CHROMOSOME 22 IMPLIQUE DANS LES TRANSLOCATIONS

CHROMOSOMIQUES RECURRENTES ASSOCIEES AU DEVELOPPEMENT DE

TUMEURS CANCEREUSES ET ACIDES NUCLEIQUES DE FUSION

5 RESULTANT DESDITES TRANSLOCATIONS.

La présente invention concerne un acide nucléique comprenant tout ou partie de la séquence nucléique d'un gène du chromosome 22 impliqué dans les

10 translocations chromosomiques récurrentes associées au développement de tumeurs cancéreuses. L'invention a aussi pour objet des acides nucléiques hybrides correspondant aux produits de fusion résultant des translocations chromosomiques dans lesquelles est engagé

15 ledit gène du chromosome 22.

L'invention concerne plus particulièrement un acide nucléique comprenant tout ou partie de la séquence nucléique du gène du chromosome 22 impliqué dans les translocations chromosomiques récurrentes

20 t(ll;22), t(21;22) et t(12;22), ainsi que les acides nucléiques hybrides résultant de la fusion de ce gène du chromosome 22 avec respectivement les gènes des chromosomes 11, 21 et 12 qui sont impliqués dans ces translocations. L'invention concerne également les ARNm

25 issus de l 'ADN du gène du chromosome 22 et des ADN de fusion, ainsi que les ADNc qui peuvent en dériver, de même que les protéines pour lesquelles ils codent.

L'invention concerne également la détection du gène du chromosome 22 impliqué dans des

30 translocations chromosomiques ainsi que des gènes de fusion résultant desdites translocations, à l'aide de

^• ~ sondes préparées à partir des acides nucléiques .% précédents, en vue du diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentés chez des sujets atteints de

35 tumeurs dites "à petites cellules rondes" ou de tumeurs

neuroectodermiques primitives périphériques ou encore du mélanome malin des parties molles; l'invention concerne aussi la détection, aux mêmes fins, des produits pour lesquels codent ces gènes ainsi que les produits et réacti s pour la mise en oeuvre de ces procédés .

Les trans locations récurrentes chromosomiques constituent un mécanisme d'activation d'oncogènes et sont donc impliquées dans l'apparition de nombreuses tumeurs pathogènes (Solomon E, Borrow J, Goddard A D, Science 254, 1153-1160; (1991)) . Parmi celles-ci les tumeurs dites "à petites cellules rondes" constituent un groupe de cancers hétérogènes. Un diagnostic précis de ces tumeurs est essentiel pour choisir correctement le protocole thérapeutique à utiliser pour les traiter. Un sous-ensemble de ces tumeurs porte une translocation chromosomique t(ll;22) (q24;12) et est sensible au même protocole thérapeutique.

Le sarcome d'Ewing constitue la seconde tumeur des os la plus fréquente chez l'enfant. Malgré l'absence de marqueur morphologique, les cellules du Sarcome d'Ewing expriment occasionnellement des antigènes ou peuvent causer l'expression de figures morphologiques caractéristiques d'une differentiation neurale (Lipins y M, Braham K, Philip I et al, Cancer Res. 47, 183-187 (1987) ; Cavazzana A O, Miser J S, Jefferson J, Triche T J, Am. J. Pathol. 127, 507-518 (1987)) . Ainsi les techniques de diagnostic des tumeurs à petites cellules rondes utilisent des méthodes classiques de 1'anatomopathologie et de la cytologie, et constituent donc un diagnostic d'exclusion qui n'est pas totalement fiable. La démonstration de la présence d'une translocation chromosomique t(ll;22) dans une tumeurs à petites cellules rondes peut être réalisée par une étude du caryot pe; cette étude nécessite que les cellules

parviennent vivantes au laboratoire, ce qui est souvent difficilement réalisable et entraîne un taux élevé d'échec; en outre, il existe des difficultés d'interprétation. Le Sarcome d'Ewing (ES) a été rattaché à un sous-type de Tumeurs Neuroectodermiques Primitives Périphériques (PNET) dénommées Neuroépithéliome Périphérique (PN) . Cette relation est en outre supportée par l'expression hautement spécifique de l'antigène MIC2 à la fois dans le Sarcome d'Ewing (ES) et le Neuroépithéliome Périphérique (PN) , alors que cet antigène n'est pas exprimé dans la plupart des autres tumeurs humaines (A bros I M, A bros P F, Strehl S et al, Cancer 67, 1886-1893 (1991) ; Garin-Chesa P, Fellinger E J, Huvos A G et al, Am. J. Pathol. 139, 275- 286 (1991)) . Avec d'autres sous-types rares de Tumeurs Neuroectodermiques Primitives (Whang-Peng J, Fréter C E, Knutsen T, Nanfro J J, Gazdar a, Cancer Genêt. Cytogenet. 29, 155-157 (1987) ; De Chadarevian J P, Vekemans M, Seemayer T A, N. Engl . J. Med. 311, 1702- 1703, (1984) ; Cavazzana A 0, Navarro S, Noguera R et al, Adv. Neuroblastoma Res. 2,463-473 (1988) ; Vigfusson N V, Allen L J, Philip J H, Alschibaja T, Riches W G, Cancer Genêt. Cytogenet. 22, 211-218 (1986)), le Sarcome d'Ewing et le Neuroépithéliome Périphérique partagent une translocation chromosomique t (11;22) (q24;ql2) très spécifique et cytogénétiquement identique (Aurias A, Rimbaut C, Buffe C, Dubousset J, Mazabraud A, N. Engl. J. Med. 309, 496-497 (1983) ; Turc-Carel C, Philip I, Berger M P, Philip T, Lenoir G M, N. Engl. J. Med. 309, 497-498, (1983) ; hang Peng J, Triche T J, Knutsen T, Miser J, Douglass E C, Israël M A, N. Engl. J. Med. 311, 584-585 (1984)) . Cette translocation a été observée dans 83 % des cas de Sarcome d'Ewing. Des variantes de cette translocation ou des translocations plus complexes ont

été observées dans 9 % des autres cas et impliquent de manière constante la bande 22ql2 (Turc-Carel C, Aurias A, Mugneret F et al, Cancer Genêt. Cytogenet. 32, 229- 238 (1988)) . La région 22ql2 apparaît donc comme l'un des principaux sites d'apparition d'altérations chromosomiques récurrentes rencontrées dans un groupe défini de tumeurs humaines.

Les travaux de recherches menés sur la cartographie physique du bras long du chromosome 22 (Zhang F, Delattre 0, Rouleau G, Couturier J, Lefrançois D, Thomas G, Aurias A, Genomics 6, 174-177 (1990) ; Zhang F R, Aurias A, Delattre O, Stern M H, Benitez J, Rouleau G, Thomas G, Genomics 7, 319-324 (1990) ; Delattre O, Azairibuja C J, Aurias A, Zucman J, Peter M, Zhang F, Hors-Cayla M C, Rouleau G, Thomas G, Genomics 9, 721-727 (1991)), et l'isolement de sondes à proximité du point de cassure chromosomique (Zucman J, Delattre 0, Desmaze C, Azambuja C, Rouleau G, De Jong P, Aurias A, Thomas G, Genomics, sous presse) ont conduit les Inventeurs à mettre en évidence que la translocation t(ll;22) (q24;ql2) fusionne un gène porté par le chromosome 22 et un gène porté par le chromosome 11; cette fusion conduisant à la formation d'un gène hybride associé à la pathologie. Ces deux gènes ont été caractérisés et les produits de leur fusion ont pu être définis.

Le gène du chromosome 22 impliqué dans la translocation t(ll;22), dénommé Ews, a été isolé et son ADNc séquence; la séquence de la protéine pour laquelle il code a été déduite de la séquence de l'ADNc; le gène Ews comporte une région dénommée EWSRl d'environ 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22.

Le gène du chromosome 11 impliqué dans la translocation t(ll;22), dénommé Hum-Fli-1, a été isolé

et son ADNc séquence; la séquence de la protéine pour laquelle il code a été déduite de la séquence de l'ADNc; le gène Hum-Fli-1 comporte une région dénommée EWSR2 d'environ 40 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 11. En outre, les Inventeurs ont confirmé la forte homologie du gène Hum-Fli-1 avec les gènes de la famille Ets et plus particulièrement avec le gène murin Fli-1 (Baud V et al., Genomics vol. 11, 223-224, 1991; Ben-David Y et al., Gènes & Development vol. 5, no. 6, 1991) .

Les Inventeurs ont par ailleurs montré que dans environ 12 % des cas de Sarcome d'Ewing, le gène Ews du chromosome 22 fusionne avec le gène Erg porté par le chromosome 21. Lequel gène Erg fait également partie de la famille des facteurs de transcription Ets.

En outre, les travaux de recherche menés par les Inventeurs sur les translocations chromosomiques récurrentes dans lesquelles est impliqué le gène Ews, les ont conduits à mettre en évidence que la translocation chromosomique récurrente t(12;22) (ql3;12) associée au mélénome malin des parties molles (MMSP) fusionne le gène Ews avec le gène Atf-1 porté par le chromosome 12. Le lien entre la translocation t(12;22) et le mélénome malin des parties molles a été décrit notamment par Bridge J A et al. (Bridge J A, Borek D A, Neff J R, Huntrakoon M, Am. J. Cin. Pathol. 93, 26-31, 1986) et Stenman G et al. (Stenman G, Kindblom L-G, Angervall L, Gènes Chrom. Cancer 4, 122-127, 1992) .

Le mélanome malin des parties molles est une tumeur grave se développant le plus souvent au niveau des tendons et des aponeuroses chez des sujets âgés de 15 à 35 ans (Chung E B, Enzinger F M, Am. J. Surg. Pathol. 7, 405-413, 1983; Epstein L, Martin A O, Kempson R, Cancer Res . 44, 1265-1274, 1984) . Bien que le MMSP présente plusieurs figures phenotypiques communes avec

les mélanomes malins cutanés, la translocation t (12;22) (ql3;12) est spécifique de ce type de tumeur (Mitelman F, Catalog of Chromosom Aberrations in Cancer, New York : Alan R. Liss, 1988) . Du fait que le point de cassure du chromosome 22 dans la translocation t (12; 22) (ql3; 12) ne peut être distingué cytogénétiquement de celui de la translocation t(ll;22), les inventeurs ont étudié les réarrangement du gène Ews dans la translocation t(12;22) . L'invention concerne en conséquence un acide nucléique comprenant tout ou partie de la séquence nucléique du gène Ews du chromosomes 22, localisé au niveau du point de cassure de ce chromosome dans diverses translocations chromosomiques récurrentes associées au développement de tumeurs cancéreuses.

L'invention concerne aussi les ADN hybrides résultant de la fusion du gène Ews avec d'autres gènes lors de translocations chromosomiques récurrentes impliquant le chromosome 22, constitués essentiellement d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews et d'une partie de la séquence nucleotidique du gène localisé au niveau du point de cassure de l'autre chromosome impliqué dans la translocation.

Plus particulièrement, l'invention concerne les ADN hybrides comprenant essentiellement la partie de la séquence nucleotidique du gène Ews jusqu'à la région de 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22.

Parmi ces ADN hybrides comprenant la partie de la séquence nucleotidique du gène Ews depuis son origine jusqu'à la région de 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22, l'invention concerne plus particulièrement ceux résultant des translocation chromosomiques suivantes :

- t(ll;22) (q24;ql2), associée à au moins 80% des cas de sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées;

- t(21;22), associée à au moins 10% des cas de sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées;

5 - t(12;22), associée au mélanome malin des parties molles.

L'invention concerne également les ARNm issus de l'ADN du gène du chromosome 22 et des ADN de fusion, ainsi que les ADNc qui peuvent en dériver, de

10 même que les protéines pour lesquelles ils codent.

L'invention a donc pour objet les ADN hybrides, résultant de la translocation t (11;22) (q24;ql2) , constitués essentiellement par la fusion d'une partie de la séquence nucleotidique du gène

15 Ews, et de la partie de la séquence nucleotidique du gène Hum-Fli-1 localisée au niveau du point de cassure du chromosome 11 dans ladite translocation. Plus précisément, l'invention concerne les ADN hybrides comprenant la partie de la séquence nucleotidique du

20 gène Hum-Fli-1 depuis la région EWSR2 de 40 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 11 dans cette translocation jusqu'à son extrémité 3'.

Les Inventeurs ont étudié en détail les mécanismes donnant naissance aux différents gènes de

25 fusion de la translocation t(ll;22) .

Les structures exoniques des gènes Ews et Hum-Fli-1 ont été déterminées. Il apparait que les positions précises des points de cassures situés au niveau des régions EWSRl et EWSR2 se trouvent le plus

30 souvent, et peut être exclusivement dans les introns des deux gènes afin que, par le jeu des epissages ayant lieu au cours de la maturation du transcrit primaire, un cadre ouvert de lecture puisse être restauré. La

<_v position des exons par rapport aux sites de restriction

35 a été définie pour les gènes Ews et Hum-Fli-1.

