La pratique de la germination des céréales et légumineuses et notamment du riz bien établie en Asie est devenue populaire dans le monde occidental, Les graines ainsi germées peuvent être utilisées dans de nombreux plats, comme les salades, les soupes, les ragoûts, les boissons et les produits de boulangerie.

Les graines germées sont considérées comme ayant une valeur nutritive exceptionnelle. Il est également connu que les graines germées comme le riz brun germé ou partiellement germé contiennent des teneurs importantes en acide gamma- amino butyrique (GABA). Le GABA est un neurotransmetteur des cellules du cerveau qui joue un rôle dans la prévention de certaines maladies et la stimulation de la production de l'hormone de croissance.

La germination peut se faire sans équipement sophistiqué. Les graines sont placées dans de l'eau à une température adéquate pendant plusieurs heures. Les graines germées peuvent être conservées pendant quelques jours à plus d'une semaine au réfrigérateur.

La germination débute avec l'imbibition de la graine et cesse dès que la radicule a percé les téguments de la graine.

Durant la germination, les phases de trempage et/ou de conservation des graines humides peuvent être favorables au développement de microorganismes pathogènes ou d'altération. Il est fréquent que des bactéries comme des conformes tels que Escherichia coli ou Enterococcus spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp., Sphingomonas spp., Microbacterium spp. ou des champignons filamenteux appartenant notamment au genre Aspergillus se développent. L'ingestion de telles bactéries peut s'avérer dangereuse pour la santé. La présente invention a pour objet une nouvelle souche isolée du genre

Lactobacillus charatérisée par sa capacité à se développer dans le milieu de germination d'une graine, et sa capacité à limiter le développement de bactéries comme les Enterobactericaceae et plus particulièrement E. coli ou comme Bacillus spp, en cas de contamination de ladite graine lors de sa germination comparativement à une germination sans Lactobacillus. Selon un mode particulier, l'invention a pour objet une souche isolée de du genre Lactobacillus plantarum et plus particulièrement la souche NUT-2 déposée auprès de la CNCM le 4 septembre 2013 sous le numéro CNCM 1-4799.

Dans une mise en œuvre particulière de l'invention, la souche de L. plantarum NUT-2 permet de limiter la croissance d'une souche d' E. coli 0157:1-17.

Dans le cadre de la présente invention, les graines sont choisies notamment parmi les espèces suivantes : les légumineuses comme les haricots, les lentilles, les pois, le soja, les Chénopodiacées comme le quinoa ou les céréales comme le blé, l'orge, le maïs ou le riz.

Le développement de la souche selon l'invention se caractérise par une augmentation du nombre de bactéries au cours du temps. Ce développement ou croissance bactérienne peut être mesuré de différentes façons bien connues de l'homme du métier. On peut citer de manière non exhaustive : la mesure de la biomasse sèche, le dénombrement des cellules par utilisation de la cellule de Thoma, par turbidimétrie, par comptage sur milieu solide (ensemensement, incubation et dénombrement), ou encore par mesure de l'activité cellulaire (par exemple : consommation d'un subtrat ou d'un constituant cellulaire).

La limitation du développement ou de la croissance des bactéries et notamment d'E.coli, d'Enterobactericaceae, et/ou de Bacillus spp est définie en comparant le nombre de bactéries présentes dans le milieu à l'issue de la germination dans des conditions expérimentales identiques à l'exception de la présence de la souche de l'invention, et plus particulièrement de la souche NUT2. La limitation est ici définie à l'issue de la germination par une réduction du nombre de bactéries d'au moins 0,5 log, de préférence de 1 log en présence de la souche de l'invention, et plus particulièrement de la souche NUT2 par rapport au nombre de bactéries mesuré en absence de la souche de l'invention et plus particulièrement de la souche NUT2.

La présente invention a également pour objet une composition comprenant une souche selon l'invention.

La souche, comme la composition, selon l'invention peuvent être utilisée dans des procédés de germination. Un tel procédé comprend la mise en présence de la souche ou d'une composition selon l'invention, du milieu de germination et des graines. Le procédé de germination comporte une première étape de trempage des graines dans un milieu de trempage en présence de la souche selon l'invention à une température et pendant une durée adaptées à la la nature de la graine. Cette étape peut être effectuée dans l'obscurité. Dans une mise en œuvre particulière la première étape de trempage est faite en présence de la souche NUT-2 déposée auprès de la CNCM le 4 septembre 2013 sous le numéro CNCM 1-4799 - ou d'une composition comprenant ladite souche. Celle-ci est présente dans une quantité de bactéries comprenant entre 10 ⁵ à 10 ⁹ UFC/g de graine, de préférence 10 ⁷ UFC/g de graine. Le milieu de trempage est défini par l'homme du métier en fonction du type de graine. Il est le plus souvent constitué par de l'eau.

