L'invention se rapporte à un procédé de culture de microalgues du genre Botryococcus faisant appel à un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, notamment sous forme de flashs, ainsi qu'à de nouvelles souches de microalgues du genre Botryococcus particulièrement adaptées à la production d'hydrocarbures en mode mixotrophe.

Préambule

Les algues unicellulaires se présentent comme des microorganismes photosynthétiques ayant un caractère autotrophe, c'est-à-dire qu'elles ont l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.

La plupart des espèces d'algues unicellulaires rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont strictement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître autrement que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés ou de matières organiques ne leur est pas favorable et tend même à inhiber leur croissance.

Cependant, un certain nombre d'espèces d'algues unicellulaires, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. Certaines d'entre-elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à- dire en exploitant la matière organique.

D'autres espèces d'algues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer partie de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.

Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme co-existent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6 :87-102].

A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des algues, alors que celles-ci recouvrent une très grande diversité d'espèces et dé formes [Dubinsky et al. 2010, hydrobiologia, 639:153-171]. De ce fait, une souche est considérée comme étant mixotrophe dès lors que, de manière expérimentale, il peut être prouvé qu'elle a la capacité de croître par photosynthèse dans un milieu minimum, dans lequel est ajouté un substrat carboné tel que du glucose, de l'acétate ou du glycérol. Si cette supplémentation en substrat carboné ne donne pas lieu à une inhibition de croissance durant la phase éclairée, alors la souche peut être considérée comme ayant un caractère mixotrophe.

Les algues unicellulaires font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés.

En conditions favorables, les microalgues peuvent ainsi accumuler jusqu'à 80 % de leur poids sec en acides gras et, de ce fait, offrent une alternative crédible à la culture des plantes terrestres oléagineuses, notamment pour la production de biocarburants [Li, Y et al., 2008 Biotechnol. Prog., 24 : 815-820].

II est connu, en outre, que certaines souches de microalgues du genre Botryococcus (Chlorophyta, Chlorophyceae, Chlorococcales, Disctyosphaericae) [ITIS, Catalogue of Life, 2010] sont capables de produire des hydrocarbures en quantité non négligeable, notamment des n- alkadiènes, triènes, squalènes méthylés, triterpénoïdes, tétraterpénoïdes et des lycopadiènes. Ces souches produisent, en outre, des hydrocarbures particuliers à longues chaînes carbonées, regroupés sous le nom de botryococcènes. Ces hydrocarbures consistent majoritairement en des triterpènes isoprénoïdes non ramifiés de formule C _n H _2n -io. Us peuvent être transformés par craquage et raffinage en kérosène ou gasoil. On distingue différents groupes de souches de Botryococcus (A, B et L) selon le profil des lipides constituant les botryococcènes [Metzger, P et al. (2005) Applied Microbiology and Biotechnology 6(25): 486-496].

Botryococcus braunii est l'espèce, qui, à ce jour, a été la plus étudiée, en raison de la qualité de ses hydrocarbures, et sa facilité à être cultivée en mode autotrophe. La culture de cette algue verte, réputée fortement pigmentée, s'opère généralement en conditions de forte luminosité, entre 500 et 1500 μιηοΙ. m ^"2 , s ^"1 .

La souche B. braunii var. Showa est connue pour accumuler jusqu'à

30 % de son poids sec en botryococcènes. Les chaînes grasses de ces botryococcènes comprennent entre 30 et 37 atomes de carbone [Plant Patent US 6 ,169]. Le génome de cette souche est actuellement en cours de séquençage.

Une variété mutante de cette souche, Botryococcus braunii var.

Ninsei a été décrite comme pouvant sécréter les botryococcènes vers la matrice extracellulaire [US 2006/0265800]. Cette sécrétion a pour effet de rendre les colonies de Botryococcus flottantes par rapport à leur milieu de culture liquide, ce qui permet avantageusement de récolter les algues chargées en botryococcènes à la surface du milieu de culture.