Les cadres ouverts de lectures sont divisés et chaque intron entre deux exons codant interrompt les cadres de lectures; la détermination de la majorité des jonctions introns-exons a été réalisée pour les deux gènes Ews et Hum-Fli—1.

A partir de ces travaux, il a été possible de déduire la taille approximative des introns, sites des points de cassures chromosomiques, et de prévoir la multiplicité des produits de fusion possibles. En outre, la séquence promotrice du gène EWS a été déterminée.

De manière avantageuse, les ADN hybrides selon l'invention correspondant aux produits de fusion résultant de la translocation chromosomique récurrente t(ll;22), sont constitués essentiellement d'une partie de la séquence nucleotidique de l'ADNc du gène Ews, et plus précisément de la séquence nucleotidique d'un ADNc résultant de la fusion des gène Ews et Hum-Fli-1.

Des sondes nucléotidiques ou leurs homologues, capables de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence nucleotidique des gènes Ews ou Hum-Fli-1 ou encore avec l'ADNc de l'un de ces gènes ont été préparées. Parmi celles-ci des sondes capables de s'hybrider spécifiquement avec une partie du gène Ews ou une partie du gène Hum-Fli-1 ont été sélectionnées. Des sondes complémentaires de tout ou partie des ADN hybrides, correspondant notamment à la partie des gènes Ews et Hum-Fli-1 altérées par la translocation t(ll;22), ou encore avec l'ARNm ou l'ADNc des gènes de fusion, ont également été obtenues en vue de détecter par hybridation, dans les cellules tumorales d'un sujet, la présence éventuelle d'une translocation t(ll;22) .

Des oligonucléotides de synthèses ont été préparés à partir des séquences nucléotidiques des gènes Ews, Hum-Fli-1 et des produits résultant de la fusion de ces deux gènes, afin de préparer par transcription

réverse d'ARNm issu d'un échantillon à analyser, l'ADNc correspondant à la zone de fusion. L'amplification génique in vi tro de cet ADNc par PCR, à l'aide d'oligonucléotides amorces, permet l'analyse des produits amplifiés par des méthodes radioactives ou colorimétriques simples du type électrophorèse sur gel et coloration au bromure d'éthidium, ou révélation immunologique ou fluorographique.

L'invention concerne en conséquence les séquences nucléotidiques, ou leurs analogues, constituant des sondes génétiques capables de s'hybrider avec la séquence nucleotidique des gène Ews ou les ADN hybrides résultant de la fusion des gènes Ews et Hum- fli-1, ou leurs ARNm et ADNc, ainsi que des oligonucléotides issus de ces séquences et constituant des amorces pour la réalisation d'une transcription réverse d'ARN ou la mise en oeuvre d'un processus d'amplification génique par PCR.

La translocation chromosomique t(ll;22) observée dans les tumeurs neurectodermiques donne naissance à des gènes de fusion hybrides capables de coder pour des protéines chimères ayant conservées la partie N-terminale de la protéine EWS codée par le gène Ews et la partie C-terminale de la protéine HUM-FLI-1 codée par le gène Hum-Fli-1.

L'étude approfondie du gène Ews, montre que celui-ci code pour une protéine de 656 acides aminés présentant deux domaines de structure différents. La partie C-terminale est caractérisée par trois régions riches en résidus glycine et arginine et une région de 85 acides aminés homologue au domaine consensus de fixation de l'ARN; ceci suggère fortement que la partie C-terminale de la protéine EWS pourrait interagir avec les acides nucléiques simples brins et plus particulièrement avec l'ARN. La partie N-terminale de la

protéine EWS (NTD-EWS) comporte un polypeptide répété et dégénéré possédant une séquence consensus SYGQQS qui présente une faible ^" homologie avec la CTD-PolII.

La séquence en acides aminées des protéines chimères peut être déduite des ADNc de fusion résultant de la translocation t(ll;22); plusieurs de ces protéines ont été produites in vitro afin notamment de préparer des anticorps polyclonaux et monoclonaux capables de se lier avec les cellules produisant ces protéines et, en conséquence, présentant la translocation t(ll;22) . L'invention concerne donc aussi les protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(ll;22), ainsi que les anticorps pour la détection immunologique de la présence de ces protéines et plus particulièrement d'une protéine chimère dans un échantillon biologique provenant d'un sujet susceptible de porter une translocation chromosomique t(ll;22) .

L'invention concerne aussi les procédés de détection d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll;22) .

Dans une première forme de réalisation, un procédé de détection d'un tel gène comprend les étapes suivantes :

- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde; - la mise en contact d'au moins une sonde selon l'invention spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion correspondant à la translocation t(ll;22), avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes

d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;

- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés. Ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.

Une seconde forme de réalisation d'un tel procédé, vise à détecter le transrit d'un gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22); ce procédé consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à l'un ou l'autre des gènes impliqués dans la translocation t(ll;22) ou à un gène de fusion. Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles.

L'invention concerne aussi la détection d'une protéine chimère codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes :

- le traitement d'un échantillon biologique provenant d ^r un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de prés enter une trans location chromosomique t (ll;22) , de façon à rendre les protéines qu ' il contient accessibles à des anticorps;

- la mise en contact de l ' échantillon biologique avec au moins un anticorps spécifique de la protéine chimère selon l ' invention correspondant à la translocation t (ll; 22) , dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l ' échantillon;

- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés .

De manière spécifique la détection d'ADN ou d'ARN de fusion ou encore d'une protéine chimère permet le diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées chez les sujets présentant des tumeurs à petites cellules rondes.

L'invention a en conséquence pour objet un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, consistant, à partir d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), à traiter de façon à rendre les acides nucléiques qu ^r il contient apte à s'hybrider avec une sonde, à détecter la présence d'une translocation t(ll;22) dans les cellules tumorales. Un tel procédé comprend les étapes suivantes :

- la mise en contact d'au moins une sonde de l'invention, éventuellement marquée, spécifique soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion correspondant à la translocation t(ll;22) , avec

l'échantillon biologique traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;

- la mise en évidence par tout moyen approprié des hybrides éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22) .

Comme précédemment, ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.

Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à un gène de fusion de la translocation t(ll;22) . Des méthodes de détection des produits

amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles .

Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentés, consiste, à partir d'un échantillon cellulaire mis en contact avec un ou plusieurs anticorps de l'invention spécifiques de protéines de fusion correspondant à la tranlocation t(ll;22), à détecter immunσlogiquement la présence d'au moins une protéine codée par un ou plusieurs gènes de fusion résultant de la translocation t(ll;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes :

- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps monoclonaux;

- la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps den l'invention dirigé contre au moins une protéine chimère correspondant à la tranlocation t(ll;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps (s) et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon; - la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22) . Des trousses pour la mise en oeuvre de ces procédés peuvent avantageusement être préparées . Ces trousses ou kits contiennent, dans le cas d'un procédé par hybridation, des sondes selon l'invention ainsi que des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé par transcription réverse et PCR, les

oligonucléotides adéquats pour la mise en oeuvre en oeuvre de chacune de ces techniques ainsi des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé immunologique, les anticorps monoclonaux ainsi que des échantillons témoins de réactivité connue.

L'invention concerne également l'utilisation des séquences d'ADN de l'invention pour préparer des nucléotides anti-sens, ou analogues, ayant une activité anti-tumorale; lesquels par hybridation avec tout ou partie du gène de fusion inhibent sa transcription et ainsi empêchent la production d'ARNm et de protéines chimères, et/ou, dans une autre de forme de mise en oeuvre, s 'hybride avec l'ARNm transcrit et inhibe alors la production de protéines chimères . L'invention concerne en conséquence, l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ADN hybride selon l'invention pour préparer un agent thérapeutique inhibant l'expression d'un gène de fusion résultant d'une translocation chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) , dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées.

L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber l'expression d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ADN hybride selon l'invention, ou un analogue de cet ADN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll; 22)- (q24; ql2) .

Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique

ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ARN hybride selon 1 ' invention pour préparer un agent thérapeutique inhibant la traduction de protéines chimères résultant d'une translocation chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) , dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées .

L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la trans location chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ARN hybride selon l'invention, ou un analogue de cet ARN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique de l'ARN issu d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) . L'invention a aussi pour objet les ADN hybrides résultant de la translocation t(21;22) associée à environ 10% des cas de sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, constitués essentiellement par la fusion d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, et de la partie de la séquence nucleotidique du gène Erg localisée au niveau du point de cassure du chromosome 21 dans cette trans location. Plus précisément, l'invention concerne les ADN hybrides comprenant la partie de la séquence nucleotidique du gène Erg depuis la région au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 21 jusqu'à son extrémité 3'.

Les Inventeurs ont étudié en détail les mécanismes donnant naissance aux différents gènes de fusion de la translocation t(21;22) .

De manière avantageuse, les ADN hybrides selon l'invention correspondant aux produits de fusion résultant de la translocation chromosomique récurrente t(21;22) sont constitués essentiellement d'une partie de la séquence nucleotidique de l'ADNc du gène Ews, et plus précisément de la séquence nucleotidique d'un ADNc résultant de la fusion des gène Ews et Erg.

Des sondes nucléotidiques ou leurs homologues, capables de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence nucleotidique des gènes Ews ou Erg ou encore avec l'ADNc de l'un de ces gènes ont été préparées. Parmi celles-ci des sondes capables de s'hybrider spécifiquement avec une partie du gène Ews ou une partie du gène Erg ont été sélectionnées . Des sondes complémentaires de tout ou partie des ADN hybrides, correspondant notamment à la partie des gènes Ews et Erg altérées par la translocation t(21;22), ou encore avec l'ARNm ou l'ADNc des gènes de fusion, ont également été obtenues en vue de détecter par hybridation, dans les cellules tumorales d'un sujet, la présence éventuelle d'une translocation t(21;22) .

Des oligonucléotides de synthèses ont été préparés à partir des séquences nucléotidiques des gènes Ews, Erg et des produits résultant de la fusion de ces deux gènes, afin de préparer par transcription réverse d'ARNm issu d'un échantillon à analyser, l'ADNc correspondant à la zone de fusion. L'amplification génique in vi tro de cet ADNc par PCR, à l'aide d'oligonucléotides amorces, permet l'analyse des produits amplifiés par des méthodes radioactives ou colorimétriques simples du type électrophorèse sur gel et coloration au bromure d'éthidium, ou révélation immunologique ou fluorographique.

L'invention concerne en conséquence les séquences nucléotidiques, ou leurs analogues,

constituant des sondes génétiques capables de s'hybrider avec la séquence nucleotidique des gène Ews ou les ADN hybrides résultant de la fusion des gènes Ews et Erg, ou leurs ARNm et ADNc, ainsi que des oligonucléotides issus de ces séquences et constituant des amorces pour la réalisation d'une transcription réverse d'ARN ou la mise en oeuvre d'un processus d'amplification génique par PCR.

La translocation chromosomique t(21;22) observée dans les tumeurs neurectodermiques donne naissance à des gènes de fusion hybrides capables de coder pour des protéines chimères ayant conservées la partie N-terminale de la protéine EWS codée par le gène Ews et la partie C-terminale de la protéine ERG codée par le gène Erg.

Comme dans le cas des protéines chimères résultant de la fusion des gènes Ews et Hum-Fli-1, les protéine chimères résultant de la translocation t(21,22) conserve le domaine NTD-EWS, lequel est en phase avec le domaine de fixation de l'ADN de la protéine ERG.

La séquence en acides aminées des protéines chimères peut être déduite des ADNc de fusion résultant de la translocation t(21;22); certaines de ces protéines ont été produites in vitro afin notamment de préparer des anticorps polyclonaux et monoclonaux capables de se lier avec les cellules produisant ces protéines et, en conséquence, présentant la translocation t(21;22) . L'invention concerne donc aussi les protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(21;22), ainsi que les anticorps pour la détection immunologique de la présence de ces protéines et plus particulièrement d'une protéine chimère dans un échantillon biologique provenant d'un sujet susceptible de porter une translocation chromosomique t(21;22) .

L'invention concerne aussi les procédés de détection d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21;22) .

Dans une première forme de réalisation, un procédé de détection d'un tel gène comprend les étapes suivantes :

- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;

- la mise en contact d'au moins une sonde selon l'invention spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion correspondant à la translocation t(21;22), avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;

- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés.

Ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.

Une seconde forme de réalisation d'un tel procédé, vise à détecter le transrit d'un gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) ; ce procédé consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à

amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à l'un ou l'autre des gènes impliqués dans la translocation t(21;22) ou à un gène de fusion. Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles. L'invention concerne aussi la détection d'une protéine chimère codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes :

- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps;

- la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps spécifique d'au moins une protéine chimère selon l'invention correspondant à la translocation t(21;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;

- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés .

De manière spécifique la détection d'ADN ou d'ARN de fusion résultant de la translocation t(21;22)

ou encore d'une protéine chimère correspondante, permet le diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées chez les sujets présentant des tumeurs à petites cellules rondes. L'invention a en conséquence pour objet un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, consistant, à partir d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), à traiter de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient apte à s'hybrider avec une sonde, à détecter la présence d'une translocation t(21;22) dans les cellules tumorales. Un tel procédé comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'au moins une sonde de l'invention, éventuellement marquée, spécifique soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) , avec l'échantillon biologique traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon; la mise en évidence par tout moyen approprié des hybrides éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) .

Comme précédemment, ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.

Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à un gène de fusion de la trans location t(21;22) . Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles.

Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentés, consiste, à partir d'un échantillon cellulaire mis en contact avec un ou plusieurs anticorps de l'invention spécifiques de protéines de fusion, à détecter immunologiquement la présence d'au moins une protéine codée par un ou plusieurs gènes de fusion résultant de la translocation t(21;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes :

- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation

chromosomique t(21;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps monoclonaux;

_* - la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps dirigé contre au

1 5 moins une protéine chimère correspondant à la translocation t(21;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps (s) et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;

10 - la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) .

15 La translocation t(21;22) étant associée à environ 10% des cas de sarcome d'Ewing et la translocation t(ll;22) étant associée à au moins 80% des cas de sarcome d'Ewing, il est avantageux, pour réaliser un diagnostic du sarcome d'Ewing de mettre en oeuvre

20 simultanément les procédés visant à détecter dans les cellules tumorales de patients susceptibles de présenter ces translocations chromosomiques, les produits résultant de ces deux translocations.

Des trousses pour la mise en oeuvre de ces

25 procédés peuvent avantageusement . être préparées. Ces trousses ou kits contiennent, dans le cas d'un procédé par hybridation, des sondes selon l'invention ainsi que des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé par transcription réverse et PCR, les

30 oligonucléotides adéquats pour la mise en oeuvre en oeuvre de chacune de ces techniques ainsi des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un

^• 4 procédé immunologique, les anticorps monoclonaux ainsi que des échantillons témoins de réactivité connue.

L'invention concerne également l'utilisation des séquences d'ADN de l'invention pour préparer des nucléotides anti-sens, ou analogues, ayant une activité anti-tumorale; lesquels par hybridation avec tout ou partie du gène de fusion inhibent sa transcription et ainsi empêchent la production d'ARNm et de protéines chimères, et/ou, dans une autre de forme de mise en oeuvre, s'hybride avec l'ARNm transcrit et inhibe alors la production de protéines chimères. L'invention concerne en conséquence, l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ADN hybride correspondant à la translocation t(21;22) selon l'invention pour préparer un agent thérapeutique inhibant l'expression d'un gène de fusion résultant de ladite translocation , dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées .

L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber l'expression d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21; 22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ADN hybride selon l'invention correspondant à ladite translocation, ou un analogue de cet ADN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21;22) . Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ARN hybride selon l'invention correspondant à la translocation t(21;22) pour préparer un agent

thérapeutique inhibant la traduction de protéines chimères résultant d'une telle translocation chromosomique, dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées. L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(21; 22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ARN hybride selon l'invention correspondant à la translocation t(21;22) , ou un analogue de cet ARN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique de l'ARN issu d'un gène de fusion résultant de cette translocation chromosomique.

La translocation t(21;22) étant associée à environ 10% des cas de sarcome d'Ewing et la translocation t(ll;22) étant associée à au moins 80% des cas de sarcome d'Ewing, l'invention concerne, de façon avantageuse, un agent thérapeutique constitué essentiellement, soit des agents thérapeutiques inhibant l'expression des gènes de fusion résultant de ces deux translocations chromosomiques, soit des agents thérapeutiques inhibant la traduction des gènes de fusion résultant de ces deux translocations chromosomiques .

L'invention a enfin pour objet les ADN hybrides, résultant de la trans locat ion t (12;22) (ql3;ql2) , constitués essentiellement par la fusion d'une partie de la séquence nucleotidique du gène

Ews, et de la partie de la séquence nucleotidique du gène Atf-1 localisée au niveau du point de cassure du chromosome 12 dans ladite translocation. Plus précisément, l'invention concerne les ADN hybrides comprenant la partie de la séquence nucleotidique du

gène Atf-1 depuis la région au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 12 dans cette translocation jusqu'à son extrémité 3'.

Les Inventeurs ont étudié en détail les mécanismes donnant naissance aux différents gènes de fusion de la translocation t(ll;22) .

De manière avantageuse, les ADN hybrides selon l'invention correspondant aux produits de fusion résultant de la translocation chromosomique récurrente t(12;22), sont constitués essentiellement d'une partie de la séquence nucleotidique de l'ADNc du gène Ews, et plus précisément de la séquence nucleotidique d'un ADNc résultant de la fusion des gène Ews et Atf-1.

Des sondes nucléotidiques ou leurs homologues, capables de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence nucleotidique des gènes Ews ou Hum-Fli-1 ou encore avec l'ADNc de l'un de ces gènes ont été préparées. Parmi celles-ci des sondes capables de s'hybrider spécifiquement avec une partie du gène Ews ou une partie du gène Hum-Fli-1 ont été sélectionnées.

Des sondes complémentaires de tout ou partie des ADN hybrides, correspondant notamment à la partie des gènes Ews et Atf-1 altérées par la translocation t(12;22), ou encore avec l'ARNm ou l'ADNc des gènes de fusion, ont également été obtenues en vue de détecter par hybridation, dans les cellules tumorales d'un sujet, la présence éventuelle d'une translocation t(12;22) .

Des oligonucléotides de synthèses ont été préparés à partir des séquences nucléotidiques des gènes Ews, Atf-1 et des produits résultant de la fusion de ces deux gènes, afin de préparer par transcription réverse d'ARNm issu d'un échantillon à analyser, l'ADNc correspondant à la zone de fusion. L'amplification génique in vitro de cet ADNc par PCR, à l'aide d'oligonucléotides amorces, permet l'analyse des

produits amplifiés par des méthodes radioactives ou colorimétriques simples du type électrophorèse sur gel et coloration au bromure d'éthidium, ou révélation immunologique ou fluorographique. L'invention concerne en conséquence les séquences nucléotidiques, ou leurs analogues, constituant des sondes génétiques capables de s'hybrider avec la séquence nucleotidique des gène Ews ou les ADN hybrides résultant de la fusion des gènes Ews et Atf-1, ou leurs ARNm et ADNc, ainsi que des oligonucléotides issus de ces séquences et constituant des amorces pour la réalisation d'une transcription réverse d'ARN ou la mise en oeuvre d'un processus d'amplification génique par PCR. La translocation chromosomique t(12;22) observée dans les tumeurs du mélanome malin des parties molles (MMSP) donne naissance à des gènes de fusion hybrides capables de coder pour des protéines chimères ayant conservées la partie N-terminale de la protéine EWS codée par le gène Ews et la partie C-terminale de la protéine ATF-1 codée par le gène Atf-1.

La séquence en acides aminées des protéines chimères peut être déduite des ADNc de fusion résultant de la translocation t(12;22) ; l'une de ces protéines a été produite in vitro afin notamment de préparer des anticorps polyclonaux et monoclonaux capables de se lier avec les cellules produisant cette protéine et, en conséquence, présentant la translocation t(12;22) . L'invention concerne donc aussi les protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(12;22), ainsi que les anticorps pour la détection immunologique de la présence de ces protéines et plus particulièrement d'une protéine chimère dans un échantillon biologique provenant d'un sujet susceptible de porter une translocation chromosomique t(12;22) .

L'invention concerne aussi les procédés de détection d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(12;22) .

Dans une première forme de réalisation, un procédé de détection d'un tel gène comprend les étapes suivantes :

- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;

- la mise en contact d'une sonde selon l'invention spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion correspondant à la translocation t(12;22), ou d'un mélange de ces sondes, avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillo ;

- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés .

Ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.

Une seconde forme de réalisation d'un tel procédé, vise à détecter le transrit d'un gène de fusion résultant de la translocation t(12;22); ce procédé consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse

adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à l'un ou l'autre des gènes impliqués dans la translocation t(12;22) ou à un gène de fusion. Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles.

L'invention concerne aussi la détection d'une protéine chimère codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes : - le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps; - la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps spécifique de la protéine chimère selon l'invention correspondant à la translocation t (12,22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;

- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés.

De manière spécifique la détection d'ADN ou d'ARN de fusion ou encore d'une protéine chimère permet le diagnostic du MMSP .

L'invention a en conséquence pour objet un procédé de diagnostic du MMSP, consistant, à partir d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), à traiter de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient apte à s'hybrider avec une sonde, à détecter la présence d'une translocation t(12;22) dans les cellules tumorales. Un tel procédé comprend les étapes suivantes :

- la mise en contact d'au moins une sonde de l'invention, éventuellement marquée, spécifique soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion correspondant à la translocation t(12;22), avec l'échantillon biologique traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon; - la mise en évidence par tout moyen approprié des hybrides éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) .

Comme précédemment, ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.

Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du MMSP, consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de

cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à un gène de fusion de la translocation t(ll;22) . Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles.

Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du MMSP, consiste, à partir d'un échantillon cellulaire mis en contact avec un ou plusieurs anticorps de l'invention spécifiques de protéines de fusion, à détecter immunologiquement la présence d'une protéine codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes :

- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps monoclonaux; la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine chimère correspondant à la translocation t(12;22), dans des conditions permettant

la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps (s) et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;

- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) .

Des trousses pour la mise en oeuvre de ces procédés peuvent avantageusement être préparées . Ces trousses ou kits contiennent, dans le cas d'un procédé par hybridation, des sondes selon l'invention ainsi que des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé par transcription réverse et PCR, les oligonucléotides adéquats pour la mise en oeuvre en oeuvre de chacune de ces techniques ainsi des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé immunologique, les anticorps monoclonaux ainsi que des échantillons témoins de réactivité connue. L'invention concerne également l'utilisation des séquences d'ADN de l'invention correspondant à une translocation t(12;22), pour préparer des nucléotides anti-sens, ou analogues, ayant une activité anti¬ tumorale; lesquels par hybridation avec tout ou partie du gène de fusion inhibent sa transcription et ainsi empêchent la production d'ARNm et de protéines chimères, et/ou, dans une autre de forme de mise en oeuvre, s 'hybride avec l'ARNm transcrit et inhibe alors la production de protéines chimères. L'invention concerne en conséquence, l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ADN hybride selon l'invention correspondant à une translocation t(12;22), pour préparer un agent thérapeutique inhibant

l'expression d'un gène de fusion résultant d'une translocation chromosomique t (12;22) (ql3;ql2) , dans les cellules tumorales de patients atteints de MMSP.

L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber l'expression d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t (12; 22) (ql3;ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints de MMSP, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ADN hybride selon l'invention correspondant à la translocation t(12;22), ou un analogue de cet ADN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(12;22) (ql3;ql2) .

Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ARN hybride selon l'invention correspondant à une translocation t(12;22) , pour préparer un agent thérapeutique inhibant la traduction de protéines chimères résultant d'une translocation chromosomique t (12;22) (ql3;ql2) , dans les cellules tumorales de patients atteints MMSP .

L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(12; 22) (ql3; ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints de MMSP, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ARN hybride selon l'invention correspondant à une translocation t(12;22), ou un analogue de cet ARN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique de l'ARN issu d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(12; 22) (ql3; ql2) .

L ' invention concerne aussi l ' acide nucléique correspondant au gène Ews , ainsi que l ' ARNm qui en est issu et l 'ADNc qui en dérive, de même que la protéine pour laquelle il code . En effet, la préparation de sondes et d' amorces constituent des outils permettant la détection du gène Ews normal; cette détection du gène Ews normal pouvant être avantageusement conjuguée aux procédés de détection des gènes de fusion résultant des diverses translocations dans lesquelles ce gène est impliqué, afin de servir de témoin positif .

Les ADN de l ' invention peuvent être introduites dans des vecteurs d' expression dérivés de plasmides ou de virus , dans le but , notamment , de produire les protéines correspondant à ces séquences d'ADN, afin de préparer des anticorps spécifiques de ces protéines, ou encore afin de disposer de modèles d' étude pharmacologique .

D ' autres caractéristiques de l ' invention apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfèrent à des exemples , étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée des revendications .

EXEMPLE 1 : ETUDE DE LA TRANS LOCATION CHROMOSOMIQUE RECURRENTE t ( 11 : 22 ) ASSOCIEE A U

SARCOME D ' EWING

X ~ Clonage _\s≤ points de cassures

En utilisant un panel de cellules somatiques hybrides, il a été montré que le locus identifié avec la sonde VTIIF2 et celui codant pour le Facteur d' Inhibition de la Leucémie (LIF) sont de chaque coté et à proximité du point de cassure du chromosome 22 (Delattre O, Azambuja C J, Aurias A et al, Genomics 9,

721-727, (1991)) . Selon l'échelle définie par Trask et al. (Trask B, Pinkel D, Van Den Engh G, Genomics 5, 710- 717 (1989)), la distance entre ces deux loci a été estimée par Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur noyaux interphasiques entre 1,5 et 2 Mégabases.

