<抗BTN3モノクローナル抗体の調製>
 まず、本発明のモノクローナル抗体作製に� ��かるハイブリドーマ細胞を作製するため、� ��ラスミドDNAの調製を行った。
 ヒト全長BTN3A3分子は、ヒト末梢血単核球(以 下PBMCs)由来のcDNA(相補性DNA)ライブラリから、 以下2つのプライマーを用いて、クローニン� �を行った。
5’-ATT AAG CTT CAA TGA AAA TGG CAA GTT CCC TG-3� ��(配列番号7)
5’-AGT TCT AGA TCA GTA AAG TGC TTC AGT GCG TGC  CT-3’(配列番号8)

 DNA増幅には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(G eneAmp PCR System9700;Applied Biosystem社)を行い、95 ℃30秒、55℃30秒、72℃30秒を30サイクル実行し た。

 次に、上記PCRにて得られたBTN3A3分子全長cDNA (配列番号5、アミノ酸配列は配列番号6に記載 )をサイトメガロウイルス由来プラスミドベ� �ター(pRC-CMV)(INVITROGEN)のHindIII/XbaI領域に挿入� �プラスミドDNAを完成させた。
 BTN3A3を発現したBALB/3T3細胞はpRC-CMV-BTN3A3を用 いてBTN3A3を強制発現させることにより作製し た。その際の遺伝子導入には、リポフェクト アミン2000(インビトロジェン)を使用した。ま ず該当プラスミドベクター30mgに対し75mlリポ� ��ェクトアミン2000を添加し、室温で20分反応� ��せた。その後、75cm ² フラスコ(Sumilon)に播種しておいた4×10 ⁶ 個BALB/3T3細胞に添加し、48時間後に回収した� �のを免疫原細胞とした。

 次に、上記調製プラスミドDNAをマウスへ� ��疫しポリクローナル抗体を得る。具体的に� ��、8~10週齢メスBalb/cマウスの皮下に対し、30� �gの上記プラスミドDNAを移入した。この操作� ��2週間おきに4回行った。

 その後、免疫後のマウスより採取した血清� ��含まれるポリクローナル抗体の力価をフロ� ��サイトメーターにて測定した。具体的には� ��ャイニーズハムスター由来CHO-K1細胞にpTracer -BTN3A3-GFP(BTN3A3分子とGFP(緑色蛍光タンパク質)� ��子を両方発現するベクター;INVITROGEN)を一過� ��に発現させた。前記プラスミドベクター30mg に対し75mlリポフェクトアミン2000を添加し、� ��温で20分反応させた。その後、75cm ² フラスコ(Sumilon)に播種しておいた4×10 ⁶ 個BALB/3T3細胞に添加し、48時間後に回収した� �のをトランスフェクタントとして用いた。

 上記1×10 ⁶ 個トランスフェクタントを懸濁した懸濁液に 対し、採取血清を1/100、1/1000の割合となるよ� ��に添加し、4℃で30分反応させた。PBS(-)で洗� ��後、0.5mlのPEラベル抗マウスIgG+IgMポリクロ� �ナル抗体を添加し、4℃で30分反応させた。PB S(-)で洗浄後、フローサイトメーターで解析� �行った。フローサイトメーター解析で1/1000� �も反応することが確認され、十分にBTN3A3分� �に対するポリクローナル抗体が作製されて� �る事を確認した。

 対象マウスの脾臓細胞1×10 ⁸ 個とSP2/0ミエローマ細胞(ATCCより購入し、培� �したもの)2×10 ⁷ 個とを、ポリエチレングリコール(PEG1500;SIGMA) を用いて融合した。

 この融合細胞を15%FCS(ウシ胎児血清)、HAT(ヒ� ��キサンチン100μM、アミノプテリン0.4μM、チ� ��ジン16μM:Sigma-Aldrich)、さらに10%メチルセル� �ース(Stem Cell Technologies)を添加したDMEM培地� �播種し、37℃、5% CO ₂ インキュベーター内で培養した。