Les rendements en lipides obtenus à l'aide de ces algues sont toutefois actuellement insuffisants pour pouvoir envisager une production rentable d'hydrocarbures à l'échelle industrielle. En effet, pour que le bilan énergétique de l'exploitation des microalgues du genre Botryococcus soit satisfaisant, il conviendrait de diminuer l'énergie apportée aux cultures sous forme de lumière, tout en augmenter la quantité et la qualité des lipides ou des hydrocarbures convertibles en bio-carburants.

Pour atteindre cet objectif, le demandeur a sélectionné de nouvelles souches de Botryococcus, issues de ses collections personnelles. li a recherché parmi ces souches celles ayant la capacité de croître, à la fois, en mode mixotrophe, et en présence d'un éclairement discontinu, notamment sous la forme de flashs. L'alternance rapprochée de phase éclairées et de phases obscures, perçue généralement comme stressante pour des micro-algues telles que Botryococcus, a permis, de manière inattendue, d'isoler de nouvelles souches de Botryococcus ayant une plus grande capacité à évoluer en conditions de mixotrophie et à s'adapter aux fluctuations de lumière. Ces nouvelles souches de Botryococcus, aptes à résister à des changements d'intensité lumineuse répétés, se trouvent particulièrement adaptées pour la production de lipides et d'hydrocarbures en mode mixotrophe. En particulier, elles se contentent d'un apport lumineux discontinu, dont l'intensité est globalement inférieure à celle que nécessitent des cultures en mode autotrophe, ou dont l'éclairement est permanent. En outre, une partie de l'énergie consommée par les algues dans ce système, provient d'une supplémentation du milieu de culture en substrats carbonés, tels que le glycérol ou l'acétate, lesquels peuvent provenir de sous-produits issus de diverses industries.

Sans être lié par la théorie, l'inventeur émet l'hypothèse que la sélection des souches par flashage, permet d'isoler des souches ayant un métabolisme mixte, c'est-à-dire davantage en mesure de pratiquer simultanément la photosynthèse et la fermentation.

Par ailleurs, selon lui, c'est lorsque les souches passent d'un type de métabolisme à l'autre, au gré des variations d'intensité lumineuse, qu'elles ont tendance à stocker des réserves lipidiques, notamment sous la forme d'hydrocarbures.

La mise en œuvre du procédé de sélection selon l'invention décrit ci- après, appliqué plus particulièrement à des souches de microalgues du genre Botryococcus, a permis d'isoler trois nouvelles souches de l'espèce Botryococcus braunii et une autre de l'espèce Botryococcus sudeticus, particulièrement adaptées à la production de lipides et d'hydrocarbures.

Les trois souches de Botryococcus braunii sont originales en ce que l'une (827) est apparue comme étant à la fois mixotrophe et hétérotrophe, ce qui n'est pas le cas des autres souches mixotrophes connues de Botryococcus braunii et les deux autres (828 et 829) comme étant strictement mixotrophes (inhibition totale de croissance en mode hétérotrophe) en présence de glycérol, de saccharose et de lactose dans leur milieu de culture. Ces deux dernières souches, 828 et 829, semblent avoir les mêmes caractéristiques.

La souche de Botryococcus sudeticus 841 présente, pour sa part, une mixotrophie stricte en présence de glucose et d'acétate dans le milieu de culture, ce qui la distingue des autres souches et des souches de l'état de la technique.

Ces nouvelles souches ont fait l'objet, pour trois d'entre-elles, d'un dépôt de souches selon le Traité de Budapest le 20 octobre 2010, auprès du CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume-Uni).

Les deux souches de Botryococcus braunii, 827 et 828 ont reçu respectivement les numéros de dépôt CCAP 807/5 et CCAP 807/6. La souche de Botryococcus sudeticus, 841 a reçu, quant à elle, le numéro de dépôt CCAP 807/4.

