Stärkesynthese beteiligt sind

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die ein Enzym codieren, das an der Stärkesynthese in Pflanzen be¬ teiligt sind. Bei diesem Enzym handelt es sich um eine neue Isoform der Stärkesynthase.

Weiterhin betrifft diese Erfindung Vektoren, Bakterien, sowie mit den beschriebenen Nucleinsäuremolekülen transformierte Pflanzenzellen und aus diesen regenerierbare Pflanzen. Ferner werden Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen beschrieben, die aufgrund der Einführung von DNA-Molekülen, die eine Stärkesynthase codieren, eine in ihren Eigenschaften veränderte Stärke synthetisieren.

Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung, die pflanzlichen In¬ haltsstoffen als erneuerbaren Rohstoffquellen in letzter Zeit beigemessen wird, ist es eine der Aufgaben der biotechnologi¬ schen Forschung, sich um eine Anpassung dieser pflanzlichen Rohstoffe an die Anforderungen der verarbeitenden Industrie zu bemühen. Um eine Anwendung von nachwachsenden Rohstoffen in möglichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es darüber hinaus erforderlich, eine große Stoffvielfalt zu er¬ reichen.

Neben Ölen, Fetten und Proteinen stellen Polysaccharide die wesentlichen nachwachsenden Rohstoffe aus Pflanzen dar. Eine zentrale Stellung bei den Polysacchariden nimmt neben Cellu¬ lose die Stärke ein, die einer der wichtigsten Speicherstoffe in höheren Pflanzen ist. Hierbei ist Mais eine der interessan¬ testen Pflanzen, da sie die weltweit für die Stärkeproduktion wichtigste Kulturpflanze ist.

Das Polysaccharid Stärke ist ein Polymer aus chemisch einheit¬ lichen Grundbausteinen, den Glucosemolekülen. Es handelt sich dabei jedoch um ein sehr komplexes Gemisch aus unterschiedli¬ chen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisa¬ tionsgrades und des Auftretens von Verzweigungen der Glucose-

ketten unterscheiden. Daher stellt Stärke keinen einheitlichen Rohstoff dar. Man unterscheidet insbesondere die Amylose- Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1, 4- glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen, von der Amylopek- tin-Stärke, die ihrerseits ein komplexes Gemisch aus unter¬ schiedlich verzweigten Glucoseketten darstellt. Die Verzwei¬ gungen kommen dabei durch das Auftreten von zusätzlichen α- 1, 6-glycosidischen Verknüpfungen zustande. In typischen für die Stärkeproduktion verwendeten Pflanzen, wie z.B. Mais oder Kartoffel, besteht die synthetisierte Stärke zu ca. 25 % aus Amylose-Stärke und zu ca. 75 % aus Amylopektin-Stärke. Um eine möglichst breite Anwendung von Stärke zu ermöglichen, erscheint es wünschenswert, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, modifizierte Stärke zu synthetisieren, die sich für verschiedene Verwendungszwecke besonders eignet. Eine Möglichkeit, derartige Pflanzen bereitzustellen, besteht - neben züchterischen Maßnahmen - in der gezielten genetischen Veränderung des Stärkemetabolismus stärkeproduzierender Pflan¬ zen durch gentechnologische Methoden. Voraussetzung hierfür ist jedoch die Identifizierung und Charakterisierung der an der Stärkesynthese und/oder -modifikation beteiligten Enzyme sowie die Isolierung der entsprechenden, diese Enzyme codie¬ rende DNA-Moleküle.

Die biochemischen Synthesewege, die zum Aufbau von Stärke füh¬ ren, sind im wesentlichen bekannt. Die Stärkesynthese in pflanzlichen Zellen findet in den Piastiden statt. In photo¬ synthetisch aktiven Geweben sind dies die Chloroplasten, in photosynthetisch inaktiven, stärkespeichernden Geweben die Amyloplasten.

Die wichtigsten an der Stärkesynthese beteiligten Enzyme sind die Stärkesynthasen sowie die Verzweigungsenzyme. Bei den Stärkesynthasen sind verschiedene Isoformen beschrieben, die alle eine Polymerisierungsreaktion durch Übertragung eines Glucosylrestes von ADP-Glucose auf α-1,4-Glucane katalysieren. Verzweigungsenzyme katalysieren die Einführung von α-1, 6-Ver¬ zweigungen in lineare α-1, 4-Glucane.

