NOUVELLE APPLICATION THERAPEUTIQUE DE LA 1,6-DIMETHYL-8p- HYDROXYMETHYL-1 Oa-METHOXYERGOLINE La présente invention concerne l'utilisation de la 1,6-diméthyl-8p-hydroxyméthyl- lOa-méthoxyergoline dans la prévention et/ou le traitement des maladies motoneuronales.

La 1,6-diméthyl-8(3-hydroxyméthyl-10a-méthoxyergoline ou 1-méthyl-lOa-méthoxy- 9,10-dihydrolysergol est un des métabolites de la nicergoline (F. ARCAMONE et coll., Biochem. Pharmacol., 21 (16), 2205-2013 (1972)). Ce composé présente comme la nicergoline mais à un degré moindre des propriétés al-adrénergiques et 5HTla sérotoninergiques. Il est également utile comme intermédiaire pour la préparation de la nicergoline (brevet FR2616788).

Il a maintenant été trouvé que la 1,6-diméthyl-8ß-hydroxyméthyl-lOa- méthoxyergoline augmente la survie des motoneurones et peut ainsi être utilisée dans la prévention et/ou le traitement des maladies motoneuronales.

Les maladies motoneuronales incluent notamment la sclérose latérale amyotrophique, l'atrophie musculaire spinale progressive, l'atrophie musculaire infantile, la slérose latérale primaire.

En présence de support trophique fourni par les facteurs neurotrophiques BDNF ou GDNF, les cultures de motoneurones sont composées de neurones larges et homogènes avec de longs neurites branchés. Cependant, les motoneurones meurent par apoptose si la culture est effectuée en absence de support trophique.

L'effet de la 1,6-diméthyl-83-hydroxyméthyl-1Oa-méthoxyergoline a donc été déterminé dans un modèle de dégénération induite par privation de facteur neurotrophique de motoneurones en culture.

Par ailleurs, les astrocytes jouent un rôle majeur dans le contrôle et la maintenance d'un environnement adéquat pour la survie motoneuronale.

La 1,6-diméthyl-8(3-hydroxyméthyl-l0a-méthoxyergoline a ainsi également été testée sur une co-culture de motoneurones et d'astrocytes.

Les protocoles utilisés sont les suivants : CULTURES ENRICHIES EN MOTONEURONES : Les cultures enrichies en motoneurones sont préparées en utilisant la méthode de centrifugation décrite par R. L. SCHNAAR et A. E. SCHAFFNER, J. Neurosci., 1, 204-217 (1981) et modifiée par W. CAMU et C. E. HENDERSON, J. Neurosci.

Methods, 44,59-70 (1992). Sur des plaques de cultures préalablement enduites de laminine/ornithine selon la méthode de A. G. ESTEVEZ et coll., J. Neurosci., 18 (3), 923-931 (1998), on étale les motoneurones à une densité de 2500 cellules par plaque de 35 mm. Les cultures sont ensuite maintenues dans du milieu L15 (GIBCO BRL) contenant du bicarbonate de sodium (22mM), de la conalbumine (0,1 mg/ml), de la putrescine (0,1 mM), de l'insuline (5 ug/ml), du sélénite de sodium (31 nM), du glucose (20 mM), de la progestérone (21 nM), de la pénicilline (100 IU/ml) et de la streptomycine (100 ug/ml).

Les motoneurones ainsi obtenus sont composés de neurones larges (25-30 M) et homogènes avec de longs neurites branchés. Plus de 70% des cellules sont immunoréactives pour le récepteur neurotrophine p75 et les marqueurs Islet % 2 pour les motoneurones spinaux. Environ 70% des motoneurones meurent par apoptose 24 heures après l'étalement si la culture est effectuée en absence de facteur trophique.

CULTURES D'ASTROCYTES DE MOELLE EPINIERE : Les astrocytes sont obtenus à partir de jeunes rats âgés d'un jour selon la méthode de R. P. SANETO ET J. DE VELLIS, in Neurochemistry a practical approach (A. J.

TURNER et H. S. St JOHN) IRL Press, Oxford-Washington DC, p27-63 légèrement modifiée. Les moelles épinières sont disséquées stérilement, débarassées des méninges et des ganglions dorsaux. Cinq à dix moelles épinières sont transferrées dans du PBS (phosphate buffer saline) et coupées avant incubation à 37°C pendant 25

minutes dans du PBS auquel on a ajouté 0,25% de trypsine. Le traitement enzymatique est stoppé par addition de 10 ml de milieu Dubelcco-Eagle modifié (DMEM) auquel on a ajouté 10% de sérum foetal de veau (FCS) et les cellules sont collectées par centrifugation. Une autre étape de dissociation mécanique est effectuée en utilisant l'extrémité d'une pipette de 1 ml. Les cellules sont étalées à une densité de 1,5-2x106 cellules pour 25 cm2 de milieu de culture dans du DMEM à 10% de FCS.

