 (Class 3 Gl i a-l ike cel l , C3-GLC) , 22C는슈반세포 (Human Schwann ce l l )의 형태학적 특징에 관한도이다. 각세포의 형태학적인 특징을 보여주기 위해 대표적인 모양을 보이는 몇 개의 세포들의 외곽을 붉은 점선으로 표시하였다 (Scale bar=100 u m) .

[0051] 도 23은 마이크로 어레이로 확인한 각 샘플에서 차별적으로 발현되는 슈반세포 마커 유전자의 unsupervi sed c luster ing에 대한도이다 (N_Hum_Schw： 인간슈반세포; N_f ibr oblast： 섬유아세포; N_SC_12d： Cl-GLC(6+3)； N_SC_9d： Cl_GLC(6+6)) . 분화된 세포와슈반세포에서는 슈반세포 마커가 발현되고 있지만, 섬유아세포에서는 슈반세포마커의 발현이 거의 안되고 있음을 확인할수 있는 것으로보다구체적인 발현물질에 관한도면은 이하에 기재하였다 (도 71-74) .

[0052] 도 24 는 마이크로 어레이로 확인한 각 샘플에서 차별적으로 발현되는 돌기교세포 (01 igodendrocyte) 마커 유전자의 unsupervi sed cluster ing 에 대한 도이다 (N_Hum_Schw： 인간 슈반세포; N.f ibrobl ast： 섬유 아세포; N_SC_12d： Cl-GLC(6+3) ; N_SC_9d： Cl-GLC(6+6) ) . 분화된 세포에서 돌기교세포에서 발현되는 많은 유전자가 발현되고 있지만, 섬유아세포에서는돌기교세포마커가발현이 안되고있었고슈반세포에서는돌기교세포마커 의 일부가발현되고 있음을 확인할수 있다. 2020/141648 1»（그1^1{2019/000705

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[0053] 도 25는마이크로어레이로확인한각샘플에서 차별적으로발현되는별교세포 (Astrocyte) 마커 유전자의 unsupervised clustering 에 대한 도이다 (N_Hum_Schw : 인간 슈반세포; N_fibroblast： 섬유아세포; N_SC_12d： Cl-GLC(6+3)； N_SC_9d： Cl-GLC(6+6)) . 분화된세포에서 별교세포에서 발현되는 많은 유전자가 발현되고 있지만, 섬유아세포에서는 별교세포 마커가 발현이 안되고 있고슈반세포에서는별교세포마커의 일부가발현되고 있음을확인할수있다.

[0054] 도 26은 Cl-GLC(6+6)의 마이크로 어레이를 통해 발현이 증가하는 유전자들을 기능적으로 분류하였을 때 astrocyte 및 microglia 과 같은 신경교세포에서 발현되는 싸이토카인의 발현이 증가하는 결과를보여준다.

[0055] 도 27은 분화 유도 단계 일수와 성숙 시키는 단계 일수가 다른 유사신경교세포 (GLC) , 섬유아세포 (fibroblast) 및 인간 슈반세포 (Human Schwann cell)에서 발현되는 마커로써 사용되는유전자의 마이크로어레이 결과에 관한도이다. (시신경교세포의 마커 유전자의 발현 (B) 섬유아세포 마커 유전자의 발현.

[0056] 도 28은 면역형광법 (immunofluore : ence)로 나타낸 C1-GLC에 관한 것으로, A, B, C는 각각 신경교세포 마커로써 S100, P0 (MPZ), GFAP를 사용한 사진이다, 핵을 염색하는데는 공통적으로 DAPI를사용하였다 (Scale bar=100ym).

[0057] 도 29는 면역형광법 (immunofluorescence)로 나타낸 C3-GLC에 관한 것으로, 신경교세포 마커로써 GFAP (초록색)를 사용한사진이다， 핵을 염색하는데는 DAPI (파란색)를 사용하였고 증식 중인 세포를 염색하기 위해서는 EDU (빨간색)을사용하였다 (Scale bar=50 p m) .

[0058] 도 30 은 프로토콜 I 에 의해 분화된 유사신경교세포와 체세포 및 섬유아세포에서의 섬유아세포 마커 유전자의 발현 결과에 대한 구체적인 그래프로써 , 발현 정도는 RT-PCR에 의해 발현 레벨이 측정되어 비교되었다.

[0059] 도 31은 프로토콜 II에 의해 분화된 유사신경교세포와 체세포 및 섬유아세포에서의 섬유아세포 마커 유전자의 발현 결과에 대한 구체적인 그래프로써 , 발현 정도는 RT-PCR에 의해 발현 레벨이 측정되어 비교되었다.

[006이 도 32는 프로토콜 II， III에 의해 분화된 유사신경교세포와체세포 및 섬유아세포에서의 신경교세포 마커 유전자의 발현 결과에 대한 구체적인 그래프로써 , 발현 정도는 RT-PCR에 의해 발현 레벨이 측정되어 비교되었다.

[0061] 도 33은 유사신경교세포의 배양액에 분비된 사이토카인 및 성장 인자의 양을 분석한 도이다. MIF, CXCL12, IL8, BDNF, GRO-alpha, HGF 등이 유사신경교세포에서 섬유아세포 (fibroblast)에 대비하여 과량으로 분비되고 있는 것을 확인할 수 있다. 신경보호 및 재생 기능을 갖는다고 알려진 MLF, BDNF, HGF등은 인간슈반세포 (hSC)에 대비하여 더 많은 양이 유사신경교세포에서 발현되는 것을 확인할수 있다. 2020/141648 1»（그1'/또1{2019/000705

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[0062] 도 34내지 39는프로토콜 I, II내지 III에 따라 제조된 각기 다른유사신경교세포에서 분비된사이토카인 및 성장인자에 대한양적 분석 그래프이다. 면적이 28.2cm ² 인 60mm culture dish에서 3.2 x 10 ⁶ cells을 3일동안 키우는 동안 배지로 분비된 단백질의 양을 ELISA를 이용하여 측정하였다.

[0063] 도 40의 40A는 체세포 (섬유아세표) 배양액으로 처리된 모터 뉴런 NSC34 세포의 신경 돌기 성장의 대표되는현미경 사진에 관한것이며 , 40B는섬유아세포배양액으로처리된모터 뉴런 NSC34세포의 신경 돌기의 길이의 정량분석 그래프이다.

[0064] 도 41의 A는 프로토콜 I으로 분화시킨 Cl-GLC(6+6) 유사신경교세포 배양액으로 처리된 모터뉴런 NSC34세포의 신경 돌기 성장의 대표되는현미경사진에 관한것이며, B는 프로토콜

I으로 분화시킨 C1-GLCC6+6) 유사신경교세포 배양액으로처리된모터 뉴런 NSC34세포의 신경 돌기의 길이의 정량분석 그래프이다.

[0065] 도 42의 A는 프로토콜 II로 분화시킨 C2_GLC(15+3) 유사신경교세포 배양액으로 처리된 모터 뉴런 NSC34세포의 신경 돌기 성장의 대표되는현미경 사진에 관한것이며 , B는프로토콜

II로분화시킨 C2-GLCU5+3)유사신경교세포 배양액으로 처리된 모터 뉴런 NSC34세포의 신경 돌기의 길이의 정량분석 그래프이다.

[0066] 도 43의 A는프로토콜 III로분화시킨 C3_GLC(6+3+12)유사신경교세포 배양액으로처리된 모터 뉴런 NSC34세포의 신경 돌기 성장의 대표되는현미경 사진에 관한것이며 , B는프로토콜

III로 분화시킨 C3-GLCX6+3+12)유사신경교세포 배양액으로 처리된 모터 뉴런 NSC34 세포의 신경 돌기의 길이의 정량분석 그래프이다.

[0067] 도 44의 A는 슈반세포 배양액으로 처리된 모터 뉴런 NSC34 세포의 신경 돌기 성장의 대표되는현미경 사진에 관한것이며 , B는 NSC34슈반세포배양액으로처리된모터 뉴런 NSC34 세포의 신경 돌기의 길이의 정량분석 그래프이다.

[0068] 도 45는유사신경교세포로의 전환율에 대한것으로, GFAP의 발현을나타내는세포에 의해 측정된 바에 따라 85%수율을 나타낸다.

[0069] 도 46 은 재배양된 세포가 나타내는 증식 특성에 관한 것으로, 세포 증식 능력의 추정치로써의 프로토콜 III로 분화시킨 C3-GLCC 6+3+12) 유사신경교세포의 EdU염색정도 (A, 빨간색)를나타낸 것이다. ( 는 H0ECHST33342염색 (파란색)으로써 핵을표시하고 (C)는 (시와 ( 를 겹친 사진이다(Scale bar=50 pm)

[007이 도 47은 EdU양성 세포의 비율에 대한 정량적 그래프에 관한 도이다, 오차 막대(Error bar)는 평균의 표준오차(standard error of mean;SEM)를 의미한다. 2020/141648 1»（：1^1{2019/000705

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[0071] 도 48 은 현미경에 의해 관찰된 사진에 관한 것으로, 동결 후 해동한 C3- GLC(6+3+6)유사신경교세포의 형태학적 특징에 관한 도이다. 동결 및 해동 과정을 진행하여도 세포 형태 측면에서 변화 없음을보여주는 도이다 (Scale bar=50 u m) .

[0072] 도 49는 프로토콜 I, II 내지 III에 따라 제조된 각기 다른 유사신경교세포에서 분비된 HGF를 ELISA를 이용해 측정한 양적 분석 그래프이다. 특히 C3-GLC (6+3+6) 및 C3-GLC (6+3+12)의 경우 세포를 얼렸다가 (F, freezing) 해동 (T, thawing)한 후 세포를 키우면서 분비되는 HGF를 측정하였다 (FT). 동결 및 해동 과정을 진행하여도 HGF 발현 측면에서 큰 변화가 없음을 보여주는 도이다.

[0073] 도 50은 동결 및 해동 과정을 진행하여도 세포형태 및 신경 돌기의 성장 측면에서 변화 없음을 보여주는 도로, 프로토콜 III의 C3-GLC (6+3+12)유사신경교세포 배양액에서의 NSC34 세포의 신경돌기 성장사진이다 (Scale bar=100um).

[0074] 도 51은 동결 및 해동 과정을 진행하여도 세포형태 및 신경 돌기의 성장 측면에서 변화 없음을 보여주는 도로, 프로토콜 III의 C3-GLC (6+3+12)유사신경교세포 배양액에서의 NSC34 세포의 신경돌기 성장의 정량분석에 관한그래프이다.

[0075] 도 52는로타로드분석에 관한그래프이다. 쥐의 대퇴부신경을손상시켜서 만성협착모델 (rat chronic constriction injury, CCI , model)을 만들고손상된 신경에 사람의 섬유아세포, 사람의 슈반세포, 유사신경교세포를 이식한후 8주후에 신경재생정도를 rotaros분석을 통해 측정하였다. FB (Fibroblast, 섬유아세포), SC (Schwann cell, 슈반세포). G3, G4, G5 (C1- GLC)의 경우 G2(무처리) G6(섬유아세포 처리), G7(인간 슈반 세포 처리)에 비해 신경재생이 잘 되었음을 확인할 수 있다. 특히 G5 (C1-GL 6+6)의 경우 신경재생이 가장 잘 되어 있음을 확인 할수 있다.

[0076] 도 53 은 EMG 분석에 관한 그래프이다. 도 37 와 같은 조건에서 실험을 하였고 신경재생정도를 electromyogram (EMG)로 분석하였다. 역시 G5 (C1-GLC (6+6)처리)의 경우 G2(무처리) G6(섬유아세포 처리)， G7(인간 슈반 세포 처리)에 비해 가장 신경재생이 잘 되었음을 확인할수 있다. .

[0077] 도 54는수초화된신경의사진이다. 도 52와같은조건에서실험을하였고신경재생정도� �� 수초화된 신경의 분포로 확인할 수 있다. G5 (C1-GLC (6+6)처리)의 경우 G2(무처리) G6(섬유아세포 처리)， G7(인간슈반세포 처리)에 비해 수초화가가장잘되었음을 확인할수 있다.