Stärkesynthasen können in zwei Klassen eingeteilt werden: die Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen ("granule-bound starch

synthases"; GBSS) und die löslichen Stärkesynthasen ("soluble starch synthases"; SSS) . Diese Unterscheidung ist nicht in je¬ dem Fall eindeutig zu treffen, da einige der Stärkesynthasen sowohl stärkekorngebunden als auch in löslicher Form vorliegen (Denyer et al . , Plant J. 4 (1993) , 191-198; Mu et al . , Plant J. 6 (1994) , 151-159) . Für verschiedene Pflanzenspezies werden innerhalb dieser Klassen wiederum verschiedene Isoformen be¬ schrieben, die sich hinsichtlich ihrer Abhängigkeit von Star¬ termolekülen unterscheiden (sogenannte "primer dependent" (Typ II) und "primer independent" (Typ I) starch synthases) . Lediglich für die Isoform GBSS I gelang es bisher, die genaue Funktion bei der Stärkesynthese zu ermitteln. Pflanzen, in de¬ nen diese Enzymaktivität stark oder vollkommen reduziert ist, synthetisieren eine amylosefreie (sogenannte "waxy") Stärke (Shure et al . , Cell 35 (1983) , 225-233; Visser et al . , Mol. Gen. Genet. 225 (1991) , 289-296; WO 92/11376) , so daß diesem Enzym eine entscheidende Rolle bei der Synthese der Amylose- Stärke zugesprochen wird. Dieses Phänomen wird ebenfalls in Zellen der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii beobachtet

(Delrue et al . , J. Bacteriol . 174 (1992) , 3612-3620) . Bei Chlamydomonas konnte darüber hinaus gezeigt werden, daß GBSS I nicht nur an der Synthese der Amylose beteiligt ist, sondern auch einen Einfluß auf die Amylopektinsynthese besitzt . In Mu¬ tanten, die keine GBSS I-Aktivität aufweisen, fehlt eine be¬ stimmte Fraktion des normalerweise synthetisierten Amylopek- tins, die längerkettige Glucane aufweist.

Die Funktionen der anderen Isoformen der Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, insbesondere der GBSS II, und der löslichen Stärkesynthasen sind bisher unklar. Es wird angenommen, daß die löslichen Stärkesynthasen zusammen mit Verzweigungsenzymen an der Synthese des Amylopektins beteiligt sind (siehe z.B. Ponstein et al., Plant Physiol . 92 (1990) , 234-241) und daß sie eine wichtige Funktion bei der Regulation der Stärkesyn¬ theserate spielen.

Bei Mais wurden zwei Isoformen der Stärkekorn-gebundenen, so¬ wie zwei bzw. drei Isoformen der löslichen Stärkesynthasen identifiziert (Hawker et al. , Arch. Biochem. Biophys. 160

(1974) , 530-551; Pollock und Preiss, Arch. Biochem. Biophys.

204 (1980) , 578-588; MacDonald und Preiss, Plant Physiol . 78 (1985) , 849-852; Mu et al . , Plant J. 6 (1994) , 151-159) . Eine GBSS I aus Mais codierende cDNA sowie eine genomische DNA sind bereits beschrieben (Shure et al . , Cell 35 (1983) , 225- 233; Kloesgen et al . , Mol. Gen. Genet. 203 (1986) , 237-244) . Weiterhin ist ein sogenannter "Expressed Sequence Tag" (EST) beschrieben worden (Shen et al . , 1994, GenBank Nr. : T14684) , dessen abgeleitete Aminosäuresequenz eine starke Ähnlichkeit zur abgeleiteten Aminosäuresequenz der GBSS II aus Erbse (Dry et al., Plant J. 2 (1992) , 193-202) und Kartoffel (Edwards et al., Plant J. 8 (1995) , 283-294) aufweist. Nucleinsäuresequen- zen, die weitere Stärkesynthase-Isoformen aus Mais codieren, lagen jedoch bisher noch nicht vor. cDNA-Sequenzen, die für andere Stärkesynthasen als für die GBSS I codieren, wurden bisher lediglich für Erbse (Dry et al . , Plant J. 2 (1992) , 193-202) , Reis (Baba et al. , Plant Physiol. 103 (1993) , 565- 573) und Kartoffel (Edwards et al . , Plant J. 8 (1995) , 283- 294) beschrieben.