 培養から10~12日後、形成されたハイブリ� �ーマのコロニーをピックアップし、ポリク� �ーナル抗体測定時と同様にフローサイトメ� �ターによるスクリーニングを行った。モノ� �ローナル抗体産生ハイブリドーマの選択は� �フローサイトメーターの検出結果をGFPと抗� �ウスIgG+IgMポリクローナル抗体の結合量で展� ��し、GFPの発現と抗体の結合量が正比例の関� ��にあるものを選択した。スクリーニングを� ��う中で、ハイブリドーマ232-5及び34-7を得た� ��約1Lの232-5又は34-7それぞれの細胞上清をPROTE IN Gカラム(GE Healthcare Science)で精製し、232-5� ��は34-7由来のモノクローナル抗体(以下、そ� �ぞれの抗体を232-5抗体、34-7抗体と記す。)を� ��た。

 得られた本発明抗体のサブクラスは、Isos trip kit(Roche)により、免疫グロブリンG2a(IgG2a)� ��あることを確認した。

 次に、CHO-K1にpTracer-BTN3A3-GFP又はpTracer mock  geneを一過性に発現させ、本発明抗体(232-5抗 体)又はコントロールIgG2aを反応させた。

 図1は、細胞を洗浄後フローサイトメータ ーで測定した結果である。mock gene(偽遺伝子) を発現しているCHO-K1細胞ではコントロールIgG 2a、本発明抗体(232-5抗体)ともに反応しなかっ た。一方、BTN3A3を発現しているCHO-K1細胞では 本発明抗体(232-5抗体)のみ反応した。これら� �結果から本発明抗体(232-5抗体)はBTN3A3に対し� ��特異的なモノクローナル抗体であることが� ��された。

 また、同様の実験をIgG2a、232-5抗体、34-7� �体を用いて行った結果を図2に示す。図1では 、232-5抗体がBTN3A3特異的なモノクローナル抗� ��であることが明らかとなったが、図2から、 34-7抗体もBTN3A3特異的なモノクローナル抗体� �あることが明らかとなった。

<抗原認識部位の推定1>
 PBMCsに0、0.1、1、10、100、1000ng/mlのBT3.1抗体� �反応させ、洗浄後FITC標識した232-5抗体を1000n g/mlの濃度で反応させた後、フローサイトメ� �ターでFITCの蛍光強度を測定した。

 図3はフローサイトメーター解析の結果を 示す図である。予めBT3.1処理していたPBMCsに� �いて、BT3.1の濃度依存的に本発明抗体(232-5抗 体)による蛍光強度は減少した。このことか� �、BT3.1と232-5抗体はBTN3抗原の非常に近傍のエ ピトープを認識していることが示された。

<抗原認識部位の推定2>
 BTN3抗原は細胞外領域にイムノグロブリンス ーパーファミリーに属するVset領域とCset領域� ��保有する。BT3.1及び、本発明抗体(232-5)の認� ��領域がVset又はCsetの何れかを検討するため� �BTN3A3のCsetのみ又はVsetとCset両者を発現する� �クター(pDisplay-Cset又はpDisplay-ALL)を作製した� �

 上記pDisplayベクター(INVITROGEN)はHA Tagを挿� ��している。COS-7細胞にpDisplay-Cset又はpDisplay-A LLプラスミドを一過性にトランスフェクショ� ��し、BT3.1又は本発明抗体(232-5抗体)を反応さ� ��た。更に、pDisplayベクターの発現確認のた� �、抗HA(A型肝炎ウイルス)抗体でも染色をおこ なった。

 図4はフローサイトメーターの結果である 。BT3.1、232-5両者でpDisplay-Csetでは蛍光は検出� ��きなかった。一方、pDisplay-ALLトランスフェ� ��タントでは両者の抗体で蛍光が検出された� ��これらの結果から、BT3.1、本発明抗体(232-5� �体)による抗原認識部位はBTN3抗原のN末端側� �Vset領域に存在することが明らかになった。

 また、同様の実験をBT3.1、232-5抗体、34-7� �体を用いて行った結果を図5に示す。34-7抗体 も他の2つの抗体同様にBTN3抗原のN末端側のVse t領域を認識することが明らかとなった。

<抗原認識部位の推定3>
 次に、BTN3抗原のVset内での抗原認識部位を� �定するため以下のプラスミドを作製した。� �れらはV-all、V-35、V-40、V-50、V-60の5種類で、� ��れぞれBTN3抗原(BTN3A3)の細胞外ドメインの26-1 39、35-139、40-139、50-139、60-139のアミノ酸をコ� ��ドする。