[0078] 도 55는 도 54의 사진에서 수초화된 신경을 정량적 그래프로 표현한것이다. G5 (C1-GLC (6+6)처리)의 경우 G2(무처리) G6(섬유아세포처리), G7(인간슈반세포처리)에 비해수초화된 신경이 가장 많은 것으로보아신경재생이 가장 잘되었음을 확인할수 있다. 02020/141648 1»〔"^0技019/000705

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[0079] 도 56은 수초화된 신경의 전자현미경사진이다. 도 52와 같은 조건에서 실험을 하였고 신경재생정도를 신경의 수초화 정도로 확인할 수 있다. G5 (C1-GLC (6+6)처리)의 경우 G2(무처리) G6(섬유아세포처리), G7(인간슈반세포처리)에 비해 수초화가가장잘되었음을 확인할수 있다.

[008이 도 57은 도 56의 전자현미경사진에서 신경의 수초화 정도를 수초 두께를 정량화하여 그래프로 표현한 것이다. G5 (C1-GLC (6+6)처리)의 경우 G2(무처리) G6(섬유아세포 처리)， G7(인간슈반세포 처리)에 비해 수초의 두께가가장두꺼운 것으로보아신경재생이 가장잘 되었음을 확인할수 있다.

[0081] 도 58은 유사신경교세포 유도과정에서 사용되는 화합물 칵테일에 포함된 여섯 종류의 화합물의 농도에 따른 분화 여부에 관한 것으로, 도 58 에는 최적화된 농도 (working concentration), 최적화농도의 2배 농도 (2 x working concentration), 각화합물의 ICso값에 해당하는 농도 (ICM values) , 그리고 ICso농도의 두배 농도 (2xIC ₅ o values) 값을 보여주고 있고, 각각의 농도의 화합물이 섞인 칵테일을 사용하여 분화를 유도 시켰을 때 얻어지는 유사신경교세포를현미경으로관찰한사진을각 도 59내지 62에나타냈다 (Scale bar=100ym).

[0082] 도 59는 최적화된 농도의 화합물 칵테일을 처리하여 분화시킨 유사신경교세포에 대한 사진으로, 유사신경교세포의 모양으로 보았을 때 분화가 잘 이루어졌음을 확인할수 있었다.

[0083] 도 60은 최적 농도의 2배 농도를 처리하여 분화시킨 유사신경교세포로에 대한사진으로, 분화는 이루어 졌지만, 전환된 세포수의 감소로 보아, 화합물들이 세포에 대한 독성이 다소 있다는 것을 확인하였다.

[0084] 도 61 은 제 1 화합물 칵테일의 6 종의 화합물을 IC ₅ o 값으로 처리하여 분화시킨 유사신경교세포에 대한사진으로, 분화효율이 현저히 줄어돎을 확인하였다.

[0085] 도 62는 IC ₅ o값의 두 배의 농도의 화합물 칵테일로 처리하여 분화시킨 유사신경교세포에 대한사진으로, 분화 효율이 현저히 줄어듦을 확인하였다.

[0086] 도 63 및 64는 환자의 피부세포에서 분리한섬유아세포를 이용한유사신경교세포분화에 대한 것으로써, CMKchar cot-mar ie-Tooth disease)질환을 앓는 환자의 피부에서 채취한 섬유아세포를 프로토콜 II (도 63) 및 III (도 64) 를 이용하여 전환한 C2-GLC (15+3) 및 C3- GLC( 6+3+6) 유사신경교세포의 현미경 사진이다 (Scale bar=100ym).

[0087] 도 65 및 66은 6살 남성의 진피 유래 섬유아세포를 이용한유사신경교세포 분화에 대한 것으로써 , 섬유아세포를프로토콜 11(도 65) 및 111(도 66)을 이용하여 전환한 C2-GLC (15+3) 및 C3-GLC(6+3+6) 유사신경교세포의 현미경 사진이다 (Scale bar=100um). 2020/141648 1»（：1^1{2019/000705

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[0088] 도 67및 68은 82살여성의 피부유래 섬유아세포를이용한유사신경교세포분화에 대한 것으로써,섬유아세포를프로토콜 11(도 67) 및 111(도 68) 를이용하여전환한 C2-GLC (15+3) 및 C3-GLCX6+3+6)유사신경교세포의 현미경 사진이다 (Scale bar=100um).

[0089] 도抑및 70은 47살남성의 포피유래 유래 섬유아세포를 이용한유사신경교세포분화에 대한 것으로써, 섬유아세포를프로토콜 11(도 69) 및 111(도 70)를 이용하여 전환한 C2-GLC (15+3) 및 C3-GLC( 6+3+6)유사신경교세포의 현미경 사진이다 (Scale bar^lOOum).

[0090] 도 71 내지 74은 도 23의 마이크로 어레이로 확인한 각 샘플에서 차별적으로 발현되는 슈반세포마커 유전자의 unsupervised clustering에 대한구체적인도이다 (N_Hum_Schw: 인간 슈반세포; N_fibroblast： 섬유아세포; N_SC_12d： Cl-GLC(6+3)； N_SC_9d: C1-GLCC6+6)) .

[0091] 도 75는 CMT환자 섬유아세포에서 만든 유사신경교세포 (C3-GLC 6+3+6) (도 64)에서 분비되는 HGF양에 대한그래프이다.

[0092] 도 76은다양한섬유아세포로부터 프로토콜 II의 방법으로분화시킨유사신경교세포 (C2- GLCU5+3))에서 분비된 HGF의 양에 대한그래프이다.

[0093] 도 77는 프로토콜 I의 방법으로 제조한유사신경 교세포에 있어서 , 분화유도 단계에서 사용되는 화합물 칵테일의 다양한 조합을 이용하여 분화시킨 유사신경 교세포 (C1- GLCX6+6))에서 분비된 HGF의 양에 대한그래프이다.

[0094] 도 78는프로토콜 II및 III의방법으로제조한유사신경교세포에서분비 되는 HGF의 양에 대한그래프이다.

[0095] 도 79은 섬유아세포, 슈반세포 및 도 58의 화합물 칵테일의 각 농도와 관련된 조합의 화합물 칵테일을 이용하여 분화시켜 제조된 유사신경교세포에서 분비되는 HGF의 양에 대한 그래프이다.

[0096] 도 80은로타로드및 BBB분석에 관한그래프이다. 쥐의 척추신경을손상시켜 , 척수손상 모델 (SCI, spinal cord Injury, Rat)을 만들고 손상된 신경에 사람의 슈반세포, 유사신경교세포를이식한후 0일， 14일 및 28일 후신경재생정도를 rotarod및 BBB분석 (BBB scoring: Basso, Beattie and Breshen locomotor scale 방법)을 통해 즉정하였다. FB (Fibroblast , 섬유아세포), SC (Schwann cell, 슈반세포), G3 (C3-GLC (6+3+6)처리)의 경우 G2(무처리), G4(인간슈반세포처리)에 비해 가장신경재생이 잘되었음을확인할수 있다.

[0097] 도 81은유사신경세포의 체내분포에 대한것이다. Green fluorescence protein유전자를 갖는바이러스를감염시켜서 녹색형광을보이는 C3-GLC및사람슈반세포에 쥐 (Rat)의 허벅지 근육에 주사기를 이용하여 넣은 후 지정된 시간에 형광의 위치 및 밝기를 관찰하여 C3- GU6+3+6)의 변화를 관찰하였다. 실험결과 최소 5일 이상 유사신경세포가 남아 있는 것을 확인할수 있었다. 2020/141648 1»（：1^1{2019/000705

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[0098]

발명실시예의상세한설명

[0099] 이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.

[010이 본 발명은 종래 기술상의 문제점을 해결하여 유전자 조작 없이도 분화 가능하며, 체세포로부터 화합물칵테일의 처리만으로 인간및/동물에서 유래된 신경교세포와같이 손상된 신경의 재생 및/또는 회복뿐만 아니라 신경 자체의 보호 활성을 갖는 신규한 유사신경교세포 (gl i a- 1 ike cel l )를 제공한다.

[0101 ] 본 발명에서 신경교세포라 함은 돌기교세포 혹은 희돌기교세포 (ol igodendrogl ia) , 별교세포 혹은 성상교세포 (astrocyte) , 슈반세포 (Schwann cel l s) , 소교세포 혹은 미소교세포 (mi crogl ia) , 위성세포 (satel l i te cel l ) 및 상의교세포 (ependymal cel l ) 등을포함한다. 본 발명이 제공하는신규한유사신경교세포는신경교세포 들이 갖는신경 재생, 복구 및/또는보호 기능을 갖는 것이다.

[0102] 또한 본 발명은 분화능이 없는 체세포를 직접분화시키기 때문에 종래 세포치료제 개발에 사용되고 있는 배아줄기세포, 역분화 줄기세포와 같은 전분화능세포에 비해 암 발생가능성이 없는 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

[0103] 또한, 본 발명은 저분자 화합물만을 사용하기 때문에 종래 유전자 조작들에 의해 이루어지는 분화방법 대비 유전체 변형의 위험이 적고, 분화 기간이 단축되며, 우수한 효율로 체세포로부터 분화된 유사신경교세포를 제공 가능한신규한유사신경교세포를제조하는방법 을 제공하는 것을 목적으로 한다.

[0104] 또한 본 발명은 분화된 세포를 저분자 화합물 없는 일반 배양액에서 계대 배양이 가능한 안정된 세포로 유지할 수 있는 재배양 기술을 제공함으로써, 종래 저분자 화합물을 이용한 직접분화의 단점 중하나인 분화세포의 불안정성을극복하는 것을목적으로한다. 본발명에서 저분자화합물이란， 본원 발명에 포함되는 제 1 화합물 칵테일 또는 제 2화합물 칵테일을구성 가능한 성분을 의미하는 것이다.

[0105] 또한, 본 발명은 손상된 신경세포들을 우수한 효율로 복구, 재생 및/또는 회복 가능하며, 체세포로부터 분화된 신경세포 자체를 보호하는 활성을 갖는 신규한 신경재생보호기능세포를 포함하는 신경질환 예방또는 치료용 세포 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

[0106] 또한본 발명은 환자의 체세포를 직접분화시켜서 신경질환에 대한세포치료제로사용할수 있기 때문에 기존에 사용 혹은 연구되고 있는 줄기세포를 이용한 세포치료제와는 달리 면역 거부반응 없는 세포 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

[0107] 본 발명의 신규한 신경유사교세포는 HGF 분비량 이 20 , 000pg/ml 이상인 것일 수 있다. 2020/141648 1 ^> (그1'/1(3?2019/000705

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[0108] 또한, 본 발명의 신경유사교세포는 ¾1 분비량 101¾ 1이상; 및 분비량 15如§細1 이상을 포함하는 체세포로부터 분화된 신규한 유사신경교세포를 제공하며, 상기 유사신경교세포는 신경 재생 및 보호용일 수 있으며, 구체적으로 우수한 효율로 손상된 신경세포의 재생, 회복 및/또는신경의 보호를 가능하게 한다.

[0109] 본 발명의 신규한 유사신경교세포는 보다 구체적으로 신경재생기능이 있는 단백질인자인 胎 분비량이 분화에 사용된 세포인 섬유아세포의 분비량에 비해 10배이상 높거나 혹은 20, 00¾¾/ 이상일 수 있으며, 바람직하게는 20,000 내지 5,000,00如용/ , 더 바람직하게는 30,000내지 5 ,000 ,00如 ₈ 1， 보다더 바람직하게는 50,000내지 5 , 000 , 00¾¾/«11 일 수 있다. 는신경보호 및 재생기능이 있는단백질이므로 많이 분비 될수록우수한효과를발현할수 있다. 또한신경재생기능이 있는또다른 단백질 인자인 분비량이 분화에 사용된 세포인 섬유아세포의 분비량에 비해 10배이상높거나혹은 15此 ₂ 1 이상일 수 있으며 , 바람직하게는 200 내지 5 ,000 ,00（¾ 細1 , 더 바람직하게는 700 내지 5, ¥0,00的용/1111 , 보다 더 바람직하게는 1,000내지 5, 000,00抑용/1111 일 수 있다. 80 역시 신경보호 및 재생기능이 있는단백질이므로 많이 분비 될수록효과가높다. 또한신경재생기능이 있는또다른단백질 인자인 ¾1 분비량이 분화에 사용된 세포인 섬유아세포의 분비량에 비해 10배이상높거나혹은 10明/1111 이상일 수 있으며, 바람직하게는 15내지 1,000,000^^1 , 보다바람직하게는 20내지 1，000, 0001¾/ 일 수 있다. 11 는 신경보호 및 재생기능이 있는 단백질이므로 많이 분비 될수록 효과가 높다. 敗 ¾!1 및 표 ! ^? 는 각 각 신경보호 및 재생기능이 있다고 알려져 있는 단백질 인자이므로 분비량이 상기 범위로 분비될 경우신경재생기능 측면에서 우수한효과를가질 수 있다.

