NOUVEAUX PEPTIDES INTERAGiSSANT AVEC LES MEMBRES ANTI-APOPTOTIQUES DE LA FAMILLE DE PROTEINES BCL-2

ET UTILISATIONS

La présente invention s'inscrit dans le cadre de la recherche et l'identification de nouveaux peptides interagissant avec les membres anti- apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.

L'invention concerne une méthode de criblage et d'identification de modulateurs de l'interaction protéique entre ces nouveaux peptides et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. Les modulateurs isolés par cette méthode de criblage sont utiles pour réguler la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique. Ces modulateurs sont administrés aux patients lors de traitements de cancers.

L'invention a pour objet cinq motifs peptidiques capables d'interagir respectivement avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 et leurs utilisations pour induire de la mort cellulaire programmée chez les patients atteints de cancers.

La mort cellulaire programmée est composée, d'une part de l'apoptose et, d'autre part de la mort autophagique. L'apoptose est le phénomène le mieux connu. Ce type de mort cellulaire fait intervenir des changements morphologiques, tels que la condensation du noyau, la fragmentation de l'ADN, ainsi que des phénomènes biochimiques, tels que l'activation des caspases qui vont dégrader des composants structuraux clés de la cellule pour induire son désassemblage et sa mort. La régulation du processus d'apoptose est complexe et implique l'activation ou la répression de plusieurs voies de signalisation intracellulaire.

La mort autophagique est un deuxième mécanisme moins connu de la mort cellulaire programmée. Sur le plan cellulaire, l'autophagie peut se résumer

en trois étapes : la formation d'une vacuole autophagique initiale (autophagosome) et la maturation de l'autophagosome en vacuole dégradative puis sa fusion avec le lysosome. La mort autophagique fait donc intervenir des processus de dégradation lysosomale, caractérisés par l'accumulation de vacuoles autophagiques, indépendants d'une voie de régulation de type caspase.

Maintenir une cellule en vie ou programmer sa mort nécessite la régulation d'une voie de signalisation majeure impliquant en particulier les protéines de la famille Bcl-2.

Les protéines de la famille Bcl-2 sont divisées en trois classes principales.

Les protéines anti-apoptotiques, telles que Bcl-2, BCI-XL et BcI-W, présentent une forte homologie au niveau de leurs quatre domaines BH. Les protéines pro-apoptotiques sont divisées en deux catégories, d'une part, les protéines multidomaines telles que BAX et BAK et, d'autre part, les protéines pro-apoptotiques telles que BID, NOXA, PUMA, BIK, BIM et BAD se caractérisant par la présence d'un seul domaine d'homologie, le motif BH3 (Cory and Adams, The Bcl-2 family : regulators of the cellular life-or- death switch Nature reviews vol.2 september 2002).

Le motif BH3 est une région α hélicoïdale amphiphile dont l'identité de séquences est relativement faible dans la famille de protéines BcI-2. En outre, la présence du motif BH3 chez une protéine est requise pour permettre une interaction avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. En effet, l'activité d'un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est régulée par le produit des gènes pro- apoptotiques de ladite famille, les deux protéines s'assemblant en hétérodimères. Sous cet état le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est inactif et n'a donc plus son activité anti-apoptotique. En outre l'interaction spécifique du motif BH3 avec les membres anti-

apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 peut être modifiée par des modulateurs de façon à induire de manière spécifique la mort cellulaire programmée.

L'invention propose donc, de cribler et identifier de nouveaux peptides interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines

Bcl-2 et d'utiliser à ce titre ces nouveaux peptides pour cribler et identifier des molécules capables de modifier ces interactions pour obtenir de réels candidats médicaments efficaces dans les pathologies impliquant des dérégulations de l'apoptose, notamment les cancers.