Ces souches se trouvent être particulièrement adaptées pour la production de lipides en conditions de culture mixotrophe, notamment lorsque celles-ci sont cultivées en présence d'un apport de lumière dont l'intensité est variable ou discontinue.

Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après.

Figure 1 : Graphique représentant l'évolution de la biomasse des microalgues (g/L) en culture, en milieu de culture f/10, supplémenté avec 10% d'extrait de sol au cours du temps (jours) pour les différents modes de culture : autotrophie,(^) mixotrophie (■) et mixotrophie en mode flash selon l'invention (Δ). Les cultures sont réalisées à l'aide de la souche 828, de la façon décrite dans l'exemple 2.

Figure 2 : Graphique représentant l'évolution de la biomasse des microalgues (g/L) en culture, en milieu de culture f/10, supplémenté avec 10% d'extrait de sol au cours du temps (jours) pour les différents modes de culture : autotrophie, (♦), mixotrophie (■) et mixotrophie en mode flash selon l'invention (Δ). Les cultures sont réalisées à l'aide de la souche 829, de la façon décrite dans l'exemple 2.

Figure 3 : Graphique représentant l'évolution de la biomasse des microalgues (g/L) en culture, en milieu de culture f/10, supplémenté avec 10% d'extrait de sol au cours du temps (jours) pour les différents modes de culture : autotrophie (♦), mixotrophie (■) et mixotrophie en mode flash selon l'invention (Δ). Les cultures sont réalisées à l'aide de la souche 841 , de la façon décrite dans l'exemple 2.

Figure 4 : Diagramme représentant la teneur en acides gras des souches 828 et 841 après 5 jours de culture selon les différents modes de culture (% acides gras/matière sèche) en autotrophie (auto), mixotrophie (mixo) et mixotrophie en mode flash (mixo-flash). Description détaillée

La présente invention a donc pour objet un procédé permettant de cribler ou de sélectionner des souches d'algues unicellulaires (microalgues), notamment du genre Botryococcus, capables d'assurer un haut rendement de production en lipides et en hydrocarbures.

Les algues sélectionnées sont à la fois capables de croître en mode mixotrophe, donc d'utiliser un ou plusieurs substrats carbonés comme source d'énergie, et de tirer parti, par photosynthèse, d'un apport lumineux variable ou discontinu. Les algues ayant ces propriétés sont considérées comme présentant un potentiel de production de lipides et d'hydrocarbures plus élevé que les autres.

L'invention a également pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Botryococcus, mettant en oeuvre un apport lumineux variable ou discontinu dans des conditions similaires de celles mises en oeuvre pour la sélection des microalgues.

Ce procédé est caractérisé en ce que le flux de lumière apporté aux algues en culture est variable ou discontinu au cours du temps. Contrairement aux idées reçues, il est apparu qu'un éclairement variable ou discontinu des cultures, notamment en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait, notamment, d'accroître la production de lipides par ces dernières.

Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu ou variable de lumière a pour effet de provoquer un stress chez les algues favorable à la synthèse des lipides. En effet, il est fréquent, dans la nature, que les algues accumulent des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement.

Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.

Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu. II est apporté, par exemple, sous forme de flashs, c'est-à-dire sur des périodes de courtes durées. Les phases successives d'éclairement sont alors généralement comprises entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.

Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, c'est-à-dire que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de lumière peut être périodique, cyclique, voire aléatoire.

Selon l'invention, l'éclairement peut varier de manière continue, c'est- à-dire que l'intensité lumineuse n'est pas constante et varie en permanence au cours du temps (dpmol(photons)/dt≠ 0), de manière régulée et contrôlée.

Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.