 上記プラスミドを作製する際に用いたプラ� ��マーは、
V-all:5’-GTT GGG GCA ACG CCG CCC TCT TTT GGA GGG� �TT-3’(配列番号9)、
V-35: 5’-TCA ATG GCC CAG CCG GCC GGA CCC TCT GGG  CCC AT-3’(配列番号10)、
V-40: 5’-TCA  ATG GCC CAG CCG GCC ATC CTG GCC A TG GTG GG-3’(配列番号11)、
V-50: 5’- TCA ATG GCC CAG CCG GCC CTG CCC TGT C AC CTG TT-3’(配列番号12)、
V-60: 5’- TCA ATG GCC CAG CCG GCC GCA GAG ACC A TG GAG CT-3’(配列番号13)
であり、共通のリバースプライマーは、
5’- TCA ATG TCG ACA AGA TCA GAA CCC AAT GCT G-3 ’(配列番号14)
である。

 PBMCs由来cDNAライブラリDNAをテンプレート� ��し、PCR法により各種PCR産物(Vset領域のDNA断� �)を得た。PCRは95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30� ��で25サイクル行った。

 上記プラスミドをpDisplayベクターのSfi/Sal� ��イトに挿入し、COS-7に一過性に強制発現さ� �た。24時間後に細胞を回収し、ウエスタンブ ロッティングにて発現の確認を行った。詳し くは、SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリ アクリルアミドゲル電気泳動)サンプルバッ� �ァに溶解し熱処理を行い(100℃ 5分間)、12.5%S DS-PAGEにて電気泳動を行った。電気泳動後、� �ルをPVDF(ポリフッ化ビニリデン)メンブレン(B IO-RAD社)に転写し、3%BSA(ウシ血清アルブミン)� ��メンブレンをブロッキングした。その後、B T3.1又は本発明抗体を1μg/mlでメンブレンに添� ��し室温で一時間反応させた。PBS-tween(リン酸 緩衝食塩水-界面活性剤)で洗浄後、ヒツジ抗� ��ウスIgG-HRPを2000倍希釈で室温、30分間反応さ せた。PBS-tweenで洗浄後、HRPの基質であるECL(GE  Healthcare Science社)を添加し、X線フィルムに� ��光させた。

 図6は上記ウエスタンブロットの結果であ る。BT3.1はV-all、V-35、V-40でバンドが検出され たが、V-50、V60では検出されなかった。よっ� �BT3.1はBTN3抗原の40-50間のアミノ酸配列を認識 していることが示唆された。

 一方、本発明抗体(232-5抗体)に特異的なバ ンドはV-all、V-35で検出され、V-40ではその濃� �は薄いものであった。また、V-50、V60ではバ� ��ドは検出されなかった。このことから、本� ��明抗体はBTN3抗原の35-40間のアミノ酸配列を� ��識していることが推定された。

 また、同様の実験をBT3.1、232-5抗体、34-7� �体を用いて行った結果を図7に示す。232-5抗� �と同様に、34-7抗体もBTN3抗原の35-40間のアミ� ��酸配列を認識していることが推定された。3 5-40間のアミノ酸配列はBTN3A1、BTN3A2、BTN3A3で� �致しており、本発明抗体がBTN3のいずれの分� ��も認識するモノクローナル抗体であること� ��推定された。

<BT3.1及び本発明抗体のPBMCsにおけるBTN3抗原 の発現割合及び抗原親和性>
 PBMCsをBT3.1又は232-5抗体(10μg/ml)により染色後 、FITC-goat anti-mouse IgG(BD Bioscience)を反応させ 、フローサイトメーターで解析した。また、 BT3.1、232-5抗体の最終濃度が0.01、0.1、1、10、1 00、100ng/mlになるよう調製した。これらの溶� �をPBMCsに反応させ、反応後フローサイトメー ターで蛍光強度を測定した。

 結果を図8に示す。
 フローサイトメーター解析の結果、BT3.1はPB MCsの約80%を染色するのに対し、232-5抗体は約9 5%染色することが示された。また本発明抗体� ��BT3.1に比べBTN3抗原に対する抗原親和性が最� ��で8~9倍(10ng/ml時)あることが示された。

<各種リンパ球サブセット細胞表面におけ� �BTN3抗原の発現>
 実施例5において、本発明抗体はPBMCsの約95%� ��染色することを示したが、リンパ球の各サ� ��セットにおけるBTN3抗原の発現を検証した。