[011이 또한유사신경교세포는 인간의 슈반세포랑 유사한모양을 보이는데, 보다자세히, 길이가 50-500 1）1 _^ 이고 직경이 15-50 인 기다란 형태의 세포로써 부풀어져 있는 중심 부분에서 양 끝 혹은 여러 개 （＜ 10）의 끝으로 가늘어 지고, 어떤 경우, 이 끝 부분이 폭 1 미크론 정도의 긴 실 모양을 띤다（도 22 참조）.

[0111] 또한유사신경교세포는 분화를 시키는 데 사용한섬유아세포의 마커인 ^0（1이나 ?요내5의 발현이 섬유아세포의 발현에 20%이하로관측되어야하고, 신경교세포에서 발현이 증가된다고 알려진 마커 유전자인 ! ³ , 0/^0, 炯1¾1등의 발현이 섬유아세포 대비 1.5배 이상중가하는 특징을 갖는다（도 27 참조） .

[0112] 또한유사신경교세포는 ^032와같이운동신경세포의신경돌기의성장을� �와주는특징을 갖는다. 보다 구체적으로 유사신경세포배양액을 운동신경세포 배양시 첨가해 주면 70¾이상의 세포가 길이 50 500 신경돌기를 갖는다.

[0113] 또한본 발명은, 신규한유사신경교세포를 제조가능한 제 1 화합물 칵테일 및 제 2 화합물 칵테일을 제공한다. 2020/141648

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[0114] 상기 제 1 화합물 칵테일은 체세포를 신규한 유사신경교세포로 유도하기 위한 것으로써， 히스톤 디아세틸라제 억제제, GSK 억제제, ALK-5 키나아제 억제제， cAMP 작용제 및 히스톤 디메틸라제 억제제를포함하는 것일 수 있다.

[0115] 또한, 제 2 화합물 칵테일은 제 1 화합물 칵테일 처리된 체세포에 후처리 하여 성숙하는 단계를포함하도록할수있는것으로써， G況억제제 , ALK-5키나아제 억제제 및 cAMP작용제를 포함하는 것일 수 있다.

[0116] 본 발명에서 "히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetyl ase inhibitor)"는 히스톤 디아세틸라아제를 억제하는 물질을 의미하며, 히스톤 디아세틸화를 저해를 통해 크로마틴을 고아세틸화 상태로 만들어 세포증식억제인자 및 분화유도에 필수적인 유전자들의 발현을 촉진하여 암세포의 분화를 유도하고 혈관신생을 억제하며， 세포주기를 G1상태로 고정시켜 암세포의 아폽토시스 (apoptosis)를 유발하여 강한 세포증식억제 (cytostatic) 항암활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC)는 pRB/E2F를 매개로 유전자 전사 (gene transcription)을 억제하며, 히스톤 아세틸레이션 (histone acetylat ion)의 파괴가 여러 가지 암발생과관련되어 있고, HDAC는저산소증, 저당, 세포암화등열악한환경조건에서 고발현되어 세포증식억제인자의 발현을저해하여 세포증식을촉진시키는역할을하여， HDAC는 세포암화 및 분화조절에 중요조절인자로 인식되고 있다고 알려져 있다. 특히, 상기 VPA는 이노시톨 감소를 유발하고, GSK-3{3를 저해하고 ERK pathway를 활성화시키고, PPAR 활성을 자극하는 것으로 알려져 있다. 상기 히스톤 디아세틸라아제 억제제 (HDAC inhibitor)는 InM 내지 lOOmM으로 포함될 수 있다 .

[0117] 상기 히스톤 디아세틸라제 억제제는 그 종류가 제한되지는 않으나, 보다 구체적으로 발프론산 (Valproic acid), 프라시노스타트 (Pracinostat) , 트리코스타틴 A (Trichostat in A), 2, 4 -피리딘디카르복시산 (2,4-Pyridinedicarboxyl ic Acid) , 수베로일아닐리드 하이드록삼산 (Suberoylani 1 ide hydroxamic acid), 히드록삼산 (hydroxamic acid) , 사이클릭 테트라팹티드 (cyclic tetrapept ide) , 뎁시펩티드 (depsipept ides) , 보리노스타트 (Vorinostat) , 벨리노스타트 (Bel inostat) , 파노비 노스타트 (Panobinostat) , 벤즈아마이드 (Benzamide) , 엔티노스타트 (Ent inostat) 및부틸레이트 (butyrate)로구성된군으로부터 선택된 1종이상을 포함할 수 있으며, 발프론산 (Valproic acid) 및/또는 프라시노스타트 (Pracinostat)가 보다 바람직 할수 있다.

[0118] 상기 화합물 중 발프론산은 50 pM 내지 5mM로 포함될 수 있으며 , 바람직하게는 250 yM 내지 4mM로포함될수 있으며 , 보다바람직하게는 400 uM내지 2mM, 더욱바람직하게는 500 iiM 내지 ImM 로 포함될 수 있다, 상기 범위로 포함될 경우 효과적이고 독성없이 효과를 발현할 수 있다는 점에서 바람직 할 수 있다. 또한 상기 화합물 중 프라시노스타트는 50nM 내지 200nM의 범위로 포함될 경우 독성 없이 체세포를 유사신경교세포로 우수하게 분화시킬 수 있다는 점에서 바람직 할수 있다. () 2020/141648 1»(：1/10公019/000705

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[0119] 발명에 있어서， ”GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor)’’는 GSK 신호전달과정에 관여하는 GSK1/2의 업스트림 (upstream) 분자인 GSK1/2를 표적으로 하는 물질들이면 제한되지 않는다. 상기 GSK억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor)는 InM 내지 lOOmM으로 포함될 수 있다. 상기 GSK 억제제는 종류가 제한되지는 않으나, 보다 구체적으로 Chir99021 (6-(2-(4-(2,4~dich1oropheny1 )-5-(4-methyl-lH-imidazol-2- yl )pyr imidin-2-ylamino)ethylamino) nicot inonitr i le) ; LY2090314 (3-imidazo[l _f 2~ a]pyr idin-3-y1-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piper idinylcarbonyl )-pyrrolo[3,2, jk] [1 , 4] benzo diazepin-7-yl ] ) ; 1-azakenpaul lone (9-Bromo-7, 12-dihydro- pyrido[3' ,2'：2,3]azepino[4,5-b] indol-6(5H)ᅳone)； BIO ((2 ^, Z _t 3'E)-6-Bromoindirubin-3' ^~ oxime) ; ARA014418 (N-(4-Methoxybenzy1 )-N ¹ -(5-nitro-1 ,3-thiazol-2-yl)urea)； Indirubin- 3'-monoxime； 5-1odo-indirubin-3'-monoxime； kenpaul lone (9-Bromo-7,12_dihydroindolo ^~ [3,2-d] [l]benzazepin-6(5H)-one)； SB-415286 (3-[(3-Ch1oro-4-hydroxypheny1 )amino]-4-(2- nitro-phenyl )-lH~pyrro1e-2,5~dione) ; SB-216763 (3-(2,4-Dich1oropheny1 )-4-(1-methy1-1H- indol-3-yl )-1Hpyrro1e-2,5~dione )； Maybridge SEW00923SC (2-ani 1 ino-5-pheny1-1 ₁ 3,4- oxadiazole)； (Z)-5-(2,3-Methy1enedioxypheny1 )-imidazol idine-2,4-dione； TWS 119 (3-(6- (3-aminopheny1 )-7H-pyrro1o[2,3-d]pyr imidin-4-y1oxy)pheno1 )； Chir98014 (N2-(2-(4-(2,4 ^~ dichlorophenyl )-5~(l H-imidazol-l-yl )pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6' diamine) ; SB415286 (3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)~4-(2-nitrophenyl)-lH-pyrr ole-25~ dione); 및 Tideglusib (2-(1-naphtha1eny1 )-4-(pheny1methy1 ))로구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며， 바람직하게는 Chir 99021및/또는 LY2090314일 수 있다.

[012이 상기 GSK억제제 중 Chir 99021및/또는 LY2090314는 5nM내지 ImM로포함될 수 있으며 , 바람직하게는 lOnM 내지 20uM로 포함될 수 있으며， 보다 바람직하게는 20nM 내지 15tiM, 더욱바람직하게는 io _u M내지 20uM로포함될수 있다， 상기 범위로포함될 경우효과적이고 독성없이 효과를 발현할수 있다는 점에서 바람직 할수 있다.

[0121] 본 발명에 있어서， "ALK-5키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor)’’는 TGF- 타입 I 리셉터에 결합하여 TGF-|3 I의 정상적인 신호전달과정을 방해하는물질을 의미하며 , TGF-I3 타입 I (Transforming growth factor-{3 type I)은 세포증식， 분화 및 다양한 종류의 세포에 다양한 작용을 하는 다가능성 펩타이드로서， 이러한 다기능성은 지방세포형성， 근세포형성， 골세포형성, 상피세포 분화등 여러 조직의 성장 및 분화에서 중추적인 역할을 한다.

[0122] 상기 ALK-5키나아제 억제제는 InM내지 lOOmM로포함될 수 있다.

[0123] 상기 ALK-5키나아제 억제제는그 종류가 제한되는 것은 아니다. 보다구체적으로, 상기 ALK-5키나아제 억제제 (TGF-p 타입 I 리셉터 억제제)는 RepSox (1,5-Naphthyr idine, 2-[3- (6-methyl-2-pyridinyl )-lH-pyrazol-4-yl ] )； SM31542 (4~(4-(ben2o[d] [l,3]dioxol-5-yl )-5- (pyridin-2-yl)-lH-imidazol-2-yl )benzamide) ; SB525334 (6-(2-tert~butyl-4-(6- 2020/141648 1»(：1^1 ^{ 2019/000705

16 methylpyridin-2-y1 )-lH-imidazo1_5_y1 )quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-y1 )-1H- pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl )-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl )benzamide)； SD-208 (2-(5-chloro_ 2-fluorophenyl )-N-(pyr idin-4-yl )pter idin-4-amine)； Galunisert ib (LY2157299, 4-(2-(6- methylpyr idin-2-yl )-5,6-dihydro-4H-pyrro1o[1,2-b]pyrazo1-3~y1 )quino1 ine ^~ 6- carboxamide)； EW-7197 (N-(2-f1uoropheny1 )-5-(6-methy1-2-pyr idinyl )-4-

[l,2,4]tr iazolo[l,5-a]pyridin-6-yl-lH-imidazole-2-methanamine) ; LY2109761 (7-(2- morpho1 inoethoxy)-4-(2-(pyr idin-2-y1 )-5,6-dihydro-4H~pyrro1o[1,2_b]pyrazo1-3- yl )quinol ine) ; SB505124 (2-(4-(benzo[d] [l,3]dioxo卜5-yl )-2-tert-butyl-lH-imidazol-5- yl )-6~methylpyr idine) : LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-lH-pyrazo1-4-y1 ] )；

K02288 (3-1(6-Amino~5-(3,4,5-trimethoxypheny1 )-3~pyridinyl]pheno1 ] 및; LDN-

212854(Quinol ine, 5-[6-[4-(l-piperazinyI)phenyl]pyrazolo[l,5-a]pyrimidin-3-yl] )£- 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 Repsox및/또는況431542일 수 있다.

[0124] 보다 구체적으로 Repsox 및/또는 況431542는 InM 내지 500 yM 로 포함될 수 있으며 , 바람직하게는 4nM내지 20uM로포함될 수 있으며, 보다바람직하게는 8nM내지 7.5yM, 더욱 바람직하게는 5 u M 내지 10 y M 로 포함될 수 있다, 상기 범위로 포함될 경우 효과적이고 독성없이 효과를 발현할수 있다는 점에서 바람직 할수 있다.

[0125] 본발명에서 “cAMP작용제 (cAMP agonist)"는 cAMP신호를활성화시키는물질을의미한다.

cAMP작용제는 InM내지 lOOmM로포함될 수 있다.

