Le transfert de gène dans une cellule donnée est la base mme de la thérapie génique. Cette nouvelle technologie dont le champ d'application est vaste, permet d'envisager le traitement de maladies graves pour lesquelles les alternatives thérapeutiques classiques sont peu efficaces, voire inexistantes, et concerne aussi bien les maladies d'origine génétique (hémophilie, mucoviscidose, myopathie,...) qu'acquises (cancer, SIDA,...).

Au cours des 30 dernières années, de nombreux outils ont été mis au point permettant l'introduction de divers gènes hétérologues dans des cellules, notamment des cellules de mammifère. Ces différentes techniques peuvent tre divisées en deux catégories. La première catégorie concerne les techniques physiques telles que la microinjection, l'électroporation ou le bombardement particulaire qui, bien qu'efficaces, sont largement limitées à des applications in vitro et dont la mise en oeuvre est lourde et délicate. La seconde catégorie fait appel à des techniques relatives à la biologie moléculaire et cellulaire pour lesquelles le gène à transférer est associé à un vecteur de nature biologique ou synthétique qui favorise l'introduction dudit matériel.

Actuellement, les vecteurs les plus efficaces sont des vecteurs viraux, en particulier adénoviraux ou rétroviraux. Les techniques développées reposent sur les propriétés naturelles dont disposent ces virus pour traverser les membranes cellulaires, échapper à la dégradation de leur matériel génétique et faire pénétrer leur génome dans le noyau. Ces virus ont déjà fait l'objet de nombreuses études et certains d'entre eux sont d'ores et déjà employés à titre expérimental comme vecteurs de gènes chez l'homme en vue par exemple d'une vaccination, d'une immunothérapie ou d'une thérapie visant à suppléer une déficience génétique. Toutefois, cette approche virale présente de nombreuses limitations, notamment en raison de la capacité de clonage restreinte dans le génome viral, des risques de dissémination dans l'organisme hôte et dans l'environnement des particules virales infectieuses produites, du risque de mutagénèse artéfactuel par insertion dans la cellule hôte dans le cas des vecteurs rétroviraux, et de la forte induction des réponses immunitaire et inflammatoire in vivo lors du traitement thérapeutique, limitant considérablement le nombre d'administrations pouvant tre envisagées (Mc Coy et al, 1995, Human Gene Therapy, 6, 1553-1560 ; Yang et al., 1996, Immunity, 1, 433-442). Ces nombreux inconvénients, notamment dans le cadre d'un usage chez l'homme, ont conduit plusieurs équipes à développer des systèmes alternatifs de transfert de polynucléotides.

Plusieurs méthodes non-virales sont disponibles à l'heure actuelle. Citons pour exemples la coprécipitation au phosphate de calcium, l'utilisation de récepteurs mimant les systèmes viraux (pour une revue voir Cotten et Wagner, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4, 705-710), ou l'utilisation de polymères tels que le polyamidoamine (Haensler et Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372-379), ou de polymère tels que ceux présentés dans WO 95/24221 décrivant l'utilisation de polymères dendritiques, le document. WO 96/02655 décrivant l'utilisation de

polyéthylène imine, ou de polypropylène imine et les documents US-A-5 595 897 et FR 2 719 316 décrivant l'utilisation de conjugués de polylysine. D'autres techniques non virales s'appuient sur l'utilisation de liposomes dont l'intért à titre d'agent permettant l'introduction, à l'intérieur de cellules, de certaines macromolécules biologiques, telles que par exemple l'ADN, l'ARN, les protéines ou certaines substances pharmaceutiquement actives a été largement décrit dans la littérature. A cette fin, plusieurs équipes ont déjà proposé l'utilisation de lipides cationiques qui présentent une forte affinité à l'égard des membranes cellulaires et/ou des acides nucléiques. En effet, bien qu'il ait été montré, dans le cas des acides nucléiques, que ce type de macromolécule est capable de traverser la membrane plasmatique de certaines cellules in vivo (WO 90/11092), il n'en demeure pas moins que l'efficacité de la transfection observée est encore très limitée, en raison notamment de la nature polyanionique des acides nucléiques qui prévient leur passage au travers de la membrane cellulaire, présentant elle-mme une charge apparente nette négative. Dés 1989 (Felgner et al., Nature, 337, 387-388) les lipides cationiques ont été présentés comme des molécules intéressantes pour favoriser l'introduction de grosses molécules anioniques, telles que les acides nucléiques, dans certaines cellules. Ces lipides cationiques sont capables de se complexer aux molécules anioniques tendant ainsi à neutraliser les charges négatives desdites molécules et à favoriser leur rapprochement vers les cellules. De nombreuses équipes ont déjà développé différents lipides cationiques. A titre d'exemples, on peut citer le DOTMA (Felgner et al., 1987, PNAS, 84, 7413-7417), le DOGS ou Transfectaii-Pm (Behr et al., 1989, PNAS, 86, 6982-6986), le DMRIE et le DORIE (Felgner et al., 1993, Methods 5, 67-75), le DC-CHOL (Gao et Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285), le DOTAPu (McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 574-622) ou la Lipofectamine,

ainsi que ceux décrits dans les demandes de brevet W09116024 ou W09514651.

Plus particulièrement, la demande de brevet WO-A-9116024 décrit des lipides cationiques de formule : dans laquelle : R1 et R2 sont notamment des radicaux alkyle ou alcényle ; Y1, Y2 sont des radicaux-OCH2-,-OC (=0)- ou-0- ; R3, R4 sont des radicaux alkyle ou alcényle ; R5 est une chaîne alkylène ; Ré est-C (=0)-(CH2) m-NH-, un acide diaminocarboxylique ou-C (=0)- (CH2) m'NH- lié audit acide diaminocarboxylique ; R7 est H, spermine, spermidine, histone, une protéine, un amino acide, un polypeptide.

Toutefois, plusieurs travaux (à titre d'exemples, voir Mahato et al., J. Pharm. Sci., 1995, 84, 1267-1271, Thierry et al., 1995, P. N. A. S, 92, 9742-9746) ont mis en évidence que l'efficacité du transfert à l'intérieur des cellules de la macromolécule anionique pouvait varier en fonction notamment de l'interaction entre les complexes et les membranes cellulaires, de la cellule considérée, de la composition lipidique des composés cationiques, de la taille des complexes formés avec les molécules anioniques et plus particulièrement du rapport de charges positives et négatives des différents composants dudit complexe. Les mécanismes qui permettent en particulier l'interaction des complexes avec les membranes cellulaires et le transfert des complexes à l'intérieur de la cellule sont encore largement méconnus et les chercheurs procèdent dans leurs travaux selon une approche fortement empirique. D'autres facteurs, tels que par exemple la formation des complexes, la stabilité, le comportement in vivo, ou éventuellement leur

toxicité, rendent en outre le choix des lipides à priori non évident. Il est par conséquent souhaitable de proposer-d'autres lipides cationiques, ayant éventuellement des propriétés améliorées ou-différentes de ceux déjà décrits.

Le déposant a aujourd'hui identifié de nouveaux composés lipidiques, qui peuvent se présenter sous forme cationique, utiles notamment pour transférer une substance active, notamment thérapeutiquement comportant des charges négatives, notamment un polynucléotide, à l'intérieur d'une cellule cible, dont on peut envisager l'utilisation notamment in vivo dans le cadre d'une thérapie génique.

Ainsi, la présente invention a tout d'abord pour objet un composé lipidique de formule : R-HN-[-(CH2)m - NR-]n-1 - (CH2)m-NH-R I dans laquelle : les restes R sont, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe de formule II : dans laquelle : R1 et R- sont, indépendamment l'un de l'autre, des radicaux C-C23 alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C (=O)-(C6-C23) alkyle ou-C (=0)- (Cg-C23) alcényle, linéaires ou ramifiés, des radicaux aryle, des radicaux cycloalkyle, des radicaux fluoroalkyle, des groupements polyéthylène glycol, des groupements oxyéthylène ou oxyméthylène éventuellement répétés, linéaires ou ramifiés, eventuellement substitués, p est un nombre entier positif de 1 à 4, n est un nombre entier positif de 1 à 6,

m est un nombre entier positif de 1 à 6 qui peut tre différent pour chaque motif -(CH2)m, et plus particulièrement pour chaque motif-(CH2) m-NR-lorsque n > 1, - le nombre de groupes R de formule II étant compris entre 1 et 4.

Par l'expression « alcényle », on entend que la chaîne carbonée peut comprendre une ou plusieurs double (s) liaison (s) le long de ladite chaîne.