Le système du double hybride consiste initialement en un test en levure entre deux protéines recombinées. La première protéine, appelée « appât », est une protéine de fusion contenant un domaine de liaison à l'ADN (DNA binding domain ou BD) lié en amont d'une protéine A. La seconde protéine est également une protéine de fusion, communément appelée « proie », contenant un domaine d'activation (activation domain ou

AD) lié à une protéine B. Les domaines de liaison et d'activation couramment utilisés sont ceux de Gal4 ou E. CoIi Lex A. Les protéines A et B sont respectivement un membre anti-apoptotique de Ia famille de protéines Bcl-2 et un motif issu d'une banque ADNc. L'association des protéines A et B par interaction protéique permet la formation, par complémentation, d'un domaine fonctionnel (BD-AD) capable de se lier au site de liaison (binding site ou BS) présent en amont d'un gène rapporteur et d'assurer la transcription dudit gène rapporteur.

Cependant, cette méthode conventionnelle du double hybride a ses limites. II est par exemple bien connu que de tels criblages peuvent conduire à des faux positifs et/ou faux négatifs et des confirmations biochimiques des résultats obtenus sont nécessaires. Les faux positifs obtenus via le système du double hybride sont particulièrement fréquents et sont à

l'origine de mise en évidence d'interactions fonctionnelles et non structurelles.

Une technique plus performante, permettant de minimiser les faux positifs et/ou négatifs, est décrite dans la demande de brevet international WO 99/42612 ou le brevet US 6,187,535 et utilise des levures haploïdes recombinantes contenant les polypeptides «appât» et «proie». Ce système permet la détection d'un plus grand nombre de «proies» à partir d'un seul «appât», de façon plus précise, plus reproductible et plus sensible que les autres méthodes conventionnelles utilisées dans le domaine.

Les inventeurs ont établi, sur la base du système du double hybride, l'existence d'une interaction structurelle entre les membres anti- apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 et les peptides suivants de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 selon l'invention. Cette interaction protéique entre ces partenaires est similaire à celle existant dans la régulation du phénomène apoptotique entre les partenaires anti- et pro-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.

Des peptides originaux de séquences peptidiques SEQ ID NO.1 , SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 et SEQ ID NO.5 ont été mis en évidence dans le cadre de l'invention par le système du double hybride. Chacun de ces peptides est capable d'interagir de manière très spécifique avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. En effet, cette spécificité d'interaction est liée à la séquence, la structure tridimensionnelle et/ou l'hélicité dudit peptide sélectionné. De plus, ces peptides correspondent au domaine précis d'interaction avec Bcl-2, BCI-XL et/ou BcI-W et possèdent les critères structuraux typiques permettant la formation d'homo- ou d'hétérodimères. Le motif peptidique suivant NH ₂ - XXXXXXXXLXXXXDXXXXXXXXXX -COOH (SEQ ID NO.6) dans lequel X correspond à tout acide aminé, correspond à

une séquence consensus des séquences peptidiques SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 selon l'invention. Cette séquence consensus est similaire à celle des motifs BH3 présents chez les membres pro-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.

Enfin, la taille des peptides selon l'invention en font des candidats idéaux pour l'élaboration de tests permettant le criblage hautement efficace de molécules capables de moduler les interactions entre ces peptides et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2. On trouve dans la littérature de nombreux tests de criblage de modulateurs d'interactions protéines-protéines mais ils présentent souvent des limites quant à leur sensibilité et leur faisabilité à haut débit. Les méthodes couramment utilisées nécessitent la mise en œuvre d'outils complexes (protéines de fusion, protéines recombinantes...) peu compatibles avec un criblage à haut débit. Elles génèrent le plus souvent un bruit de fond important et sont peu fiables d'un point de vue quantitatif : elles présentent une fenêtre de lecture réduite ne permettant pas un criblage optimal des molécules testées.