L'invention vise, en particulier, un procédé de culture d'algues unicellulaires, caractérisé en ce que lesdites algues sont cultivées dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude égale ou supérieure à 10 pmol. m ^"2 , s ^"1 à raison de plusieurs fois par heure, de préférence égale ou supérieure à 40 pmol. m ^"2 , s ^"1 , plus préférentiellement égale ou supérieure à 50 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Le point commun de ces différents modes d'éclairement, discontinu ou variable, réside dans le fait que, selon l'invention, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (pmol. m ^"2 , s ^"1 ), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement supérieure à 10 pmol. m ^"2 , s ^"1 , préférentiellement supérieure ou égale à 20 pmol. m ^"2 , s ^"1 , plus préférentiellement supérieure ou égale à 50 μιηοΙ. m ^"2 . s ^"1 . Autrement dit, l'intensité lumineuse atteint, chaque heure, de préférence plusieurs fois dans l'heure, une valeur haute et basse, dont la différence est égale ou supérieure à celle indiquée ci-dessus. De préférence, ladite intensité lumineuse atteint successivement les valeurs 50 pmol. m ^"2 , s ^"1 et 100 pmol. m ^"2 , s ^"1 à chaque heure, plus préférentiellement les valeurs 0 et 50 pmol. rrï ² s ^"1 , plus préférentiellement encore les valeurs 0 et 100 pmol. m ^"2 . s ¹ .

Il est rappelé que 1 pmol. m ^"2 , s ^"1 correspond à 1 μΕ m ^"2 , s ^"1 (Einstein), unité utilisée dans les exemples de la présente demande.

L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.

Le procédé de sélection et de culture selon l'invention s'applique plus particulièrement aux microalgues du genre Botryococcus afin de sélectionner des souches à haut rendement en lipides.

Le procédé de culture est caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs des étapes suivantes :

- la culture de différentes souches du genre Botryococcus dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie préférentiellement d'une amplitude égale ou supérieure à 50 pmol. m ^"2 , s ^"1 à raison d'au moins une fois par heure; - le maintien de ladite culture sur plusieurs générations;

- l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.

Le procédé de culture selon l'invention a pour but d'augmenter la production de lipides et/ou d'hydrocarbures, notamment via la récupération des lipides et hydrocarbures contenus ou excrétés par les microalgues, plus particulièrement les hydrocarbures de type botryococcènes.

Pour réaliser le criblage de souches, différentes souches de microalgues, notamment du genre Botryococcus, peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et aux substrats carbonés, offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides et d'hydrocarbures sur le plan qualitatif (profil lipidique) et quantitatif (lipides ou hydrocarbures totaux produits).

Alternativement, les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'un pool de microalgues diversifié et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention, alliant lumière discontinue ou variable avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.

Le procédé de culture selon l'invention se caractérisé plus particulièrement, en ce que la culture des souches s'effectue sur plusieurs générations, de préférence en mode mixotrophe, et en ce qu'on récolte les cellules chargées en lipides ou hydrocarbures.

Au sens de la présente invention, une espèce d'algue est considérée comme étant mixotrophe, dès lors qu'elle peut être cultivée à la lumière, dans un milieu minimum (par exemple MM ou f/10 supplémenté avec 10% d'extrait de sol) dans lequel est ajouté un substrat carboné à raison, par exemple, d'une concentration en carbone ou en glycérol, équivalente ou supérieure à 5 mM, sans observer d'inhibition de croissance, c'est-à-dire sans constater de perte de biomasse en poids sec par rapport à une culture effectuée dans un même milieu minimum dépourvu de substrat carboné (c'est-à-dire en mode autotrophe).

Les substrats carbonés préférés comprennent l'acétate, le glucose, la cellulose, l'amidon, le lactose, le saccharose et le glycérol. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent des substrats carbonés de choix.

De préférence, les microalgues sont choisies parmi les espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus. L'appartenance à l'une ou l'autre de ces espèces étant établie sur les critères habituels de classification des microalgues.

L'invention vise également les souches de microalgues à haut rendement en hydrocarbures et/ou lipides, susceptibles d'être sélectionnées selon le procédé de l'invention, caractérisées en ce qu'elles sont mixotrophes et capables de croître en lumière discontinue ou variable.