Selon un cas particulier, l'invention concerne un composé sélectionné parmi les composés de formules : H2N- [- (CH2) m-NH-] n R III RNH- [- (CH2) m-NH] n H IIIa dans lesquelles : R est un groupe de formule II tel que défini précédemment et H2N- [- (CH2).-NRL. i- (CH2) m-NH2 IIIb dans laquelle : R a l'une des significations indiquées pour la formule I pour autant qu'au moins un R est un groupe de formule II et pour chacune des formules : n est un nombre entier positif de 1 à 6, m est un nombre entier positif de 1 à 6 qui peut tre différent pour chaque motif -(CH2)m, et plus particulièrement pour chaque motif-(CH2) m-NR-lorsque n > 1.

Selon un cas préféré, les composés de formule IIIb renferment un ou deux groupes R de formule II.

Selon des modes de réalisation préférés de l'invention, on choisira les variantes présentées ci-dessous, prises ou non en combinaison entre elles : Ri et R2 sont, indépendamment l'un de l'autre, des radicaux-C (=0)- alkyle linéaires ou-C (=0)-alcényle linéaires, - R1 et R2 sont, indépendamment l'un de l'autre, des radicaux- alkyle ou-C (=0)- alcényle, comprenant de 12 à 20 atomes

de carbone, de préférence 12, 16 ou 18 atomes de carbone, lorsque le lipide comporte 1 ou 2 groupements R de formule II, -n est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4, -m est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4.

Selon un cas particulier, il est possible de diminuer la longueur de la chaîne alkyle ou alcényle de manière à ce que RI et R2 soient des radicaux de 6 à 10 atomes de carbone mais dans ce cas on choisira de préférence des composés pour lesquels le nombre de groupes R de formule II est égal à 2, 3 ou 4.

De préférence, les lipides selon l'invention sont choisis dans le groupe constitué par les composés de formules suivantes : pour lesquelles Ri et R2 sont identiques et choisis parmi les radicaux stéaryle et oléoyle.

Les composés selon l'invention sont préparés par réaction d'un composé de formule : dans laquelle : R3 et R4 sont des groupes protecteurs, notamment Fmoc (Grandas et al., 1989, Int. Journal pept. prot. Res. vol 33, 386-390) avec une amine de formule : RsNH [ (-CHZ) m-NRS n-1- (CH^) m NHRS VI m, n ayant la mme signification que pour la formule I, Rs étant un groupe protecteur, notamment le t- butoxycarbonyle (BOC) ou un atome d'hydrogène, au moins un des radicaux Rs et au plus quatre des radicaux Rs correspondant à l'atome d'hydrogène.

Les fonctions N-R3,-N-R4 sont ensuite déprotégées pour fixer par amidation ou alkylation les radicaux Ri et R2 de manière connue, notamment par action de l'ester-N- hydroxysuccinimide correspondant.

Le composé obtenu est déprotégé en présence d'acide trifluoroacétique.

Les amines de formule VI sont préparées de manière connue.

Dans le cas où le composé de formule VI est la 1-4 di-boc- spermidine on se référera aux exemples indiqués ci-après pour connaître les modalités pratiques de synthèse. Les procédés décrits sont applicables en général aux synthèses des composés selon l'invention moyennant des adaptations à la portée de l'homme du métier.

Toutefois, les composés de l'invention ne sauraient se limiter à ceux obtenus par les modes de préparation décrits précédemment.

Les composés selon l'invention peuvent en outre tre substitués. De telles substitutions peuvent notamment consister

en une molécule de marquage (voir molécules de marquage dans US 4711955) qui permet par exemple de visualiser la distribution des composés ou des complexes les renfermant après administration-in vitro ou in vivo, une molécule de ciblage cellulaire, une molécule d'ancrage. L'invention concerne par conséquent également un composé tel que présenté ci-dessus conjugué à un ou plusieurs éléments de ciblage, également appelés ligands d'intért, par l'intermédiaire d'au moins a) un des atomes de carbone, en particulier choisis parmi ceux présents sur les groupements R1 et/ou R2, ou b) un des atomes d'azote secondaire ou primaire de la chaîne polyamine ou de l'acide diaminocarboxylique. De tels éléments peuvent permettre le ciblage vers un type cellulaire particulier, faciliter la pénétration à l'intérieur de la cellule, la lyse des endosomes ou encore le transport intracellulaire et sont largement décrits dans la littérature. Il peut s'agir par exemple de tout ou partie de sucres, de peptides (peptide GRP, Gastrin Releasing Peptide, par exemple), d'oligonucléotides, de lipides, d'hormones, de vitamines, d'antigènes, d'anticorps, de ligands spécifiques de récepteurs membranaires, de ligands susceptibles de réagir avec un anti-ligand, de peptides fusogèniques, de peptides de localisation nucléaire, ou d'une combinaison de tels composés. On peut citer plus particulièrement les résidus galactosyl permettant de cibler le récepteur asyaloglycoprotéique à la surface des cellules hépatiques, le peptide fusogénique INF-7 dérivé de la sous-unité HA-2 de l'hémagglutinine du virus influenza (Plank et al. 1994, J. Biol.

Chem. 269, 12918-12924) ou d'un signal de localisation nucléaire dérivé de l'antigène T du virus SV40 (Lanford et Butel, 1984, Cell 37, 801-813) ou de la protéine EBNA-1 du virus Epstein Barr (Ambinder et al., 1991, J. Virol. 65, 1466-1478).

De tels conjugués peuvent tre aisément obtenus selon les techniques largement décrites dans la littérature, et plus particulièrement par couplage chimique, notamment en utilisant

des groupes protecteurs tels que trifluoroacétyle ou Fmoc ou Boc sur la polyamine et plus particulièrement en utilisa-nt un ou plusieurs groupes protecteurs orthogonaux tels que ceux décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis (p. 309-406, 1991, eds. T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Wiley) sur la polyamine ou l'acide diaminocarboxylique. La déprotection sélective d'un groupe protecteur permet alors de coupler l'élément de ciblage, et l'on déprotège ensuite le lipide. Il convient toutefois d'indiquer que la substitution des groupes non réactifs tels que les atomes de carbone dans les groupements CH ou CH2, sera réalisée en cours de synthèse des composés de l'invention selon des méthodes connues de l'homme du métier ; tandis que les groupes réactifs, tels que les amines primaires ou secondaires, peuvent faire l'objet de substitutions sur les lipides de l'invention néosynthétisés.

Selon un cas avantageux de l'invention, ledit composé est sous forme cationique, c'est à dire qu'il est sous forme protonée par fixation d'un proton sur un ou plusieurs atomes d'azote présents sur la chaîne polyamine. Dans ce cas, ledit lipide cationique est associé à un ou plusieurs anions biologiquement acceptables, tels que par exemple l'anion trifluoroacétate, halogènure, monométhylsulfate, acétate ou phosphate, iodure, chlorure, bromure... Il est également possible d'obtenir des composés sous forme cationique par substitution des amines par exemple avec un radical méthyl, éthyl,...

Selon un autre aspect, l'invention concerne également une composition comprenant au moins un composé tel que décrit ci- dessus et éventuellement au moins un adjuvant susceptible d'améliorer la formation de complexe entre undit composé et une substance active, ou d'améliorer le fonctionnement de ces complexes vis-à-vis de la cellule.

De manière préférée, un tel adjuvant sera un lipide neutre ou zwitterionique, tel que par exemple un lipide qui est ou

dérive d'un triglycéride, d'un diglycéride, du cholestérol (voir par exemple US 5 438 044), en particulier, un lipide-neutre ou zwitterionique qui est ou qui dérive d'une phosphatidyl éthanolamine^- (PE), phosphatidylcholine, phosphocholine, sphyngomyéline, céramide ou cérébroside. De manière avantageuse, on choisira la dioleoylphosphatidyl éthanolamine (DOPE).

Le rapport en poids entre le composé de l'invention et le lipide neutre ou zwitterionique est généralement compris entre 0, 1 et 10, étant entendu que ce rapport peut varier selon la nature des composants considérés. L'homme du métier dispose des connaissances suffisantes pour permettre ces adaptations mineures. Il est également possible d'utiliser un mélange de lipides neutres et/ou zwitterioniques ou encore un mélange de lipides cationiques et de lipides neutres et/ou zwitterioniques.