De manière alternative aux méthodes déjà disponibles, un test de criblage hautement efficace basé sur la polarisation de fluorescence a été mis en œuvre dans la présente invention (Owicki et al., Journal of Biomolecular Screening, 5, 2000, 297-306). Cette technique permet par exemple de mesurer l'interaction entre un ligand marqué avec un fluorophore et un récepteur. Le principe consiste à mesurer une augmentation de la polarisation de fluorescence émise par le ligand fixé à son récepteur comparée à celle émise par le ligand libre. La polarisation de fluorescence du ligand libre est dépendante de son poids moléculaire et sera d'autant plus importante que le poids moléculaire sera élevé. Ainsi lorsque ce test est réalisé avec un ligand de haut poids moléculaire, ayant une forte polarisation de fluorescence intrinsèque, il sera difficile d'apprécier de façon fiable la différence de polarisation de fluorescence entre le ligand libre et le

ligand fixé. L'utilisation d'un ligand au poids moléculaire minimal permettra au contraire d'exacerber cette différence, et par conséquent d'augmenter la précision de la méthode. Il sera ainsi possible de mieux évaluer la réelle activité d'une molécule, et d'effectuer des criblages à haut débit.

La présente invention a pour objet un peptide interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. Ce peptide comprend les séquences d'acides aminés suivantes : a) MATVIHNPLKALGDQFYKEAIEHC (SEQ ID NO.1) ; b) VMTQEVGQLLQDMGDDVYQQYRSL (SEQ ID NO.2) ; c) RLKHSCLLALKRAADLLGQRSSST (SEQ ID NO.3) ; d) DMWDTRIAKLRVSADSFVRQQEA (SEQ ID NO.4) ; e) VATRRLSGFLRTLADRLEGTKELL (SEQ ID NO.5) ; f) XXXXXXXXLXXXXDXXXXXXXXXX (SEQ ID NO.6) ; et les variants fonctionnels de ces séquences d'acides aminés.

Par « séquence d'acides aminés », il doit être compris une séquence peptidique isolée du contexte naturel. Il s'agit notamment de séquences isolées, synthétisées chimiquement et/ou purifiées et éventuellement modifiées par génie génétique.

On entend par « variants fonctionnels » les séquences d'acides aminés des peptides décrits supra comprenant des substitutions conservatrices ou des mutations ponctuelles conservatrices et ayant essentiellement les mêmes propriétés que les peptides, respectivement, codés par les séquences SEQ

ID NO.1 à SEQ ID NO.5, soit la capacité d'interagir avec un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2. Les substitutions ou mutations conservatrices des séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID

NO.5 sont, par exemple, les suivantes : glycine par alanine (G-A), valine par leucine (V-L) ; acide aspartique par acide glutamique (D-E),

asparagine par glutamine (N-Q), arginine par lysine (R--K), tyrosine par leucine (Y-L), leucine par méthionine (L-M), valine par isoleucine (V-I) et glutamine par histidine (Q-H).

L'invention concerne aussi les séquences d'acides nucléiques codant pour les peptides de séquences SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5. Ces séquences nucléotidiques correspondant aux séquences peptidiques SEQ ID NO.1 , SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 et SEQ ID NO.5 sont respectivement les suivantes : a) atggcgactgtcattcacaaccccctgaaagcgctcggggaccagttctacaaggaa gccattgagcactgc (SEQ ID NO.7) ; b) gttatgacccaagaggttggccagctcctgcaagacatgggtgatgatgtataccagcag taccggtcactt (SEQ ID NO.8) ; c) agacttaaacattcctgcctgctggctctgaagagagcagcggatctcctaggacagcgc tcaagctctact (SEQ ID NO.9) ; d) gatatgtgggacactcgtatagccaaactccgagtgtctgctgacagctttgtgagacag caggaggca (SEQ ID NO.10) ; g) gttgctacaagacgattaagtggcttcctgaggacacttgcagaccggctggagggcacc aaagaactgctt (SEQ ID NO.11 ).