Comme l'indique les exemples de la présente demande, la mise en œuvre du procédé selon l'invention a permis plus particulièrement d'isoler de nouvelles souches du genre Botryococcus. Ces souches, qui ont fait l'objet d'un dépôt dans la collection de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), le 20 octobre 2010, suivant les dispositions du Traité de Budapest, sont les suivantes :

- Souche de Botryococcus braunii 827, déposée sous le numéro CCAP 807/5.

- Souche de Botryococcus braunii 828, déposée sous le numéro CCAP 807/6.

Ces deux souches présentent la caractéristique d'être mixotrophes mais ne sont pas hétérotrophes, c'est-à-dire qu'elles sont cultivables en milieu minimum supplémenté en substrat carboné, en présence d'un apport lumineux, mais qu'elles ne le sont pas en l'absence de lumière. Ce comportement s'observe, notamment, lorsque le substrat carboné ajouté dans le milieu de culture est le saccharose, le lactose ou le glycérol. A la connaissance de l'inventeur, c'est la première fois que des souches de Botryococcus présentent cette particularité.

- Souche de Botryococcus sudeticus 841 , déposée sous le numéro CCAP 807/4.

Cette souche de l'espèce sudeticus présente la caractéristique d'être mixotrophe. A la connaissance du déposant, c'est la première souche de cette espèce décrite comme étant mixotrophe. Par ailleurs, comme pour les souches précédentes, cette souche présente la caractéristique d'être mixotrophe sans être hétérotrophe. Cela s'observe notamment lorsque le substrat carboné ajouté dans le milieu de culture minimum est le glucose ou l'acétate.

Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue, prédispose lesdites souches à une production plus élevée de lipides et d'hydrocarbures, notamment de botryococcènes.

Néanmoins, le procédé de culture selon l'invention est applicable à toute souche du genre Botryococcus cultivable en condition de mixotrophie et ne se limite pas seulement à l'utilisation des nouvelles souches décrites dans la présente demande. En effet, les inventeurs ont pu observer un gain de productivité dans les cultures, notamment en termes de biomasse, chez toutes les souches de Botryococcus préalablement identifiées comme pouvant croître en conditions de mixotrophie par rapport aux mêmes cultures réalisées en mode autotrophe.

Les exemples qui suivent ont pour but de compléter la description et illustrer l'invention. Ils ne sauraient conférer une quelconque limitation à l'invention. Exemple 1

1 - Souches : Les souches de Botryococcus ont été sélectionnées parmi une collection de souches du demandeur constituée des souches prélevées en eau douce, isolées et caractérisées selon les critères courants [Komarek, J. et al. (1992) P. Morphological différences in natural populations of the genus Botryococcus (chlorophyceae). Archiv fur Protistenkunde, 141 (1 -2):65-100] [Dayananda C. et al. (2007) Isolation and characterization of hydrocarbon producing green alga Botryococcus hraunii from Indian freshwater bodies. Elect. J. Biotechnol., 10: 1 -14].

2- Conditions de culture :

Plusieurs isolats de Botryococcus braunii et de Botryococcus sudeticus ont, dans un premier temps, été cultivés à 22°C en autotrophie (200 μΕ de lumière) en Milieu Minimum (MM) liquide [50 mL/L Solution Beijerink (NH ₄ CI 8g/L, CaCI ₂ 1g/L, MgS0 ₄ 2g/L), 1 mL/L Tampon Phosphate (K ₂ HP0 ₄ 106g/L KH ₂ P0 ₄ 53g/L), 1 mL/L solution d'oligoéléments (B0 ₃ H ₃ 1 1 .4g/L, ZnS0 ₄ 7H ₂ 0 22g/L, MnCI ₂ 4H ₂ O 5.06g/L, FeS0 ₄ 7H ₂ O 4.99g/L, CoCI ₂ 6H ₂ 0 1 .61 g/L, CuS0 ₄ 5H ₂ O 1 .57g/L, Mo ₇ O ₂ (NH4) ₆ 4H ₂ 0 1 .1 g/L, EDTA 50g/L), 2.42g/L Trizma base, pH ajusté entre 7.2 et 7.4 par HCI, 1 .2mg/L Vitamine B-i et 0.01 mg /L Vitamine Bi ₂ (ajoutées extemporanément)].