Außer beim Mais wurden lösliche Stärkesynthasen auch in einer Reihe weiterer Pflanzenarten identifiziert. Lösliche Stärke¬ synthasen sind beispielsweise bis zur Homogenität aus Erbse (Denyer und Smith, Planta 186 (1992) , 609-617) und Kartoffel (Edwards et al . , Plant J. 8 (1995) , 283-294) isoliert worden. In diesen Fällen stellte sich heraus, daß die als SSS II iden¬ tifizierte Isoform der löslichen Stärkesynthase identisch ist mit der Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthase GBSS II (Denyer et al., Plant J. 4 (1993) , 191-198; Edwards et al . , Plant J. 8 (1995) , 283-294) . Für einige weitere Pflanzenspezies wurde das Vorhandensein mehrerer SSS-Isoformen mit Hilfe chromatographi¬ scher Methoden beschrieben, beispielsweise bei Gerste (Tyynelä und Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993) 835-841; Kreis, Planta 148 (1980) , 412-416) und Weizen (Rijven, Plant Physiol. 81 (1986) , 448-453) . DNA-Sequenzen, die diese Proteine codie ^¬ ren, wurden jedoch bisher nicht beschrieben.

Um weitere Möglichkeiten bereitzustellen, beliebige stärke- speicherde Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie eine mo¬ difizierte Stärke synthetisieren, ist es erforderlich, jeweils

DNA-Sequenzen zu identifizieren, die weitere Isoformen der Stärkesynthasen codieren.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Nucleinsäuremoleküle zur Verfügung zu stellen, die an der Stärkebiosynthese beteiligte Enzyme codieren und mit deren Hilfe es möglich ist, gentechnisch veränderte Pflanzen herzu¬ stellen, die eine erhöhte oder erniedrigte Aktivität dieser Enzyme aufweisen, wodurch es zu einer Veränderung der chemi¬ schen und/oder physikalischen Eigenschaften der in diesen Pflanzen synthetisierten Stärke kommt.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patent¬ ansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst .

Die vorliegende Erfindung betrifft daher Nucleinsäuremoleküle, die Proteine mit der biologischen Aktivität einer Stärke¬ synthase codieren, wobei derartige Moleküle vorzugsweise Pro¬ teine codieren, die die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfassen. Insbesondere betrifft die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder einen Teil davon enthalten, bevorzugt Moleküle, die die in Seq ID No. 1 angegebene codierende Region umfassen bzw. entsprechende Ribonucleotidsequenzen

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremoleküle, die eine Stärkesynthase codieren und deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen der oben beschriebenen Moleküle abweicht. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole¬ küle, die eine Stärkesynthase codieren und die mit einem der oben beschriebenen Moleküle hybridisieren.

Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, die eine Se¬ quenz auf weisen, die zu der gesamten oder einem Teil der Sequenz der obengenannten Nucleinsäuremoleküle komplementär ist.

6

Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich sowohl um DNA- als auch RNA-Moleküle handeln. Entsprechende DNA-Moleküle sind beispielsweise genomische oder cDNA-Mole- küle. RNA-Moleküle können beispielsweise mRNA oder antisense- RNA-Moleküle sein.

Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfin¬ dung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisie- rungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Labo¬ ratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Nuclein¬ säuremolekülen hybridisieren, können prinzipiell aus jedem be¬ liebigen Organismus (d.h. Prokaryonten oder Eukaryonten, ins¬ besondere aus Bakterien, Pilzen, Algen, Pflanzen oder tieri¬ schen Organismen) stammen, der derartige Moleküle besitzt. Sie stammen vorzugsweise aus monokotylen oder dikotylen Pflanzen, insbesondere aus Nutzpflanzen, und besonders bevorzugt aus stärkespeichernden Pflanzen, insbesondere aus Mais. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z.B. aus genomischen oder aus cDNA-Bi- bliotheken verschiedener Organismen isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremo¬ leküle aus Pflanzen oder anderen Organismen kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Moleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfol¬ gen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) .

Als Hybridisierungsprobe können z.B. Nucleinsäuremoleküle ver¬ wendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile dieser Se¬ quenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente han¬ deln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfin¬ dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene

identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemaßen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Se¬ quenz codierten Proteine erforderlich.

Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi¬ sierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und alle- lische Varianten der oben beschriebenen DNA-Moleküle, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, die lang ge¬ nug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu codieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Se¬ quenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben be¬ schriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Posi¬ tionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu die¬ sen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Se¬ quenzidentität von mindestens 40 %, insbesondere eine Identi¬ tät von mindestens 60 %, vorzugsweise über 80 % und besonders bevorzugt über 90 %. Die Abweichungen zu den oben beschriebe¬ nen Nucleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Substi¬ tution, Insertion oder Rekombination entstanden sein. Homologie bedeutet ferner, daß funktioneile und/oder struktu¬ relle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremolekü¬ len oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, han¬ delt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftre¬ tende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus an¬ deren Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch ge¬ zielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch herge¬ stellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varian¬ ten.

Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte ge¬ meinsame Charakteristika auf. Dazu können z.B. Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z.B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Ver¬ halten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektrosko¬ pische Eigenschaften, Stabilität; pH-Optimum, Temperatur-Opti¬ mum etc.

Wichtige Charakteristika einer Stärkesynthase sind: i) ihre Lokalisation im Stroma der Piastiden pflanzlicher Zellen; ii) ihre Fähigkeit zur Synthese linearer α-1, 4-verknüpfter Poly- glucane unter Verwendung von ADP-Glucose als Substrat. Diese Aktivität kann wie in Denyer und Smith (Planta 186 (1992) , 606-617) oder wie in den Beispielen beschrieben bestimmt wer¬ den.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipiell aus jedem Organismus stammen, der die beschriebenen Proteine exprimiert, vorzugsweise aus Pflanzen, insbesondere aus stär¬ kesynthetisierenden bzw. stärkespeichernden Pflanzen. Diese können sowohl monokotyle oder auch dikotyle Pflanzen sein. Be¬ sonders bevorzugt sind dabei z.B. Getreidearten (wie Gerste, Roggen, Hafer, Weizen etc.) , Mais, Reis, Erbse, Maniok, Kar¬ toffel usw.

Bei den durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen co¬ dierten Proteine handelt es sich um eine bisher nicht identi¬ fizierte und charakterisierte Isoform einer pflanzlichen Stär¬ kesynthase. Diese Proteine weisen die enzymatische Aktivität einer Stärkesynthase auf, sowie auch gewisse Homologiebereiche zu bisher bekannten Stärkesynthasen aus Pflanzen, können aber keiner der bisher bekannten Isoformen eindeutig zugeordnet werden.

Die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen insbesondere die Eigenschaft auf, daß sie nach Einführung in eine E. coli-Mutante, bei der sämtliche glg-Gene deletiert sind und die eine mutierte, deregulierte ADP- Glucose-Pyrophosphorylase exprimiert, Kultivierung dieser

Mutante auf Glucose-haltigem Medium und Jodbedampfung zur Blaufärbung der Bakterienkolonien führt .

Gegenstand der Erfindung sind auch Oligonucleotide, die spezi¬ fisch mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül hybridi¬ sieren. Derartige Oligonucleotide haben vorzugsweise eine Länge von mindestens 10, insbesondere von mindestens 15 und besonders bevorzugt von mindestens 50 Nucleotiden. Diese Oli¬ gonucleotide sind dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch mit erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, d.h. nicht oder nur in sehr geringem Ausmaß mit Nucleinsäure- sequenzen, die andere Proteine, insbesondere andere Stärke¬ synthasen codieren. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide kön¬ nen beispielsweise als Primer für eine PCR-Reaktion verwendet werden. Ebenso können sie Bestandteile von antisense-Konstruk- ten sein oder von DNA-Molekülen, die für geeignete Ribozyme codieren.

Ferner betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Transkription und Synthese einer transla- tierbaren RNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in prokaryontischen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli, ist insofern interessant, als daß auf diese Weise eine ge¬ nauere Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten der En¬ zyme, für die diese Moleküle codieren, ermöglicht wird. Es ist insbesondere möglich, das Produkt, das von den entsprechenden Enzymen in Abwesenheit anderer, in der pflanzlichen Zelle an der Stärkesynthese beteiligter Enzyme synthetisiert wird, zu charakterisieren. Dies läßt Rückschlüsse zu auf die Funktion,

die das entsprechende Protein bei der Stärkesynthese in der Pflanzenzelle ausübt.