Le criblage différentiel d'une banque de cosmides spécifiques du chromosome 22 avec plusieurs produits Alu-PCR (Nelson D L, Ledbetter S A, Corbo L, Victoria M F, Ramirez-Solis R, Webster T D, Ledbetter D H, Caskey C T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6686-6690 (1989) ) générés à partir de quatre cellules hybrides, a conduit à l'identification de trois loci indépendants qui sont télomériques au point de cassure et à proximité du locus LIF (Zucman J, Delattre O, Desmaze C et al, Genomics, sous presse) . Deux d'entre-eux sont disposés sur un large contig de 450 Kilobases préalablement construit par expansion du locus LIF. Par la technique FISH bi-couleur sur noyaux interphasiques, le troisième locus, identifié grâce aux cosmides chevauchant Cos5 et Cos6 (Zucman J, Delattre O, Desmaze C et al, Genomics, sous presse) , a été localisé entre les loci VIIIF2 et LIF. Le locus Cos5/Cos6 a été progressivement étendu par isolement récurrent de clones chevauchant en utilisant une banque de cosmides spécifiques du chromosome 22.

Au cours de cette procédure, il a été mis en évidence que deux cosmides, dénommés B6 et G9, chevauchent le point de cassure du chromosome 22 sur le dérivé 11 de la translocation t(ll;22), de A3EW2-3B et Alu6, deux cellules hybrides dérivant respectivement des tumeurs ES et PN et contenant le der (11) (Geurts van Kessel A H M, Turc-Carel C, Klein A de et al, Mol. Cel. Biol. 5, 427-429 (1985) ; Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174-177 (1990)) .

La technique FISH sur chromosomes métaphasiques d'une lignée cellulaire PN mise en oeuvre avec l'un de ces deux cosmides confirme que le point de cassure a été franchi car un signal fluorescent est alors observé sur le dérivé 22 de la translocation.

Des fragments d'ADN, en copies uniques dans le génome humain, proches du point de cassure du chromosome 22 ont été sélectionnés pour analyser l'ADN d'un groupe de 20 tumeurs ES et PN. Dans tous les cas, un point de cassure est observé dans la même région de environ 7 Kb, laquelle a été dénommée EWSRl pour Région 1 du Sarcome d'Ewing.

Une banque de cosmides fabriquée à partir de la lignée cellulaire ICB104 dérivant d'une tumeur PN (Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174- 177 (1990) ) a été criblée avec des sondes issues de EWSRl . Trois groupes de cosmides chevauchant ont été isolés, l'un correspondant au chromosome 22 normal et les deux autres à chacun des deux dérivés de la translocation. Par la suite, des fragments non issus du chromosome 22 mais provenant de ces cosmides ont été utilisés pour identifier un clone, dont il a été mis en évidence par la technique FISH qu'il dérivait de la région q2 du chromosome 11. La comparaison des cartes de restriction des régions intactes et réarrangées des chromosomes 11 et 22 indique, au niveau de résolution autorisée par l'étude, que la translocation est simple et réciproque.

Le locus du chromosome 11 a été étendu sur 100 Kb par isolement récurrent de cosmides chevauchants . Le criblage du même groupe de 20 tumeurs avec des sondes de cette région a permis d'identifier 17 points de cassures sur le chromosome 11. Ils sont répartis, sans agrégation évidente, sur une région de plus de 40 Kb dénommée EWSR2. De manière intéressante, les deux

tumeurs avec une translocation variante et présentant toutes les deux un chromosome 11 cytogénétiquement intact sont altérées dans la région EWSR2; ce qui met en évidence un réarrangement sub-microscopique dans ces tumeurs .

Au niveau moléculaire, les positions des points de cassure dans les tumeurs ES et PN ne démontrent pas une spécificité évidente, suggérant qu'ils ne permettent pas de différencier ces deux cancers très proches .

II - Caraetérisation des σ è n e s impliqués dans la translocation

La région EWSRl est flanquée de trois groupes de sites pour une endonucléase à site de restriction rare. Il apparaît dans les cellules humaines que ces sites sont au moins partiellement non méthylés, ce qui suggère qu'ils font partie d'îlots HTF (Lindsay S, Bird A P, Nature 327, 336-338, (1987)) .

Comme cela a été mis en évidence par hybridation croisée sur de l'ADN de souris et de hamster, la région EWSRl est inclue dans une région phylogénétiquement conservée. Des fragments ont été sélectionnés pour cribler des northern blots préparés à partir d'ARN extrait de 7 tumeurs PNET présentant une translocation t(ll;22), 3 tumeurs ES non caryotypées et plusieurs tissus normaux (poumon, coeur, foie, pancréas, placenta, rein, muscle squelettique) et 4 tumeurs de contrôle ou lignées cellulaires (neuroblastome, phéochromocytome, adenocarcinome du colon, HeLa) .

Un fragment de restriction EcoRl de 3 Kb dénommé 22RR3, centromérique de la région EWSRl, détecte dans tous les échantillons un transcrit de 2,5 Kb et

dans les 10 PNET testés un autre transcrit spécifique de taille variable.

Le même transcrit de 2,5 Kb et non les transcrits spécifiques des tumeurs PNET, est observé avec une sonde télomérique de la région EWSRl (sonde 22RR12) . A l'inverse, une sonde distale de la région EWSR2 du chromosome 11 (sonde 11RR1) donne le résultat opposé en détectant le transcrit spécifique des tumeurs PNET et pas le transcrit de 2,5 Kb. Ces résultats suggèrent fortement la présence dans les tumeurs PNET testées d'un ARN chimère liant ensemble les séquences codées par le chromosome 22 et le chromosome 11. En outre, la sonde 11RR1 montre à l'évidence un transcrit dans les ARN messagers des tissus du poumon, du coeur et du foie, lequel n'est pas observé dans les autres tissus normaux testés.

Des sondes dénommées 22RR3 et 22RR12 ont été utilisées pour cribler une banque d'ADNc humain, et les clones chevauchants hy ridant avec les deux sondes ont été caractérisés . Le clone le plus grand contient 1968 pb dont la phase de lecture ouverte comporte un premier codon ATG se présentant dans le contexte d'une séquence consensus Kozak, il code une protéine de 656 acides aminés dénommée EWS. Une recherche dans des bases de données (NBRF et Swissprot) a révélé que la séquence des 285 premiers acides aminés présente une homologie avec des protéines telles que le glutène, la gliadine, la protéine chorionique S36, 1'annexine VII, les ordéines Bl et C. Toutefois, les plus grandes homologies ont été observées avec le domaine C-terminal de la grosse sous-unité des ARN polymérases II Eucaryote (CTD-polII) .

Ces différentes molécules contiennent un domaine comprenant la répétition d'un peptide de sept résidus d'acides aminés dont la tyrosine et un taux

important de proline et serine. Ce domaine peut adopter une structure secondaire particulière dénommée pro-β

(Matsushima N, Creutz C E, Kretsinger R H, Proteins 7, 125-155, (1990)) . La portion C-terminale de la protéine EWS contient trois régions (300-340, 454-513, 559-640) riches en glycine (46%) , arginine (19%) et proline (13%) qui présente des homologies avec les protéines riches en glycines telles que le collagène, la kératine et les protéines liant les acides nucléiques simples brins.

Une séquence de 85 acides aminés disposée entre la première et la deuxième région est homologue à une séquence rencontrée dans plusieurs protéines liant l'ARN. Ce domaine contient les séquences consensus RNP-1 et RNP-2 (Bandziulis R J, Swanson M S, Dreyfuss G, Gènes Dev. 3, 431-437 (1989)) et a été montré comme le motif de reconnaissance de l'ARN pour la protéine snRNP Ul de 70 Kd (Query C C, Bentley R C, Keene J D, Cell 57, 89- 101 (1989)) . Dans cette région, d'autres marques d'homologies similaires ont été trouvées avec plusieurs protéines liant l'ARN et fonctionnellement caractérisées. Toutefois, le taux le plus élevé d'homologie a été obtenu avec le produit de traduction de l'ADNc du clone pen pl9 de Drosophile, lequel n'a pas de fonction connue et contient des- éléments du type pen répétés (Haynes S R, Rebbert M L, Mozer B A, Forquignon F, Dawid I B, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 84, 1819-1823 (1987) ) .

La sonde dénommée 11RR1 a été utilisée pour retrouver 11 clones se chevauchant issus d'une banque d'ADNc de moelle humaine. Le clone le plus long, dénommé BM025, avec un insert de 2939 pb, contient une phase ouverte de lecture de 1356 pb.

L'analyse de la séquence en acides aminés déduite, révèle une homologie avec des membres de la

famille des gènes Ets. Pour le gène humain Ets-1, cette homologie est proche de 33 % dans le domaine d'activation de la transcription (Gutman A, Wasylyk C, Trends Genêt. 7, 49-54 (1991)) et atteint 70 % pour le domaine de fixation de l'ADN (Karim F D, Urness L D, Thummel C S et al. Gènes Dev. 4, 1451-1453 (1990)) .

L'homologie la plus frappante a été mise en évidence avec le gène Fli-1 de souris pour lequel

1'identité en acides aminés atteint 97 % (Ben-David Y, Giddens E B, Letwin K, Bernstein A, Gènes Dev. 5, 908-

918 (1991) ) .

III - Caractérisât-ion des ARNm chimères codant pour L≤_≤ protéines hybrides

L'hybridation des extrémités 5' des deux ADNc sur les contigs des chromosomes 11 et 22 a montré que les deux gènes sont transcrits dans le sens du centro ère vers le télomère. Le transcrit de fusion vu en northern blots est initialisé sur le chromosome 22 et terminé sur le chromosome 11. Afin d'étudier la jonction des deux gènes, les Inventeurs ont recherché les exons flanquants de manière centromérique la région EWSRl et de manière télomérique la région EWRS2. Deux. fragments génomiques dénommés 22HP.5 et 11RR1 qui s'hybrident respectivement avec les ADNc codant pour les protéines EWS et Hum-Fli- 1 ont été séquences et ont révélé dans chaque cas la présence d'un exon. Des oligonucléotides homologues à ces exons ont été utilisés pour réaliser une transcription réverse et amplifié par PCR les ARN issus de différentes sources .

A la différence des ARN issus de tissus de sein, de neuroblastome (IMR32) , de phéochromocytome, de

lymphome, de carcinome ovarien, tous les ARN issus de 7 tumeurs PNET avec une translocation t(ll;22) et ceux issus de 3 tumeurs ES non-caryotypées permettent l'amplification d'un produit spécifique. Selon la tumeur, trois tailles différentes de produits d'amplification ont été observées dans un premier temps. Leurs séquences révèlent trois types de transcrits de fusion.

Le premier type contient des séquences exoniques présentes dans les fragments 22HP.5 et 11RR1 et une séquence de 174 pb issue de l'exon adjacent le plus centromérque du gène Hum-Fli-1.

Les deuxième et troisième types diffèrent du premier du fait de la présence au niveau du site de jonction de séquences supplémentaires provenant respectivement de la région codante des gènes Ews et Hum-Fli-1. Dans tous les cas, la fusion est en phase, et les protéines chimères résultantes diffèrent de la protéine EWS par la substitution du domaine de fixation de l'ARN, par le domaine de fixation de l'ADN de la protéine HUM-FLI-1 homologue au domaine de la protéine ETS. Une étude similaire réalisée sur environ 40 tumeurs ES et PN a permis de mettre en évidence d'autres types de gènes de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll;22) .

IV - Discussion

La protéine EWS partage à travers sa séquence totale des homologies avec des protéines connues pour interagir avec des acides nucléiques simples brins et plus particulièrement avec l'ARN.

Premièrement, la région C-terminale contient un motif de reconnaissance de l'ARN qui est aussi rencontré dans un groupes de protéines qui participent

au processus post-transcriptionnel de l'ARN (Frankel A D, Mattaj I W, Rio D C, Cell 67, 1041-1046 (1991)) . En outre, dans la protéine Ews ce motif est flanqué par des séquences d'acides aminés riches en glycine. De telles séquences, observées dans plusieurs protéines de fixation de l'ARN, interagissent également avec l'ARN (Kumar A, Casas-Finet J R, Luneau Cj et al, J. Biol. Chem. 265, 17094-17100 (1990) ; Munroe S H, Dong X, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 895-899 (1992)) . Deuxièmement, la région N-terminale de la protéine EWS présente une homologie avec la région CTD-polII. Il a été suggéré que ce domaine interagit avec les facteurs de transcription au niveau du complexe d'initiation (Corden J L, TIBS 15, 383-387 (1990)) . Ces homologies de la protéine EWS suggèrent qu'elle possède deux domaines fonctionnels différents qui participent ensemble au mécanisme d'expression génétique.