Ces séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent être obtenues d'après le code génétique à partir des séquences d'acides aminés correspondantes et leurs variants.

Les «variants» de ces séquences d'acides nucléiques sont notamment : - des séquences capables de s'hybrider dans des conditions stringentes avec les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO.7 à SEQ ID NO.11 ou des séquences complémentaires de celles-ci, et codant des polypeptides ayant respectivement essentiellement les mêmes propriétés que les peptides de séquences SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5, ou,

- des séquences d'une espèce de mammifère homologues aux séquences SEQ ID NO.7 à SEQ ID NO.11 isolées chez l'Homme.

Par «conditions stringentes», on entend les conditions qui permettent l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin à environ 65°C par exemple dans une solution de 6 x SSC, 0,5 % SDS, 5X

Denhardt's solution et 100 μg d'ADN carrier non spécifique ou toute autre solution de force ionique équivalente et après un lavage à 65°C, par exemple dans une solution d'au plus 0,2 x SSC et 0,1 % SDS ou toute autre solution de force ionique équivalente. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81 ,5 + 0,41 (%G+C) + 16,6Log (concentration en cations) - 0,63 (% formamide) - (600 / nombre de bases). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 4 (G+C) + 2(A+T). Les conditions de stringence peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille de la séquence, la teneur en GC et tout autre paramètre, selon notamment les protocoles décrits dans Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning : A laboratory Manual, 3rd Ed., CoId Spring Harbor, laboratory press, CoId Spring Harbor, New York).

On entend par « séquences d'une espèce de mammifères homologues aux séquences SEQ ID NO.7 à SEQ ID NO.11 », des séquences de structure similaires auxdites séquences nucléotidiques et codant respectivement pour des polypeptides ayant essentiellement les mêmes propriétés chez des espèces de mammifères non-humains, notamment les primates, le rat ou la souris. Le pourcentage d'identité entre deux séquences homologues dans les régions fonctionnelles est en général supérieur à 80 %, de préférence supérieur à 90 %.

L'invention concerne également un vecteur recombinant comprenant une des séquences d'acides nucléiques, SEQ ID NO.7 à SEQ ID NO.11 telle que revendiquée selon l'invention. Par vecteur, il faut comprendre tout type de vecteur permettant l'introduction de la séquence d'acides nucléiques dans la cellule hôte et éventuellement l'expression du polypeptide codé par la séquence d'acides nucléiques dans cette cellule hôte. Un tel vecteur est par exemple un plasmide, un cosmide, un chromosome bactérien artificiel ou un bactériophage comprenant les séquences nécessaires à l'expression des peptides de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5.

De façon préférée, le vecteur recombinant selon l'invention comprend les séquences nécessaires à l'expression des peptides de séquences SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 dans la cellule hôte. Ces séquences sont notamment des séquences promotrices de la transcription et de la traduction dans la cellule hôte ainsi que des séquences terminatrices. Le vecteur recombinant peut également comprendre des séquences codant pour des signaux de sécrétions permettant la libération des protéines traduites dans l'environnement extracellulaire.

L'invention porte aussi sur les cellules hôtes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, ces cellules hôtes sont des cellules bactériennes telles que Escherichia coli, les streptococci par exemple ou des cellules eucaryotes telles que des cellules de levures, de champignons filamenteux, des cellules d'insectes et de préférence des cellules de mammifères.

La transformation de cellules hôtes appropriées par un vecteur recombinant comprenant les séquences d'acides nucléiques selon l'invention permet d'exprimer respectivement les peptides revendiqués SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5. Dans un second temps, il est possible de purifier les peptides

exprimés dans ces cellules hôtes à partir de différentes méthodes connues de l'homme du métier et abondamment décrites dans l'état de la technique. Citons par exemple les purifications par précipitation au sulfate d'ammonium, par chromatographie d'exclusion par la taille et de préférence par chromatographie d'affinité.