S'agissant du riz brun, la première étape se déroule dans de l'eau à température ambiante pendant 16 heures.

Dans une mise en œuvre particulière du procède de germination l'étape de trempage comprend une étape d'activation durant laquelle le milieu de germination comprenant la souche et les graines est placé à une température comprise entre environ 35°C et envrion 40°C pendant une durée comprise entre environ deux et environ quatre heures. La température peut varier entre 30°C et 45°C. La durée de cette étape d'activation peut être comprise entre lh30 et 4h30. Cette augmentation température permet de réduire le temps total de trempage de 6 heures.

Par exemple l'étape d'activation, du riz brun peut être faite par trempage des grains de riz dans de l'eau à environ 30°C-40°C , de préférence 32°C, pendant une durée comprise entre 2 et 4 heures. Dans une seconde étape, ou étape de germination (proprement dite), le milieu de trempage est enlevé et les graines humides sont placées dans un récipient lequel est éventuellement placé à l'abri de la lumière. Les graines sont rincées à l'eau à plusieurs reprises durant cette seconde étape dont la durée dépend de la nature des graines. Elle est généralement comprise entre 4 et 48h (de l'ordre de 4 à 8h pour le quinoa, 16h pour le riz ou encore 48h pour le haricot mungo). Le nombre de rinçage est adapté en fonction du type de graine, il est généralement compris entre 1 et 10 rinçages, de préférence de 1 à 5 rinçages.

Le rinçage est habituellement fait avec de l'eau.

L'apparition de la radicule au travers des téguments de la graine indique la fin du procédé de germination. Celui-ci peut cependant être poursuivi en fonction des souhaits de l'utilisateur par exemple jusqu'à l'obtention de jeunes pousses.

Un tel procédé de germination s'adapte à tous les types de graines et notamment les graines choisies parmi les espèces suivantes : les légumineuses comme les haricots, les lentilles, les pois, le soja, les chénopodiacées comme le quinoa ou les céréales comme le blé, l'orge, le maïs ou le riz.

Pour une cuisson ultérieure des graines, le procédé de germination des graines peut être effectué directement dans un dispositif de cuisson des graines (ou cuiseur tel que décrit par exemple dans la demande de brevet WO2012/056171). Ainsi, le cuiseur peut comprendre également un accessoire de germination comprenant un panier amovible (comme celui décrit dans la demande de brevet WO2012/056171.

Dans cette mise en œuvre de l'invention, les graines sont placées directement dans un accessoire du cuiseur et l'accessoire placé dans la cuve du cuiseur avec de l'eau et en présence de la souche selon l'invention durant l'étape de trempage.

Puis après avoir enlevé l'eau de la cuve, les graines humides sont laissées ou non dans l'accessoire à l'abri ou non de la lumière pendant une durée adaptée à la graine que l'on fait germer, soit de 4 à 48h et plus particulièrement 30 heures, en particulier 32 heures. De temps en temps, les graines sont lavées. Lorsque les germes des graines sont visibles à l'œil nu, un dernier rinçage des graines est effectué. Elles sont ensuite versées dans la cuve du cuiseur. Le niveau d'eau est ajusté et l'étape de cuisson des graines germées est lancée. La cuisson est très rapide puisque le trempage a déjà fortement ramolli les graines. Pour le riz germé, la cuisson se fait à une température de l'ordre de 100°C

(comprise entre 90 et 110°C), plus précisément entre 101 °C et 108°C. A cette température les nutriments qui se sont multipliés pendant la phase de germination des grains sont préservés.

Un tel mode de préparation permet l'obtention d'une préparation contenant beaucoup plus de GABA dans le riz germé ainsi cuit (jusqu'à 10 fois plus de GABA par rapport à un riz brun normal non germé).

Ainsi, selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de cuisson de graines comprenant les étapes suivantes : une étape de germination des graines tels que décrit ci-dessus et une étape de cuisson des graines germées obtenue à l'étape précédente.

Ainsi, dans une mise en ouvre particulière, le procédé de cuisson comprend les étapes suivantes : l'étape de trempage des graines est réalisée en présence de la souche ou de la composition selon l'invention dans un milieu de trempage à une température et pendant une durée adaptée à la nature de la graine,

Lors de l'étape de germination, les graines humides sont laissées de préférence à l'abri de la lumière et sont régulièrement rincées jusqu'à l'apparition de la radicule au travers des téguments de la graine, - Les graines germées obtenues à l'étape précédente sont mises à cuire.