La famille des gènes Ets est impliqus à travers différents mécanismes dans les erythroleucémies induites chez la souris et la poule par des rétrovirus . Le premier membre de cette famille a été découvert comme étant un élément génétique co-transduit donnant jour à des protéines hybrides contenant les séquences MYB et ETS-1 (Watson D K, Ascione R, Papas T s, Crit. Rev. Oncogenesis 1, 409-436 (1990)) . Indépendamment, deux autres membres de cette famille, Spi-1 (PU1) et Fli-1, sont activés par 1'intégration rétrovirale de différents souches du virus de la leucémie de Friend (Ben-David Y, Bernstein A, Cell 66, 831-834 (1991)) . Tous les membres de cette famille de protéines ont une région hautement conservée, dénommée domaine ETS (Karim F D, Urness L D, Thummel C S et al; Gènes Dev. 4, 1451-1453 (1990)), dont on a montré dans la plupart des cas qu'il se fixe spécifiquement à des éléments de la région promotrice

riches en purine, et favorise l'activation transcriptionnelle de différents gènes viraux ou cellulaires d'eucaryotes (Gutman A, Wasylyk C, Trends Genêt. 7, 49-54 (1991) ; Lim F, Kraut N, Frampton J, Graf T, EMBO J. 11, 643-652 (1992) ; Hipskind R A, Rao V N, Mueller C G F et al, Nature 354, 531-534, (1991)) . En outre, du côté N-terminal, les protéines ETS-1 et ETS-2 contiennent une région qui favorise la transcription lorsque celle-ci est liée au domaine de fixation de l'ADN de LexA (Wasylyk B, Gutman A, Flores P, Bègue A, Leprince D, Stehelin D, Nature 346, 191-193 (1990)) ou Gal4 (Seneca S, Punyammalee B, Bailly M et al, Oncogene 6, 357-360 (1991) ) .

La plus forte homologie concernant le produit de traduction de Hum-Fli-1 apparaît avec la protéine murine FLI-1 (Ben-David Y, Giddens E B, Letwin K, Bernstein A, Gènes Dev. 5, 908-918 (1991)), une protéine pour laquelle les homologies avec les domaines de fixation de l'ADN et d'activation de la transcription de ETS-1 peuvent être clairement identifiées.

Il a été montré que le site d'insertion rétroviral activant le gène murin Fli-1 est situé à proximité du gène Ets-1 sur le chromosome 9 de la souris. Le site d'insertion est phylogénétiquement conservé et est homologue à une région du chromosome 11 humain proche du gène Ets-1 (Baud V, Lipinski M, Rassart E, Poliquin L, Bergeron D, Genomics 11, 223-224 (1991)) . Sur- la base à la fois de cette homologie et de cette conservation synténique, il est proposé que Hum-Fli-1 représente l'ADNc du gène humain homologue au gène murin Fli-1.

Le clonage des points de cassure des translocations chromosomiques récurrentes somatiquement acquises a éclairé deux mécanismes majeurs de cancérisation : la dérégulation de l'expression d'un

gène et la génération de protéines de fusion (Solomon E, Borrow J, Goddard A D, Science 254, 1153-1160; (1991) ) .

La translocation décrite dans 1'exposé de l'Invention résulte clairement de la fusion de deux gènes qui appartiennent à des familles jusqu'alors non impliquées dans la carcinogénèse humaine : la famille ETS des protéines se fixant à l'ADN et la famille des protéines se fixant à l'ARN. Du fait que la translocation est réciproque sans perte apparente de matériel génétique, sur chacun des deux chromosomes dérivés, l'extrémité 5' du gène est juxtaposée à l'extrémité 3' de l'autre gène.

Le gène chimère généré sur le der (11) n'est pas exprimé à un niveau suffisant pour être mesuré en northern blots et ne semble pas être impliqué dans le phénotype tumoral puisque le der (11) peut occasionnellement être perdu dans les tumeurs ES (Turc- Carel C, Philip I, Berger M P, Philip T, Lenoir G M, Cancer Genêt. Cytogenet. 12, 1-19 (1984) ; Douglass E C, Valentine M, Green A A, Hayes F A, Thompson E i, J. N. C. I. 77, 1211-1213 (1986)) . Au contraire, l'hybride transcrit généré par le der(22) est visible en northern blots bien que son niveau intracellulaire semble diminuer en comparaison avec le transcrit normal du gène Ews codé par le chromosome 22. Cette différence pourrait être due à une instabilité conférée par une longue séquence 3' non codante riche en AT (Brawerman G, Cell 57, 9-10 (1989) ) , telle que celle rencontrée dans le transcrit Hum-Fli-1. La translocation t (11,-22) a deux conséquences directes :

- Premièrement, elle place l'expression du domaine de fixation de l'ADN, HUM-FL-1, sous le contrôle d'un promoteur ectopique, le promoteur Ews, dont il a été montré par hybridation en northern blot, qu'il ne

partage pas la spécificité de tissus du promoteur Hum- Fli-1.

- Deuxièmement, la translocation substitue le domaine de fixation de l'ADN, HUM-FLI-1, par un domaine de fixation de l'ARN et le relie par la même chaîne polypeptidique à un domaine qui présente une homologie avec la CTD-polII .

L'implication constante de la bande 22ql2 et plus précisément de la région EWSRl dans les tumeurs ES et PN. indique que ce dernier domaine joue un rôle essentiel dans le processus de cancerisation. La structure de la protéine chimère indique que ce rôle est probablement mis en oeuvre via l'altération de la régulation de transcription des gènes cibles de Hum- Fli-1.

Par analogie avec le mode d'action de la CTD-polII (Peterson C L, Krugen W, Herskowitz I, Cell 64, 1135-1143 (1991)), la protéine chimère peut gêner fonctionnellement les éléments de régulation négatifs contrôlant la transcription. Un exemple possible d'une telle altération pourrait être l'antigène MIC2, lequel est spécifiquement surexprimé dans les tumeurs PNET présentant une translocation t(ll;22) (Ambros I M, Ambros P F, Strehl S et al, Cancer 67, 1886-1893 (1991) ; Garin-Chesa P, Fellinger E J, Huvos A G et al, Am. J. Pathol. 139, 275-286 (1991)) .

L'implication dans une tumeur solide d'un gène du type Ets indique que le rôle de la famille des protéines ETS dans le processus de cancerisation n'est pas limité aux cancers hématologiques . Dans le cas des érythroleucémies, dans lesquelles cette famille est impliquée, un phénotype hautement transformé est associé à d'autres altérations, intervenant soit par cotransduction des séquences Myb, soit par une

altération du gène TP53 (Ben-David Y, Bernstein A, Cell

66, 831-834 (1991)) .

Dans le cas du Sarcome d'Ewing, outre la translocation t(ll;22) , d'autres d'aberrations chromosomiques récurrentes incluant une translocation t(lql6p) non compensée ont été décrites (Douglass E C,

Valentine M, Green A A, Hayes F A, Thompson E i, J. N.

C. I. 77, 1211-1213 (1986) ; Mugneret F, Lizard S,

Aurias A, Turc-Carel C, Cancer Genêt. Cytogenet. 30, 239-245 (1988) ) . Leur contribution au phénotype tumoral reste à évaluer.

Les analyses de caryotypes démontrant la présence d'une translocation t(ll;22) dans les tumeurs à petites cellules rondes ont été utilisées pendant plusieurs années comme un critère de diagnostic des tumeurs ES et PN. Deux nouvelles approches pour un diagnostic sont maintenant disponibles :

- la première repose sur le fait que la petite taille de la région EWSRl autorise une détection simple des réarrangements génomiques par la technique de Southern;

- la seconde repose sur une transcription réverse et une amplification génique par PCR et fourni une méthode sensible pour montrer la présence de transcrits de fusion dans les tumeurs et dans leurs sites métastasiques potentiels.

Il est à présent possible d'obtenir des indications sur la fréquence et la spécificité des altérations Ews et Hum-Fli-1 dans les tumeurs humaines, et plus particulièrement dans celles présentant des aberrations cytogénétiques 22ql2 et/ou llq24 (Whang-Peng J, Fréter C E, Knutsen T, Nanfro J J, Gazdar a, Cancer Genêt. Cytogenet. 29, 155-157 (1987) ; De Chadarevian J P, Vekemans M, Seemayer T A, N. Engl. J. Med. 311, 1702- 1703, (1984) ; Cavazzana A O, Navarro S, Noguera R et

al, Adv. Neuroblastoma Res . 2,463-473 (1988) ; Vigfusson N V, Allen L J, Philip J H, Alschibaja T, Riches W G, Cancer Genêt. Cytogenet. 22, 211-218 (1986) ; Aurias A, Rimbaut C, Buffe C, Dubousset J, Mazabraud A, N. Engl. J. Med. 309, 496-497 (1983) ; Turc-Carel C, Philip I, Berger M P, Philip T, Lenoir G M, N. Engl. J. Med. 309, 497-498, (1983) ; Whang Peng J, Triche T J, Knutsen T, Miser J, Douglass E C, Israël M A, N. Engl. J. Med. 311, 584-585 (1984) ; Turc-Carel C, Aurias A, Mugneret F et al, Cancer Genêt. Cytogenet. 32, 229-238 (1988)) ; Turc- Carel C, Dal Cin P, Rao U, Karakousis C, Sandberg A, Cancer Genêt. Cytogenet. 30, 145-150 (1988) ; Shen W P V, Young R F, Walter B N, Choi B H, Smith M J, Katz J, Cancer Genêt. Cytogenet. 45, 207-217 (1990) ; Trent J M, Kaneko Y, Mitelman F, Cytogenet. Cell Genêt. 51, 533-562 (1989) ) .

L'hypothèse d'une relation entre Ews et un défaut génétique héréditaire responsable de la Neurofibromatose de type II, qui a été localisé dans la même région 22ql2 (Rouleau G A, Seizinger B R, Wertelecki W et al., Am. J. Hum. Genêt. 46, 323-328 (1990)) peut également être examinée.

V - Description des fiςrures

FIGURE 1

1) Résultats

La figure 1 représente la carte de la région EWSRl sur le chromosome 22 .

- En A est représentée de manière schématique une partie du contig résultant de l'expansion du locus Cos5/Cos6 identifié par hybridation différentielle Alu-PCR (Zucman J, Delattre O, Desmaze C,

Aza buja C, Rouleau G, De Jong P, Aurias A, Thomas G, Genomics, sous presse) .

La position du contig est indiquée en rapport avec différents autres loci proches . Les cosmides B6 et G9 recouvrent les points de cassure de

A3EW2-3B et ALU 6, deux cellules somatiques hybrides qui contiennent le der (11) respectivement des tumeurs ES et

PN (Geurts van Kessel A H M, Turc-Carel C, Klein A de et al, Mol . Cel . Biol . 5 , 427-429 ( 1985 ) ; Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6 , 174-177

(1990) ) .

- En B est représentée la carte de restriction EcoRl d'un fragment de 100 Kb centré autour de la région EWSRl. La position de trois régions de dinucléotides CpG est indiquée : CpGl contient 3 sites SacII, 3 sites BssHII et 1 site MluI; CpG2A contient 3 sites SacII, 3 sites BssHII; CpG2B contient 3 sites BssH2, 3 sites SacII et 1 site Notl.

- En C est représentée une carte de restriction détaillée de la région EWSRl sur laquelle les sites PstI sont marqués (P) , les sites BamHI sont marqués (B) , les sites Xbal sont marqués (X) et les sites EcoRI sont marqués (R) . Les flèches verticales indiquent les fragments de restriction réarrangés dans chacune des 20 tumeurs testées.

2) Méthode a) Une banque spécifique du chromosome 22, LL22NC01 construite à partir de vecteur cosmidique Lawrist 5 a été utilisée pour mener les expériences sur le chromosome 22. Les fragments terminaux où l'insert entier ont été marqués par random priming en utilisant un dCTP marqué en alpha par le ³² P. Les séquences humaines répétitives et les vecteurs contaminant

résiduels ont été inhibés avec un large excès d'ADN humain total et de vecteurs d'ADN.

La sonde préincubée a été alors utilisée pour cribler la banque selon les procédures standards et les cosmides chevauchants ont été identifiés. b) Les échantillons de tumeurs ont été récupérés immédiatement après opération.

Un fragment a été utilisé pour l'analyse de caryotype : - les tumeurs T2 à Tll présentent une translocation t (11;22) (q2 ;ql2) typique;

- la tumeur T12 présente une translocation complexe t (10; 11;22;12) (q22;q24;ql2;q24) ;

- la tumeur T13 présente une variante de translocation t (14;22) (q32;ql2) ;

- la tumeur T14 présente une variante de translocation t(7;22) (q35;ql2);

- la tumeur T15 présente une translocation complexe t(ll;ll;22) (ql3;q24;ql2) . L'analyse des carayotypes des tumeurs 16 à

19 n'a pas été réalisée et la tumeur T20 présente uniquement des metaphases normales. L'analyse en FISH bi-couleur sur noyaux interphasiques des tumeurs T17 et T19 montre l'apparition d'un point de cassure dans la bande 22ql2 (Desmaze C, Zucman J, Delattre O, Thomas G, Aurias A, Gènes Chr. Cancer, sous presse) .