Les peptides de séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 , SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 et SEQ ID NO.5, peuvent également être synthétisés chimiquement, à façon, par Néosystem. La synthèse chimique des séquences peptidiques SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 et de leurs variants fonctionnels est réalisée par synthèse sur support solide selon la stratégie Boc/benzyle à l'aide d'un synthétiseur de peptides « Applied Biosystems 430A ». La synthèse repose sur l'élaboration sur résine de la séquence voulue, puis la déprotection des fonctions aminés N et C- terminales. En stratégie Boc/benzyle, il est nécessaire d'introduire l'acide aminé Boc-L-Lys(Fmoc)-OH lors de la synthèse du peptide. Après avoir élaboré toute la séquence, la fonction amino est déprotégée et le peptide coupé de la résine en présence d'un acide fort.

L'invention porte également sur une composition pharmaceutique comprenant un peptide de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 , SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 ou SEQ ID NO.5 en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.

Dans le contexte de l'invention, on entend par « excipients » d'une composition pharmaceutique tout agent assurant le transport du principe actif dans les voies internes chez le patient traité. Par « principe actif », on entend toute substance responsable des propriétés pharmacodynamiques ou thérapeutiques de la composition pharmaceutique.

Parmi les excipients, non toxiques, pharmaceutiquement acceptables, on peut citer à titre indicatif et non limitatif les diluants, les solvants, les conservateurs, les agents mouillants, les émulsifiants, les agents dispersants, les liants, les agents gonflants, les agents désintégrants, les retardants, les lubrifiants, les absorbants, les agents de suspension, les colorants ou les aromatisants.

La présente invention concerne non seulement la composition pharmaceutique considérée en tant que telle et définie supra, mais également l'utilisation de cette composition dans une méthode d'induction de mort cellulaire programmée. Cette méthode d'induction comprend l'administration au patient atteint notamment de cancers d'une quantité efficace de composition pharmaceutique comprenant l'un des peptides selon l'invention.

L'invention a également pour objet une méthode d'identification de modulateurs de l'interaction entre un peptide selon l'invention et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 comprenant les étapes suivantes :

a) la mise en contact dudit peptide et dudit membre anti-apoptotique de la famille de protéines BcI-2 ; b) l'ajout du composé à tester ; et c) la mesure de l'activité du composé à tester comme modulateur de l'interaction protéique entre le peptide et le membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 puis la comparaison de ladite mesure en l'absence du composé à tester.

Avantageusement, la méthode d'identification de modulateurs de l'interaction comprend les étapes suivantes :

a) le marquage fluorescent d'un peptide selon la revendication 1 ; b) l'incubation dudit peptide en présence du composé à tester ; c) l'ajout d'un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 ; d) la mesure de la polarisation de fluorescence ; e) la comparaison de la mesure avec ou sans le composé à tester.

On entend par « modulateur » tout composé capable d'accroître, d'empêcher ou au moins de limiter une activité spécifique telle qu'une interaction protéine-protéine, une activité enzymatique, une fixation à des récepteurs cellulaires. Selon la présente invention, les modulateurs sont des inhibiteurs ou bien des activateurs de l'interaction protéique entre les partenaires peptidiques de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.

L'invention concerne aussi une méthode d'identification d'un inhibiteur de l'interaction entre un des peptides selon l'invention et un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 capable de diminuer la polarisation de fluorescence par rapport à un témoin consistant en cette interaction en l'absence de modulateur.

L'invention porte également sur une méthode d'identification d'un activateur de l'interaction entre un des peptides selon l'invention et un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 capable d'augmenter la polarisation de fluorescence par rapport à un témoin consistant en cette interaction en l'absence de modulateur.

Le ligand fluorescent, i.e. un des motifs peptidiques SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 fluorescent, après liaison avec le partenaire anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 a une constante de rotation plus faible que le ligand libre correspondant et de ce fait la fluorescence émise par le ligand lié devient polarisée. En conséquence, on observe une augmentation de la polarisation de la fluorescence émise par le ligand lié versus ligand libre.