Après 2 jours in vitro les cultures sont alimentées chaque jour. Quand une monocouche visible de cellules est terminée, les cultures sont agitées 48 heures à 250 rpm et, le lendemain, les monocouches sont traitées par du cytosine arabinoside (10-5 M) pendant 48 heures. Les monocouches d'astrocytes sont ensuite amplifiées à une densité de cinq sur des plaques de culture de 35mm pour des flacons de culture de 25 cm2 au départ.

Les cultures d'astrocytes spinaux sont composées à plus de 98% de cellules polygonales, plates et immunoréactives pour la protéine gliale fibrilaire acide (GFAP). Les monocouches sont exposées au produit à tester et ensuite incubées avec le milieu motoneuronal pour obtenir un milieu de culture conditionné. Ce milieu est transféré et testé à différentes dilutions pour déterminer ses effets sur la survie neuronale.

IMMUNOCHIMIE Les cellules sont fixées dans 4% de paraformaldéhyde et 0,1% de glutaraldéhyde dans du PBS (pH 7,4 à 4°C pendant 15 minutes) et dans une solution méthanolique froide.

Les cultures sont ensuite lavées et les sites non spécifiques bloqués avec 10% de sérum de chèvre et 2 % d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS et traités pour immunochimie en utilisant des anticorps contre le récepteur de neurotrophine de faible affinité p75 ou une protéine de neurofilaments 200 kD (Amersham) en utilisant les instructions du fabricant et en appliquant la réaction d'amplification avidine- biotine DAB/peroxyde d'hydogène.

TRAITEMENT DES ASTROCYTES AVEC LA 1,6-DIMETHYL-8ß- HYDROXYMETHYL-1 Oa-METHOXYERGOLINE Le traitement des astrocytes avec la 1,6-diméthyl-8ß-hydroxyméthyl-1 Oa- méthoxyergoline s'effectue de la manière suivante : le produit est dissous dans du méthanol, stérilisé par filtration et utilisé immédiatement après préparation. Le traitement appliqué aux cultures de motoneurones enrichies est effectué par addition d'aliquotes des produits à tester en solution au milieu L15 par étalement. Les monocouches d'astrocytes sont exposées au véhicule ou aux solutions du composé à tester pendant 24 heures et à différentes concentrations. Les monocouches d'astrocytes sont lavées 3 fois avec du DMEM et incubées avec du milieu complet L15. Le milieu conditionné d'astrocytes est repris 24 heures plus tard et centrifugé à 1800 g pendant 15 minutes et utilisé immédiatement ou conservés à-70°C 2 semaines maximum sans perte d'activité trophique.

COMPTAGE DES CELLULES ET ANALYSE STATISTIQUE Les cellules immunoréactives pour les neurofilaments et exhibant des neurites plus longs que les diamètres des cellules sont considérés comme des motoneurones viables. Le nombre de motoneurones est évalué par comptage des cellules marquées dans une surface de 0,4-1 cm2 sous microscope grossissant 200 fois. Dans tous les cas, les valeurs sont exprimées comme un pourcentage du nombre de motoneurones présents dans les cultures maintenues avec des facteurs trophiques. Les expériences sont réalisées au moins 3 fois.

Les analyses statistiques sont effectuées en utilisant le test de Student (t-test).

Les résultats obtenus sont les suivants : 1-Effet de la 1,6-diméthyl-8p-hydroxyméthyl-l0a-méthoxyergoline sur la survie neuronale en co-cultures astrocytes/motoneurones : % de motoneurones marqués tous les motoneurones motoneurones très larges véhicule seul 1009,4 1002,8 1,6-diméthyl-8ß- hydroxyméthy !-1 Oa- méthoxyergoline 0,1 pM 1239,3 ** * 11µM 117~5,6** 10 *ND137,5~19 * significativement différent du véhicule (p<0,05) ** significativement différent du véhicule (p<0,01) ND non déterminé Ces résultats démontrent que la 1, 6-diméthyl-8ß-hydroxyméthyl-10α- méthoxyergoline (0, 1-1µM) prévient la mort neuronale des co-cultures et augmente le nombre de motoneurones larges.

2-effet de la 1, 6-diméthyl-8ß-hydroxyméthyl-10α-méthoxyergoline sur l'activité neurotrophique des motoneurones produite par les astrocytes spinaux : survie motoneuronale en % Dilutions des astrocytes dans le milieu conditionné 1 : 50 1 : 10 1 : 4 véhicule seul 36, 93, 2 45, 44, 2 59, 98 1, 6-diméthyl-8ß- 49,6~5,3 ** hydroxyméthyl-l Oa- méthoxyergoline(1µM) ** significativement différent du véhicule (p<0,01)

Ces résultats démontrent que la 1,6-diméthyl-8ß-hydroxyméthyl-l Oa- méthoxyergoline stimule l'activité trophique motoneuronale produite par les monocouches d'astrocytes spinaux.