[0126] 상기 cAMP 작용제는 그 종류가 제한되지 않으나, 구체적으로 포스콜린(Forskolin), isoproterenol , NKH 477 (a novel forskol in derivative), PACAP l-27(Pi tui tary adenylate cyclase activating polypeptide receptor antagonist : PACAP antagonist) , 또는 PACAP 1-38 (PACAP antagonist)을포함할수 있으며, 바람직하게는포스콜린 및/또는 NKH 477일 수 있다.

[0127] 상기 화합물 중 포스콜린은 InM내지 500 uM로 포함될 수 있으며 , 바람직하게는 0.5 uM 내지 50yM로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 lyM 내지 45 p M , 더욱 바람직하게는 25 uM내지 50uM로 포함될 수 있으며, NKH 477는 0.5yM 내지 lOOyM로 포함될 수 있다. 상기 범위로포함될 경우 효과적이고독성없이 효과를 발현할수 있다는 점에서 바람직 할수 있다.

[0128] 본 발명에서 "히스톤 디메틸라제 억제제” 는 히스톤 H3에서 발견되는 2 개의 라이신을 선택적으로 탈메틸화하는 효소인 L況) 1을 억제하는 역할을 하며, 모노아민으로부터 산화적 탈 아민화를 저해하는 역할을 한다. 히스톤 디메틸라제 억제제는 InM 내지 lOOmM로 포함될 수 있다. 2020/141648 1»（：1^1{2019/000705

17

[0129] 상기 히스톤 디메틸라제 억제제는 그 종류가 제한되지는 않으나, 구체적으로 파네이트 (parnate; Tranylcypromine) ,SP2509, Cicl ipirox, Daminozide, GSK Jl, GSK J2, GSK J4, GSK J5, G況 LSD1, (R)-2-hydroxyglutaric acid, I 0X1, JIB04, NSC636819, 0G-L002, PBIT, RN 1 di hydrochloride, S2101, TC-E 5002 일 수 있으며， 바람직하게는 파네이트 (parnate; Tranylcypromine) 및/또는 SP2509일 수 있다.

[0130] 상기 히스톤 디메틸라제 억제제 중 파네이트는 InM 내지 ImM 로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.5yM내지 500pM로포함될 수 있으며, 보다바람직하게는 lyM내지 100 pM, 더욱 바람직하게는 10 pM내지 20 pM로포함될 수 있고, SP2509는 InM내지 100nM로포함될 수 있다. 상기 범위로 포함될 경우 효과적이고 독성없이 효과를 발현할 수 있다는 점에서 바람직 할수 있다.

[0131] 본 발명에서 상기 제 1 화합물 칵테일 및/또는 제 2 화합물 칵테일은 RAR 작용제를 더 포함하는 것이 신경보호 및 재생 기능이 있는 단백질 인자가 더 우수하게 발현된다는 점에서 더 바람직 할 수 있다. 본 발명에서, RAR 작용제는 그 종류는 제한되지 않으나, 구체적으로 TTNPB(4 -[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalen yl)-l- propenyl ] benzoic acid； 또는 Arotinoid acid)일 수 있다.

[0132] 상기 RAR작용제는 InM내지 500 yM로포함될수 있으며 , 바람직하게는 10nM내지 2yM로 포함될 수 있으며， 보다바람직하게는 20 uM내지 1.5UM, 더욱바람직하게는 luM내지 2yM 로 포함될 수 있다, 상기 범위로 포함될 경우 효과적이고 독성없이 효과를 발현할 수 있다는 점에서 바람직 할수 있다.본 발명에서 체세포 (somatic cell)은 그 종류가 제한되지 않으나, 각종 조직에서 분리된 섬유아세포 (fibroblast), 혈액, 지방세포를 포함하는 완전 분화된 체세포 및/또는 랫줄, 태반, 제대혈, 골수, 피, 지방 등에서 존재하는 성체줄기세포 (adult stem cell 혹은 somatic stem cell) 일 수 있다.

[0133] 본발명은히스톤디아세틸라제 억제제 , GSK억제제, ALK-5키나아제 억제제 , cAMP작용제, 히스톤 디메틸라제 억제제， RAR 작용제를 포함하는 제 1화합물 칵테일을 상기 체세포에 처리하여 분화를 유도하는 분화 유도 단계를 포함하여 제조되는 체세포로부터 분화한 유사신경교세포의 제조방법을 제공한다.

[0134] 상기 분화유도단계는히스톤 디아세틸라제 억제제 , GSK억제제 , ALK-5키나아제 억제제 , cAMP 작용제 및 히스톤 디메틸라제 억제제를 포함하는 제 1화합물 칵테일을 상기 체세포에 처리하여 분화 유도하는 것일 수 있다. 본 발명은 상기 분화 유도 단계를 포함하여 제조된 체세포로부터 분화된 유사신경교세포라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 상기 분화 유도단계 후 재배양 (re-culture)하는단계를 더 포함하는 것이 보다바람직할수 있다.

[0135] 또한, 본 발명은 히스톤 디아세틸라제 억제제, GSK 억제제, ALK-5 키나아제 억제제, cAMP 작용제 및 히스톤디메틸라제 억제제를포함하는제 1화합물칵테일을상기 체세포에 처리하여 2020/141648

18 분화를 유도하는 분화유도 단계; 상기 분화유도 단계 및 재배양 단계 사이에， G況 억제제, ALK-5 키나아제 억제제 및 cAMP 작용제를 포함하는 제 2화합물 칵테일을 제 1화합물 칵테일 처리된 체세포에 추가로 처리하여 성숙시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 성숙시키는 단계가포함될 경우 성숙 시키는 단계는 분화유도 단계 일수와 같거나 짧은 것이 바람직 할 수 있다.

[0136] 또한, 본 발명은 히스톤 디아세틸라제 억제제 , G況 억제제 , ALK-5 키나아제 억제제 , cAMP 작용제 및 히스톤디메틸라제 억제제를포함하는제 1화합물칵테일을상기 체세포에 처리하여 분화를 유도하는 분화 유도 단계를 포함하는 유사신경교세포를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

[0137] 또한, 본 발명은 상기 분화 유도단계 후 재배양 (re-cul ture)하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 재배양단계가포함될 경우저분가없는배양액 및/또는배지에서 안정되게 계대 배양 가능한유사신경교세포가 제공 가능하다는 점에서 보다바람직할수 있다.

[0138] 본발명의 제조방법은유도단계 및 재배양하는단계사이에 , G況억제제 , ALK-5키나아제 억제제 및 cAMP작용제를 포함하는 제 2화합물 칵테일을 제 1화합물 칵테일 처리된 체세포에 추가로 처리하여 성숙시키는단계를더 포함할수 있다. 상기 성숙시키는단계가포함될 경우 성숙 시키는 단계는 분화유도 단계 일수와같거나짧은 것이 바람직 할수 있다.

[0139] 또한, 본 발명은 상기 분화 유도단계 후 세포를 성숙시키는 단계 (maturat ion)； 및 상기 유도단계 후 혹은 유도 와 성숙단계 후 재배양 (re-cul ture)하는 단계를 더 포함하는 것인, 체세포로부터 분화한유사신경교세포의 제조방법을제공한다 .

[0140] 상기 분화 유도 단계는 섬유아세포와 같은 분화대상세포 (예를 들어, 섬유아세포 둥)를 활성화시켜서 분화목표세포 (예를들어,신규한유사신경교세포)단계로진입 하게하는역할을 한다. 분화유도 단계는 3일 이상 이루어질 수 있으며 , 바람직하게는 3일 이상 18일 이하일 수 있다.

[0141] 상기 성숙 시키는 단계는 분화목표세포로 진입한세포가완전히 목표세포의 활성을 가질 수 있도록 배양하는 것을 의미한다. 분화 성숙 단계는 3일 이상 이루어질 수 있으나, 상기 분화 유도 단계를 길게 조절하면 성숙 시키는 단계를 대신할 수 있고, 이 경우 성숙 단계는 생략가능 할수 있다.

[0142] 상기 재배양단계는분화된 세포가저분자화합물없이 계대 배양이 가능한안정된 세포로 유지될 수 있도록 하는 데 필요하다. 상기 재배양단계는분화유도된 세포를 3 일 이상추가 배양하는 단계를포함할수 있으며 , 재배양된 세포는 안정하게 계대 배양이 가능하여 장기간 배양이 가능하지만 3일 이상 12일이하의 재배양기간이 더욱바람직할수 있다. 상기 재배양 단계는 매트리겔이 제거된 상태로 세포를 배지에 배양시키는 단계를 포함하는 것으로, 보다 구체적으로재배양단계는저분자화합물및 매트리겔 (Matr igel , BD biosc ience사)이 포함되지 0 2020/141648

19 않숀 채로 체세포로부터 분화유도된 유사신경교세포를 추가 배양하는 단계를 포함하는 것을 의미한다.

[0143] 보다 구체적으로 재배양 단계는 하기와 같은 방법을 통하여 이루어 질 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 1XPBS로 체세포로부터 분화 유도 단계 및/또는 성숙 단계를 거친 세포를 두번 세척하고, 15분동안 인큐베이터에서 따뜻한 accutase ^® 용액 (37°C 항온수조에서 보관) 3m 1를 추가한다. 15분 후, 광학현미경 (bright-field microscope)에서 세포 분리를 관찰 여부를 확인한다. Complete DMEM을 첨가하고, 상기 용액을 부드럽게 피페팅해서 60mm 접시로부터 세포가들어있는매트리겔층을분리한다. 셀스트레이너 (cell strainer)에 용액을 통과시켜 매트리겔 덩어리률제거한다. 1000rpm/5분/RT에서 상기 여과된 세포를원심분리한다. 상등액을 버리고 complete 슈반세포 배지 (science research laboratory)에 세포 필렛(cell pellet) 부드럽게 흔들어 다시 섞는 과정 (resuspend)을 진행하고, 이를 매트리겔 등의 코팅 없는새로운플레이트에 첨가한다. 세포가 첨가된 플레이트를 37°C인큐베이터에 보관하면서,

3일마다 배지를 교체하면서 총 3 내지 12일 바람직하게는 6 내지 12일동안 배양한다.

[0144] 상기 재배양 단계 이전의 분화유도 단계 및/또는 성숙 시키는 단계는 매트리겔이 포함될 수 있다.

[0145] 또한, 상기 재배양 단계는 액체 질소 (N ₂ )하에서 동결시키는 단계를 포함할 수 있다. 즉 12일 이상 장기간 보관해야 하는 경우 배양을 계속하는 방법 대신 동결건조를 하여 장기간 보관하고 필요시 해동하여 다시 재배양 배지에서 배양할 수 있다.

[0146] 본 발명의 신규한 유사신경교세포는 체세포로부터 분화되는 것으로, 분화의 효율은 유사신경교세포로 특징 지워지는 형태를 갖는 세포의 정도, 혹은 HGF, MIF나 BDNF로 특징 지워지는 유사신경교세포에서 과발현되는 단백질 인자의 분비정도, 혹은 각 세포의 발현되는 gene을 마커 (maker)로 기준 삼아 판단할 수 있는데 , 상기 마커는 섬유아세포에서 발현되는 FBLN5 , DKK1 , FBN1 , PRRX1 및/또는 ECM1 등과 신경교세포에서 발현되는 MBP, NDGR1 , GALC ,GFAP및/또는 MPZ등으로 구분할 수 있다. 우수한 효율로 체세포가 유사신경교세포로 분화되는 경우, 섬유아세포에서 우수하게 발현되는 FB내 5 , DKK1 , FBN1 , PRRX1 및/또는 ECM1 등의 발현량이 낮아지고, 신경교세포의 마커인 MBP, NDGR1 , GALC ,GFAP 및/또는 MPZ 등의 발현량이 높아 진다 (도 23 내지 27 참조) .