Dans un mode de réalisation préférée, la sonde de fluorescence utilisée dans la méthode de criblage et d'identification selon l'invention est le bodipy, l'oregon green et de manière encore préférée la fluorescéine. Plus particulièrement, le membre anti-apoptotique de la famille de protéines

Bcl-2, intervenant comme partenaire de l'interaction dans le processus de criblage et d'identification selon l'invention, peut être la protéine Bcl-2, BCI-XL ou BcI-W.

Avantageusement, le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est une protéine de fusion. Par «protéine de fusion», on entend la fusion entre un domaine de la protéine Bcl-2, Bcl-X _L ou BcI-W et un domaine de protéine telle que la GST (Glutathion-S-transferase).

L'invention vise également une composition pharmaceutique comprenant au moins un modulateur, activateur ou inhibiteur, identifié à partir de la méthode d'identification de modulateurs selon l'invention, en tant que principe actif de ladite composition en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.

L'invention porte aussi sur une méthode d'induction de mort cellulaire programmée de type apoptotique (caspase dépendante) et/ou autophagique (caspase indépendante) à partir de l'administration d'une quantité efficace de composition définie supra à un patient atteint de cancers.

Les compositions pharmaceutiques telles que décrites supra sont utilisables dans le traitement de cancers, par action sur la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique.

Les compositions selon l'invention sont sous une forme convenant à l'administration orale, parentérale, nasale, per ou transcutanée, rectale, perlinguale, oculaire ou respiratoire et notamment les comprimés simples ou dragéifiés, les comprimés sublinguaux, les sachets, les paquets, les gélules, les glossettes, les tablettes, les suppositoires, les crèmes, les pommades, les gels dermiques, et les ampoules buvables ou injectables.

La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les figures et exemples suivants :

- Figure 1 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 du peptide Cerd4 interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. - Figure 2 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.2 du peptide Kiaa

1578 interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.

- Figure 3 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.3 du peptide Genematch interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.

- Figure 4 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.4 du peptide Loc 51569 interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.

- Figure 5 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.5 du peptide Mina53 interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.

- Figure 6 : Motif consensus SEQ ID NO.6 des séquences peptidiques SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 selon l'invention.

- Figure 7 : détermination de Ki en polarisation de fluorescence des peptides compétiteurs de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 selon l'invention, sur l'interaction entre le peptide pro-apoptotique Bak et le membre anti-apoptotique BCI-XL.

- Figure 8 : Tableau récapitulatif des séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 et de leurs séquences d'acides nucléiques respectives SEQ ID NO.7 à SEQ ID NO.11.

EXEMPLE 1 : Identification, par le système du double hybride, des peptides décrits dans les figures 1 à 5

Trois banques de cDNA humains ont été criblées (placenta, cerveau, lignée cellulaire CEMC7) par la technique du double hybride (Fields et al.) chez la levure en utilisant le protocole de conjugaison décrit par Legrain et al. dans Nature Genetics, 1997, vol.16, 277-282 (US 6,187,535).

1) Préparation des « appâts » et « proies »

a) Les « appâts » utilisés sont :

- BCI-XL (numéro d'accession Z23115) délétée de son extrémité C- terminale (1-209) et fusionnée au domaine de liaison à l'ADN LexA ;

- Bcl-2 (numéro d'accession XM_008738) délétée de son extrémité C- terminale (1-211 ) et fusionnée au domaine de liaison à l'ADN LexA. Ces appâts sont exprimés dans les levures Saccharomyces cerevisiae souche L40δgal4 (MATa ade2, trp1-901 , leu2-3, 112, Iys2-8O1 , his3δ200, LYS2 (lexAop) ₄ -HIS3, ura3-52 ::URA3 (lexAop) ₈ -LacZ, GAL4 ::Kan ^R ) et mis en pré-culture à 30 ⁰ C dans un milieu synthétique dépourvu de tryptophane (DO-Trp) jusqu'à obtention d'une densité optique DO ₆ oonm comprise entre 0,1 et 0,5. Cinquante ml d'une dilution de cette pré-culture (DO ₆ oonm =0,006) sont incubés à 3O ⁰ C pendant une nuit.