 1×10 ⁶ 個PBMCsに対し、FITCラベルを施した232-5抗体と� ��種リンパ球マーカーであるPE-CD3、CD4、CD8、C D19、CD56、γδTCR抗体(以上、ベックマンコール ター社製)を用いてフローサイトメーター解� �を行った。また、FITC-232-5のネガティブコン� ��ロールとして、FITC-IgG2a(ベックマンコール� �ー製)を用いた。

 結果を図9に示す。
 フローサイトメーター解析の結果、各種リ� ��パ球マーカー陽性画分の殆ど全てがBTN3陽性 であった。

<本発明抗体の細胞増殖に対する作用>
 PBMCsにCFSE(カルボキシフルオセイン二酢酸サ クシニミジルエステル;DOJINDO社)を最終濃度2μ Mになるように0.1%BSAを含むPBS中に添加し37℃� �10分反応させた後、10%FCSを含むRPMI1640培地を� ��加することでその反応を停止させた。CFSEラ ベルされたPBMCsをOKT3(5μg/ml)がプレコーティン グされている24穴(well)プレートに1×10 ⁶ /mlで播種した。その際、コントロールマウス 抗体、BT3.1、本発明抗体(232-5抗体)をそれぞれ 1μg/mlで添加した。培地は10%FCSを含むRPMI1640に 対し、rhIL-2(組替えヒトインターロイキン-2)� �50U/ml添加したものである。37℃、5%CO ₂ インキュベーターで3日間培養後、フローサ� �トメーターで解析した。この際、フィコエ� �スリン(PE)-抗ヒトCD4(13B.2;ベックマンコール� �ー)、或いはPE-抗ヒトCD8a(B9.11;ベックマンコ� �ルター)を用いた。

 本試験の結果を図10に示す。
 CFSEは細胞が分裂する割合に伴い、その蛍光 強度が減弱する性質を持つ。それぞれのサン プルをフローサイトメーター解析すると、本 発明抗体(232-5)を添加したPBMCsでのみ細胞分裂 の抑制が観察された。これは全PBMCsを対象に� ��た場合だけでなく、CD4又はCD8に限定した場� ��でも同様の傾向が観察された。BT3.1添加群� �はそのような傾向は観察されなかった。

 また、同様の実験をBT3.1、232-5抗体、34-7� �体を用いて行った結果を図11に示す。232-5抗� ��と同様に34-7抗体でも、細胞分裂の抑制が観 察された。これらの結果から本発明抗体(232-5 抗体及び34-7抗体)が細胞増殖の抑制効果を有� ��ることが明らかとなった。

<PBMCsを刺激した際のBTN3の発現減少>
 T細胞及びNK(ナチュラルキラー)細胞を刺激� �ることを目的とし、1×10 ⁶ 個PBMCsをOKT3(5μg/ml)プレコーティング24wellプレ ートに播種し、10%FCS、50U/ml rhIL-2を含むRPMI164 0培地で37℃、5%CO ₂ インキュベーターで培養を行った。

 またB細胞を刺激する目的で、別の培養系と して1×10 ⁶ 個PBMCsにlipopolysaccharide(リポ多糖:LPS)を最終濃� ��100ng/mlで添加した。3日後細胞を回収し、FITC -232-5/PE-ヒトCD3(UCHT1;ベックマンコールター)、 FITC-232-5/PE-ヒトCD4、FITC-232-5/PE-ヒトCD8a、FITC-23 2-5/PE-ヒトCD19(J4.119;ベックマンコールター)、F ITC-232-5/PE-ヒトCD56(N901;ベックマンコールター) 、FITC-232-5/PE- ヒトγδTCR(IMMU510;ベックマンコ� ��ルター)で染色し、フローサイトメーター解 析した。

 本試験の結果を図12に示す。
 OKT3/rhIL-2で刺激したPBMCsを回収してフローサ イトメーター解析すると、T細胞の表面マー� �ーであるCD3、CD4、CD8、γδTCRや、NK細胞の表� �マーカーであるCD56陽性細胞においてBTN3の発 現が減少していた。B細胞の表面マーカーで� �るCD19陽性細胞ではその現象は観察されなか� ��た。

 一方、LPSで刺激したPBMCsをフローサイト� �ーター解析すると、CD19陽性細胞のみにBTN3の 発現減少が見られ、その他の画分ではBTN3発� �減少は見られなかった。このことから、刺� �されたリンパ球ではBTN3の発現減少が起こる� ��とが明らかとなった。