Des cultures ont été effectuées en mode mixotrophe (200 μΕ) en lumière continue et discontinue, ainsi qu'en mode hétérotrophe (témoin à 0 μΕ de lumière) à 22°C sur milieu MM additionné de substrats carbonés : acétate 1 g/L, glucose 5g/L, lactose 10g/L, saccharose 10g/L ou glycérol 5g/L.

Le caractère hétérotrophe et/ou mixotrophe des souches de Botryococcus a été évalué par une mise en culture des souches de microalgues en milieu MM + substrat carboné en microplaques 24 puits (V=2mL). Un contrôle de croissance en autotrophie (MM) a été systématiquement effectué pour servir de référence aux cultures en mixotrophie et hétérotrophie.

Les microplaques 24 puits ont été placées en chambre d'incubation (SANYO MLR-351 H) à 22°C, 60% d'humidité et 200μΕ d'intensité lumineuse pour les cultures en autotrophie et mixotrophie et en chambre d'incubation (BINDER KB53) à 22°C, 60% d'humidité et à l'obscurité (ΟμΕ) pour les cultures en hétérotrophie.

La croissance cellulaire a été évaluée par comparaison de la turbidité et/ou de la teneur en chlorophylle par rapport à la référence en autotrophie. Un suivi bi-hebdomadaire a été assuré pendant une durée de 2 semaines pour les cultures en autotrophie et mixotrophie et pendant une durée de 2 à 3 semaines pour les cultures en hétérotrophie. La mobilité et la pigmentation des microalgues cultivées en autotrophie/mixotrophie (auto/mixo) et hétérotrophie ont observées et comparées au moyen d'un microscope binoculaire, objectifs 10X et 32X.

Pour les cultures réalisées en mode mixotrophe en lumière discontinue, l'apport de lumière a consisté en des flashs à raison de 30 flashs de 30 secondes par heure.

Les souches dont la culture en lumière discontinue s'est avérée plus favorable qu'en lumière continue, ont été sélectionnées. Parmi ces souches, 4 ont été plus particulièrement étudiées : 3 souches de Botryococcus braunii (827, 828 et 829) et une souche de Botryococcus sudeticus (841).

3 - Propriétés des quatre souches du genre Botryococcus sélectionnées :

L'effet de la lumière (colonnes autotrophie et mixotrophie) et de substrats carbonés (colonnes mixotrophie et hétérotrophie) tels que le glucose (Glc 5g/L), l'acétate (Ac 1g/L), le saccharose (Sac 10g/L), le lactose (Lac 10g/L) et le glycérol (Gly 5g/L) sur la croissance de 4 souches du genre Botryococcus a été évalué par criblage en microplaques 24 puits sur milieu liquide MM (cf. tableau ci-dessous). Le suivi de croissance a été réalisé durant 3 à 4 semaines de façon bi-hebdomadaire par observation macroscopique des cultures et microscopique à la binoculaire (objectifs 10X et 32X).

Tableau 1 : croissance des souches sélectionnées en mixotrophie

- : croissance inhibée ; + : croissance modérée;

++ : croissance significative ; +++ : croissance forte

Sur les 4 souches testées du genre Botryococcus, les 2 souches B. braunii 827 et B. sudeticus 841 présentent un caractère hétérotrophe strict en présence de saccharose. Les 2 autres souches B. braunii 828 et β. braunii 829 sont strictement mixotrophes à 200 μΕ en présence de saccharose, et la souche B. sudeticus 841 est strictement mixotrophe à 200 μΕ en présence d'acétate. On observe, en effet, que les 2 souches B. braunii 827 et B. sudeticus 841 présentent une croissance significative à 0 μΕ en présence de 10g/L de saccharose, croissance supérieure à celle en autotrophie. On observe également une croissance accrue à 200 μΕ d'intensité lumineuse des souches B. braunii 828 et B. braunii 829 lors de l'ajout de 10g/L de saccharose dans le milieu de culture et une croissance accrue de la souche B sudeticus 841 lors de l'ajout d'1 g/L d'acétate dans le milieu de culture, comparée à leur croissance en autotrophie (200 μΕ d'intensité lumineuse).