b) Une collection de levures Saccharomyces cerevisiae, souche YHGX13 (MATα Gal4δ GalδOδ ade2-101 ::Kan ^R , his3, leu2-3-112, trp1-901 , ura3- 52 URA3 ::UASGAL1-LacZ, Met) contenant les plasmides exprimant les banques de cDNA fusionnés au domaine d'activation de la transcription Gal4 est obtenue par transformation après sélection sur un milieu de culture dépourvu en leucine (DO-Leu). Ces levures sont aliquotées et conservées à -80 ⁰ C.

2) Conjugaison

La conjugaison est réalisée avec un ratio « appât »/ « proie » égal à 2. Une quantité de cellules de levures «appâts» obtenues au stade 1 )a) correspondant à 50 unités DOβoonm est mélangée aux levures «proies» obtenues au stade 1 )b). Après centrifugation, le culot est re-suspendu dans un milieu YPGIu, étalé sur des boîtes de culture YPGIu et incubé 4 heures 30 à 30 ⁰ C. La sélection des levures conjuguées contenant un « appât » et une « proie » capables d'interagir ensembles est réalisée sur un milieu DO-

Leu-Trp-His : l'absence de leucine et de tryptophane permet de maintenir une pression de sélection ne permettant qu'aux levures contenant les deux types de plasmides (« appâts »/« proies ») de pousser ; l'absence d'histidine dans Ie milieu permet de sélectionner les levures conjuguées contenant un plasmide « appât » et un plasmide « proie » capables d'interagir ensembles : la complémentation telle que décrite permet d'activer le gène HIS3, en tant que gène rapporteur codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'histidine.

3) Identification des clones positifs

Les fragments «proies» d'une colonie de levures sélectionnées selon la méthode de conjugaison décrite au paragraphe 2) sont amplifiés par PCR à

partir d'un lysat brut de cette colonie, en utilisant des amorces spécifiques du vecteur « proie » :

ABS 1 5'-GCTTTGGAATCACTACAGG-3' (SEQ ID NO.12) ;

ABS2 5'-CACGATGCACGTTGAAGTG-3' (SEQ ID NO.13). Les produits de PCR sont ensuite séquences et les séquences obtenues sont identifiées par comparaison avec des banques de données.

4) Identification des peptides décrits aux figures 1 à 5

Pour chaque fragment «appât» testé, le système du double hybride permet d'identifier plusieurs fragments «proies». Cette identification se fait par comparaison de séquences des « proies » sélectionnées à partir d'un programme informatique tel que Blastwun disponible sur le site internet de l'Université de Washington : http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/blastwu.html.

EXEMPLE 2 : Validation de l'interaction entre les peptides obtenus dans l'exemple 1 et Bcl-2, BcI-Xi et/ou BcI-W

1 ) Détermination de Ki en polarisation de fluorescence

La détermination de Ki en polarisation de fluorescence consiste à mesurer l'effet des peptides compétiteurs de séquences d'acides aminés respectives SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 sur l'interaction entre le peptide pro-apoptotique Bak et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 tel que BCI-XL.

Les réactifs suivants sont mélangés dans l'ordre précisé :

- du peptide compétiteur à une concentration finale de 1nM à 100 μM ;

- du peptide ligand fluorescent (Bak BH3 carboxyfluoresceine) à une concentration finale de 15 nM ;

- du membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 à une concentration finale de 100 nM pour BCI-XL.