Darüber hinaus ist es möglich, mittels gängiger molekularbio¬ logischer Techniken (siehe z.B. Sambrook et al . , 1989, Molecu¬ lar Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ein¬ zuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3'- Ende der codierenden DNA-Sequenz Nucleinsäuremoleküle erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen. Durch derartige Deletionen am 5 '-Ende der Nucleotidsequenz ist es beispielsweise möglich, Aminosäuresequenzen zu identifizie¬ ren, die für die Translokation des Enzyms in die Piastiden verantwortlich sind (Transitpeptide) . Dies erlaubt es, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Entfernen der entsprechenden Sequenzen nicht mehr in den Piastiden, sondern im Cytosol lo¬ kalisiert sind, oder aufgrund der Addition von andereren Signalsequenzen in anderen Kompartimenten lokalisiert sind. Andererseits ist auch die Einführung von Punktmutationen denk¬ bar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäure¬ sequenz einen Einfluß beispielweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die einen veränderten K^-Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen über allosterische Regula¬ tion oder kovalente Modifizierung unterliegen.

Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine ver¬ änderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen, wie z.B. Mutanten, die als Substrat ADP-Glucose-6-Phosphat anstatt ADP- Glucose verwenden. Weiterhin können Mutanten hergestellt wer ^¬ den, die ein verändertes Aktivitäts-Temperatur-Profil aufwei¬ sen.

Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingebracht werden, die eine Muta-

genese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl. Sambrook et al . , 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Frag¬ mente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfer¬ nen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Sub¬ stitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primer repair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbio¬ logische Methoden durchgeführt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die mit einem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül oder einem erfindungsgemäßen Vektor trans¬ formiert und genetisch modifiziert sind, sowie Zellen, die von derart transformierten Zellen abstammen und ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder einen Vektor enthalten. Dabei handelt es sich vorzugsweise um bakterielle Zellen oder pflanzliche Zellen.

Gegenstand der Erfindung sind ferner die Proteine oder biolo¬ gisch aktive Fragmente davon, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, sowie Verfahren zu deren Herstellung, wobei eine erfindungsgemäße Wirtszelle unter Be¬ dingungen kultiviert wird, die die Synthese des Proteins er¬ lauben, und anschließend das Protein aus den kultivierten Zel¬ len und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.

Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremo¬ leküle ist es nun möglich, mit Hilfe gentechnischer Methoden in den Stärkemetabolismus von Pflanzen einzugreifen, wie es

bisher nicht möglich war, und ihn dahingehend zu verändern, daß es zur Synthese einer modifizierten Stärke kommt, die bei¬ spielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhältnis, dem Verzwei¬ gungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatge¬ halt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärkekorngröße und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wildtyp-Pflan¬ zen synthetisierter Stärke verändert ist. Durch eine Erhöhung der Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine, beispielsweise durch Überexpression entsprechender Nucleinsäuremoleküle, oder durch die Bereitstellung von Mutanten, die nicht mehr den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen und/oder unter¬ schiedliche Temperaturabhängigkeiten in bezug auf ihre Aktivi¬ tät besitzen, besteht die Möglichkeit der Ertragssteigerung in entsprechend gentechnisch veränderten Pflanzen. Die wirt¬ schaftliche Bedeutung der Möglichkeit des Eingriffs in die Stärkesynthese allein bei Mais ist offensichtlich: Mais ist weltweit die wichtigste Pflanze zur Stärkegewinnung. Ca. 80% der weltweit jährlich produzierten Stärke wird aus Mais gewon¬ nen.

Möglich ist somit die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in pflanzlichen Zellen, um die Aktivität der entsprechenden Stärkesynthase zu erhöhen. Ferner ist es möglich, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle nach dem Fachmann bekannten Methoden zu modifizieren, um erfindungsge¬ mäß Stärkesynthasen zu erhalten, die nicht mehr den zelleige¬ nen Regulationsmechanismen unterliegen, bzw. veränderte Tempe¬ raturabhängigkeiten oder Substrat- bzw. Produktspezifitäten aufweisen.