Dans une mise en œuvre du procédé de cuisson décrit ci-dessus, l'étape de trempage comprend une étape d'activation telle que décrite plus haut.

Dans une mise en œuvre particulière, au moins une étape ou l'ensemble des étapes du procédé de cuisson est effectué dans un dispositif de cuisson. Un exemple de dispositif de cuisson est décrite dans la demande de brevet WO 2012/056171.

Ainsi, s'agissant du riz brun, le procédé comprend les étapes suivantes : les grains de riz brun sont placés directement dans un accessoire du dispositif de cuisson avec de l'eau. La souche isolée du genre Lactobacillus selon l'invention est ajoutée et mélangée aux grains. L' accessoire est replacé dans la cuve du dispositif . Cette étape de trempage est effectuée à température ambiante pendant 16h, après avoir enlevé l'eau du récipient, les grains humides peuvent être laissées dans l'accessoire à l'abri de la lumière ou en dehors du dispositif de cuisson pour une durée de 24h à 48h en particulier 32h , les grains sont lavées à plusieurs reprises avec de l'eau, - Lorsque les radicules sont visibles à l'oeil nu, les graine sont lavés une dernière fois à l'eau et et sont placées dans la cuve du dispositif, le niveau d'eau est ajusté et Γ étape de cuisson est lancée.

La cuisson est très rapide puisque le trempage a déjà fortement ramolli le riz. De plus, la cuisson se fait à une température de l'ordre de 100°C (comprise entre 90°c et 110°C). Dans un mode de réalisation, la tempétature est plus précisément entre 101°C et 108°C. A cette température les nutriments qui se sont multipliés pendant la phase de germination des grains sont préservés.

La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples et les figures suivants.

Fifiure 1 : Capacité de bio-préservation (Impact de l'inoculation de la souche de L. plantarum NUT-2 à des concentrations de 10 ⁵ , 10 ⁶ ou 10 ⁷ UFC/g de riz de la variété Koshihikari sur la flore totale, les Entérobactéries et les Bacillus sp. après 16 heures de germination).

Fifiure 2 : Capacité de bio-préservation (Impact de NUT-2 à des concentrations de 10 ⁵ , 10 ⁶ ou 10 ⁷ UFC/g de riz de la variété Chu Cheong sur la flore totale, les Entérobactéries et les Bacillus sp.). Fifiure 3 : Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de 10 ⁵ , 10 ⁶ ou 10 ⁷ UFC/g de riz de la variété Koshihikari suite à une contamination par E. coli O157H7 (10 ² UFC/g de riz). Fifiure 4 : Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de 10 ⁵ , 10 ⁶ ou 10 ⁷ UFC/g de riz de la variété Chu Cheong suite à une contamination par E. coli O157H7 (10 ² UFC/g de riz).

Fifiure 5 : Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de 10 ⁵ , 10 ⁶ ou 10 ⁷ UFC/g de riz de la variété Koshihikari suite à une contamination par E. coli O157H7 (10 ¹ UFC/g de riz).

Fifiure 6 : Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de 10 ⁵ , 10 ⁶ ou 10 ⁷ UFC/g de riz de la variété Chu Cheong suite à une contamination par E. coli O157H7 (10 ¹ UFC/g de riz).

Exemple 1 : isolement de la souche NUT-2

La souche de Lactobacillus plantarum NUT-2 a été isolée à partir du riz japonais NIPPON BARE paddy.

L'isolement de cette souche a été réalisé après enrichissement du riz dans du bouillon MRS (Man, Rogosa et Sharpe) à 35°C ± 2°C pendant 24 heures en aérobiose et isolement sur du milieu LPSM (L. plantarum Sélective Médium) à 35°C ± 2°C pendant 16 à 24 heures en anaérobiose (système AnaeroGen, Oxoid). Cette souche a ensuite été conservée à - 80°C dans des stocks glycérolés.

Pour les besoin de l'étude cette souche a été isolée sur du milieu MRS gélosé supplémenté en L-cystéine (0,05 % m/v). Les boites de Pétri ont été incubées à 35°C ± 2°C pendant 16 à 24 heures en anaérobiose (système AnaeroGen, Oxoid).