L'invention concerne en outre un complexe comprenant au moins un composé ou au moins une composition tels que décrits précédemment et au moins une substance active, notamment thérapeutiquement comportant au moins une charge négative. Selon une variante de l'invention, ledit complexe peut en outre renfermer un ou plusieurs amphiphiles cationiques tels que ceux décrits dans la littérature dont des exemples ont été proposés plus haut.

Selon un mode particulier de réalisation, ladite substance active, est choisie parmi les acides nucléiques et les protéines. De préférence, la substance active du complexe selon l'invention est un polynucléotide, ledit composé ou ladite composition permettant alors d'améliorer le pouvoir transfectant du polynucléotide dans une cellule.

Par « polynucléotide », on entend désigner un fragment d'ADN et/ou d'ARN, double brin ou simple brin, linéaire ou circulaire, naturel isolé ou de synthèse, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non (voir à titre d'exemple US 5525711), marqués ou non (voir, par exemple, US 4711955 ou

EP 302175), permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique sans limitation de taille. Par polynucléotide on entend désigner notamment un cADN, un ADN génomique, un ADN plasmidique, un ARN messager, un ARN antisens, un ribozyme, un ARN de transfert, un ARN ribosomique, ou un ADN codant pour de tels ARN. « Polynucléotide » ou « acide nucléique » sont des termes synonymes dans le cadre de la présente demande. Par"anti sens", on entend désigner un acide nucléique ayant une séquence complémentaire à une séquence cible, par exemple une séquence d'ARNm dont on cherche à bloquer l'expression par hybridation sur la séquence cible ; et par"sens", un acide nucléique ayant une séquence homologue ou identique à une séquence cible, par exemple une séquence qui se lie à un facteur de transcription protéique et impliquée dans l'expression d'un gène donné.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit polynucléotide comprend un gène d'intért et des éléments permettant l'expression dudit gène d'intért. Dans ce mode de réalisation, ledit polynucléotide est avantageusement sous forme de plasmide. Les éléments permettant l'expression sont l'ensemble des éléments permettant la transcription dudit fragment d'ADN en ARN (ARN antisens ou ARNm) et la traduction de l'ARNm en polypeptide. Il s'agit notamment des séquences promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule, et éventuellement les séquences requisent pour permettre l'excrétion ou l'expression à la surface des cellules cibles dudit polypeptide. A titre d'exemple, on mentionnera les promoteurs tels que les promoteurs des virus RSV, MPSV, SV40, CMV ou 7. 5k, du virus de la vaccine, les promoteurs du gène codant pour la créatine kinase musculaire, pour l'actine, pour le surfactant pulmonaire. Il est en outre possible de choisir une séquence promotrice spécifique d'un type cellulaire donné, ou activable dans des conditions définies. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de telles séquences promotrices. Par ailleurs, ledit polynucléotide peut

comprendre au moins deux séquences, identiques ou différentes, présentant une activité de promoteur transcriptionnel-et/ou au moins deux séquences codantes d'ADN, identiques ou différentes, situées l'une par rapport à l'autre de manière contiguë, éloignée, dans le mme sens ou en sens inverse, pour autant que la fonction de promoteur transcriptionnel ou la transcription desdites séquences ne soit pas affectée. De mme, dans ce type de construction d'acide nucléique, il est possible d'introduire des séquences nucléiques « neutres » ou introns qui n'affectent pas la transcription et sont épissées avant l'étape de traduction. De telles séquences et leurs utilisations sont décrites dans la littérature. Ledit polynucléotide pourra également renfermer des séquences requises pour le transport intracellulaire, pour la réplication et/ou pour l'intégration.

De telles séquences sont bien connues de l'homme de l'art. Par ailleurs, les polynucléotides selon la présente invention peuvent également tre des polynucléotides modifiés de sorte qu'il ne leur est pas possible de s'intégrer dans le génôme de la cellule cible ou des polynucléotides stabilisés à l'aide d'agents, tels que par exemple la spermine.

Dans le cadre de la présente invention, le polynucléotide peut tre homologue ou hétérologue à la cellule cible. Il peut tre avantageux d'utiliser un polynucléotide qui code pour tout ou partie d'un polypeptide, notamment un polypeptide présentant une activité thérapeutique ou prophylactique, et plus particulièrement une activité immunogène de type cellulaire ou humorale. Le terme polypeptide s'entend sans restriction quant à sa taille ou son degré de modification (par exemple de glycosylation). On peut à titre d'exemples citer les gènes codant pour un enzyme, une hormone, une cytokine, un récepteur membranaire, un polypeptide structural, un polypeptide formant un canal membranaire, un polypeptide de transport, une molécule d'adhésion, un ligand, un facteur de régulation de la transcription, de la traduction, de la réplication, de la

stabilisation des transcripts, ou un anticorps, tels que par exemple le gène codant pour la protéine CFTR, la dystrophine, le facteur VIII ou IX, E6/E7 de HPV, MUC1, BRAC1, l'interféron, l'interféron'y, l'interleukine (IL) 2, l'IL-4, l'IL-6, l'IL-7, l'IL-12, le facteur nécrosant de tumeur (TNF) de type alpha, le GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), le gène tk du virus Herpes Simplex de type 1 (HSV-1), le gène associé au rétinoblastome ou p53 ou tout ou partie d'immunoglobulines, telles que les fragments F (ab) 2, Fab', Fab ou les anti-idiotypes (US 4, 699, 880). Bien entendu, cette liste n'est pas limitative et d'autres gènes peuvent tre employés.

Selon un mode de réalisation préféré, les complexes selon l'invention sont de faible taille (inférieure à 500 nm, avantageusement à 200 nm et de préférence à 100 nm).

Par ailleurs, les expériences de transfection réalisées montrent qu'avantageusement le rapport en poids du composé lipidique selon l'invention audit polynucléotide est de 0, 01 à 100. Le rapport optimal se situe de 0, 05 à 10.

L'invention concerne également un procédé de préparation des complexes composés cationiques/substances actives anioniques, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met en présence un ou plusieurs lipides sous forme cationique ou une composition selon l'invention dont le lipide est sous forme cationique avec une ou plusieurs substances actives comportant au moins une charge négative et en ce que l'on récupère ledit complexe, éventuellement après une étape de purification. Elle concerne également les kits pour préparer de tels complexes comprenant un ou plusieurs lipides ou une ou plusieurs compositions selon l'invention.

Dans un premier temps, selon une première variante, un ou plusieurs composés cationiques sont mis en solution avec une quantité appropriée de solvant ou mélange de solvants miscibles dans l'eau, notamment l'éthanol, le diméthylsulfoxide (DMSO), ou de façon préférée un mélange éthanol/DMSO 1 : 1 (v : v), de manière

à former des agrégats lipidiques selon une méthode connue décrite par exemple dans la demande de brevet WO-A-9b03977, ou selon une seconde variante, sont mis en suspension avec une quantité appropriée d'une solution de détergent comme un octylglucoside tel que le n-octyl ß-D-glucopyranoside, ou le 6- 0- (N-heptylcarbomoyl)-méthyl-a-D-glucopyranoside.

La suspension peut ensuite tre mise dans un milieu tampon et mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négatives.

Dans le cas où l'on souhaite qu'un lipide neutre ou zwitterionique soit présent dans le complexe final, on forme, de manière connue, préalablement à la mise en solution dans le solvant miscible à l'eau ou dans la solution de détergent, un film avec un mélange renfermant undit composé cationique et undit lipide neutre ou zwitterionique, tel que par exemple la DOPE.

Une des caractéristiques importantes du procédé réside dans le choix du rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active.

Sans vouloir tre limité par un rapport spécifique, on choisira des quantités des différentes charges de manière à ce que le rapport entre le nombre de charges positives du composé ou de la composition cationique et le nombre de charges négatives de la substance active soit compris entre 0, 05 et 20, notamment entre 0, 1 et 15 et de préférence entre 5 et 10.

Ce rapport entre le nombre de charges positives du ou des composés et/ou compositions cationiques et le nombre de charges négatives de ladite substance active constitue également une caractéristique avantageuse du complexe selon l'invention.

Le calcul pour arriver à un tel rapport prendra en considération les charges négatives portées par la substance active et on ajustera la quantité de composé nécessaire pour satisfaire au rapport indiqué ci-dessus. Les quantités et les concentrations pour les autres composants sont ajustées en

fonction de leurs masses molaires respectives et de leur nombre de charges positives et/ou négatives.

Dans le cas de la seconde variante et de manière optionnelle, >-on peut procéder à une dialyse subséquente pour réduire le détergent et récupérer les complexes. Le principe d'une telle méthode est par exemple décrit par Hofland et al.