Bei der Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, muß die die Lo¬ kalisation in Piastiden gewährleistende Sequenz deletiert wer¬ den und die verbleibende codierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen

sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al . , EMBO J. 11 (1992) , 3219-3227; Wolter et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988) , 846-850; Sonnewald et al . , Plant J. 1 (1991) , 95- 106) .

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflan¬ zenzellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül transformiert und genetisch modifiziert wurden, sowie transgene Pflanzenzellen, die von derartig tranformierten Zellen abstammen. Derartige Zellen enthalten ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül, wobei dieses vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor. Die transgenen erfindungsgemäßen Pflanzenzellen lassen sich von natürlicherweise auftretenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie integriert in ihr Genom ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül enthalten, welches in den Zellen natürlicherweise entweder überhaupt nicht vorhanden ist, oder aber in einer anderen genetischen Umgebung, d.h. an einem anderen Ort im Genom. Pflanzenzellen, die gegebenenfalls natürlicherweise in ihrem Genom ein erfindungsgenmäßes DNA- Molekül enthalten, unterscheiden sich von erfindungsgemäßen Pflanzenzellen dadurch, daß letztere mehr Genkopien der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle aufweisen, als natürlicherweise in den jeweiligen natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen auftreten und daß diese zusätzlichen Kopien an anderen genetischen Loci integriert sind. Die oben erwähnten Merkmale lassen sich beispielsweise durch Southern Blot-Analyse genomischer DNA bestimmen. Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekann¬ ten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegen¬ den Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die obenbeschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflan¬ zen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d.h. sowohl

monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, insbesondere um stärkesynthetisierende bzw. stärkespeichernde Pflanzen, wie z.B. Getreidearten (Roggen, Gerste Hafer, Weizen etc.) , Reis, Mais, Erbse, Maniok oder Kartoffel.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der er¬ findungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knol¬ len, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren aufgrund der Expression bzw. zusätzlichen Ex¬ pression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls eine Stärke, die beispielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhält¬ nis, dem Verzweigungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatgehalt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärke¬ korngröße und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wild¬ typ-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist. Insbeson¬ dere kann eine solche Stärke im Hinblick auf die Viskosität und/oder die Gelbildungseigenschaften von Kleistern dieser Stärke im Vergleich zu Wildtypstärke verändert sein. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die aus den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen erhältliche Stärke.

Ferner ist es möglich, mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle Pflanzenzellen und Pflanzen zu erzeugen, bei denen die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins ver¬ ringert ist. Dies führt ebenfalls zur Synthese einer Stärke mit veränderten chemischen und/oder physikalischen Eigenschaf¬ ten verglichen mit Stärke aus Wildtyp-Pflanzenzellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind somit auch trans¬ gene Pflanzenzellen, in denen die Aktivität eines erfindungs¬ gemaßen Proteins verringert ist im Vergleich zu nicht-trans¬ formierten Pflanzen.

Die Herstellung von Pflanzenzellen mit einer verringerten Ak¬ tivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann beispielsweise erzielt werden durch die Expression einer entsprechenden anti-

sense-RNA, einer sense-RNA zur Erzielung eines Cosuppressions- effektes oder die Expression eines entsprechend konstruierten Ribozyms, das spezifisch Transkripte spaltet, die eines der erfindungsgemäßen Proteine codieren, unter Verwendung der er¬ findungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle.

Vorzugsweise wird zur Reduzierung der Aktivität eines erfin¬ dungsgemäßen Proteins in pflanzlichen Zellen eine antisense- RNA exprimiert .

Hierzu kann zum einen ein DNA-Molekül verwendet werden, das die gesamte für ein erfindungsgemäßes Protein codierende Se¬ quenz einschließlich eventuell vorhandener flankierender Se¬ quenzen umfaßt, als auch DNA-Moleküle, die nur Teile der co¬ dierenden Sequenz umfassen, wobei diese Teile lang genug sein müssen, um in den Zellen einen antisense-Effekt zu bewirken. Es können im allgemeinen Sequenzen bis zu einer Mindestlänge von 15 bp, vorzugsweise einer Länge von 100-500 bp, für eine effiziente antisense-Inhibition insbesondere Sequenzen mit einer Länge über 500 bp verwendet werden. In der Regel werden DNA-Moleküle verwendet, die kürzer als 5000 bp, vorzugsweise Sequenzen, die kürzer als 2500 bp sind. Bevorzugt werden DNA- Moleküle verwendet, die homolog in bezug auf die zu transfor¬ mierende Pflanzenspezies sind.