Exemple 2 : caractérisation de la souche NUT-2 (détermination de la Concentration Minimal Inhibitrice par la méthode de diffusion ETEST (Biomérieux)

La détermination de la plus petite concentration en antibiotique nécessaire pour inhiber la croissance de la bactérie (Concentration Minimale Inhibitrice ou CMI) a été réalisée sur milieu gélosé à l'aide du système Etest ^® . Ce système repose sur l'utilisation d'une bandelette imprégnée de quantités croissantes d'antibiotique. Dix antibiotiques ont été testés avec cette méthode, les concentrations minimales et maximales varient selon les antibiotiques (Tableau 1). Ces antibiotiques ont été sélectionnés en accord avec les recommandations de l'EFSA (« Update of the criteria used in the assessment of bacterial résistance to antibiotics of human or veterinary importance » - The EFSA Journal (2008) 732, 1-15).

Tableau 1 : Bandelettes Etest ^® (BioMérieux) utilisées pour la détermination de la CMI.

A partir de colonies isolées sur milieu MRS gélosé supplémenté en L- cystéine (0,05 % m/v), un inoculum a été préparé dans de l'eau physiologique (NaCI 0,85 % - lot 130703) à une densité d'environ 0,5 sur l'échelle de MacFariand. Des boites de Pétri de 140 mm contenant de la gélose Mueiler-Hinton (BioMérieux - n° lot 1002307830 Exp 20130724) ont été ensemencées par inondation avec l'inoculum préparé.

Les bandelettes Etest ^® ont ensuite été appliquées sur la gélose selon les recommandations du fournisseur (6 bandelettes par boites). Après incubation à 35°C ± 2°C pendant 24 à 48 heures, des ellipses d'inhibition symétriques ont été observées.

La CM! a été lue directement à partir de l'échelle de graduation et exprimée en ng/mL au point où l'ellipse d'inhibition croise la bandelette. Dans le cas où le point d'intersection de l'ellipse d'inhibition et de la bandelette était situé entre deux graduations, la concentration la plus importante a été retenue comme CM!,

Exemple 3 : résultats obtenus avec la souche L plantarum NUT-2

Trois essais indépendants ont été réalisés pour la détermination de la CMI sur les 10 antibiotiques testés. Les lectures des tests ont donc été réalisées après 24 heures de croissance.

Les résultats obtenus, avec la souche de LactobaciiÎus plantarum NUT-2, pour les antibiotiques testés, sont indiqués dans le Tableau 2. L'interprétation des résultats a été réalisée à l'aide des tables fournies avec les bandelettes Etest ^® (version 16029 B - 2011/01) et des valeurs seuils définies par l'EFSA (Européen Food Safety Autority - Technical guidance- Update of the criteria used in the assessment of bacteriai résistance to antibiotics of human or veterinary importance - Prépare by the Panel on Additives and Products or Substances used in Anima! Feed - The EFSA Journal (2008) 732, 1-15 and the EFSA Journal (2012);10(6):2740).

Tableau 2 : Interprétation des résultats obtenus lors de la détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) par la méthode Etest ^® de la souche de L. plantarum NUT-2. Les résultats ont été interprétés selon les critères définis par i'EFSA pour L plantarum / L pentosus (The EFSA Journal (2008) 732, 1-15 and the EFSA Journal (2012);10(6):2740)

Antibiotique C I (mg/rnL) Interprétation

Ampici!line (AM) 4,0 Résistante

Chioramphénicol (CL) 12,0 Résistante

Ciindamycine (CM) 4,0 Résistante

Erythromycine (EM) 0,38 Sensible

Gentamycine (GM) 16,0 Sensible

Kanamycine (KM) 32,0 Sensible

Qinupristine / dalfopristine 1,0 Sensible

(QDA)

Streptomycine (SM) 128,0 Sensible

Tétracycline (TC) 192,0 Résistante

Vancomycine (VA) >256 Résistante La souche de LactobaciHus plantarum NUT-2 est apparue comme étant sensible à l'érythromycine, à la gentamicine, à la kanamycine, à la qinupristine / dalfopristine et à la streptomycine.

La souche de LactobaciHus plantarum NUT-2 est résistante à l'ampicilline, le chloramphénicol, la clindamycine, la tétracycline et à la vancomycine,. comme les souches de LactobaciHus.