La tumeur Tl correspond à la lignée cellulaire hybride A3EW2. La lignée cellulaire hybride Alu6 est issue de la tumeur T8. Les tumeurs T7 à T13 sont des tumeurs PN; toutes les autres tumeurs ont été diagnostiquées Sarcome d'Ewing. L'ADN des échantillons de sang (N) et d'échantillons de tumeurs (T) a été digéré avec l'enzyme PstI et analysé selon la méthode de Southern avec la sonde 5.5-sac.

FIGURE 2

Cette figure représente la détection de bandes réarrangées dans des tumeurs; plus particulièrement, la détection de fragments genomiques anormaux dans 6 tumeurs. Le numéro de la tumeur est indiqué en haut des bandes. Les échantillons d'ADN provenant de sang des patients porteurs des tumeurs T16 et T18 sont indiqués par (N) . Dans chaque cas, le fragment correspondant à la jonction réarrangée est indiqué par une flèche horizontale.

f GURE g

1) Résultats

La figure 3 représente la carte de restriction des régions impliquées dans la translocation chromosomique t (11;22) (q24;ql2) ; les régions normales (22N) et (UN) et les deux dérivés 11 et 22 de la translocation t(l;22) , der (11) et der (22) sont représentées pour la tumeur Tll.

La double ligne représente le chromosome 11, la ligne épaisse représente le chromosome 22.

Dans les dérivés der(ll) et der (22), la simple ligne entre les parties des- chromosome 11 et 22 représente le fragment de fusion EcoRl. EWSRl et EWSR2 représente la région la plus petite qui contient tous les points de cassures identifiés respectivement sur le chromosome 22 et le chromosome 11. Les flèches verticales indiquent la position des fragments réarrangés EcoRl identifiés dans 17 tumeurs .

Les abréviations désignant les tumeurs sont identiques à celles utilisées à la Figure 1.

Enfin, les positions des sondes 22RR3, 22RR12, 22HP.5 et 11RR1 sont indiquées.

2 ) Méthodes

Un linker Xhol a été inséré au niveau du site BamHI d'un vecteur SuperCos commercialisé par la Société Stratagene. L'extrémité 3' de l'ADN partiellement digéré par Mbol d'une lignée cellulaire ICB 104 dérivée de la tumeur Tll (Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174-177 (1990) ), a été partiellement comblé avec des dGTP et dATP . Les fragments de haut poids moléculaire ont été purifiés sur gel et lié au site Xhol du vecteur SuperCos modifié et comblé partiellement avec des dTTP et dCTP . Après conditionnement avec le kit Gigapack Gold de la Société Stratagene, les virions ont été utilisés pour infecter la souche d'E. coli DH5 alpha MCR.

La banque obtenue de 4.10 ⁵ cosmides indépendants a été criblée avec les sondes 22RR3 et 22RR12. Les groupes de clones chevauchants contenant soit une région EWSRl non altérée (22N) ou le fragment de jonction du dérivé 22 de la translocation, der(22), ou du dérivé 11 de la translocation, der (11), ont été identifiés. La sonde 11RR1 a permis de retrouver un cosmide, lequel par hybridation fluorescente in situ sur chromosome est montré comme provenant de la bande llq24. Ce cosmide a été utilisé pour étendre la locus sur le chromosome 11 normal.

Fiςrure 4

Cette Figure montre la détection en Northern blots de transcrits anormaux dans le Sarcome d'Ewing ou des lignées cellulaires.

Le même northern blot contenant 1 μg d'ARNm polyadénylé provenant des tumeurs T19, Tll, T8 et T18 ou de la lignée de neuroblastome IMR32 a été successivement

hybride avec les sondes 22RR3 , 22RR12 et 11RR1 . N représente le transcrit normal du gène Ews , R représente les transcrits de fusion .

Selon la tumeur, les tailles des transcrits anormaux sont sensiblement différentes . Les mêmes transcrits anormaux sont détectés à la fois avec la sonde 22RR3 et la sonde 11RR1 , ce qui indique que la translocation donne lieu à la synthèse d' un transcrit chimère .

FIGURE 5

1) Résultats

Cette figure représente la détection par transcription réverse et PCR de trois types de transcrits chimères .

M est un marqueur de taille . Breast correspond à un tissu de sein; OVARY correspond à un carcinome ovarien; IMR32 correspond à une lignée cellulaire de neuroblastomes . Les abréviations désignant les patients sont identiques à ceux de la figure 1.

Les trois types de transcrits décrits à la figure 9 ci-après sont indiqués 1, 2, 3 par une flèche .

2) Méthode

L'oligonucléotide 11A de formule suivante : 5' AGAAGGGTACTTGTACATGG 3' a été utilisé comme amorce pour la transcription réverse de 1 μg d'ARN total en utilisant un kit de PCR Gen Amp RNA de la Société Cetus. L'ADNc résultant a été soumis à 30 cycles d'amplification par PCR avec les amorces 11.3 et 22.3 respectivement de formules suivantes :

5* ACTCCCCGTTGGTCCCCTCC 3' 5' TCCTACAGCCAAGCTCCAAGTC 3'

Chaque cycle comprenant une étape de dénaturation à 90°C pendant 30 secondes, puis à 65°C pendant 1 minute, une étape d'extension à 72°C pendant 2 minutes. Le fragment amplifié a été identifié par électrophorèse sur gel et révélé au bromure d'éthidium.

FIGURE 6

1) Résultats Cette figure représente la séquence nucleotidique de l'ADNc contenant la région codante entière et l'extrémité 3' non transcrite du gène Ews; Ainsi que la séquence en acides aminés déduites de cet ADNc codon par codon. Ces séquences sont numérotées sur la gauche.

Deux signaux de polyadénylation, l'un commençant au nucléotide 2143 et l'autre au nucléotide 2332 sont soulignés .

Le premier codon de la méthionine est localisé avec une purine (A) en position -3 et une guanosine (G) en position +4 en accord avec la séquence consensus Kozak.

2) Méthode Les sondes 22RR3 et 22RR12 ont été utilisées pour cribler une banque d'ADNc de cerveau foetal humain

(Stratagene cat . n° 936206) et ont permis d'identifier un clone qui a été dénommé BF1AC5. La sonde 11RR1 a été utilisée pour cribler une banque d'ADNc de moelle humaine (Clontech cat. n° HL1058) et a permis d'identifier un clone qui a été dénommé BM025. Un million de clones ont été mis sur plaques et criblés dans chaque banque. Les fragments d'ADN sous-clonés dans les phages Ml3mpl8 ou M13mpl9 ont été utilisés comme matrices pour déterminer les séquences nucléotidiques en

utilisant la méthode de terminaison de chaîne didéoxy et soit une polymérase T7 modifiée, soit la taq polymérase commercialisée par la Société Amersham. Les séquences d'ADNc de 2372 pb et 2939 pb des clones BF1AC5 et BM025 ont été déterminées sur les brins des sous-clones chevauchant, en utilisant soit l'amorce M13, soit des amorces du commerce. Il a été montré qu'ils contiennent la séquence codante entière des gènes Ews et Hum-Fli-1. Le séquençage direct des produits d'amplification PCR a été effectué avec un Sequenase commercialisé par la Société USB après 30 cycles d'amplification asymétrique avec soit l'amorce 11.3, soit l'amorce 22.3, puis purification à travers une membrane Centricon 100 commercialisé par la Société Amicon.

FIGURE 7

Cette figure représente l'ADNc du gène Hum-Fli-1.

FIgϋRE 8

La figure 8 représente la séquence nucleotidique de l'ADNc de fusion -obtenue par réverse transcription et amplification par PCR du transcrit de fusion de type 1.

La séquence homologue (à l'extrémité 5') ou complémentaire (à l'extrémité 3') aux amorces utilisées pour l'amplification par PCR sont soulignées. La ligne verticale indique la jonction entre les deux gènes qui se présentent entre la première et la seconde position du codon 265 du gène Ews et entre les mêmes positions du codon 219 du gène Hum-Fli-1.

FTSUfiE 9

Cette figure représente les différentes domaines de la protéine EWS codée par le gène Ews . - en A, sont représentés les différents domaines peptidiques . La région hachurée représente les 270 premiers acides aminés contenant une forte proportion de tyrosine, glutamine, serine, thréonine, glycine, alanine et proline, lesquels représentent ensemble environ 90% de tous les résidus . Dans cette région, la plupart des tyrosines sont présentes tous les 5 à 9 résidus et définissent un motif dégénéré répété 31 fois. Après la tyrosine, les résidus les plus récurrents dans la répétition sont une serine en position -1 (50%) , une glycine en position +1 (50%) , et deux glutamines enpositions +2 et +3 (respectivement 70% et 40%) . Cette partie de la molécule présente une homologie avec la CTD-polII.

Les trois zones ombrées correspondent à des régions riches en glycine, arginine et proline.

La zone marquée "RNA BD" représente un domaine supposé de fixation de l'ARN, lequel est exposé en B .

Les flèches indiquent la position du point de jonction Hum-Fli-1 pour les trois types différents de protéines chimères telles que déduites par transcription réverse et amplification par PCR exposées précédemment .

- en B, on montre les alignements les plus significatifs de la protéine EWS dans la région supposée de fixation de l'ARN. Dpen pi9 pou le clone pen pi9 de Drosophile (Haynes S R, Rebbert M L, Mozert B A, Forquignon F, Dawid I B, Proc. Natl . Acad. Sci. USA 84, 1819-1823 (1987)) ; H nucl pour nucléoline humaine (Srivastava M, McBride 0 W, Flemming P J, Pollard H B, Burns A L, J. Biol . Chem. 265, 14922-14931 (1990));

HsnRNP Ul pour snRNP Ul humaine de 70 Kd (Spritz R A,

Strunk K, Surowy C S, Hoch S O, Barton D E, Francke U,

Nuclei. Acid. Res. 15, 10173-10391 (1987)); HhnRNP Al et

Bl pour hnRNP humaine Al (Biiamonti G, Buvoli M, Bassi M T, Morandi C, Cobianchi F, Riva S, J. Mol. Biol. 207,

491-503 (1988)) et Bl (Burd C G, Swanson M S, Goerlach

M, Dreyfuss G, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 9788-9792

(1989)); HPABP pour protéine de fixation poly(A) humaine

(Grange T, Martin de sa C, Oddos J, Pictet R, Nue. Acids Res. 15, 4771-4787 (1987)) .#2, #3 and #4 se rapportent à différents domaine de fixation de l'ARN au sein de la même protéine. Les positions invariables parmi ces protéines sont ombrées et les substitutions minimums entre EWS et au moins 4 des 6 protéines sont indiquées en caractères gras.

Les domaines I à IV ont été décrits par Query C C, Bentley R C, Keene J D, Cell 57, 89-101 (1989) . RNP-1 et RNP-2 se rapportent aux motifs consensus commentés par Brandzilius R J, Swanson M S, Dreyfuss G, Gènes Dev. 3, 431-437 (1989) . A la droite de la Figure 8 B, il est indiqué par "Identities" le pourcentage de résidus identiques entre EWS et chacun des domaines de fixation d'ARN considérés. Il est en outre indiqué du côté C-terminal la présence d'une région riche en résidu glycine (GR) et d'un domaine basique (Basic D) .

FIGURE 10

Cette figure représente de manière schématique les protéines codées par le gène Ews normal (EWS) , le gène Hum-Fli-1 normal (Hum-Fli-1) , et leurs gènes de fusion (EWS/Hum-Fli-1 type 1, 2 et 3) .

Dans les trois types de protéines chimères, la portion C terminale de EWS contenant le domaine

supposé de fixation de l'ARN (désigné RNA BD) est remplacée par la partie C-terminale du gène Hum-Fli-1 contenant le domaine ETS (désigné ETS D) . La protéine chimère de type 1 est entièrement représentée sur la figure; les protéines de type 2 ou 3 peuvent être déduites de celle de type 1 par l'insertion de 84 ou 22 acides aminés supplémentaires provenant respectivement de EWS ou Hum-Fli-1. Les positions des codons interrompus sont indiqués dans tous les cas .

FIGURES 11. 12. JL 1A. IS «fc 16

La figure 11 représente la carte de restriction des gènes Ews et Hum-Fli-1 au niveau de leur région de cassure EWSRl et EWSR2. La position des exons est indiquée par rapport aux sites de restrictions. Les cadres ouverts de lecture sont divisés par les différents exons; chaque intron entre deux exons codant interrompt le cadre ouvert de lecture suivant une des trois phases : A, B ou C.

La figure 12 représente la structure exonique du gène Ews .

Il a été en outre possible de séquencer la totalité des jonctions introns-exons pour ce gène, comme représenté figure 12.

La figure 13 représente la structure exonique du gène Hum-Fli-1.

Il a été en outre possible de séquencer la majorité des jonctions introns-exons pour ce gène, comme représenté figure 13.