[0147] 또한, 본 발명은 상술한 체세포로부터 분화된 신규한 유사신경교세포를 유효성분으로 포함하는 신경 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다. 상기 신경 질환이란, 신경퇴행성 질환, 유전에 의한신경질환, 신경 손상에 질환등을 의미하며, 상기 신경퇴행성 질환이란 근위축성 측색 경화증 (ALS) , 전두측두엽 치매 (FTD) , 알츠하이머 병, 파킨슨 병， 노인성 치매, 헌팅턴 병 등을 포함하고, 유전에 의한 신경질환은 질 드 라 뚜렛 증후군(Gilles de la Tourettes' syndrome) , 선천성 운동 및 감각 신경병증, 샤르코 - 마리 - 투스 병 (CMT) , 가족성 자율신경 2020/141648 1»（그1^1{2019/000705

20 실조증 (Fami l i al Dysautonomi a) , 로우증후군, 로웨 증후군 (Lowe syndrome) , 레트증후군 (Rett Syndrome) , Cerebral Autosomal Dominant Arter iopathy wi th Subcort ical Infarcts and Leukoencephalopathy(CADASIL) , 결절성 경화증 (Tuberous Scl erosi s) , 모세혈관 확장성 운동 실조증후군 (Atax i a tel angi ectas i a) , 신경섬유종중 (Neurof i bromatos i s)등이 있고, 손상에 의한 신경질환에는 다발성 경화증 (mul t ipl e scleros i s) , 길랑 - 바레 증후군 (GBS) , 급성 염증성 탈수초성 신경병증 polyradi culopathy 형) , schwannomatos i s 및 만성 염증성 탈수 초성 신경 병증 (CIDP) , 당뇨병성 신경병증, 항암제에 의한신경병증, 외상에 의한 말초신경 절단, 및 척추손상 (spinal cord injury) , 녹내장 등의 말초 및 중추신경계 조직을포함하는 여러 가지 신경 손상 질환등을 들수 있다.

[0148] 또한, 본발명은상술한체세포로부터 분화된유사신경교세포를신경질환이 유발된 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경 질환을 예방및 치료하는 방법을 제공할수 있다.

[0149] 본발명에 따른세포치료제는 약학적으로유효한양의 유사신경교세포를포함하거나하나 이상의 약학적으로허용되는담체, 부형제 또는희석제를포함할수 있다. 상기에서약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

[015이 본발명에 따른활성성분인유사신경교세포는 lxl0 ² ~ lxlO ¹⁵ 의 세포수로포함될수있으며 , 상기 약학적으로 유효한 양은 면역질환 증상의 정도， 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

[0151] 또한, 상기에서 약학적으로 허용되는 이란생리학적으로허용되고 인간및/또는포유동물 등에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨， 자일리톨, 에리스리톨， 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물 , 메틸하이드록시벤조에이트 , 프로필하이드록시벤조에이트 , 탈크 , 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료， 유화제 및 방부제 등을추가로 포함할수 있다.

[0152] 또한, 본 발명의 세포치료제는 인간 및/또는 포유동물등에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은분말, 과립, 정제， 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는경질 젤라틴 캄셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

[0153] 또한， 본발명에 따른신경 질환을치료및/또는예방하기 위한치료제는경구, 경피， 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며 , 손상부외에 직접 주사하거나 및/또는 수술을 통한 이식 방법 등으로 투여될 수 있다. 또한, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할수 있다.

[0154] 본발명은슈반세포와매우유사한특성을갖는신 경 재생 , 복구및신경보호세포기능을 갖는 신규한 유사신경교세포로의 인간 섬유아세포의 화학 기반 전환의 개발을 보고한다. 우리는 히스톤 디아세틸라제 억제제, G況 억제제, ALK-5 키나아제 억제저｝, cAMP 작용제 및 히스톤 디메틸라제 억제제를 포함하는 화합물 칵테일들이 이러한 전환에 중요하다고 판단했으며, 이러한신규한신경 세포 타입의 여러 양상을 특정하여 규명하고 이의 기능성을 평가하기 위하여 하기와같은제조예 , 실시 예등을제공한다. 다만, 본발명의 실시가하기에 제한되는 것은 아니다.

[0155] 제조 예: 다양한 프로토콜 하에서의 유사신경교세포 (신경복구 및 신경보호 기능을 갖는 세포; Neurorepair-and-protect ion cell; 이하 ’’유사신경교세포"라 함)의 제조 유사신경교세포의 생성

[0156] 제조예 1： 세포배양

[0157] 인간 포피 (foreskin) 섬유아세포 (SCC058, Millipore사)를, 10%抑 S 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 (Welgene사)이 첨가된고농도글루코스 DMEM (Welgene사)에서 배양했다. 인간 슈반 세포를, 성장 첨가제 (Science사) 및 1¾ 페니실린 및 스트렙토마이신 (Welgene사)을 함유하는 슈반 세포 기본 배지 (ScienCell사)로 구성된 슈반 세포 배지에서 배양했다. ᅩ인간 뉴런세포주 NSC34룰, 10¾抑 S및 15¾페니실린 및스트렙토마이신 (Welgene사)이 첨가된고농도 글루코스 DMEM (Welgene사)에서 배양했다

[0158】 제조예 2： 분화에 사용되는 배지의 제조

[0159] 분화유도배지 (Reprogramming media;RM) :녹아웃 DMEM (Gibco사), 15%녹아웃혈청보충물, 5¾ FBS (Gibco사), 1% Glutamax (Gibco사), 1% 비필수 아미노산 (Gibco사), 0.1 mM P - 머갑토에탄올 (Sigma사) 및 IX페니실린/스트렙토마이신 , 제 1화합물칵테일 (표 1, 혹은도 2： 500 uM 발프로산 (V), 10 uM CHIR99021 (C)； 5 pM RepSox (R)； 25 pM포스콜린 (F)； 10 pM 트라닐시프로민 (P)； 1 pM TTNPB (T)), (칵테일에 사용된 모든 소분자 물질들은 Medchemexpress사로부터 얻었음).

[016이 [표 1] () 2020/141648 1»(：1/10公019/000705

22

[0161]

[0162] 녹아웃 ®! 的比⑶사) , 15%녹아웃 혈청 보충물,

IX페니실린/스트렙토마이신), 10 !1¾1抑 99021 (0； 5 1切9¾표 (10; 25 포스콜린 ( 로 구성된 제 2화합물 칵테일을 함유.

[0163] 재배양 배지 (reculture media): 성장 첨가제 (Science 사) 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Welgene사)을 함유하는 슈반 세포 기본 배지 (ScienCel 1사)로 구성된 슈반 세포 배지에서 배양했다.

[0164] 제조예 3： 분화에 사용되는 배지의 제조

[0165] 표 1 혹은 도 2에 나와 있는 제 1 화합물 칵테일 에 사용된 화합물 대신, 표 2 혹은 도 6에 나와있는 화합물로 대체되었다는 점만을 제외 하고는 제조예 2와 동일한 구성으로 배지를 제조하였다. 제 2 화합물 칵테일의 경우 하기 표 2에서 , 2090314, 88-431542 및 ■¾77가 포함된 것 이외에는 제조 예 2의 성숙배지 제조방법과동일하게 제조하였다.

[0166] [표 2]

정정용지 (규칙 제 91조) / 2020/141648 1»（그1^1{2019/000705

23

[0168] 실시예: 프로토콜 I, II내지 III으로제조한유사신경교세포의 제조

[0169] 도 3에서 보는 바와 같이 초기 전환을 확인한 후, 우리는 몇몇의 다른 전환 프로토콜을 이용했고전환효율을모니터링했다. 전환조건에 따라, 유사신경교세포들은 3개의 프로토콜, 즉, 프로토콜 I （도 14）, 프로토콜 II （도 15） 및 프로토콜 III （도 16） 유사신경교세포 타입들로 분류된다 （도 14 내지 16）. 프로토콜 1은 성숙 시간의 변화에 따라 유도 시간이 고정되는특징이 있고 , 프로토콜 2는유도시간이 변화되는특징이 있고, 프로토콜 3는분화된 세포를 화학물질이 없이 재배양되는 특징이 있다. 프로토콜 I, 프로토콜 II 및 프로토콜 III에 의해 전환된유사신경교세포들은각각 -유사신경교세포（ -亂 , 02 -유사신경교세포 （02^0 및 03 -유사신경교세포 0：3-此0라 부르고, 이들 각각의 세포모양을 현미경 분석을 통해 조사하였을때 （도 18내지 20）, 분화에 사용된 본래의 인간포피 섬유아세포（도 17）와는 다른모양을보였지만 인간슈반세포 （도 21）와비슷한 형태임을 알수 있었다.

[017이 실시예 1： 프로토콜 1（（：1 -유사신경교세포의 제조）:

[0171] 인간 포피 섬유아세포를 트림신 처리하고 에 재현탁한다. 세포를 매트리겔이 코팅된 60ä） 조직 배양 플레이트（실온에서 2 시간 동안 1: 100 매트리겔犯 이야 6 63사）로 미리 코팅됨）에 6 0 ⁵ 세포수의 밀도로분주한다. 그배양액을 3일마다새로운 1¾1배지로교체하여 , 분화 유도 단계에 의한 배양을 진행한다. 상기 분화 유도 단계에 의한 유도（比£111（：니011）를 6일까지 계속한다. 유도 6일째에 , 배양액을關으로교체하고추가의 3내지 12일 동안성숙 시키는 단계에 의한 배양을 계속한다.

[0172] 실시예 1-1： （：1 -유사신경교세포（6+3） 2020/141648 1»（그1^1{2019/000705

24

[0173] 상기 실시예 1에서 성숙 시키는 단계에 의한 배양을 3일로 한 것이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한유사신경교세포

[0174] 실시예 1-2： C1-유사신경교세포 (6+6)

[0175] 상기 실시예 1에서 성숙 시키는 단계에 의한 배양을 6일로 한 것이외에는 실시예 1과 동일한방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한유사신경교세포

[0176] 실시예 1-3： C1-유사신경교세포 (6+9)

[0177] 상기 실시예 1에서 성숙 시키는 단계에 의한 배양을 9일로 한 것이외에는 실시예 1과 동일한방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한유사신경교세포

[0178] 실시예 1-4： C1-유사신경교세포 (6+12)

[0179] 상기 실시예 1에서 성숙 시키는 단계에 의한 배양을 12일로 한 것이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한유사신경교세포

[018이 실시예 2： 프로토콜 II(C2 -유사신경교세포의 제조) :

[0181] 인간 포피 섬유아세포를 트림신 처리하고 RM에 재현탁한다. 세포를 매트리겔이 코팅된 60mm조직 배양 플레이트 (실온에서 2 시간 동안 1: 100 매트리겔(BD Biosciences사)로 미리 코팅됨)에 6xl0 ⁵ 세포수의 밀도로분주한다. 그배양액을 3일마다새로운 RM배지로교체하여 분화 유도 단계에 의한 배양을 수행한다. 분화 유도 단계에 의한 배양을 6 내지 15일간 계속하고, 유도 기간 후 즉시 3일간의 고정 성숙 기간(fixed maturation period)을 두었다. 혹은성숙기간 없이 18일간유도하였다.

[0182] 실시예 2-1： C2 -유사신경교세포 (6+12)

[0183] 상기 실시 예 2에서 분화유도단계에 의한배양을 6일, 성숙시키는단계에 의한배양을 12일로 한 것 이외에는 실시 예 2와 동일한 방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한 유사신경교세포

[0184] 실시예 2-2： C2 -유사신경교세포 (9+9)

[0185] 상기 실시예 2에서 분화유도 단계에 의한 배양을 9일, 성숙 시키는 단계에 의한 배양을 9 일로 한 것이외에는 실시예 2 와 동일한 방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한 유사신경교세포

[0186] 실시예 2-3： C2· ^· 유사신경교세포 (12+6)

[0187] 상기 실시예 2에서 분화유도 단계에 의한배양을 12일 , 성숙시키는 단계에 의한배양을 6 일로 한 것이외에는 실시예 2 와 동일한 방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한 유사신경교세포 \¥0 2020/141648 1»(71710 ^{ 2019/000705

25

[0188] 실시예 2-4： 02·유사신경교세포 (15+3)

[0189] 상기 실시예 2에서 분화유도단계에 의한배양을 15일 , 성숙시키는단계에 의한배양을 3 일로 한 것이외에는 실시예 2 와 동일한 방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한 유사신경교세포

[019이 실시예 2-5： 02-유사신경교세포 (18+0)

[0191] 상기 실시예 2에서 분화유도단계에 의한배양을 18일, 성숙시키는단계에 의한배양을 0 일로 한 것이외에는 실시예 2 와 동일한 방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한 유사신경교세포

[0192] 실시예 3： 프로토콜 111(03-유사신경교세포의 제조)

[0193] 인간 포피 섬유아세포를 트림신 처리하고 湖에 재현탁한다. 세포를 매트리겔이 코팅된 60 조직 배양 플레이트 (실온에서 2 시간 동안 1 : 100 매트리겔

코팅됨 )에 6 0 ⁵ 세포수의 밀도로분주한다. 그배양액을 3일마다새로운 1¾1배지로교체한다. 유도를 6일까지 계속한다. 유도 6일째에 , 배양액을■으로교체하고추가의 3일 동안성숙 시키는단계에 의한배양을계속하거나, 성숙시키는단계를 생략한다. 이러한분화유도단계 또는 성숙 단계에 의한 배양의 종료 시 , 그 세포를 아큐타제 세포 탈착 용액 ( 1 1 1{30 사) 처리를 통해 수확하고, 그 수확된 세포를 슈반 세쏘 배지에 재현탁하고 새로운 조직 배양 플레이트에 분주한다. 세포를 추가의 6 내지 12 일간 성장시킨다. 배양액에는 3일 마다새로운 배지를보충했다.