(1996, PNAS 93, p 7305-7309) et dans le chapitre II du document Philippot et al. (G. Gregoriadis, 81-89, CRC Press 1993).

On a montré que la première variante conduit à d'excellents résultats en terme de taille des complexes obtenus.

Selon une troisième variante, un ou plusieurs composés ou compositions cationiques, sont mis en suspension dans un tampon puis la suspension est soumise à une sonication jusqu'à homogénéité visuelle. La suspension lipidique est ensuite extrudée au travers de deux membranes microporeuses sous pression appropriée. La suspension lipidique est alors mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négatives. Dans le cas où un lipide neutre est présent dans le complexe, on forme préalablement à la mise en suspension, un film du mélange de lipide cationique et de lipide neutre comme la DOPE de manière connue. Les mmes remarques concernant le rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active que celles indiquées dans la première variante sont applicables à cette troisième variante. Cette technique dite de sonication-extrusion est bien connue dans l'art.

Les caractéristiques des complexes formés peuvent tre évaluées par plusieurs moyens permettant de déterminer, par exemple : -l'état de complexation avec la substance active, notamment par recherche des acides nucléiques libres par électrophorèse sur gel d'agarose dans le cas où les substances sont des acides nucléiques,

-la taille des particules par diffusion quasi élastique de la lumière, -l'absence de précipitation à long terme.

La présente invention a également pour objet les complexes obtenus par la mise en oeuvre des procédés énumérés ci-dessus.

L'invention concerne aussi l'utilisation d'un composé, d'une composition ou d'un complexe selon l'invention pour transférer au moins une substance active, notamment thérapeutiquement active, plus particulièrement un acide nucléique, dans des cellules cibles, in vitro, ex vivo ou in vivo, plus particulièrement in vivo.

Par « cellules cibles » selon l'invention, on entend les cellules procaryotes, les cellules de levure et les cellules eucaryotes, les cellules de plantes, les cellules humaines ou animales, et en particulier les cellules de mammifère. Il convient par ailleurs de citer les cellules cancéreuses. In vivo, l'invention peut tre appliquée au niveau de l'espace interstitiel ou luminal de tissus tels que le poumon, la trachée, la peau, le muscle, le cerveau, le foie, le coeur, la rate, la moelle osseuse, le thymus, la vessie, la lymphe, le sang, le pancreas, l'estomac, le rein, les ovaires, les testicules, le rectum, le système nerveux périphérique ou central, les yeux, les organes lymphoïdes, les cartilages, l'endothélium. Selon un choix avantageux de l'invention, la cellule cible sera une cellule musculaire, une cellule souche hématopoïétique ou encore une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, et avantageusement une cellule de l'épithélium respiratoire.

Les complexes selon l'invention sont utilisables à titre de médicament, à but curatif, préventif ou vaccinal. C'est pourquoi l'invention a également pour objet les complexes de l'invention à titre de médicament à but curatif, préventif ou vaccinal. De tels complexes peuvent tre mis en oeuvre dans une méthode de traitement thérapeutique consistant à transférer au moins une

substance thérapeutiquement active, notamment un polynucléotide, dans des cellules cibles, notamment une cellule de mammifère, et plus précisemment une cellule musculaire, une cellule souche hématopoïétique, une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, une cellule de l'épithélium respiratoire.

Un composé selon l'invention est tout particulièrement intéressant pour transférer un acide nucléique dans une cellule musculaire ou une cellule pulmonaire. Il s'agit du composé noté pcTG37 (voir exemple).

Plus largement, la présente invention concerne également un procédé pour introduire une substance active comportant des charges négatives à l'intérieur d'une cellule notamment in vitro, caractérisé en ce que l'on met en contact des cellules, notamment cultivées sur un milieu approprié avec un complexe composé cationique/substance active comportant au moins une charge négative selon l'invention, notamment sous forme d'une suspension de complexes. Après un certain temps d'incubation les cellules sont lavées et récupérées. La vérification de l'introduction de la substance active peut tre effectuée (éventuellement après lyse de la cellule) par tout moyen approprié.

Le procédé d'introduction est bien connu en soi. Par le terme « introduction » on entend que la substance active comportant des charges négatives est transférée dans la cellule et est localisée, en fin de procédé, à l'intérieur de ladite e cellule ou au niveau de la membrane de celle-ci. Dans le cas où la substance active est un acide nucléique, on parlera plus particulièrement de « transfection ». Dans ce cas, la vérification de la transfection de l'acide nucléique pourra tre effectuée par tout moyen approprié, par exemple par mesure de l'expression du gène considéré ou de la concentration de la protéine exprimée.

L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation d'un composé, d'une composition ou d'un complexe selon l'invention pour la préparation d'un médicament à but curatif, préventif ou vaccinal, destiné au traitement du corps humain ou animal, notamment par thérapie génique.

Selon une première possibilité, le médicament peut tre administré directement in vivo (par exemple dans un muscle, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moëlle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter in vitro selon la présente invention et de les réadministrer au patient.

Les complexes selon l'invention peuvent tre administrés par voie intramusculaire, intratrachéale, intranasale, intracérébrale, intrapleurale, intratumorale, intracardiaque, intragastrique, intrapéritonéale, épidermique, intraveineuse, intraartérielle par seringue ou tout autre moyen équivalent, les systèmes adaptés au traitement des voies aériennes ou des muqueuses tels que l'inhalation, l'instillation, ou l'aérosolisation. On peut également citer les modes d'administration par application d'une crème, par administration orale ou tout autre moyen parfaitement connu de l'homme de l'art et applicable à la présente invention.

Il est également dans la portée de l'invention de cibler des organes ou des tissus particuliers par administration, notamment par voie intraveineuse, d'un complexe selon l'invention préparé de façon à ajuster le rapport composé ou composition/substance thérapeutiquement active dans ledit complexe, la charge apparente du complexe (voir notamment Liu et al, 1997, Gene Therapy, 4, 517-523 ; Thierry et al., 1995, P. N. A. S., 92, 9742-9746).

L'invention concerne également un procédé de thérapie génique consistant à administrer à un patient une quantité

appropriée d'une composition selon l'invention. Selon la présente invention et dans le cadre d'une thérapie-génique in vivo, il est possible de répéter plusieurs fois, chez un patient donné, le ~procédé tel que proposé sans. qu'aucune réaction immunitaire majeure ne soit déclenchée à l'encontre de l'un des composés administrés. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain intervalle de temps. L'administration répétée permettrait de réduire la quantité de substance thérapeutiquement active, d'ADN plus particulièrement, à administrer pour une dose donnée. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple de l'individu ou de la maladie à traiter ou encore du polynucléotide à transférer.

L'invention concerne plus particulièrement une préparation pharmaceutique comprenant au moins un complexe tel que décrit précédemment, renfermant éventuellement en outre au moins un adjuvant capable de stabiliser ladite préparation pharmaceutique en vue de son stockage par exemple et/ou d'améliorer le pouvoir de transfection dudit complexe. Un tel adjuvant pourrait par exemple tre choisi parmi le groupe consistant en la chloroquine, un composé polaire protique notamment choisi parmi le propylène glycol, le polyéthylène glycol, le glycérol, l'éthanol, le 1-methyl L-2-pyrrolidone ou leurs dérivés, ou un composé polaire aprotique notamment choisi parmi le diméthylsulfoxide (DMSO), le diéthylsulfoxide, le di-n- propylsulfoxide, le diméthylsulfone, le sulfolane, la diméthylformamide, le diméthylacetamide, la tetraméthylurée, l'acétonitrile ou leurs dérivés. De mme, ladite préparation peut renfermer un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique permettant son administration à l'homme ou l'animal.

Dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé de traitement in vivo selon la présente invention, il est en outre possible d'effectuer, avant l'administration d'une préparation

pharmaceutique telle que décrite précédemment, un traitement du patient visant à observer une déplétion temporaire des macrophages permettant d'améliorer le taux de transfection. Une telle technique est décrite dans la littérature, voir notamment Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15, 178-184.

Enfin, l'invention concerne une cellule transfectée par un complexe tel que défini précédemment, particulièrement une cellule procaryote, une cellule de levure ou eucaryote, notamment une cellule animale, en particulier une cellule de mammifère, et plus particulièrement une cellule cancéreuse.

Selon un cas préféré de l'invention, ladite cellule est une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, et avantageusement une cellule de l'épithélium respiratoire.