Il est donc possible à partir de ces informations de prévoir la multiplicité des produits de fusions possibles des deux gènes . Un nombre important de produits de fusion juxtaposant ces exons ont été

observés par transcription reverse puis amplification génique par PCR.

La figure 14 représente les juxtapositions d'exons des gènes Ews et Hum-Fli-1 et les séquences de jonction des transcrits de fusion en résultant. A gauche de la figure 14, il est indiqué schématiquement les exons de Ews (cases hachurés) et les exons de Hum-Flli-1 (case pleine) impliqués dans la juxtaposition, à droite de la figure 14 sont indiqués les séquences de jonction des transcrits de fusion correspondant aux juxtapositions symbolisées à gauche de ladite figure, avec le nombre de cas observés.

La figure 15 représente, selon une nomenclature identique à celle de la figure 14, un cas observé de juxtaposition concernant l'exon 8 de Ews et l'exon 7 de .Hum-Fli-1, entre lesquels s'est intercalé une séquence d'origine inconnue (Alien séquence) .

La figure 16 représente, selon une nomenclature identique à celle des figures 14 et 15, quatre cas chez lesquels il a été observé deux transcrits de fusion différents juxtaposant une série d'exons de Ews à une série d'exons de Hum-Fli-1; ceci étant vraissemblablement le résultat d'epissages alternatifs. Dans les séquences de fusion à doite de la figure, les (*) indique dans la séquence du produit de traduction un codon stop.

Fiςrure 17

Cette figure représente la séquence de la région promotrice du gène Ews .

EXEMPLE 2 : ETUDE DE LA TRANS LOCA ION

CHROMOSOMIOUE RECURRENTE t (21:22) ASSOCIEE AU

SARCOME D ' E ING

La figure 18 représente, selon une nomenclature identique à celle des figures 14, 15 et 16, les séquences de jonction de quatre transcrits de fusion correspondants à 5 cas observés, juxtaposant l'exon 7 du gène Ews avec les exons supposés 6, 8 et 9 du gène Erg, et l'exon 10 de Ews avec l'exon supposé 6 de Erg.

EXEMPLE 3 : ETUDE DE LA TRANSLOCATION

CHROMOSOMIOUE RECURRENTE t(12:22) ASSOCIEE AU

MELANOME MALIN DES PARTIES MOLLES (MMSP.

I - Description des figures

Les figures 19 et 20 représentent le réarrangement du gène Ews dans la lignéee cellulaire SU- CCS-1 de MMSP.

La figure 19 représente la carte de restriction de la région EWSRl et indique la position des sondes utilisées et les positions déduites du point de cassure du chromosome 22 dans la tumeur Sten-1 et dans la lignée cellulaire SU-CCS-1.

La partie (a) de la figure 20 représente l'analyse par la technique de Southern blot de l'ADN de Control et de celui de la lignée SU-CCS-1 doublement digérés par EcoRl et PstI et hybrides avec la sonde RR2 issue de EWSRl; dans cette figure, N indique la bande normale et R la bande correspondant au réarrangement .

La partie (b) de la figure 20 représente la détection en northern blot d'un transcrit anormal avec la sonde EWS-5 ' EB définie par le fragment 5' EcoRl/BamHl de l'ADNc du gène Ews; les ARN extraits

d'une lignée cellulaire Hela et d'une lignée cellulaire de gliome ont été utilisés comme témoins; N indique le Transcrit normal du gène EWS et R indique un transcrit additionnel. La partie (c) de la figure 20 représente l'analyse des produits amplifiés obtenus à la dernière étape de la procédure RACE; comparé à l'ARN de contrôle, lequel a été utilisé pour promouvoir l'amplification à partir du transcrit EWS normal (EWS), l'ARN extrait de SU-CCS-1 présente un fragment amplifié supplémentaire qui a été montré comme défivant du transcrit de fusion (Fusion) .

Les figures 21 et 22 se rapporte à l'identification du transcrit de fusion EWS/ATF-1 dans les tumeurs et lignées cellulaires MMSP.

La figure 21 représente la détection par PCR-reverse transcriptase du transcrit chimère. Après reverse transcription de l'ARN total, de la lignée SU- CCS-1, des tumeurs MMSP Sten-1 et 5852/88 et d'une lignée cellulaire Hela, la PCR a été réalisée les amorces 22.1 et ATF—1.1, correspondant respectivement à l'exon 7 du gène Ews, et à la région 3' on traduite de ATF-1. L'analyse des produits amplifiés a été réalisée sur un gel d'agarose 1% (contrôle : aucun ARN) . La figure 22 représente la séquence du fragment d'ADNc de 954 pb obtenu par PCR-reverse transcriptase du transrit résultant de la fusion des gènes Ews et Atf-1. Les séquences .identiques (à la région 5 ' ) ou complémentaires (à la région 3 ' ) aux amorces utilisées pour l'amplification sont soulignées dans la figure. La ligne vertical indique la jonction entre les deux gènes, laquelle intervient entre la seconde et la troisième position du codon 325 et entre les mêmes positions du codon 65 du gène Atf-1. La contribution de la séquence du gène Ews est indiquée en

caractères gras. La position de 1 'oligonucléotide spécifique du gène Ews utilisé dans la procédure RACE est indiquée et soulignée.

Les figures 23 et 24 représentent la jonction des transcrits chimères et donne une représentation schématique des protéines qui en sont déduites .

La figure 23 représente la séquence partielle de l'ADNc des gènes Ews et Atf-1, et de leurs transcrits hybrides dans les régions de jonction, mettant en évidence les cadres ouvert et fermé de jonction respectivement pour le transcrit hybride Ews/Atf-1 depuis le der (22), et pour le transcrit Atf- 1/Ews depuis le der (12) . La figure 24 représente les produits de traduction correspondant aux 4 ADNc indiqués à la figure 22. Dans la protéine chimère EWS/ATF-1, la portion C- Terminal de EWS contenant deux des trois régions riches en glycine (régions ombrées) et le domaine homologue de fixation de l'ARN (RNA-BD) sont remplacés par la partie C-terminale de ATF-1 contenant le domaine de base de fixation de l'ADN et les quatre heptamères leucine définissant ensemble le domaine bZIP.

Le produit réciproque est indiqué par ATF- 1/EWS et est codé par le chromosome der (12) . Le site de reconnaissance consensus pour la phosphorylation par la pritéine kinase A (acides aminés 60 à 63) est indiqué par PKA; NTD-EWS indique le domaine N-terminal de EWS .

il - Méthode

1) Tumeurs et lignées cellulaires

La lignée cellulaire SU-CCS a été préparée à partir d'une effusion pluerale de MMSP (Epstein L, Martin A O, Kempson R, Cancer Res. 44, 1265-1274, 1984) . L'analyse cytogénétique a révélé un caryotype complexe prészentant une unique copie normal des chromosomes 12 et 22. La lignée cellulaire a été cultivée comme initialement décrit . Les fragments congelés des tumeurs primaires de MMSP, Sten-1 (Stenman G, Kindblom L-G, Angervall L, Gènes Chrorr Cancer 4, 122-127, 1992), W9150 (Speleman F, Colpaert C, Goovaerts G, Leroy J G, Van Marck E, Cancer Genêt. Cytogenet. 58, 176-179, 1992) et 5852/88 (Fletcher A A, Gènes Chrom. Cancer 5, 184, 1992), ont été collectés et gardés au maitenus congelés à -80° Celsius jusqu'à leur utilisation. Toutes les tumeurs primitives ont été préalablement caractérisées cytogenetiquement et possèdent toutes une translocation t(12;22) (ql3;ql2) . L'extraction de l'ADN et de l'ARN ainsi que les Southern et nothern blot ont été réalisés conformément aux procédures standards (Maniatis T, Fritsh E F, Sambrook J, J. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) .

2) Sondes

Les sondes genomiques sont représentées à la f igure 19 , Les sondes d ' ADNc s ont les suivantes :

- EWS 5 ' EB est la région codante de 0, 8 Kb de l 'ADNc de EWS se finissant en un site BamHl ;

- EWS 3 ' XE est la dernière région codante de 0, 85 Kb commençant au site Xbal;

- La sonde ATF-1 3 ' a été préparé par PCR et s ' étend du nucléotide 754 au nucléotide 955 de la figure 17 .

3) Procédure d'amplification génique par PCR

L'ensemble des réactions PCR ont été réalisées dans 30 micolitres avec le kit AmpTAQ commercialisé par la Société Cetus, et en utilisant un cycleur commercialisé par la Société Perkin Elmer. Sauf indication contraire, 30 cycles ont été réalisés avec les paramètres suivants : - étape de dénaturation : 94° Celsius pendant 30 secondes;

- température de chauffage : comme indiqué spécifiquement pour chaque cas pendant 60 secondes

- élongation : à 72° Celsisus pendant 120 secondes.

Les produits amplifiés ont été analysés sur gels d'agarose TBE 1%.

Les séquences des différentes amorces utilisées dans les procédures RACE et RT sont rapportés ci-dessous :

A3'NV 5 'ATCGTTGAGACTCGTACCAGCAGAGTCACGAGAGAGACTACACGGT ACTGGTTTTTTTTTTTTTT 3 '

22.1 5 'CCCACTAGTTACCCACCCCA 3*

A 3 '-4 5 'CGTTGAGACTCGTACCAGCAG 3 ' 22.3 5 'TCCTACAGCCAAGCTCCAAGTC 3•' ^' 3'-5 5 'TACCAGCAGAGTCACGAGAGAG 3'

22.7 5'AACAGAGCAGCAGCTACGGGCA 3'

A 3'-6 5 'CGAGAGAGACTACACGGTACTGG 3'

ATF-1.1 5'AAAACTCCACTAGGAAATCCATTT 3' ATF-1.3 5 'CTGGGAGGGGGGAGTGGAAG 3'

22.4 5*GGGCCGATCTCTGCGCTCCT 3'

4) Procédure RACE

Un microgramme de polyA et d'ARN polyA de la lignée cellulaire SU-CCS-1 a été dénaturé pendant 10 minutes à 80° Celsius et transcrit en utilisant le kit PCR Gen AmpRNA commercialisé par la Société Cetus. La transcription reverse initial a été effectuée dans 2à microlitres en utilisant l'amorce A3'NV. L'incubation à 42° Celsius pendant 45 minutes a été suivie par 5 minutes à 94° Celsius . Un aliquot de 2 microlitres de l'ADNc résultant a été amplifié par PCR en utilisant une procédure à 3 étapes impliquant des oligonucléotides chevauchant. La première étape a mis en oeuvre les amorces 22.1 et A3 '-4 dans 20 cycles (température d'association 64°C) . Vingt microlitres ont été analysés sur un gel d'agarose 1% à faible point de fusion. La portion du gel contenant les produits amplifiés d'environ 1,5 à 2,5 Kb a été collecté, fondue à 68° Celsius, et diluée dans un volume égal de tampon TE. Un microlitre a été soumis à une amplification par PCR

(température d'association 66°C) en utilisant les amorces 22.3 et A3 '-5. L'analyse des 20 microlitres sur un gel d'agarose 1% à faible point de fusion a révélé deux bandes. En vue d'une caractéristion ultérieure, chaque bande a été dcoupée du gel,- diluée au 1/1000 dans un tampon TE, et un microlitre a été amplifié par PCR (température d'association 67°C) en utilisant les amorces 22.7 et A3'-6.

5) Analyse RT-PCR des transcrits du MMSP

Un microgramme de l'ARN total a été reverse transcrit en utilisant comme amorce un oligo-dT et le kit PCR Gen Amp RNA de la Société Cetus, selon les

conditions décrites par le fabriquant. L'ADNc obtenu a été soumis à trois amplification PCR différentes :

- les produits amplifiés correspondant aux transcrits Ews/Atf-1 ont été obtenus avec les amorces 22.1 et ATF-1.1 (température d'association 60°C) ,

-les produits amplifiés correspondant au transcrit Atf-1 normal ont été obtenus avec les amorces ATF-1.3 et ATF-1.1 (température d'association 60°C) ,

- les produits amplifiés correspondant aux transcrits Atf-1/Ews ont été obtenus avec les amorces

ATF-1.3 et 22.4 (température d'association 65°C) .

6) Séquencaαe

Les produits de la PCR ont été sous-clonés dans les phages M13mpl8 et M13mpl9. Dans chaque cas, trois clones indépendants ont été entirement séquences avec Kit Taq polymérase de la Société Applied Biosystems, en utilisant des didéoxynucléotides et des amorces fluorescentes .Les séquences de réaction ont été analysées sur un séquenceur automatique de la Société Applied Biosystems .