Möglich ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die einen hohen Grad an Homologie zu den Sequenzen der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle aufweisen, aber nicht vollkommen identisch sind. Die minimale Homologie sollte größer als ca. 65 % sein. Die Verwendung von Sequenzen mit Homologien zwischen 95 und 100 % ist zu bevorzugen.

Die erfindungsgemäßen Zellen lassen sich daher von natürlicherweise vorkommenden Zellen dadurch unterscheiden, daß sie ein heterologes rekombinantes DNA-Molekül enthalten, das eine antisense-RNA, ein Ribozym oder eine Cosuppressions- RNA codiert. Aufgrund der Expression dieses heterologen rekombinanten DNA-Moleküls kommt es zur Verringerung der Synthese eines erfindungsgemäßen Proteins in den Zellen und somit zur Verringerung der entsprechenden Aktivität . "Heterologe" DNA bedeutet in diesem Zusammenhang, daß es sich bei der in die Zellen eingeführten DNA um eine DNA handelt,

die in dieser Form natürlicherweise nicht in den Zellen vorkommt. Es kann sich dabei zum einen um DNA handeln, die natürlicherweise in diesen transformierten Zellen gar nicht vorkommt oder auch um DNA, die, selbst wenn sie natürlicherweise in diesen Zellen vorkommt, als exogene DNA in andere genetische Loci integriert ist und sich somit in einer anderen genetischen Umgebung befindet.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regene¬ riert werden. Gegenstand der Erfindung sind somit auch Pflan¬ zen, die die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen ent¬ halten. Bei diesen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflan¬ zen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d.h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen, d.h. um Pflanzen, die vom Menschen kultiviert werden für die menschliche oder tierische Ernährung oder für technische Zwecke. Insbesondere sind es vorzugsweise stärkesynthetisierende bzw. stärkespeichernde Pflanzen, wie z.B. Getreidearten (Roggen, Gerste, Hafer, Weizen, etc.), Reis, Mais, Erbse, Maniok oder Kartoffel. Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen, wie z.B. Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren aufgrund der Verringerung der Aktivität eines der erfindungsgemäßen Proteine eine Stärke, die beispielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhältnis, dem Verzweigungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatgehalt, dem Ver- kleisterungsverhalten, der Stärkekorngröße und/oder der Stär¬ kekornform im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist. Diese Stärke kann beispielsweise verän¬ derte Viskositäten und/oder Gelbildungseigenschaften ihrer Kleister zeigen im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen.

Gegenstand der Erfindung ist somit auch die aus den vorgehend beschriebenen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen erhältli¬ che Stärke.

Die erfindungsgemäßen Stärken können nach dem Fachmann bekann¬ ten Verfahren modifiziert werden und eignen sich in unmodifi- zierter oder modifizierter Form für verschiedene Verwendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht-Nahrungsmittel-bereich. Grundsätzlich läßt sich die Einsatzmöglichkeit der Stärke in zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glucose und Glucanbausteine, die über enzymatische oder chemische Verfah¬ ren erhalten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Für eine Reduktion der Kosten kann hierbei die Einfachheit und ko¬ stengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens von Bedeu¬ tung sein. Gegenwärtig verläuft es im wesentlichen enzymatisch unter Verwendung von Amyloglucosidase. Vorstellbar wäre eine Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz von Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z.B. Oberflächenvergröße¬ rung des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Ver¬ zweigungsgrad oder eine sterische Struktur, die die Zugäng¬ lichkeit für die eingesetzten Enzyme begrenzt, könnte dies be¬ wirken.

Der andere Bereich, in dem die Stärke wegen ihrer polymeren Struktur als sogenannte native Stärke verwendet wird, gliedert sich in zwei weitere Einsatzgebiete:

1. Nahrungsmittelindustrie

Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nah¬ rungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw. eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gel- bildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Ver- kleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungslei¬ stung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säurestabilität,

die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Film¬ bildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdaulichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z.B. anorgani¬ schen oder organischen Ionen.