3-Effet de la 1,6-diméthyl-8p-hydroxyméthyl-10a-méthoxyergoline en co-cultures de monocouches d'astrocytes et de motoneurones survie motoneuronale en % concentration du produit testé 1, uM 100 nM 10 nM 1 nM véhicule seul 43,94 1, 6-diméthyl-8ß- 68,7~8 ** 57,4i4 ** 48,9i3 ** 42,54 hydroxyméthyl-IOa- méthoxyergoline(1µM)

** significativement différent du véhicule (p<0,01) Ces résultats démontrent l'efficacité de la 1,6-diméthyl-8ß-hydroxyméthyl-lOa- méthoxyergoline dans la stimulation trophique motoneuronale par les astrocytes 4-effet neurotrophique-like de la 1,6-diméthyl-8p-hydroxyméthyl-10a- méthoxyergoline sur la mort neuronale dans des cultures enrichies en motoneurones et en absence de facteur trophique : La 1,6-diméthyl-8ß-hydroxyméthyl-lOa-méthoxyergoline augmente la survie des motoneurones privés de facteurs trophiques de 60% (p<0,001) avec une bonne conservation des arborisations neuronales et de la morphologie de la cellule.

Ces résultats suggèrent que la 1,6-diméthyl-8ß-hydroxyméthyl-lOa-méthoxyergoline exerce un effet neurotrophique sur ce modèle de dégéneration induite par privation de facteur trophique de motoneurones en culture et, de plus, stimule les astrocytes producteurs de ce facteur neurotrophique.

La présente invention concerne également l'utilisation de la 1,6-diméthyl-8ß- hydroxyméthyl-lOa-méthoxyergoline pour la préparation d'un médicament utile dans la prévention et/ou le traitement des maladies motoneuronales et notamment la sclérose latérale amyotrophique, l'atrophie musculaire spinale progressive, l'atrophie musculaire infantile, la slérose latérale primaire.

Le 1,6-diméthyl-8p-hydroxyméthyl-l0a-méthoxyergoline peut être préparée selon la méthode décrite dans le brevet FR2616788.

Les médicaments sont constitués par au moins la 1,6-diméthyl-8ß-hydroxyméthyl- 1 Oa-méthoxyergoline, à l'état pur ou sous forme d'une composition dans laquelle il est associé à tout autre produit pharmaceutiquement compatible, pouvant être inerte ou physiologiquement actif. Les médicaments selon l'invention peuvent être employés notamment par voie orale ou parentérale.

Comme compositions solides pour administration orale, peuvent être utilisés des comprimés, des pilules, des poudres (capsules de gélatine, cachets), des lyophilisants oraux (LyocR) ou des granulés. Dans ces compositions, le principe actif est mélangé à un ou plusieurs diluants inertes, tels que amidon, acide tartrique, gomme arabique, saccharine sodique, vanilline, cellulose, saccharose, lactose ou silice, sous courant d'argon. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un ou plusieurs lubrifiants tels que le stéarate de magnésium ou le talc, un colorant, un enrobage (dragées) ou un vernis.

Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des solutions, des suspensions, des émulsions, des sirops et des élixirs pharmaceutiquement acceptables contenant des diluants inertes tels que l'eau, l'éthanol, le glycérol, les huiles végétales ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants, épaississants, aromatisants ou stabilisants.

Les compositions stériles pour administration parentérale, peuvent être de préférence des solutions aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer l'eau, le propylèneglycol, un polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, des esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle ou d'autres solvants organiques convenables. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, isotonisants, émulsifiants, dispersants et stabilisants.

La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple par filtration aseptisante, en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage. Elles peuvent également être préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable.

EXEMPLES DE FORMULATION : gélule : 10 mg de 1,6-diméthyl-8p-hydroxyméthyl-l0a-méthoxyergoline et comme exipients du talc, du lactose et du stéarate de magnésium lyophilisat oral : 10 mg de 1,6-diméthyl-8p-hydroxyméthyl-l0a-méthoxyergoline et comme excipients de l'acide tartrique, du lactose, de la gomme arabique, de la saccharine sodique et de la vanilline poudre pour usage parentéral : 10 mg de 1,6-diméthyl-8p-hydroxyméthyl-1 Oa- méthoxyergoline et comme excipients de l'acide tartrique et du lactose.

Les doses dépendent de 1'effet recherché, de la durée du traitement et de la voie d'administration utilisée ; elles sont généralement comprises entre 30 et 200 mg par jour par voie orale pour un adulte avec des doses unitaires allant de 5 à 50 mg de 1,6- diméthyl-8p-hydroxyméthyl-1 Oa-méthoxyergoline.

D'une façon générale, le médecin déterminera la posologie appropriée en fonction du poids et de tous les autres facteurs propres au sujet à traiter.

L'invention concerne également la méthode de prévention et/ou de traitement de maladies motoneuronales et notamment la sclérose latérale amyotrophique, l'atrophie musculaire spinale progressive, l'atrophie musculaire infantile, la slérose latérale primaire qui consiste à administrer au patient de la 1,6-diméthyl-8p-hydroxyméthyl- 1Oa-méthoxyergoline.