Les exemples ci-après illustrent l'invention sans la limiter en aucune façon. Un schéma de synthèse explicatif faisant partie intégrante de la description est annexé (Figure 1). La figure 2 indique les résultats observés après injection intraveineuse de complexes selon l'invention, l'activité luciférase est indiquée en RLU/mg de protéine).

EXEMPLES La préparation du lipide cationique de formule I dans laquelle R1, R identiques sont les radicaux oléoyle ou stéaryle n = 2 ; ma = 3, m = 4 est décrite ci-dessous en liaison avec le schéma de synthèse représenté à la figure 1. a et p sont les positions des motifs-(CH2) m-NH-à partir du carbonyle.

Synthèse du lipide cationique de formule I dans laquelle n = 2, ma = 3, mp = 4, R = oléoyle (pcTG37) (voir figure 1) Synthèse de l'intermédiaire 1-4 di-boc-spermidine Le protocole appliqué pour obtenir le 1, 4-di-boc-spermidine est publié par Goodnow et al. (1990, Tetrahedron 46, 3267-3286). En pratique, l'intermédiaire N-propionitrile 1, 4-diaminobutane est

obtenu par réaction de 37, 6 mmoles de diaminobutane (Fluka ; référence 32790) dilué dans 3, 8 ml de dichlorométhane + 2 ml de méthanol à 0°C avec 18, 8 mmoles d'acrylonitrile (Fluka ; référence 01710) pendant 1 heure à 20°C. Les groupements aminés du produit de la réaction sont protégés par 99 mmoles de BOC-ON <BR> <BR> <BR> [ (2-boc-oxyimino)-2-phénylacétonitrile] (Fluka ; référence 15475) dans 50 ml de solvant CH2Cl2/CH3OH 2/1. La réaction de protection est laissée la nuit à température ambiante. Les solvants sont évaporés et le produit est repris dans 75 ml d'acétate d'éthyle pour 3 extractions avec 75 ml de NaOH 1M. La phase organique est à nouveau extraite avec 5% d'acide citrique, puis sèchée et filtrée sur Na2SO4 avant évaporation à sec. Puis on procède à l'étape de réduction des nitriles, dans l'éther à 0°C, en présence de 20 mmoles de LiAIH4 (Sigma ; L0260). Après lheure 30, la réaction est arrtée par addition de 20 ml de NaOH 1M à 0°C, avec dégagement d'hydrogène. Le mélange est filtré et extrait 3 fois avec une solution de NaCl 20% dans de l'eau.

Après séchage de la fraction éthérée, le produit est déposé sur colonne de silice dans un solvant CH2Cl2/CH3OH 2/1, puis élué dans un solvant CH2Cl2/CH3OH/(C2H5) 3N 15/5/1. On détermine par chromatographie sur couche mince les fractions contenant le di- boc-spermidine. données de RMN : RMN-1H (200 MHz, CDC13) : 1, 43-1, 48 ppm (s, 18 H, Boc), 1, 48-1, 72 ppm (m, 6H, NH (Boc)-CH,-CH2-CH2-CH2- N (Boc)-CH2-CH2-CH2-NH2), 2, 69 ppm (t, 2H, J = 6, 7 Hz,-CH2-NH2), 3, 07-3, 25 ppm (m, 6H, NH (Boc)-CH2-CH2-CH2-CH2-N (Boc)-CH2-CH2-CH2- NH2), 4, 59 ppm (b, 1H, NH (Boc)).

Quantité synthétisée (1, 45 g ; 5, 1 mmol)-rendement 27 % par rapport à la quantité d'acrylonitrile.

Synthèse du pcTG37 On ajoute à 140 pmoles de N-a N-P, di-Fmoc- diaminopropionique (Bachem B2265) 140 umoles de N- hydroxybenzotriazole (Sigma ; H2006), puis 140 umoles de di-boc- spermidine dans 1 ml de tétrahydrofuranne anhydre, et enfin

180 pmoles de dicyclohéxylcarbodiimide (Sigma ; D3128) dilué dans 2 ml CH2Cl2. Après 2 heures de réaction, on-filtre le dicyclohexylurée formé et on purifie le produit sur colonne de silice dans-un solvant CH-IC12/CH30H 99/1. Après évaporation, on élimine les groupements Fmoc du produit dans une solution de 20% pipéridine, 20% tétrahydrofurane et 60% CH-IC12 pendant 1 heure.

Après évaporation, on procède à une nouvelle purification sur colonne de silice dans un solvant CH2Cl2/CH3OH 1/1. On détermine par chromatographie sur couche mince les fractions contenant le produit. Le produit est séché avant le dernier couplage. Au di- boc-spermidine-diaminopropionamide, on ajoute 510 pmoles de l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide oléique (Sigma 0 9506) dilué dans 5 ml de CHCl anhydre. Après évaporation, le produit est purifié sur colonne de silice (éther/acétate d'éthyle ; 1/1). Le produit final, repris dans 1 ml de CHClz est déprotégé Boc dans 10 ml d'acide trifluoroacétique (Fluka 91699). Pour éliminer l'acide trifluoroacétique on évapore à pression réduite après dilution dans 50 ml de n-hexane.

Rendement global de synthèse : 64 % (89 mg ; 90 µmol) RMN-1H (200 MHz, CDC13/CD30D : 0, 81 ppm (t, j = 6, 4 Hz, 6H,- CH3), 1, 22-1, 3 ppm (m, 44 H,-CH2-), 1, 51 ppm (m, 4 H,-CH2-CH2- CO-NH-), 1, 72-1, 90 ppm (m, 6 H, NH3+ -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ -CH2-CH2- CH,-NH-), 1, 92 ppm (m, 8 H, CH2-CH=), 2, 07-2, 2 ppm (m, 4 H, CH2- CO-NH-), 2, 89 ppm (m : 6 H, NH3+ -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ -CH2-CH2-CH2- NH-), 4, 22 ppm (t, 1 H, NH-CO-CHR-NH-), 5, 27 ppm (m, 4H,-CH=).

Spectrométrie de masse : mesurée 759, 7 Da (calculée 760, 2 Da).

Synthèse du lipide cationique de formule I dans laquelle n = 2, ma = 3, m# = 4 ; R = stéaryle (lipide pcTG39) Le composé pcTG39 est préparé à l'échelle de 140 pmol de la mme façon en utilisant l'acide stéarique et le dicyclohexylcarbodiimide ou de la (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) comme agent de couplage.

Rendement global de synthèse : 22 % (30 mg ; 30 umol) RMN-1H (200 MHz, CDCl3/CD3OD/D2O) : 0, 68 ppm (t, j = 6, 8 Hz, 6H,-CH3), 1, 06 ppm (m, 48 H,-CH2-), 1, 37 ppm (m, 4 H,-CH2-CH2- CO-NH-), l, 5-3-1, 75 ppm (m, 6 H, NH3-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2-CH2-CH2- CH2-NH-), 1, 90-2, 30 ppm (m,-4 H, CH2-CO-NH=), 2, 74 ppm (m, 6H, NH3+-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+-CH2-CH2-CH2-NH-), 3, 25-3, 55 ppm (m, 4 H, -CH2-NH-CO-).

Spectrométrie de masse : mesurée 764, 5 Da (calculée 764, 3 Da).

Préparation des complexes lipides-ADN par mise en suspension dans l'éthanol 1. Préparation des complexes lipides pcTG37, éventuellement DOPE,-ADN Les quantités de lipides sont calculées en se basant sur la concentration d'ADN final (0, 1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Pour obtenir un complexe entre pcTG37/DOPE et de l'ADN plasmidique à un ratio de 10 entre charges positives apportées par le lipide cationique et charges négatives apportées par l'ADN à une concentration d'ADN finale de 0, 1 mg/ml, on mélange les différents ingrédients selon le calcul suivant : 0, 1 mg d'ADN/ml soit (0, 1/330) mmoles de charges négatives (330 Da est le poids moléculaire moyen d'un nucléotide) par ml correspondent à 0, 30 umole/ml de charges négatives. Pour obtenir 10 fois plus de charges positives il faut une concentration de 3, 0 pmole/ml de charges positives apportées par le lipide cationique. La masse molaire de pcTG37 sous forme de trifluoroacétate est de 988 g/mole et la molécule contient 2 charges positives. Donc il faut 1, 5 umole/ml de pcTG37 ce qui correspond à 1, 49 mg/ml.