<PBMCsを刺激した際のBTN3の発現減少(mRNAの解 析)>
 実施例8において、リンパ球が活性化される とBTN3分子の発現が減少していることを示し� �が、BTN3分子を構成するBTN3A1、BTN3A2、BTN3A3の� ��ずれの分子が影響を受けているかは、抗体� ��用いての解析では検証することができない� ��そこで、リンパ球を活性化させた際にmRNAを 抽出し、cDNA合成後にBTN3A1、BTN3A2、BTN3A3それ� �れに対する特異的プライマーを用いてPCRを� �った。

 (1)健常人採血直後の1×10 ⁶ 個PBMCs群、(2)健常人1×10 ⁶ 個PBMCsを培地のみで培養した群、(3)健常人1×1 0 ⁶ 個PBMCsを固相化OKT3、(5μg/ml)とrIL-2(50U/ml)で3日� ��刺激する群の3群を用意し、1mlのISOGEN(Wako)に 溶解した。トータルRNA、cDNA合成後にBTN3A1、BT N3A2、BTN3A3それぞれに対する特異的プライマ� �を用いてPCRを行った。
各プライマーの配列は以下の通りである。イ ンターナルコントロールとして、G3PDHを用い� ��。
BTN3A1:5’- GCA TCT CGG GGA GAG AGA CA-3’(配列� �号15)、5’- GAA TAT GCG ATC CAT CCA CA-3’(配� �番号16)、
BTN3A2:5’- GAT-GGA-GTG-GGC-CTA-TAT-GA-3’(配列番号17 )、5’-TCA-GGC-TGA CTT ATT G- 3’(配列番号18),
BTN3A3:5’- ATG GCT CGT GGA GAG AAG TC-3’(配列� �号19)、5’- AGA TAT GAG ATC CAT CTG TG-3’(配� �番号20)、
G3PDH:5’- ACC ACA GTC CAT CTC ATC AC-3’(配列番 号21)、5’- TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’(配列 番号22)
PCRの条件は94℃(30秒)、50℃(30秒)、72℃(1分)の� ��イクルを35回行った。

 その結果を図13に示す。採血直後のPBMCsで はBTN3A1、BTN3A2、BTN3A3いずれのmRNAも発現して� �た。それらの発現はPBMCsを培地のみで培養し た際も維持されていた。一方、OKT3/rIL-2で刺� �したPBMCsではBTN3A1、BTN3A2、BTN3A3全てのmRNAの� �現が減少していた。これらのことからリン� �球を活性化すると、BTN3分子を構成するBTN3A1� ��BTN3A2、BTN3A3の3分子全てのmRNAが減少するこ� �が判明した。

 <BTN3発現減少と活性化マーカーとの逆相� �1>
 実施例8において、リンパ球を活性化すると BTN3分子の発現が減少することが判明した。� �こで、リンパ球が活性化した際に強発現す� �IL-2レセプターα鎖(CD25)との相関を検証した� �

 1×10 ⁶ 個PBMCsをOKT3(5μg/ml)プレコーティング24wellプレ ートに播種した。10%FCS、50U/ml rhIL-2を含むRPMI 1640で3日間培養し、FITC-232-5/PE-ヒトCD25/PC5-ヒ� �CD8a(B9.11;ベックマンコールター)又はFITC-232-5/ PE-ヒトCD25/PC5-ヒトCD4(13B.8.2;ベックマンコール ター)で染色し、フローサイトメーター解析� �行った。

 本試験の結果を図14に示す。
 フローサイトメーター解析の結果、CD4陽性T 細胞に比べCD8陽性T細胞のほうが、活性化マ� �カーCD25の発現上昇とBTN3の発現減少の逆相関 がより顕著であることが示された。また、PBM CsをFSC(細胞の大きさ)、SSC(細胞の密度)のパラ メータで展開した場合、両パラメータ値が高 い群が活性化リンパ球で、低い群は刺激が入 っていない非活性のリンパ球であると予測さ れた。

 FSC/SSC高値にゲートをかけた場合、CD8、CD4 陽性細胞ともにCD25高発現、BTN3減少の細胞集� ��(ポピュレーション)が濃縮されて観察され� �。一方FSC/SSC低値にゲートをかけた場合は前� ��とは対照的に、CD25低発現、BTN3高発現ポピ� �レーションが観察された。