[0194] 실시예 3-1： 03 -유사신경교세포 (6+0+12)

[0195] 상기 실시예 3에서 분화유도 단계에 의한 배양을 6일, 성숙시키는 단계에 의한 배양을 생략 후, 12일간의 재배양 단계를 진행한 것이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한유사신경교세포

[0196] 실시예 3-2 : -유사신경교세포 (6+3+6)

[0197] 상기 실시예 3에서 분화 유도 단계에 의한 배양을 6일, 성숙 시키는 단계에 의한 배양

3일 후, 6일간의 재배양 단계를 진행한 것이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한유사신경교세포

[0198] 실시예 3-3： 期-유사신경교세포 (6+3+12)

[0199] 상기 실시예 2에서 분화 유도 단계에 의한 배양을 6일, 성숙 시키는 단계에 의한 배양

6일 후, 12일간의 재배양 단계를 진행한 것이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조된 체세포에서 분화된 신규한유사신경교세포

[020이 실시예 4： 프로토콜 111-1 (03 -유사신경교세포의 동결 후재배양) 2020/141648 1»（：1^1 ^{ 2019/000705

26

[0201 ] 프로토콜 I I I로제조한 03-유사신경교세포를 6~12일의 재배양의 종료시에 트림신처리하고 재현탁하고 추가의 사용시까지 액체 出에서 동결 보존한다. 사용 시 , 03유사신경교세포의 바이알을 해동하고, 그 세포를 완전 슈반세포 배지에 분주한다.

[0202] 03 -유사신경교세포가 기능성의 손실없이 안전하게 동결되고 해동 후 다시 재배양될 수 있는 지의 여부를 확인하기 위하여, 우리는 상기 동결 및 재배양 실험을 수행했다. 동결된 03 -유사신경교세포의 해동 및 배양 후, 우리는 세포모양 ( 印加比 ) (도 48) , 사이토카인 방출 (도 49) 및 신경돌기 성장촉진 능력 (도 50 및 51)에 있어서 동결 전 세포와의 유의한 변화를 관찰하지 못했다.

[0203] 실험예

[0204] 실험예 1： 저분자화합물을 이용한섬유아세포의 유사신경교세포로의 직접분화

[0205] 체세포에서의 유사신경교세포의 분화와 관련하여, 종래 몇몇의 중요한 신호전달 경로를 조절하는 소분자 물질 (화합물)이 마우스 섬유아세포를 전분화능 줄기 세포 (CiPSC)로 전환할 수 있다는것이 보고된 바는 있다. 또한, 체세포에서 전분화능프로그램의 일시적인 활성화는 이들 세포를 활성화된 상태로 만든다는 것이 종래 연구에서 보고된 바 있다. 즉, 이러한 활성화된 세포들은 이들을 몇몇의 성장 인자 및 사이토카인에 단순히 노출시킴으로써 몇몇의 계통 ( l ineage)으로 유도될 수 있는 가능성이 제시되어 왔다, 이에 본 발명은, CiPSC세포를 생성하기 위해 사용된 것과 유사한 화학물질을 이용하여 유사한 활성화된 상태를 생성하고자 시도하였고, 이러한 상태를 여러 계통으로 유도하고자 시도하였다. 우리는 이러한 화학물질들을 이용한 간략한 처리 방식을 통해 여러 계통으로 유도될 수 있는 활성화상태로 이어질 수 있는 것으로 가정하여 본 발명을 개량하였다 (도 1) .

[0206] 따라서， 우리는 인간섬유아세포를 6~18일간분화유도배지 (RM)에서 6종의 화학물질 , 즉， 발프로산 (V) , Chi r99021 (C) , Repsox (R) , 포스콜린 (F) , Parnate (P) 및 TTNPB(T)로 처리한 다음 (표 1 혹은 도 2) , 추가의 3 내지 12일 동안 CHIR99021 (0 , RepSox (R) 및 포스콜린 (F)를 함유한 성숙 배지 (MM)에서 유지하여 유사신경교세포로 전환하고 전환된 세포를 화합물 없이 슈반세포배지에서 재배양하였다 (도 1) . 이렇게 얻어진 유사신경교세포는 인간섬유아세포와는 전혀 다른 모양을 갖지만 인간슈반세포와 비슷한 핵/세포질 비를 갖는 스핀들 형상의 세포모양 (morpho l ogy)를 갖는다는 것을 확인 확인하였다. (도 3 , 도 22) . 보다 자세히 유사신경교세포는길이가 50-300 이고직경이 15-50 v L인 기다란형태의 세포로써 부풀어져 있는 중심 부분에서 양끝 혹은 여러 개 (< 10)의 끝으로 가늘어 지고, 어떤 경우, 이 끝부분이 폭 1 미크론 정도의 긴 실 모양을 띤다.

[0207] 유사신경교세포는 유도단계 ( induct ion) , 성숙단계 (maturat ion) , 그리고 재배양 (recu l ture)과정을 거쳐서 만들어 지는데 (도 1) , 각 단계를 위해 세포를 각 각 유도배지, 2020/141648 1»（：1^1{2019/000705

27 성숙배지 혹은 재배양 배지에 유지하는 데 , 이 때 유지시간을다양하게 변화시켜도 (3~15일 , 도 14내지 16) 유사신경교세포분화에 큰 변화는 없었다 (도 18내지 20) .

[0208] 성공적 분화의 여부는 이러한 세포모양 (morphology)에 기반한 기준에 의해 판단되었으며 (도 3) , 우리는최소한의 필요한화합물칵테일을파악하였다. 이를위하여, 우리는기본화학 칵테일로부터 한 번에 하나의 화학물질을 제거했고 (도 4 내지 11참조. ) 현미경적 명시야 이미지를 이용하여 , 6종의 화합물 (V,C,R,F,P및 을 이용하여 전환된 유사신경교세포에 대한 얻어진 세포의 유사함 (resemblance)을 평가했다 (도 3) . 이에 V, C, R, 및 P중 어느하나를 제거하였을때 는유사신경교세포분화효율이 떨어지는 것을관찰했다 (도 4내지 9) . 또한, 우리는 포스콜린의 제거가 전환 수율에 가장 심한 영향을 미친다는 것을 관찰했다 (도 8) . Parnate및 TTNPB의 제거는 전환수율이 저하되었지만전환은 가능함을 확인하였고 (도 10) , TTNPB의 제거는최소의 영향내지는거의 영향을미치지 않았다 (도 11) . 이러한관찰결과를 종합하여, 우리는 V, C, R, F및 P가섬유아세포를 유사신경교세포 형태를 나타내는데 필요, 충분조건에 해당하는 것으로, 제 1화합물 칵테일로서 선정하였다.

[0209] 이에 더하여 , 제조예 2의 화합물 칵테일 (도 12)로 처리된 경우의 인간 섬유아세포도 제조예 1의 화합물칵테일로처리된섬유아세포와같은세포 모양 (morphology)변화를나타내고, 제조 예 1의 화합물 칵테일을 통해 얻은 것과 매우 유사하게 유사신경교세포로 분화되었다 (도 13) .

[021이 실험 예 2： Microarray (도 23내지 27및 도 71내지 74)

[021 1 ] DNase I로 처리한전체 RNA를위에서 언급한바와같이 RNeasy Mini키트 (QIAGEN사, CA, USA)를 이용하여 추출했다. GeneChip Mouse 2.0 ST arrays (Affymetrix사, CA, USA)에의 혼성화를수행했다. 얻어지는 데이터를요약하고, Affymetrix® Power Tools (Affymetrix사, CA, USA)에서 실시된로버스트다중평균(robust multi-average)방법을이용하여 정규화했다.

[0212] 유전자 클러스터링 (clustering)을 위해서는 GSE 데이타베이스 (GSE87385)에 들어 있는 인간 슈반세포, 별교세포 및 돌기교세포의 마이크로어레이 결과에서 각 세포에서 발현이 증가하는 유전자와 본 실험에서 사용한 섬유아세포, 유사신경교세포, 슈반세포의 마이크로 어레이 결과에서 발현이 두 배 이상 증가하는 유전자를 Venny2.1 (http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)fmf 이용하여 비교 분석 하여서 두 그룹에서 공통으로 발현이 . 증가하는 유전자들을 선택하였고, ClustVis

(https://bi it .cs.ut.ee/clustvis/)를 이용하여 유전자 clustering을하여 heatmap을그렸다 (도 23 내지 25 참조; 도 23의 보다구체적인 도면은 도 71 내지 74에 기재하였음) .

[0213] 또 한 분석 결과는 유전자 수준 분석으로서 내보내 졌고 차별 발현 유전자 (DEG) 분석이 수행되었다. 발현 데이터의 통계적 유의성은 배수 변화(fold change)를 이용하여 확인했다. DEG세트의 경우, 유사성의 척도로서 완전연결(complete linkage)및유클리드거리 (Euclidean 2020/141648 1»（：1^1 ^{ 2019/000705

28 distMce)를 이용하여 계층적 군집 분석을 수행했다. 유의한 프로브 리스트에 대한 유전자 증폭 및 기능석 주석 (Gene-Enrichment and Functional Annotation) 분석을 유전자 온톨로지 (Gene Ontology) (http: //geneontology.org) 및 KEGG(http: //kegg.jp)를 이용하여 수행했다 (도 26) . 데이터 분석 및 차별 발현 유전자의 시각화는 모두 R 3.0.2 (www.r- proiect .org)를 이용하여 수행했다.

[0214] 상기 실험 예 2에서 실시된 실험에 대한결과값은 도 23-25에 기재하였다.

[0215] 상기 도 23 내지 25에 의한 결과를 살펴보면, 인간 슈반세포에서 과발현된다고 알려진 유전자들은 본 실험에서 사용한 섬유아세포에서는 발현되지 않지만, 본 실험에서 사용한 인간슈반세포 및 유사신경 교세포에서 대 부분발현되고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 인간 별교세포에서 과발현된다고 알려진 유전자들은 본 실험에서 사용한 섬유아세포에서는 발현되지 않고, 본 실험에서 사용한 인간슈반세포에서는 일부 발현이 되지만 유사신경 교세포에서 대부분 발현되고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 인간 돌기교세포에서 과발현된다고 알려진 유전자들은 본 실험에서 사용한 섬유아세포에서는 발현되지 않고, 본 실험에서 사용한 인간슈반세포에서는 일부 발현이 되지만 유사신경 교세포에서 대부분 발현되고 있다는 것을 확인할수 있었다.

[0216] 상기 도 26 에 의한 결과를 보면 _, 유사신경교세포에서 발현되는 유전자들을 살펴보면 astrocyte나 microgl ia같은신경교세포에서 발현되는유전자의 발현이늘어나고있음을확인할 수 있다.

[0217] 상기 도 27의 결과를보면 , 신경교세포의 마커 유전자인 MBP, GFAP, NDRG1 , GALC, MPZ등의 발현은 유사신경교세포 및 인간 슈반세포에서 늘어나 있지만, 섬유아세포의 특징적인 마커유전자인 FBN1 , FBLN5 , PRRX1 , ECM1 , DKK1등은 유사신경교세포 및 인간 슈반세포에서 현저히 감소해 있음을 확인할수 있다.