Exemple 4 : caracténsation moléculaire de la souche NUT-2

A partir de colonies isolées, des extractions d'ADN sont réalisées afin de confirmer l'identification de la souche. Une réaction d'amplification par PCR avec des amorces universelles est effectuée sur l'ADN extrait afin d'amplifier la totalité de l'ADN 16S. Cette région de l'ADN est très conservée et la séquence permet de distinguer les différentes espèces bactériennes. Le produit d'amplification obtenu a ensuite été séquencé. La comparaison de la séquence obtenue avec les séquences disponibles dans les banques de données permet d'identifier le genre et l'espèce bactérienne. Les alignements de séquences réalisés dans les bases de données ont permis de démontrer que la souche NUT-2 présente une homologie de 99 % avec l'espèce bactérienne LactobaciHus plantarum. Les résultats de ces alignements de séquence sont indiqués dans le Tableau 3. Tableau 3 : Résultats des alignements de séquence réalisés à partir de la séquence de la souche de bactérie lactique NUT-2. Les souches dont les séquences présentaient les plus fortes homologies avec la séquence de l'échantillon figurent dans le tableau. Les 10 séquences ayant les plus fortes homologies sur un total de 100 séquences ont été retenues. La base de données comportait plus de 1500 séquences d'espèces différentes.

Rang Espèce Séq. Réf. % identité

bactérienne

1 L. plantarum KF149794.1 99,00

2 L. plantarum KF149725.1 99,00

3 L. plantarum KF149647.1 99,00 4 L. plantarum KF149066.1 99,00

5 L. plantarum KF148981.1 99,00

6 L. plantarum KC836733.1 99,00

7 L. plantarum KC836684.1 99,00

8 L. plantarum KC836660.1 99,00

9 L. plantarum KC836659.1 99,00

10 L. plantarum KC836641.1 99,00

L'analyse de la séquence codant pour la totalité de l'ADN 16S a permis d'identifier la souche NUT2 au niveau de l'espèce et de confirmer son appartenance à l'espèce Lactobacillus plantarum.

Exemple 5 : La capacité de biopréservation de NUT-2 (impact sur la flore totale, les Entérobactéries et les Bacillus spp.) a été testée à différentes concentrations sur deux variétés de riz (Koshihikari et Chu Cheong).

Pour chaque test 10 grammes de riz ont été nettoyés avec de l'eau stérile (protocole Centre Sensoriel du Goût et de l'Alimentation CSGA). Le riz est ensuite placé dans des flacons avec 20 ml d'eau et 10 ⁵ , 10 ⁶ ou 10 ⁷ UFC/g de NUT-2 ont été ajoutés dans des flacons différents. Le contrôle est constitué de 10 g de riz dans 20 ml d'eau. Les flacons sont placés dans l'obscurité à 30°C pendant 16h. NUT-2, les Entérobactéries et les Bacillus spp et les germes totaux sont dénombrés par dilution et étalement à partir de chaque flacon. Les résultats sont présentés dans les figures 1 et 2. Les résultats montrent une persistance et même une croissance de L. plantarum NUT-2 au cours de la germination et la réduction de la population d'entérobactéries et de Bacillus spp (Tableau 4).

Tableau 4 : diminution du développement d'entérobactéries et de Bacillus sp. en fonction de la quantité de L. plantarum NUT-2

Taux Réduction logarithmique (log riz non inoculé - log riz inoculé) inoculation

Koshihikari Chu Cheong

Entérobactéries Bacillus sp. Entérobactéries Bacillus sp. 10 ^E 5 0,8 1,4 2,2 2,4

10 ^E 6 3,0 4,3 3,2 > 6,8

10 ^E 7 > 6,6 > 5,7 > 6,8 > 6,8

Exemple 6 : impact de la présence de L. plantarum NUT-2 suite à une contamination par la souche E. coli 0157H7 (10 ¹ et 10 ² UFC/g de riz) testée sur deux variétés de riz (Koshihikari et Chu Cheong).

Pour chaque test 10 grammes de riz ont été nettoyés avec de l'eau stérile (protocole CSGA). Le riz est ensuite placé dans des flacons avec 20 ml d'eau et 10 ⁵ , 10 ⁶ ou 10 ⁷ UFC/g de NUT-2 ont été ajoutés dans des flacons différents. Le contrôle est constitué de 10 g de riz dans 20 ml d'eau. Les flacons sont placés dans l'obscurité à 30°C pendant 16h. NUT-2, les bactéries E. coli 0157H7 sont dénombrées par dilution et étalement à partir de chaque flacon. Les résultats sont présentés dans les figures 3 à 6.

L'inoculation du riz avec Lactobacillus plantarum NUT-2 permet d'inhiber le développement d'E. coli 0157 :H7 à partir d'une concentration de 10 ⁶ UFC/g.