 これらのことからBTN3分子は活性化に伴い その発現が減少し、活性化マーカーとの発現 と逆の相関を示すことが判明した。

 <BTN3発現減少と活性化マーカーとの逆相� �2>
 BTN3は殆どのPBMCsに発現しているが、CD45ROを� ��現しているメモリーT細胞画分では一部BTN3� �発現が減少している。
 実施例8において、活性化リンパ球ではBTN3� �減少が起こることを記載したが、刺激前か� �BTN3が減少している画分が増殖したという可� ��性を打ち消す目的で、BTN3を100%発現してい� �ナイーブT細胞(CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ^- )を分離して刺激を行った。

 ナイーブT細胞の分離はまずPBMCsからCD4 ⁺ CD25 ⁺  regulatory Tcell isolation kit(Miltenyi Biotec)を用� ��て、ネガティブセレクションによってCD4 ⁺ CD25 ^- T細胞を得た。

 続いて、CD4 ⁺ CD25 ^- T細胞1×10 ⁷ 個に対してヒトCD45ROマイクロビーズ(Miltenyi B iotec)を10μl添加し、MACSバッファ(1% BSA、2mM ED TA in PBS)で洗浄後、磁場カラムに通し、CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ^- ナイーブT細胞を得た。

 こうして得られた上記ナイーブT細胞1×10 ⁶ 個をOKT3(5μg/ml)プレコーティング24wellプレー� �に播種し、10%FCS、50U/ml rhIL-2、5μg/ml抗ヒトCD 28抗体を含む培地で6日間培養した。6日後、� �胞を回収し、FITC-232-5/PE-ヒトCD25(2A3;BD Bioscien ce)、FITC-232-5/PE-ヒトCD45RO(UCHL1;ベックマンコー ルター)で染色した。またBT3.1にもFITC化を施� �(DOJINDO)、同様の染色を行い、フローサイト� �ーター解析を行った。

 図15に本試験の結果を示す。
 CD25は活性化マーカー、CD45ROはメモリーマー カーとして知られている。フローサイトメー ターの結果、本発明抗体によるBTN3の発現減� �と、CD25/CD45RO分子の発現が逆相関しているこ とが示された。BT3.1を用いても同様の傾向は� ��察されたが、本発明抗体(232-5抗体)を用いた 場合程の明瞭な結果は得られなかった。

<リンパ球活性化に伴う活性化マーカーと� �相関性>
 BTN3分子はリンパ球活性化に伴い減少するこ とを示したが、BTN3分子を発現していないリ� �パ球も存在するので、ほぼ100%BTN3分子を発現 しているナイーブCD4陽性T細胞を用いて検証� �行った。

 健常人PBMCsからヒトCD4 isolation kit(Miltenyi� �biotec)とヒトCD25ビーズ(Miltenyi biotec)、CD45ROビ ーズ(Miltenyi biotec)を用いてCD4+CD25-CD45RO-ナイ� �ブT細胞を得た。これらの細胞を固相化OKT3(5� �g/ml)、rIL-2(50U/ml)、αCD28抗体(5μg/ml、BD Bioscien ce)で7日間刺激し、その後フローサイトメー� �ー解析を行った。染色はFITC-232-5、FITC-34-7、F ITC-BT3.1、FITC-IgG2a(ベックマンコールター)、PE- CD25(Miltenyi biotec)、PE-CD45RO(ベックマンコール� ��ー)、PE-CD70(BD Bioscience)、PE-CD103(BD Bioscience)� ��PE-ICOS(BD Bioscience)、PE-PD-1(BD Bioscience)を用い た。

 本試験の結果を図16に示す。
 図14と同様にナイーブT細胞を活性化させた� ��にもCD25の発現に伴いBTN3分子の発現減少が� �察された。その他の活性化/メモリーマーカ� ��(CD45RO、CD70、CD103、ICOS、PD-1)とBTN3分子の発� �について解析しても、BTN3分子の活性化に伴� ��発現減少が観察された。これらのことから� ��BTN3分子はCD25以外の活性化/メモリーマーカ� ��とも発現が逆相関することが確認された。� ��方、e-Bioscience社のBT3.1を用いて解析した場� �も活性化、メモリーマーカーとの逆相関が� �察されたが、232-5、34-7を用いたようなクリ� �な結果(細胞集団を明確に分けること)を得る ことは出来なかった。