[0218] 실험예 3： 면역염색

[0219] 유도 단계 및/또는 성숙 단계, 혹은 재배양 단계 후의 인간 섬유아세포 유래의 유사신경교세포 (Glia-1 ike Cell, GLC)를 수확하고 IX PBS (Welgene사)로 2회 세척하고, 4% 파라포름알데히드 (Sigma-Aldrich사)로 10 분간 고정한 다음， 22 ° C에서 10 분간 PBS에서 0.25% Triton X-100 (USB Corporat ion사)로 투과처리하고 PBS로 각 5분씩 2회 세척하였다. 다음에 , 세포를 PBS에서 1¾ BSA (Amresco사) , 22.52 mg/mL 글리신 (Affymetr ix사) , 0. 1% Tween 20 (Affymetrix사)를 함유하는 블로킹 용액으로 60 분간 블로킹했다. 다음에 , 그 세포를 4 °C에서 밤새 블로킹 용액으로희석한적절한 1차항체로염색하였다. 사용된항체는 토끼 항-GFAP 항체 (Abeam사， 희석 1 : 100) , 토끼 항 S-100 항체 (Abeam사, 희석 1 : 100) , 및 마우스 모노클론 PO (MBP) 항체 (Abeam사, 희석 1 : 100)였다. 일차 항체 배양 후, 세포를 PBST에서 3회 세척하고， 1 : 100으로 희석된 Alexa-488 -접합 염소 2차항마우스항체 (A11001 , 2020/141648 1»(：1^1{2019/000705

29 -563 -결합염소 2차항토끼항체 21428, 打 사)와실온에서 2시간동안배양하였다. 세포를 실온에서 배양하여 핵을 염색하였다. 이어서 형광 현미경 ( 1X713^3, 이 ^[)113사)을 사용하여 샘플을 가시화했다.

[022이 상기 실험예 3에서 실시된 실험에 대한결과값은 도 28및 도 29에 기재하였다. 상기 도 28 및 29의 결과를 살펴보면, 대 부분의 유사신경교세포가 신경교세포의 특징적인 마커 단백질인 5100 , 圖 를 발현하고 있음을 확인할 수 있다. 유사신경교세포가신경 복구 및 보호에 필수적인 중요한 신경교세포 마커들을 발현하였기 때문에 유사신경교세포가 신경교세포와유사하게 신경세포를 보호 및 복수하는 특성을 갖는다는 결론을 얻었다.

[0221] 실험예 4： 정량적 [ -ᄄ묘

[0222] 다음에, 우리는 여러 시점에서 C1-유사신경교세포의 글로벌 유전자 발현 패턴을 프로파일링하고 중요한슈반세포/신경교 세포 마커에 대하여 조사했다.

[0223] 유사신경교세포를 여러 시점에서 수확하고, 전체 RNA를 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 이용하여 추출하고, 5 ug의 전체 RNA를 RNA to cDNA EcoDry Premix (01 igo dT, Clontech사)를 이용하여 cDNA로합성했다. Bio-Rad Prime PCR기기 상에서 SYBR Green PCR Master Mix (Bio_ Rad사)를 이용하여 정량적 RT-PCR을 수행했다. 상기 qRT-PCR 조건은 95° C에서 30초, 58° C에서 15초및 72° C에서 15초를 1사이클로하는 40사이클이었다. 본실험에서사용된 프라이머는 표 3에서 나타낸다.

[0224] [표 3] List of RT PCR primers

[0226] 체세포, 슈반세포 및 실시예 1 , 2 내지 3의 프로토콜에 의해 제조된 유사신경교세포의 상기 -灰 의 각유전자발현 레벨의 결과는 도 30내지 32에 나타내었다.

[0227] 상기 도 30내지 32에 의한결과를살펴보면,유사신경교세포에서는� �유아세포의 대표적인 마커유전자인 [) 1이나 표내 5의 발현은 거의 없거나 현저히 감소되어 있지만, 신경교세포의 2020/141648 1»（그1^1{2019/000705

30 마커 유전자인 MBP, GALC그리고 NDRG1의 발현 양이 높아져 있음을확인할수 있었다. 이러한 결과는유사신경교세포가섬유아세포의 특징을 잃고신경교세포의 특징을 얻었음을말해준다.

[0228]

[0229] 실험예 5： 사이토카인 검출 및 도트블롯

[023이 말초 신경계 및 중추 신경계에서 신경교 세포를 지지하는 신경 보호 및 복구 특성은 일반적으로, 그 세포에 의해 방출되는 몇몇의 성장 인자 및 사이토카인에 의해 부여된다. 여러 종류의 생성된유사신경교세포들도유사한단백질분비 특성을갖는지의 여부를확인하기 위하여, 우리는 분비된 사이토카인 및 성장 인자들을 프로파일링했다. 섬유아세포를 실시예 1 , 2 내지 3 의 프로토콜에 기반하여 유사신경교세포 (GLC)로 전환한다. 조절된 배지 (Condi t ioned medi a)를 위에서 각 프로토콜의 마지막 단계에서 회수하고 원심분리하여 임의의 세포찌꺼기 또는입자상물질을제거했다. 상기 조절된 배지를도트블롯 키트 (Human proteome prof i ler , R&D systems 사)에 제공된 희석 완충액에 20 배 희석했다. 상이한 프로토콜을 통해 제작된 유사신경교세포 의 조절된 배지에서 분비되는 여러 사이토카인이나 성장인자를검출하기 위한도트블롯실험을제조사의프로토콜 (R紙 ⁾ systems)에 따라수행했다. 기본 배지를 음성 대조군으로 사용했다. 상기 도트 블롯 키트에서 제공되는 사이토카인이나 성장인자들의 분비를 도트블롯을 통해 확인을 하였고, 이 들 중에서 섬유아세포에 비해 유사신경교세포에서 분비량이 뚜렷하게 증가하는 인자들은 도 33에 나와 있는 것들이었다.

[0231] 상기 도 33에 의한결과를살펴보면, 시험된 여러 사이토카인이나성장인자들 중에서， 몇 몇은 섬유아세포에서의 것들보다 유의하게 많은 양으로 유도 및 분비되었다. 예를들어 MIF, CXCL12 , IL8 , BDNF , GRO-alpha , HGF등이 유도신경교세포에서 많이 분비되었다. 이 들중 MIF, BDNF및 HGF의 양은 인간슈반세포에서의 것들보다유의하게 많이 분비된다 (도 33) .

[0232] 실험예 6： 比比쇼

[0233] 여러 프로토콜의 유사신경교세포에 의해 배지내에 방출된 여러 사이토카인들의 정량 (Quant i tat ion)을 抑 NF 및 GDNF (Promega사) IL8 , HGF , MIF , GR0-a (R&D systems사)에 대한 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용하여 수행했다. 위에서 언급한 여러 프로토콜에 따라 섬유아세포를 유사신경교세포로 전환한다. 조절된 배지를 언급한 바와 같이 여러 시점에서 회수하고원심분리하여 임의의 세포찌꺼기 및 입자상물질을제거했다. 상기 조절된 배지를 ELISA키트에 제공된희석 완충액에 20배 희석했다. ELISA정량을제조사의 프로토콜에 따라 수행했다. 기본 배지를 음성 대조군으로 사용했다. 본 실험에서는 면적이 28.2cm ² 인 60mm cul ture di sh에서 3.2 x 10 ⁶ cel l s 을 3일동안 키우는 동안 배지로분비된 각 인자들의 농도에 대하여 측정하였다.

[0234] 상기 실험예 6에 대한결과값은도 34 내지 39에 기재하였다. 0 2020/141648 1»（그1^1{2019/000705

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[0235] 상기 도 34~39에 의한 결과를 살펴보면 대부분의 사이토카인이나 성장인자의 분비가 섬유아세포에 비해 체세포로부터 분화된 유사신경교세포（꾜 에서 유의하게 더 높다는 것을 확인했다 （도 34내지 도 39 참조）. 흥미롭게도, 실시예 3의 프로토콜 II I에 의해 제조된 03-유사신경교세포（此0는다른실시예에 의해 만들어진유사신경교세포（야 -亂（：와 02-比0와 비교하여 표 刀 , 附民 比8 , 冊 들의 분비가 더 많았고 （도 34 내지 39）, 03 - 유사신경교세포는 인간슈반세포및 다른프로토콜에 의한유사신경교세포보다획기적으로많은 冊 를 분비하였다 （도 75 내지 79 참조） .

[0236] 실험예 7： 유사신경교세포용 조절 배지 제조 및 신경돌기 성장촉진 분석

[0237] 슈반 세포는， 축삭의 건강 및 기능성을 촉진하고 축삭 재생에 도움을 주는 많은 신경영양 및 신경보호 인자들을 분비하는 것으로 알려져 있다. 여러 부류에 속하는 우리의 화학적으로 유도된 유사신경교세포가 기능적인 생리학적 대응물（¥11 6대3 ）과 일치하는 지의 여부를 확인하기 위하여 , 우리는 조절된 배지를 제조하고, 운동 신경세포인 腦（：-34를 처리하고, 신경돌기 성장에 미치는 그 배지의 영향을 평가하고자 했다.

[0238] 실시예 1 내지 3 에서 나타낸 프로토콜에 따라 섬유아세포를 유사신경교세포（此 로 전환한다. 각각의 경우마다 전환의 종료 시, 조절된 배지를 회수하고 원심분리하여 임의의 세포 찌꺼기 또는 입자상 물질을 제거했다. 이러한 조절된 배지를 차후의 사용을 위해 - 80° （:에서 보관한다.

[0239] 034운동신경세포를 이용하여 신경돌기 성장촉진 분석을수행했다. 이러한세포들을, 10% 묘 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 이용에 사）이 첨가된 고농도 글루코스 6 에6사）에서 유지한다. 분석을위하여 , 이러한세포를 세척하고洗세포용조절 배지로 이동시키고 추가의 48 시간 동안 성장시켰다. 다음에 신경돌기 촉진을 현미경분석을 통해 평가하고 이용하여 정량했다.

[0240] 상기에 대한 결과 값은 도 40 내지 44에 기재하였다.

[0241 ] 상기 도 40내지 44에 의한결과를살펴보면 우리의 가설과일치하게 , 상기 조절된 배지는, 슈반 세포용 조절 배지와 매우 유사하게（도 44시 신경돌기 성장을 촉진했다 （도 41， 도 42 및 도 43의 쇼들）. 하지만 이러한 성장 촉진 활성이 섬유아세포용 조절 배지에서는 확인되지 않았다（도 40시. 또한, 조절 배지에 의한신경 돌기 성장정도를정량한결과유사신경교세포 조절 배지를 처리한 결과 길이가 긴 신경돌기를 갖는 운동 신경세포 수가 슈반 세포 조절 배지를 처리한 경우와 마찬가지로 유사신경교세포 조절 배지를 처리한 경우 증가하는 것을 확인할 수 있었다 （도 41 , 도 42 및 도 43의 8들）. 하지만 섬유아세포 조절 배지를 처리한 경우 길이가 긴 신경돌기를 갖는 뉴런이 거의 발견되지 않 않았다（도 40 8 ）.

[0242] 실험예 8： 분화 효율 2020/141648

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[0243] 유사신경교세포를신경교세포의 특징적인 마커인 GFAP항체로면역 염색한다음 DAPI 염색 핵을기준으로면역양성 세포들을계수함으로써 전환효율의 정량을수행했다（도 28）. GFAP의 발현을 나타내는 세포들에 의해 결정된 것으로 유사신경교세포로의 전환의 수율은 85% 이다 （도 45）.

[0244] 실험 예 9： C3 -유사신경교세포의 중식능 （5 -에티닐- -디옥시우리딘 염색 분석）

[0245] 재생 의학 및 치료 분야에서 유사신경교세포의 적용 가능성과 관련하여 중요한특징들중 하나는 세포 증식 및 확장의 능력이다. 이러한 특징을 평가하기 위하여 , 재배양의 6일째에 C3 -유사신경교세포 12 시간 동안 Edu 를 혼입한 다음 （Cl ick-iT™ EdU Alexa Fluor™ 555 Jnvi trogen, MA , USA）를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포 제조를 수행했다. 다음에, 그 세포를 핵을 검출하기 위해 Hoechst 33342 로 동시 염색했다. EDU + Hoechst33342양성 세포들을 2개의 개별적인 현미경 시야（mi croscopic f ield）들에서 계수하고 그 현미경 시야에 존재하는 전체 Hoechst33342양성 세포의 백분율로 나타내었다.