Pour obtenir une concentration équimolaire en L-a- Dioleoyl-phosphatidyléthanolamine (DOPE, 744 g/mole, Sigma ; P0510), il en faut 1, 12 mg/ml dans la préparation lipidique. Les

quantités et les concentrations pour les autres composés sont ajustées en conséquence de leurs masses molaires respectives et de leur nombre de charges positives.

Les lipides sont repris dans du chloroforme, séchés par évaporation puis solubilisés dans du chloroforme/méthanol (v : v) et à nouveau séchés. Les lipides cationiques sont pesés et la quantité de DOPE est ajoutée à partir d'une solution mère de 10 ou 20 mg/ml dans du chloroforme dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV pour obtenir une concentration de 2 mM en lipide cationique. Les solvants sont évaporés sous vide (0, 2. 105 Pa (200 mbar)) pendant 45 min à 45°C en utilisant un vortex de 40 tours par minute (Labconco, Rapidvap, Uniequip, Martinsried, Allemagne). Le film lipidique est repris dans de l'éthanol pour tre à la concentration de 50 mg/ml en lipide cationique. pcTG37/DOPE 1, 49 mg + 1, 12 mg = 2, 61 mg dans 30 pi d'éthanol. Cette solution est complétée avec 270 pi d'HEPES 20mM pH 7, 5 (ajusté avec NaOH) pour préparer une solution à 5 mg/ml finale.

L'ADN plasmidique est préparé à partir d'une solution mère à 1 mg/ml (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7, 5).

Pour une solution de 0, 5 ml finale, on prélève 50 pi de la solution mère (50 ug ADN) auxquels on ajoute 300 ul d'HEPES 20mM pH 7, 5.

Pour complexer l'ADN avec des préparations lipidiques, on ajoute des lipides sur l'ADN. La suspension est mélangée par aspiration/refoulage à la pipette (10 fois). Les complexes sont conservés à + 4°C.

150 pi de pcTG37/DOPE sont ajoutés à 350 pi de la solution ADN pour obtenir 0, 5 ml de complexe à 0, 1 mg/ml ADN et un rapport de charges de 10.

La préparation des complexes se fait sous une hotte à flux laminaire.

On obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-après.

2. Préparation des complexes lipides pcTG39, éventuellement DOPE,-ADN On obtient les complexes selon le mme protocole que précédemment.

Préparation des complexes lipides-ADN par mise en suspension dans une solution de détergent 1. Préparation des complexes lipides pcTG37, éventuellement DOPE,-ADN Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci- dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0, 1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Le mélange des lipides se fait dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2 mM en lipide cationique (voir ci dessus). Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans une solution de n-octyl, (3-D-glucopyranoside (octylglucoside, Sigma, 0 9882) selon un rapport lipide cationique/détergent de 1/5 (mole : mole).

On prélève 375 pi d'une solution d'octylglucoside 20 mM dans de l'HEPES 20 mM pH 7, 5, avec lesquels on reprend le film de mélange lipidique pcTG37/DOPE. L'ADN plasmidique est préparé à partir d'une solution mère d'ADN plasmidique à 1 mg/ml dont on prélève 50 pi pour un volume final de 0, 5 ml (0, 1 mg/ml final) auxquels on ajoute 262, 5 pi d'HEPES 20 mM pH 7, 5. 187, 5 pi de la suspension lipidique sont ajoutés sur l'ADN en aspirant et refoulant 10 fois à la pipette pour obtenir la suspension finale à 0, 1 mg/ml en ADN et un rapport de charges +/-de 10. Pour éliminer le détergent une dialyse de 3 fois 4 heures à température ambiante contre de l'HEPES 20 mM pH 7, 5 est entreprise dans des microdoigts de dialyse (seuil d'exclusion de 13, 2 kD ; Sartorius, Gôttingen, Allemagne). Les complexes

ADN/lipides dialysés sont conservés à + 4°C. La préparation se fait dans une hotte à flux laminaire.

On obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous.

2. Préparation des complexes lipides pcTG39, éventuellement DOPE,-ADN Selon le mme protocole on obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-après.

Préparation des complexes lipides-ADN par sonication extrusion Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci- dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0, 1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. La mélange des lipides se fait dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2 mM en lipide cationique, comme indiqué ci-dessus. Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans 900 p1 d'HEPES 20 mM pH 7, 5 à 4°C pendant environ 16 h. La suspension est soniquée dans un bain de sonication (Bransonic 221) jusqu'à homogéneité visuelle. La suspension lipidique est extrudée au travers de deux membranes de 0, 2 um de diamètre de pores (Nucleopore, Costar, Cambridge, MA, USA) et rincée avec de l'HEPES 20mM pH 7, 5 (Extruder de Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada) à une pression maximale de 50 bars. La suspension lipidique est maintenue à température ambiante pendant 1 heure.

450 pi de la suspension lipidique sont ajoutés sur 50 pi d'une solution mère de l'ADN plasmidique (1 mg/ml) et mélangés en aspirant/refoulant 10 fois à la pipette. Les complexes lipide/ADN sont conservés à +4°C. Les préparations sont faites sous une hotte à flux laminaire.

Protocole d'évaluation de la complexation de l'ADN par les lipides Un gel à 1% (w : v) d'agarose est préparé dans un tampon TAE (TAE : Tris-4, 86g/1 + acétate de sodium 0, 68g/1 + EDTA 0, 336g/1 pH 7, 8. Si nécessaire, l'échantillon est dilué dans du TAE puis on ajoute le tampon d'échantillon bleu de bromophénol 0, 083%, cyanol xylène FF 0, 083%, glycérol 10% dans l'eau) de façon à se trouver à 50 ng d'ADN/pl. L'échantillon est brièvement soumis à un vortex et laissé 30 min à température ambiante. A titre de témoin, on utilise le plasmide non complexé préparé à la mme concentration. 10 pl (500 ng d'ADN) sont déposés sur le gel et la migration s'effectue à 60mV pendant 3 heures. Le gel est révélé dans du TAE contenant 0, 006% (v : v) de bromure d'éthidium à 10 mg/ml pendant au moins 30 min. Ensuite le gel est rincé dans du TAE et analysé sous UV.

Protocole de mesure de la taille des particules par diffusion quasi élastique de la lumière Les analyses sont faites sur un Coulter N4Plus (Coultronics France S. A., Margency, France) à 25°C après équilibration de l'échantillon pendant 20 min. Une aliquote de l'échantillon est aspirée et refoulée plusieurs fois avant d'tre pipettée. l'échantillon est dilué dans la cuve de mesure et homogénéisé.

La mesure de la lumière diffractée à 90° est faite pendant 180 sec après 180 sec d'attente. La gamme utilisée va dé 3 nm à 10 000 nm en utilisant 31 bins. Pour tre valable, l'échantillon doit donner entre 50 000 et 1 000 000 counts/sec.

Caractéristiques physico-chimiques Les trois méthodes de formulation"injection d'éthanol", "dialyse de détergent"et « sonication-extrusion » sont appliquées aux lipides cationiques selon l'invention avec ou sans des quantités équimolaires de DOPE à des rapports de charges d'environ 10 ou 5. Les formulations sont considérées

comme appropriées lorsque l'ADN est complètement complexé (aucune migration dans le gel d'agarose) et que les complexes présentent des'diamètres déterminés par diffusion quasi élastique de-la lumière inférieurs à 500 nm. Le tableau 1 résume les résultats de ces analyses. Tous les complexes ADN/lipides indiqués dans le tableau complexent l'ADN complètement.

TABLEAU 1 lipide Rapport'Taille Formulation pcTG37 10 77 éthanol pcTG37 5 80 éthanol pcTG37/DOPE 10 79 éthanol pcTG37/DOPE 5 64 éthanol pcTG37 10 240 détergent pcTG37 59 détergent pcTG37/DOPE 10 312 détergent pcTG39/DOPE 10 312 détergent pcTG37/DOPE 5 280 sonication ''. Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de l'ADN.

: Les populations qui représentent moins de 10 % de l'intensité ne sont pas indiquées. La taille est déterminée 24- 48 heures après la préparation.

Ces analyses montrent que les formulations remplissent les exigences requises. La méthode"injection d'éthanol"donne les meilleurs résultats, les différentes préparations testées présentant une taille inférieure à 100 nm. La méthode par dialyse de détergent ou de sonication/extrusion permet également d'obtenir des complexes répondant aux critères de la présente invention.