7) Etude de l'hybridation in situ par fluorescence (FISH)

La librairie de cosmides genomiques construite à partir de la lignée cellulaire ICB 104 et décrite par Zucman et al. (Zucman J, Delattre O, Desmaze C, Plougastel B, Joubert I, Melot T, Peter M, De Jong P, Rouleau G, Aurias A, Thomas G, Gènes Chrom. Cancer 5, 271-277, 1992) a été criblée avec la partie Atf-1 du transcrit de fusion Ews/Atf-1, et les cosmides CCS2.2, F7 et G9 correspondant respectivement à la région 3 ' et à la région 5' de Ews. Des analyses FISH monocouleur et

bicouleur ont été réalisées comme décrit par Desmaze et al. (Desmaze C, Zucman J, Delattre O, Thomas G, Aurias A, Gènes Chrom. Cancer 5, 30-34, 1992) .

III - Résultats

1) Altération de la protéine EWS dans le MMSP

L'ADN a été extrait d'une tumeur primaire de MMSP, dénommée Sten-1, présentant une translocation t(ll;22) caractéristique (Stenman G, Kindblom L-G, Angervall L, Gènes Chrom. Cancer 4, 122-127, 1992), et d'une lignée cellulaire dénommée SU-CCS-1 présentant un caryotype complexe contenant un chromosome 12 anormal (Epstein L, Martin A O, Kempson R, Cancer Res. 44, 1265- 1274, 1984) . Les ADN ont été criblés avec des sondes issues de EWSRl. Des fragments anormaux ont été mis mis en évidence avec les sondes PR.8 pour Sten-1 et RR2 pour SU-CCS-1 (comme montré figure 19) . Cependant des ADN apparis normaux de tissus normaux n'ont pas été accessible, ces bandes anormales, qui n'ont jamais été observées avec l'ADN extrait de tissus normaux, suggère fortement des réarrangement somatiquement acquis (comme montré figure 16°. Les ARN issus de Sten-1, SU-CCS-1, et de la tumeur MMSP primaire 5852/88 (Fletcher J A, Gènes Chrom. Cancer 5, 184, 1192) ont été caractérisés par northern blots avec les extrémités 3' et 5' de l'ADNc du gène Ews. Le transcrit normal de 2,5 Kb du gène Ews a été mis en évidence avec les deux sondes. Cependant, dans les trois cas, chaque sonde a révélé spécifiquement une bande supplémentaire (la sonde 5', un transcrit clairement exprimé de 3 Kb, la sonde 3 'un transcrit difus de 1,5 Kb) suggérant que ces transcrits anormaux

pouvaient correspondre aux gènes de fusion générés par la translocation t(12;22) comme montré figure 20 (b) .

2) Clonage du transcrit hvbride

Afin de cloner ces transcrits, méthode dérivée de l'amplification rapide des extrémités d'ADNc a été mise en oeuvre (Frohman AF, Dush MK, Martin GR, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 85, 8998-9002, 1988; Dumas Miline Edwards JB, Delort J, Mallet J, Methods in Molecular Biology, vol. 16, chap. 35, 1992) . Des ARN polyA de SU-CCS-1 et de cellules Hela ont été reverse transcrits en utilisant un oligonucléotide (dT) marqué à son extrémité 5' avec une séquence artificielle de 51 nucléotides (comme indiqué précédemment) . Les séquences d'ADNc localisées entre ce marquage et l'exon 7 du gène Ews ont été amplifiées par PCR en utilisant une procédure à trois étapes . Une électrophorèse sur gel d'agarose a révélé que les ARN Helaconduisent à l'amplification d'un unique fragment de 1,4 Kb, lequel a été identifié par hybridation comme correspondant à l'ADNc normal du gène Ews. Outre ce fragment , l'ARN SU- CCS-1 conduit à l'amplification d'un fragment de plus haut poids miléculaire comme indiqué à la figure 20 c. Le séquençage a mis en évidence une phase de lecture ouverte étrangère fusionné au codon 325 du côté 3' du huitième exon du gène Ews . Une recherche dans la banque de données NBRF a révélé que cette séquence dode pour la partie C-terminale du gène Atf-1, un facteur de transcription dépendant de l'AMPc. Au niveau de la séquence nucléique, cette séquence est identique à l'extrémité 3' de la séquence d'ADNc du gène Atf-1 (Hai T, Liu F, Coukos WJ, Green MR, Gènes Dev. 3, 2083-2090, 1989; Yoshimura T, Fijisawa J-L, Yoshida M, EMBA J. 9, 2537-2542, 1990) . Une sonde issue de cette extrémité,

dénommée ATF-1 3', s 'hybride avec le transcrit anormal de 3 Kb observé en northern blot.

Une procédure plus directe pour tester la présence d'un transcrit de fusion Ews/Atf-1 dans l'ARN de tumeur a été développé à partir d'un oligonucléotide spécifique dérivant de la région 3' non traduite du gène Atf-1. Cette amorce a été utilisée, en combinaison avec un oligonucléotide homologue à l'exon 7 du gène Ews, pour amplifier par PCR, des ADNc amorcés avec un oligo- dT synthétisés à partir de trois tumeurs primaires MMSP connues, de la lignée cellulaire SU-CCS-1 et de cellules de contrôle Hela. A la différence de l'ARN de Hela, qui ne conduit à aucune amplification, les quatre ARN des cas de MMSP conduisent à un fragment majeur de 1 Kb (comme montré figure 21) . pour chaque cas, le séquençage a révélé la même jonction en phase, intervenant dans le codon 325 du gène Ews et le codon 65 du gène Atf-1 (comme montré figure 21) . La protéine de fusion déduite codée par ce transcrit a conservé la totalité du domaine N-terminal de la protéine EWS et la majeure partie de la protéine ATF-1 (comme montré figure 23) .

3) Cartographie du σène Atf-1 sur le chromosome 12

La portion du transcrit de fusion correspondant au gène Atf-1 a été utilisée pour retrouver un cosmide d 'ne banque génomique humaine. Il a été montré par hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur des chromosomes en mêtaphase, que ce cosmide couvre exclusivement la bande 12ql3, démontrant ainsi que le gène Atf-1 est localisé dans cette région du génome. La complexité du caryotype des cellule SU-CCS-1 exclu une simple démonstration cytogénétique formelle de l'apparition d'une translocation impliquant les

chromosomes 12 et 22. Toutefois, l'analyse FISH bicouleur sur des noyaux de cellules SU-CCS-1 en interphase ont montré que le locus du gène Ews était divisé et que la partie proximal du gène Ews était juxtaposée au locus du gène Atf-1.

4) Gène de fusion réciproque

La transcription du gène Atf-1 normal sur le chromosome 12 et celle du gène de fusion réciproque généré sur le cromosome der (12) ont été étudiées par PCR reverse transcriptase. Dans tous les cas de MMSP, les deux transcrits ont été exprimés, ce résultat est compatible avec le large spectre d'expression du gène Atf-1 (Yoshimura T, Fijisawa J-I, Yoshida M, EMBO J. 9, 2537-2542, 1990) . Dans tous les cas, les produits amplifiés isss du transcrit de fusion réciproque sont de tailles identiques mais plus courtes qu'escompté. Le séquençage de la région de jonction de l'ADNc de tumeur Sten-1 a révélé une fusion hors phase causée par la déletion ou l'épissage du neuvième exon du gène Ews. Le produit traduction déduit est une protéine tronquée composée des 65 premier acides aminés de la protéine ATF-1 suivis de 3 acides aminés aberrants (comme montré figure 23) .

IV - Discussion

La présente étude démontre que la translocation t(12;22) associée au MMSP génère des gènes hybrides associant une partie du gène Ews et une partie du gène Atf-1, dont les caractéristiques structurales et fonctionnelles ressemblent à celles de la fusion des gènes Ews et Hum-Fli-1 dans la translocation t(ll;22) qui elle associée au Sarcome d'Ewing. Dans les deux cas,

le gène chimère générée sur le chromosome der(22) code pour une protéine dans laquelle la même portion de la partie N-terminale de la protéine EWS est liée à un domaine de fixation d'ADN d'un facteur de transcription. II a ainsi été montré sur des modèles que la portion préservée de la partie N-terminale de la protéine EWS, lorsqu'elle est liée au domaine de fixation d'ADN des protéines HUM_FLI-1, ETS-1 ou GAL-4, conduisait à la transcription de gènes reporters spécifiques contenant dans leur région promotrice les éléments de réponse correspondant.

La protéine hybride déduite de la séquence d'ADN de fusion des gènes Ews et Atf-1, contient la majeure partie de la protéine ATF-1, dont un domaine fonctionnel important bZIP . Ce domaine est connu pour médier la dimérisation de la protéine et la fixation de l'ADN. En conséquence, il est possible de considérer que ces deux propriétés sont préservées dans la protéine hybride.Celui-ci doit donc être capable de former des homodimères et des hétérodimères avec le facteur de transcription CREB connu pour interagir avec la protéine ATF-1 normal (Turc-carel C, Aurias A, Mugneret F, Lizard Sidaner I, Volk C, Thiery J-P, Olschwang S, Philip T, Lenoir GM, Mazabraud A, Cancer Genêt. Cytogenet. 32, 229-238, 1988; Douglass EC, Valentine M? Green AA, Hayes FA, Thompson El, J. Nat. Cancer Inst . 77, 1211-1213, 1988) .Il est également possible de fixer à l'ADN des motifs reconnus par la protéine ATF-l.La protéine chimère a cependant perdu un site consensus de phosphorylation de la protéine kinase A, lequel peut contribuer à la régulation de l'activité de transcription du gène Atf-1 par l'AMPc (Yoshimura T, Fijisawa J-I, Yoshida M, EMBO J. 9, 2537-2542, 1990; Flink K J, Jones N C, Oncogene 6, 2019-2026, 1991) .

La protéine chimère comprenant une partie de la protéine EWS et une partie de la protéine ATF-1, qui possède potentiellement le domaine transactivateur de EWS lié au domaine bZIP, qui n'est plus régulé par l'AMPc, de ATF-1, peut altérer la régulation de la transcription des gènes normalement contrôlés par ATF-1. Les deux hybrides transcrits sont générés, dans la plupart des MMSP, par une translocation cytogenetiquement simple, suggérant que la transcription du gène ATF-1 est identique à celle du gène EWS, soit depuis le centromère vers le télomère.Les deux étant exprimés. Cette situation avait déjà été observée dans plusieurs tumeurs malignes hematologiques . En effet, il a été montré que les chromosomes de la translocation t(15;17) associée à la leucémie promyelotique (Tkachuk D C, Kohler S, Cleary ML, Cell 71, 691-700, 1992), ceux de la translocation t(14;ll) associée aux leucémies aiguës des lymphocytes chez l'enfant (Gu Y, Nakamura T, Aider H, Prasad R, Canaani O, Cimino G, Groce CM, Canaani R, Cell 71, 701-708, 1992), expriment, dans chaque cas, des transcrits de fusion aberrants. Dans le MMSP, l'expression d'un gène de fusion réciproque sur le chromosome der (12) est compatible avec l'expression généralement connue de ATF-1. Toutefois en raison du cadre extérieur de fusion des deux séquences codantes, son produit d'expression déduit est presque entièrement composé des 65 premiers acides aminés de la région N- terminale de la protéine ATF-1. La protéine ATF-1 tronquée ne devrait donc pas former de dimères ou lier l'ADN. La contribution de cette protéine tronquée au phénotype de la tumeur demeure obscur. Toutefois, cela ne devrait pas être essentiel à la prolifération de la tumeur puisque, à une occasion, le ^' chromosome der(12) présentait une deletion dans 30% des cellules tumorales (Stenma G, Kindblom L-G, Angervall L, Gènes Chrom.

Cancer 4, 122-127, 1992) . Dans le cas du sarcome d'Ewing, la fusion réciproque n'est pas exprimée à un niveau mesurable et le chromosome der(11) n'est déleté que dans quelques cas (Turc-carel C, Aurias A, Mugneret F, Lizard Sidaner I, Volk C, Thiery JP, Olschwang S, Philip T, Lenoir GM, Cancer Genêt. Cytogenet. 32, 229- 238, 1988; Douglass AC, Valentine M, Green AA, Hayes FA, Thompson El, J. Nat. Cancer Inst. , 1211-1213, 1986) .

Dans le cas de la leucémie des lymphocytes aiguë, le domaine transactivateur N-terminal de E2A peut être lié soit au domaine de PBX1, soit au domaine bZIP de HLF (Inaba T, Roberts WM, Shapiro LH, Jolly KW, Raimondi SC, Smiht SD, Look AT, Science 257, 521-534, 1992; Hunger SP, Ohyashiki K, Toyama K, Cleary ML, Gènes Develop. 6, 1608-1620, 1992) . La présente étude démontre mode similaire de conversion oncogénétique des tumeurs solides. En effet, le domaine transactivateur N-terminal de EWS peut être fusionné au domaine de fixation de l'ADN de différentes familles de facteurs de transcription : le domaine ETS dans le cas du sarcome d'Ewing, le domaine bZIP dans le cas du MMPS. Ceci suggère un mécanisme oncogénétique commun médié par le domaine N-terminal de EWS contenu à la fois dans les protéine chimères EWS/HUM-FLI-1 et EWS/AF-1.