Ces réactifs sont en solution dans le tampon d'interaction (Na ₂ HPO4 20 mM pH 7.4, EDTA 1 mM, NaCI 50 mM et acide pluronique F-68 0.05%). Le mélange est ensuite incubé 30 minutes à température ambiante et la polarisation de fluorescence déterminée sur l'appareil Fusion (Packard) (excitation à 485 nm et lecture à 530 nm). Les valeurs sont données en mP (unité de polarisation de fluorescence).

Ces analyses en polarisation de fluorescence ont mis en évidence que les peptides de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 sont des peptides compétiteurs de l'interaction peptidique entre Bak et BCI-XL. Les Ki obtenus au cours de ces tests en polarisation de fluorescence sont les suivants :

BCI-XL/ Bak / SEQ ID NO.1 Ki = 9 μM

BCI-XL/ Bak / SEQ ID NO.2 Ki = 32 μM

BCI-XL/ Bak / SEQ ID NO.3 Ki = 1 μM

BCI-XL/ Bak / SEQ ID NO.4 Ki = 8 μM BCI-XL/ Bak / SEQ ID NO.5 Ki = 20 μM

2) Détermination de Ki en polarisation de fluorescence avec les motifs peptidiques respectivement mutés (L-A)

La détermination de Ki en polarisation de fluorescence consiste à mesurer l'effet compétitif des peptides SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 mutés, de leucine en alanine (L-A), sur l'interaction entre le peptide pro-apoptotique BAK les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 tel que Bcl-X _L .

Les séquences peptidiques SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 mutées (L-A) sont les suivantes :

MATVIHNPAKALGDQFYKEAIEHC (SEQ ID NO.14) ;

VMTQEVGQLAQDMGDDVYQQYRSL (SEQ ID NO.15); RLKHSCLLAAKRAADLLGQRSSST (SEQ ID NO.16);

DMWDTRIAKARVSADSFVRQQEA (SEQ ID NO.17);

VATRRLSGFARTLADRLEGTKELL (SEQ ID NO.18).

Le protocole de détermination de Ki en polarisation de fluorescence est identique au protocole décrit supra. On observe, par comparaison des résultats d'analyses en polarisation de fluorescence, une perte d'effet compétitif des peptides mutés (L-A) SEQ ID NO.14 à SEQ ID NO.18 par rapport aux peptides SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 selon l'invention dans l'interaction peptidique entre le peptide pro- apoptotique Bak et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 tel que Bcl-X _L .

EXEMPLE 3 : Test de criblage de molécules capables d'inhiber l'interaction entre Bcl-2 et/ou BcI-Xi et les peptides obtenus dans l'Exemple 1

Les produits à tester sont distribués dans des plaques 384 puits (Corning Fiat Bottom) à une concentration finale de 10 μg/ml. Un puits est rempli avec une quantité équivalente de tampon/solvant sans composé à tester et constituera le témoin. Les peptides obtenus dans l'Exemple 1 marqués à la fluorescéine sont ajoutés dans les puits de manière à obtenir une concentration finale allant de 1 à 100 nM. La protéine de fusion GST-BCI-XL ou GST-Bcl-2 ou encore GST-BcI-W est ensuite ajoutée de façon à obtenir une concentration finale de 0,1 à 1 μM dans un tampon contenant

Na ₂ HPO ₄ 20 mM pH 7,4, de l'EDTA 1 mM, NaCI 50 mM, de l'acide

pluronique F-68 0,05%. La polarisation de fluorescence est ensuite mesurée par l'appareil En Vision (Packard Perkin-Elmer). Une diminution significative de la polarisation de fluorescence enregistrée dans l'essai réalisé avec le composé à tester comparée à celle obtenue sans le composé à tester (puits témoin) permet de conclure à une activité inhibitrice de la molécule. A l'inverse, une augmentation significative de la polarisation de fluorescence dans l'essai avec le produit à tester comparée au témoin permet de conclure à une activité activatrice de la molécule.