[0246] 상기에 대한 결과 값은 도 46 및 47에 기재하였다.

[0247] 상기 도 46및 47에 의한결과를살펴보면실제로면역형광데이터는 C3 -유사신경교세포가 유사분열 활성이 있다는 것을 나타내고 （도 46） 정량결과는 배양액 내의 30¾가 Edu/DAPI 이중 양성 세포라는 것을 나타낸다 （도 47）.

[0248]

[0249] 실험예 10: 유사신경교세포의 동결 및 해동

[025이 유사신경교세포를 이용한 치료제 개발에서 가장 중요한 점 중에 하나는 제작된 세포를 안정되게 보관하고운반할수 있어야하는 점이다. 세포를보관하는가장좋은 방법 중하나는 세포를 낮은 온도에서 동결시키는 방법이 있다. 본 기술을 통해 제작된 유사신경교세포를 동결하고해동하였을때 활성변화를조사하기 위해 C3-G1C냉동배양액 （20%抑 S 10% DMS함유한 고농도포도당 DMEM）에 배양 후 액체질소에서 급속하게 동결시키고 일주일 후 해동하여 슈반세포배양액에서 재 배양하면서 세포의 특징을조사하였다.

[0251] 상기에 대한결과 값은 도 48 내지 51에 기재하였다.

[0252] 상기 도 48 내지 51에 의한 결과를 살펴보면 동결 후 해동된 세포는 동결 전 세포와 비교하여 같은 형태의 세포 모양을 유지하고 있고 （도 48）, 해동된 세포를 배양했을 때 동결 전 세포와 비교하여 다소 감소했지만 （도 49）, 섬유아세포 및 인간슈반세포에 비해 과량의 HGF가 분비되고 있음을확인할수 있었다. 또한해동세포배양액을이용하여 운동신경세포의 세포돌기 성장을유도하였을 때 동결 전 세포와유사한활성을보이는 것을 확인할수 있었다

（도 50 및 51）. 이러한 결과는 향 후 본 발명을 통해 장기 보존 후에도 사용 가능한 유사신경교세포를 제공 가능함을 확인할수 있게 해준 것이다. 0 2020/141648

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[0253] 실험예 11: RAT CCI모델확립 및 유사신경교세포의 이식

[0254] 체세포에서 분화된 유사신경교세포의 세포치료제로의 적용 가능성을 확인하기 위해서 동물모델레서 이 세포의 신경세포보호및 재생기능을확인하여야한다. 이러한목적으로쥐의 대퇴부 신경을 손상시켜서 만성협착모델 （rat chronic constriction injury, CCI , model）을 만들고 손상된 신경에 사람의 섬유아세포, 사람의 슈반세포, 유사신경교세포를 이식한 후 8주후에 신경재생정도를 여러가지 방법으로 분석하여 신경의 재생 정도를 측정하였다.

[0255] 수술을통해좌골신경을노출시킨후외과봉합으 로수축시켜서 RATCCI모델을제조했다. 성숙의 종료시 여러 프로토콜에 의해 제조된다양한종류의 유사신경교세포를수확하고 PBS에 담긴 5.5xl0 ⁵ 개의 세포에 동량의 Tissel 용액을 섞고, 각각의 쥐에 이식하였다. 8주 후 로타로드 라텐시（rotarod latency） 시험, 근전도 측정 염색 분석을 통해 치료적 개선을 평가하고, 이식이 없는 쥐 또는신경 손상이 없는 야생형 쥐와 비교했다. 인간슈반세포 및 섬유 아세포도 동일한 방식으로 시험했다. 로타로드 （도 52） 및 근전도 측정 （EMG） （도 53） 시험 결과는 유사신경교세포 （G3 내지 G5）는 대조군（G2 , 무처리; G6 , 섬유아세포 처리; G7, 인간슈반세포처리）와비교하여 신경 복구기능을갖는다는것을입증한다. 또한좌골신경의 염색 사진 （도 54）을 이용하여 마일린이 회복된 신경의 수를 정량한 결과 （도 55） 역시 시험군이 대조군에 비해 높은 치료효과를 보인다는 것을 보여주었다. 또 한 좌골신경의 액손부위를 전자현미경으로 관찰하고 （도 56） 및 마이엘린층 （Myelin layer）의 두께를관찰한 결과 （도 57） 시험군이 대조군에 비해 유의미하게 마이엘린 층이 두꺼워져 있다는 사실을 확인할수 있었다 （도 57） .이러한결과는 저분자화합물을 이용하여 유도된 유사신경교세포는 쥐 CCI 모델에서 신경 재생을촉진함을 확인해 준다.

[0256] 실험예 12: 칵테일 화합물의 농도에 따른효과검토

[0257] 유사신경교세포로의 전환에 필요한칵테일에서 사용된 화학물질들의 용량（dose）은사용된 화학물질의 IC _5Q 값 및 문헌에 보고된 용량으로부터 선택되었다. 추가로 최적화하고 전환에 사용된화학물질들의 용량범위의 아이디어를 얻기 위하여, 우리는초기 전환에 사용된농도의 2배를 포함하는 용량 및 IC ₅ o값 등 여러 가지 용량 범위를 선택하여 세포 전환 실험을 수행하였다. 우리는 사용된 화학물질의 독성과 함께 전환 수율을 모니터링했다. 화합물 칵테일은 표 4（도 58）에 의해 제조되었으며 , 분화 결과에 대한효과평가는 도 59내지 62에 나타내었다. 상기 도 59 내지 62에 의한 결과를 살펴보면, 최적화된 농도보다 많은 농도가 사용되었을 때 세포에 대한 독성이 일부 보이지만, 세포 전환은 효과적으로 이루어 진다는 것으 확인할 수 있었고, IC _5Q 또는 이의 두 배 정도의 농도를 사용했을 때는 세포전환이 효과적으로 이루어지지 않음을 확인할수 있었다.

[0258] [표 4] 2020/141648 1»（그1^1{2019/000705

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[026이 실험예 13: 다양한체세포를 이용한유사신경교세포분화

[0261] 본 기술을 환자 맞춤형 세포치료제 개발에 이용하기 위해서는 본 기술이 다양한 섬유아세포에 적용이 가능하다는 것을 확인하여야 한다. 따라서 CMT(charcot-mar ie-Tooth di sease)질환을 앓는 환자의 피부 및 Cor i el I Inst i tute에서 구입한 서로 다른 세 가지 섬유아세포를이용하여 각각다른세포를사용하였다는것을제외하고는 실시예 2 , 3의 방법과 동일하게 C2-GLC (15+3) 및 C3-GLC(6+3+6)를 제작하였다. 유사신경교세포 분화 확인은 현미경을 관찰을통해 분화된 세포의 모양을 보고판단하였다.

[0262] (l)CMT(charcot-mar ie-Tooth di sease)환자피부유래 섬유아세포 (도 63 및 64)

[0263] (2)6살남아진피 유래 섬유아세포 (도 65및 66)

[0264] (3) 82살 여성의 피부 유래 섬유아세포 (도 67및 68)

[0265] (4) 47살남성의 포피유래 섬유아세포 (도 69 및 70)

[0266] 상기 세포에 대한유사신경교세포 분화에 대한 결과 값은 도 63-70에 기재하였다.

[0267] 본 실험 결과는 환자를 포함한 다양한 기원의 체세포를 이용하여도 유사신경교세포로의 전환이 가능함을 확인할수 있었다.

[0268] 또한 상기 도 75-76 에 의한 결과를 살펴보면, 환자를 포함한 다양한 인간 유래 섬유아세포로부터 분화된 유사신경교세포에서도 많은 양의 HGF가분비되고 있음을 확인할수 있었다.

[0269] 상기 도 63-70, 더 75-76에 의한 결과를 살펴보면, 인간 유래 다양한 섬유아세포가 유사신경교세포로 효과적으로 분화될 수 있음을 알 수 있다. 이러한 결과는 향 후 유사신경교세포를 이용한 세포 치료제 개발 시에 환자의 섬유아세포를 이용함으로써, 2020/141648 1＞（그1'/표1¾2019/000705

35 타인에게서 얻어진혹은유래한세포치료제에서 문제가되는면역거부반응같은부작용이 없는 치료제 개발이 가능하다는 것을 의미한다.

[027이 실험예 14: RAT SCI 모델확립 및 유사신경교세포의 이식

[0271] 체세포에서 분화된 유사신경교세포의 중추신경관련 질환에 대한 세포치료제로의 적용 가능성을 확인하기 위해서 동물모델레서 이 세포의 신경세포보호 및 재생 기능을 확인하여야 한다. 이러한목적으로쥐의 척수를손상시켜서 척수손상모델 (rat spinal cord injury model , SCI )을 만들고 손상된 신경에 사람의 사람의 슈반세포, 유사신경교세포를 이식한후 2주후에 신경재생정도를 여러가지 방법으로 분석하여 신경의 재생 정도를측정하였다.

[0272] 수술을 통해 척수를 노출시킨 후 압력을 가해 RAT SCI 모델을 제조했다. 성숙의 종료 시 여러 프로토콜에 의해 제조된 다양한종류의 유사신경교세포를 수확하고 PBS에 담긴 5.5x10 ^s 개의 세포를 쥐에 척수에 이식하였다. 2주 후 로타로드 라텐시 (rotarod l atency) 시험, BBB 분석을 통해 치료적 개선을 평가하고， 이식이 없는 쥐 또는 신경 손상이 없는 야생형 쥐와 비교했다. 인간슈반세포도 동일한 방식으로 시험했다. 타로드 및 BBB분석 결과 (도 80)을 보면 손상 직후 (0주)에 손상을 준 모든 군에서 활동성이 현격하게 떨어져 있었지만, 세포 투입 후 2주후에 유사신경교세포처리군 (G3) 및 인간슈반세포처리군 (G4)에서 대조군 (G2, 무처리)에 비교하여 신경 복구 기능을 볼 수 있었다. 또 한유사신경교세포 처리군 (G3)에서 인간슈반세포처리군 (G4)에 비해 보다향상된 치료효과를관찰할수 있었다. 이러한결과는 저분자 화합물을 이용하여 유도된 유사신경교세포는 쥐 SCI 모델에서 신경 재생을 촉진함을 확인해준다. 또한이 결과는유사신경교세포가중추신경질환에 세포치료제로사용될수있음을 말해 준다.

[0273]

[0274] 실험예 15: 유사신경교세포 이식 후체내 잔존

[0275] 체세포에서 분화된 유사신경교세포의 세포치료제로의 적용 가능성을 위해서 세포가 체내 이식 후 어느정도 체내에 머무는지를 확인하는 것이 필요하다. 바이러스를 이용해 녹색형광을 내는 단백질 (GFP, green f luorescence protein)의 유전자를 유사신경교세포 및 인간슈반세포에서 발현시키고 PBS 에 담긴 5.5x10 ^s 개의 GFP-발현 유사신경교세포 및 인간슈반세포를 동량의 Ti ssel 용액에 섞어서 쥐 (Rat )의 대퇴부에 이식하였다. 지정된 시간 후 형광 이미징을 통해 쥐의 대퇴부에서 발생하는 형광의 세기를측정하였다 (도 81) .

[0276] 도 81의 결과를 분석하면 세포 주입 직후부터 5일까지 형광을 관찰할 수 있었지만, 7일부터는형광을관찰할수없었다. 이 결과는주입된세포가 5일내지 6일사이에사멸된다는 것을 말해준다. 2020/141648 1»（：1^1{2019/000705

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[0277] 본 결과는 면역저하가 없는 야생의 쥐에 사람의 세포를 주입했음에도 불구하고 이식된 세포가 생채 내에 5일 이상 머물 수 있다는 사실을 확인해 주었다. 따라서 면역활성이 없는 생체 혹은 환자로부터 분리한 세포를 이용해 제작한 유사신경세포를 환자에게 이식한 경우 보다 오랜기간동안 이식된 세포가 활성을 보일 수 있다고 판단된다.

[0278]

산업상이용가능성

본 발명은 체세포로부터 분화된 신규한 유사신경교세포， 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 신경 질환 치료용 세포 치료제 및 상술한 세포를 투여하여 신경 질환을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 선행기술문헌목록

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특허문헌 특허 문헌 1 : 대한민국 공개공보 제 10-2017-0045356호

[0280]