Transfection in vitro de cellules satellites Des cultures de muscles de chien et de muscles humains sont effectuées dans un milieu HamF 14 (Life Technologies) supplémenté--avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS, Hyclone, Logan, UT), 10 pg/ml d'insuline (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ) 2mM de glutamine (bioMérieux), et 40 pg/ml de gentamycine (Schering Plough).

Les cellules sont ensemencées 24 h à 48 h avant la transfection dans une boîte de culture à 96 puits à raison de 5x103 à 104 cellules par puits, à environ 30 % de confluence, et maintenues à 37°C en atmosphère contenant 5 % CO2 et 95 % d'air.

Les transfections sont effectuées avec des mélanges de quantités variables de lipides et d'ADN plasmidique pour déterminer les rapports de charges et les concentrations d'ADN optimales par puits.

Les complexes utilisés sont préparés 24 h à 48 h avant la transfection et dilués dans le milieu HamF 14 contenant 40 pg/ml de gentamycine et 2mM de glutamine.

Après élimination du milieu de culture, 100 pl de mélanges de transfection avec ou sans 10 M de FCS sont transférés dans chacun des puits et les plaques sont incubées pendant 4 h à 37°C.

Tous les milieux de transfection sont alors ajustés à 10~ de FCS, 10 pg/ml d'insuline (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ), 2 mM de glutamine (bioMérieux), et 40 pg/ml de gentamycine (Schering Plough) pour un volume final de 250 pi. Les cultures sont incubées pendant 48h puis les cellules sont récupérées et testées pour leur capacité à exprimer le gène de la luciférase. Les concentrations de protéines sont déterminées par le système de test de quantité de protéine (Promega).

Transfection de cellules A549 avec des complexes lipidiques Les cellules A549 (cellules épithéliales dérivées de carcinome pulmonaire humain) sont mises en culture dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL) 24 heures avant le début de la transfection dans des plaques de 96 puits (2 x 104 cellules par puits) dans une atmosphère humide à 37°C et 5% Cl,/95% air. Pour la transfection en l'absence de sérum, le milieu est enlevé et remplacé par du milieu sans sérum. On prépare dans une autre microplaque les suspensions de complexes lipides/ADN suivantes (complexes lipides/ADN à 0, 1 mg/ml d'ADN et au rapport de charges indiqué) : 44 pi (4, 4 pg ADN), 22 pi (2, 2 pg ADN), 5, 5 pi (0, 55 pg ADN) de solution stock dans les 3 premiers puits, et 11 pl (0, 11 ug ADN) de la solution stock diluée 10 fois dans le puits suivant. Le volume est complété à 110 pi avec du DMEM et 100 pl sont transférés sur les cellules A549.

L'incubation se fait avec 4, 2, 0, 5 et 0, 1 pg d'ADN par puits pendant 4 heures. 50 pl de DMEM + 30% de sérum de veau foetal sont ajoutés 4 heures après le début de la transfection puis 100 pl de DMEM + 10z de FCS 24 heures après le début de la transfection. Les transfections en présence de 10% de sérum de veau foetal sont réalisées d'une façon identique sauf aue la transfection se passe dans du milieu avec sérum.

Analyse de la transfection 48 h après la transfection, le milieu est éliminé et les cellules sont lavées avec 100 pi de solution phosphate PBS et lysées avec 50 pi de tampon de lyse (Promega). Les lysats sont congelés à-80°C jusqu'à la mesure de l'activité en luciférase.

Celle-ci se fait sur 20 pi de mélange pendant une minute en utilisant le système de détermination de la luciférase » (Promega) (luminomètre LB96P Berthold) dans des plaques à 96 puits en mode cinétique.

Transfection in vitro Les préparations de lipides cationiques pcTG37 ont été évaluées en tranfection in vitro en utilisant les cellules A549 et les myoblastes primaires de chien.

Les résultats sont résumés dans le tableau 2 ci-dessous et montrent les unités relatives de lumière (RLU) par puits. Les valeurs données sont obtenues avec 0, 5 µg d'ADN par puits. Tous les complexes sont préparés en utilisant la méthode d'injection d'éthanol. La concentration totale de protéine par puits est déterminée par les techniques conventionnelles (test BCA, Pierce). A titre indicatif, un puits contient environ 20 à 30 pg de protéine.

TABLEAU 2

Lipide Rapport'A549'A549 + myoblastes myoblaste sérum + sérum 1, 7 x 10t pcTG37 10 (4, 0 x108 3, 2 x 104 0 1, 2 x 105 RLU/mg/ min) _ 9, 9 x 10' pcTG37 5 (1, 4x109 3, 9 x 8, 5 x 10'8, 6 x 103 RLU/mg/ min) pcTG37/10 3, 5 x 10° 1, 2 x 10° 1, 5 x 104 4, 9 x 10' DOPE pcTG37/5 5, 0 x 104 6, 7 x 106 1, 9 x 10° 4, 9 x 104 DOPE Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de l'ADN.

2 : ADN libre entre 0 et 270 unités de lumière relative.

Un autre mode de synthèse des composés selon l'invention a été mis au point 1. Synthèse de la partie polyaminée 1. 1. Afin de pouvoir synthétiser des composés « T-branchés » pour lesquels le groupe R de formule II est fixé sur les amines secondaires, une N, N'di-boc-spermine a été synthétisée. Le protocole appliqué pour obtenir le 1, 4-diboc-spermidine est publié par Goodnow et al. (1990, Tetrahedron 46, 3267-3286).

L'intermédiaire le N-N' (di-boc) N, N' (dipropionitrile) 1, 4- diaminobutane est obtenu par réaction de 37, 6 mmoles de diaminobutane (Fluka ; référence 32790) dilué dans 3, 8ml de dichlorométhane + 2ml de méthanol à 0°C avec 75, 2mmoles d'acrylonitrile (Fluka ; référence 01710), lheure à 0°C. Le produit de la réaction est bloqué par 100mmoles de BOC-ON [ (2- boc-oxyimino)-2-phénylacétonitrile] (Fluka ; référence 15475) dans 50ml de solvant CH2Cl2/CH3OH 2/1. La réaction de blocage est placée une nuit à température ambiante. Les solvants sont évaporés et le produit est repris dans 200ml d'acétate d'éthyle puis soumis à 3 extractions avec 200ml de NaOH 1M. La phase organique est à nouveau extraite avec 5% acide citrique, sèchée et filtrée sur Na, S04 avant évaporation à sec. On procède alors à une étape de réduction des nitriles, dans l'éther à 0°C, en présence de 260 mmoles de LiAlH4 (Sigma ; L0260). Après 15heures, la réaction est arrtée par addition de 100ml de soude 1M à 0°C, avec dégagement d'hydrogène. Le mélange est filtré et extrait 3 fois avec une solution de NaCl 20%. Après séchage de la fraction éthérée, le produit est déposé sur colonne de silice dans un solvant CH2Cl2/CH3OH 1/l, puis élué dans un solvant CH2Cl2/CH3OH/(C2Hs) 3N 15/5/1. On détermine par chromatographie sur couche mince les fractions contenant le di-boc-spermine. Pesée du produit final : 2, 45g (5, 8mmoles). Rendement global : 15, 5%

1. 2. Synthèse de N, N' di-boc-spermidine à partir de la spermidine. 20mmoles de spermidine (Sigma S2626) dilués dans 20ml de dichlorométhane ajoutés à 20ml de méthanol, llmmoles (2ml) de dii-sopropyléthylamine à 0°C et 40mmoles de BOC-O-BOC [di- (tert-butyl)-dicarbonate] (Fluka ; référence 34660) dans 80ml de solvant CHzClz/CHsOH 1/1. La réaction de blocage est placée une nuit à température ambiante. Les solvants sont évaporés puis le produit est déposé sur colonne de silice, et élué dans des palliers de solvants CH2Cl2/CH3OH de 9/1 à 8/2. On détermine par chromatographie sur RP-HPLC les fractions contenant le N, N'di- boc-spermidine. Une partie pure de N, N' di-boc-spermidine est ainsi isolée des autres isomères de position de di-boc- spermidine. Pesée du produit final : 0, 58g (1, 68mmoles) Rendement global : 8, 5% 1. 3 Nouveau procédé de synthèse du 1-4 di-boc-spermidine : 50 mmoles de diaminobutane (Fluka ; référence 32790) dilué dans 50ml de dichlorométhane sont ajoutés à 20ml de méthanol à 0°C avec 58mmoles d'acrylonitrile (Fluka ; référence 01710) et placé lheure à 0°C. Le produit de la réaction est bloqué par 109mmoles de BOC-ON [ (2-boc-oxyimino)-2-phénylacétonitrile] (Fluka ; référence 15475) dans 50ml de solvant CH Cl>/CHQOH 2/1. La réaction de blocage est placée une nuit à température ambiante.