4 - Conclusion :

Cette étude a permis de mettre en évidence de nouvelles souches de Botryococcus braunii et de Botryococcus sudeticus présentant un caractère mixotrophe vis-à-vis de certains substrats carbonés. L'ajout de substrats carbonés tels que le saccharose et l'acétate, améliore significativement la croissance respective de ces souches.

Exemple 2

1 - Culture des souches de Botryococcus en bioréacteur selon le procédé Mixo/flash

Les cultures de chacune des souches isolées dans l'exemple 1 (828, 829 et 841 ) ont été réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 2L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture a été fixée à 23°C. L'agitation a été réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La vitesse d'agitation et le débit d'aération ont été régulés pour un minimum de 100 rpm et un maximum de 250 rpm avec Qmini =0,5 vvm / Qmaxi = 2 vvm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente. L'intensité ainsi que les cycles de lumière sont contrôlés et régulés par un automate dédié et supervisé par station informatique.

L'apport de la lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu des lampes LED réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces LED pour des temps d'éclairement ou des pulsations entre 8 et 50 μΕ. L'intensité lumineuse du système flash utilisé en mixotrophie est égale à celle utilisée en autotrophie (témoin).

Les réacteurs ont été inoculés à l'aide d'une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 rpm) en enceinte thermostatée (22°C) et éclairée en continue à 100 uE. Pré-cultures et cultures en bioréacteurs ont été réalisées dans le milieu f/10 supplémenté avec 10% d'extrait de sol et 10mM en NaHCO ₃ . Le substrat carboné utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est l'acétate de sodium à des concentrations comprises entre 20 mM et 50 mM. 2 - Suivi des cultures

La concentration en biomasse totale a été suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFC, Whatman, puis séchage à l'étuve sous vide, 65°C et -0,8 bar, pendant 24h minimum avant pesée).

La quantification des lipides totaux a été effectuée sur échantillons de cellules (10 ⁷ cellules/mL) extraites des cultures âgées de 5 jours. Les lipides ont été extraits selon les méthodes d'extraction des lipides décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37:91 1 -917].

3 - Résultats Evolution de la biomasse :

Les mesures de biomasse réalisées dans les différents prélèvements effectués quotidiennement dans les cultures pendant 15 jours ont été reportées dans les graphiques des figures 1 à 3 pour chacune des souches 828, 829 et 841. Les graphiques permettent de comparer l'évolution de la biomasse sèche par volume de culture dans les différents modes de culture autotrophe, mixotrophe (lumière continue) et mixotrophe avec flash.

Il ressort de ces mesures que, pour chacune des souches, un gain substantiel de biomasse est obtenu en mode flash. L'accroissement est de l'ordre de 30 % par rapport à la mixotrophie en lumière continue et de l'ordre de 120 % par rapport au régime autotrophe.

Teneur en lipides : Le rapport de la quantité d'acides gras présente dans les cellules après 5 jours de culture, par rapport à la matière sèche totale, a été établi pour chaque mode de culture : autotrophie (auto), mixotrophie (mixo) et mixotrophie en mode flash (mixo-flash).

Les résultats sont représentés sous forme de diagrammes dans la figure 4, pour les deux souches analysées 828 et 841 . Ces résultats montrent un accroissement de la teneur des souches en acides gras d'un facteur 4 à 5 lorsque les microalgues sont cultivées en mode mixotrophe par rapport aux cultures en mode autotrophe. La teneur obtenue en mode mixotrophe avec flash et sans flash est comparable au bout de 5 jours.