Les solvants sont évaporés et le produit est repris dans 300ml d'acétate d'éthyle pour 3 extractions avec 300ml de NaOH 1M. La phase organique est à nouveau extraite avec 5% acide citrique, sèchée et filtrée sur Na2SO4 avant évaporation à sec. On procède ensuite à l'étape de réduction des nitriles, dans l'éther à 0°C, en présence de 140 mmoles de LiAlH4 (Sigma ; L0260). Après 15heures, la réaction est arrtée par addition de 100ml de soude 1M à 0°C, avec dégagement d'hydrogène. Le mélange est filtré et extrait 3 fois avec une solution de NaCl 20t. Après séchage de la fraction éthérée, le produit est prt à tre déposé sur colonne de silice pour la purification finale.

2. Synthèse de la partie hydrophobe Synthèse de l'acide N-a-N-ß-Di [oleylamido]-propionique. A 4, lmmoles (0. 58g) de N-a-N-p-diaminopropionique acide, HCl (Bachem F3040) dans'un mélange de 22ml d'eau, 44ml de dioxane et 20, 5mmoles (2, 65ml) de diisopropyléthylamine,-on ajoute 9, 04mmoles (3, 43g) de l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide oléique (Sigma O 9506) dilué dans 10ml dioxane. Après 2 heures de réaction, on procède à 2 extractions à l'éther/HCl 5%, puis lavage NaCl saturé et séchage sur Na, S04 avant évaporation à sec de la fraction éthérée. Le produit est déposé sur colonne de silice dans un solvant CH2Cl2/CH3OH 95/5, puis élué dans des palliers de solvants CH2C12/CH30H95/5, puis 92, 5/7, 5, et enfin 90/10. On détermine par chromatographie sur couche mince les fractions contenant l'acide n-a-n-D-di [oleylamido]- propionique.. Contrôle sur CCM (CH2C12/CH30H 90/10) et RMN.

Séchage Pesée : 0, 916g (1, 45mmoles), rendemement : 35, %.

Synthèse de l'acide N-a-N-P-Di [laurylamido]-propionique. A lmmole (0. 14g) de N-a-N-ß-diaminopropionique acide, HCl (Bachem F3040) dans un mélange de 10ml d'eau, 20ml de dioxane et 5mmoles (0, 65ml) de diisopropyléthylamine, on ajoute 2, 2mmoles (0, 65g) de l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide laurique (Sigma L3900) dilué dans 10ml dioxane. Le mme protocole de purification (voir l'acide N-a-N-ß-Di [oleylamido]-propionique) est appliqué.

Pesée : 0, 4g (0, 5mole), rendemement : 50%.

Synthèse de l'acide N-a-N-p-Di [palmitylamido]-propionique. A lmmole (0. 14g) de N-a-N-p-diaminopropionique acide, HCl (Bachem F3040) dans un mélange de 10ml d'eau, 20ml de dioxane et 5mmoles (0, 65ml) de diisopropyléthylamine, on ajoute 2, 2mmoles (0, 79g) de l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide palmitique (Sigma P1162) dilué dans 10ml dioxane. L'ester activé précipite à l'addition et la réaction procède en phase hétérogène pendant 15 heures

sous agitation à température ambiante. Et le mme protocole de purification (voir l'acide N-a-N-R-Di [oleylamido]-propionique) est appliqué. Pesée : 0, 14g (0, 15mmole), rendemement : 15%.

3. Nouvelle synthèse de pcTG37 A 1, 45mmoles (500mg) de 1, 4di-boc-spermidine dilué dans 30ml CHCl3 anhydre, on ajoute 1, 45mmoles 916mg de l'acide N-a-N-p- di [oleylamido]-propionique, 1, 74mmoles (235mg) de N hydroxybenzotriazole (Sigma ; H2006), 2mmoles (265µl) de diisopropyléthylamine, et enfin 2, 175mmoles (449mg) de dicyclohéxylcarbodiimide (Sigma ; D3128) dilué dans 10ml CHCl3.

Après 2 heures de réaction on filtre et après évaporation, on redilue dans ether/hexane 50/50, on procède à une nouvelle filtration-évaporation. Ce produit est purifié sur colonne de silice déposé dans l'ether et élué dans des palliers de solvant éther/acétate d'éthyle : 75/25, 50/50, 25/75 et 100% acétate d'éthyle. Contrôle sur CCM (acétate d'éthyle) et RMN. Le produit final, repris dans 10ml CH2Cl2 est dèprotègè Boc en ajoutant goutte à goutte à 0°C 50ml d'acide trifluoroacétique (Fluka 91699) redistillé à 72°C et dilué dans 50ml CHCl2. Après 4heures, on évapore 2 fois à pression réduite après dilution dans 50ml de n-hexane. Le produit est repris dans 10ml d'ether, précipité dans l'hexane et filtré sur papier filtre. Le produit est repris par lavage du papier dans un solvant CHCl/CHOH 1/l. Contrôles sur CCM (acétate d'éthyle), HPLC et RMN.

Evaporation et pesée : 670mg (0, 68mmoles) rendement : 47%.

4. Synthèse de pcTG89 (équivalent de pcTG37mais sous une forme T-branchée) On applique le mme protocole que pour pcTG37 mais en remplaçant le 1, 4di-boc-spermidine par le N, N'di-boc- spermidine. Pesée du produit protégé : 170mg (0, 18mmoles), rendement : 12, 2-.

Injection intraveineuse de complexes selon l'invention Les résultats sont résumés sur la figure 2. Des-complexes selon l'invention ont été synthétisés selon les méthodes décrites précédemment à partir du composé pcTG337, en présence ou en l'absence de DOPE (2 : 1, mol : mol), à un ratio de charge fixe de 5, en utilisant un plasmide contenant le gène de la luciférase pTG11033 (demande de brevet français n° 97/08267).

Les souris utilisées sont des souris femelles C57BL/6 de 9 à 11 semaines. Un jour avant l'injection avec le complexe selon l'invention, les souris sont pré-traitées par injection de 50 pi d'une préparation de chlodronate encapsulé dans un liposome (voir Van Rooijen et Sanders, 1994, J. Immunol. Methods, 174, 83-93) incorporée dans un volume total de 200 pi (+ 150 pi de tampon PBS). Les injections intraveineuses sont effectuées dans la queue après désinfection de la peau à l'éthanol 70z. Le volume injecté est 250pal et la quantité d'ADN est 60 pg, la quantité de lipide est 345 pg.

Deux jours après les injections, les souris sont sacrifiées. Après extraction, les tissus sont congelés dans de l'azote liquide et conservés à-80°C. Afin de mesurer l'activité luciférase, les tissus sont broyés mécaniquement à l'aide d'un pilon dans un mortier placé sur la carboglace. 500p1 d'un tampon de lyse (Promega) sont ajoutés aux débris de tissus obtenus à partir des poumons et soumis à trois étapes de congélation/décongélation. Les débris cellulaires sont éliminés par centifugation et l'activité luciférase (en RLU/min, Unité de lumière relative par minute) est mesurée sur 20 pi de surnageant conformément aux instructions du fournisseur (Promega) en ajoutant 100 pi de réactif et en mesurant l'activité par luminescence. L'activité luciférase mesurée est standardisée par rapport à la quantité protéique à l'aide d'une gamme étalon réalisée à partir de luciférase disponible dans le commerce (Promega). La quantité de protéine totale est, par ailleurs, déterminée par la méthode colorimétrique d'acide bicinchoninique

BCA (Smith et al., 1985, Anal. Biochem., 150, 76-85 Pierce) à partir d'un aliquote de surnageant. Ceci permet-d'exprimer l'activité luciférase en RLU par milligramme de protéine extraite des-tissus. Des contrôles sont réalisés pour lesquels les souris n'ont pas été injectées ou ont été injectées avec de l'ADN seul (60 ug) dans un tampon 20 mM HEPES pH 7. 5.

Les résultats (Figure 2) montrent que l'expression du gène rapporteur luciférase dans les poumons après injection intraveineuse de complexes renfermant le composé selon l'invention à un ratio de charge de 5, en présence de DOPE est nettement améliorée par rapport à l'injection de l'ADN seul. Les valeurs indiquées sont des valeurs moyennes obtenues à partir de 3 souris injectées.