2. Nicht-Nahrungmittelindustrie

In diesem großen Bereich kann die Stärke als Hilfsstoff für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zu¬ satzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der Verwendung der Stärke als Hilfsstoff ist hier insbeson¬ dere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Die Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation (Zurückhaltung von Feststoffen) , der Abbindung von Füll¬ stoff- und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen Eigen¬ schaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.

2.1 Papier- und Pappeindustrie

Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier An¬ wendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden.

Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Oberflä¬ chenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weißegrad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositätsstabili¬ tät, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbil¬ dung. Bei der Verwendung im Strich spielt der Feststoff- gehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Bindevermö¬ gen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, ver¬ lustfreie Verteilung, eine hohe mechanische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Feststoffgehalt, hohe Viskosität sowie ein hohes Bindevermögen von Bedeutung.

2.2 Klebstoffindustrie

Ein großer Einsatzbereich der Stärken besteht in der Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert : die Verwendung als reinem Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemikalien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymerdispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90 % der Klebstoffe auf Stärke¬ basis werden in den Bereichen Wellpappenherstellung, Her¬ stellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstel¬ lung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Brief¬ umschläge, Briefmarken usw. eingesetzt.

2.3 Textil- und Textilpflegemittelindustrie

Ein großes Einsatzfeld für die Stärken als Hilfmittel und Zusatzstoff ist der Bereich Herstellung von Textilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilindustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu unterscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d.h. als Hilfstoff zur Glättung und Stärkung des Klettverhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Er¬ höhung der Abriebfestigkeit beim Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsverschlech- ternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw. , Stärke als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen so¬ wie Stärke als Zusatz zu Kettungsmitteln für Nähgarne.

2.4 Baustoffindustrie

Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung der Stärken als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die Herstel¬ lung von Gipskartonplatten, bei der die im Gipsbrei ver¬ mischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Ober¬ fläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Bei¬ mischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton

werden Stärkeprodukte zur Verzögerung der Abbindung ein¬ gesetzt.

2.5 Bodenstabilisation

Ein weiterer Markt für die Stärke bietet sich bei der Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kombi- nationsprodukte aus der Stärke und Polymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und ver- krustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten Pro¬ dukten gleichzusetzen, liegen preislich aber deutlich un¬ ter diesen.

2.6 Einsatz bei Pflanzenschutz- und Düngemitteln

Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifischen Eigenschaften der Präparate. So kann die Stärke zur Ver¬ besserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemit¬ teln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwand¬ lung flüssiger, flüchtiger und/oder übelriechender Wirk¬ stoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindungen und zur Verlänge¬ rung der Wirkdauer durch Verminderung der Zersetzung ein¬ gesetzt werden.

2.7 Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie

Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Phar¬ maka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeuti¬ schen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für Ta¬ bletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln einge¬ setzt werden. Weiterhin kann die Stärke als Tabletten- sprengmittel dienen, da sie nach dem Schlucken Flüssig¬ keit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizinische Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke. Im Bereich der Kosmetik werden Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstoffen, wie Düften und Salicyl-

säure eingesetzt. Ein relativ großer Anwendungsbereich für die Stärke liegt bei Zahnpasta.

2.8 Stärkezusatz zu Kohlen und Briketts

Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert wer¬ den, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts ver¬ hindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwi¬ schen 4 und 6 %, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und 0,5 %. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemittel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermindert werden kann.

2.9 Erz- und Kohleschlammaufbereitung

Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlammauf¬ bereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.

2.10 Gießereihilfsstoff

Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gieße¬ reihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwie¬ gend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist.

Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfe¬ stigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Darüber hinaus können die Quellstärken weitere produk¬ tionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dis- pergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.

2.11 Einsatz in der Kautschukindustrie

In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesse¬ rung der technischen und optischen Qualität eingesetzt werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflä¬ chenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Ausse-

hens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen ge¬ streut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks .

2.12 Herstellung von Lederersatzstoffen

Eine weitere Absatzmöglichkeit der modifizierten Stärken besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.

2.13 Stärke in synthetischen Polymeren

Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Einsatz¬ gebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozess (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Po¬ lymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein) .

Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist verglichen mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfähig. An¬ ders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigenschaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigenschaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyäthylen. Hierbei werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koexpression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem 'master batch' kombiniert, aus dem mit granu¬ liertem Polyäthylen unter Anwendung herkömmlicher Verfah¬ renstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Einbindung von Stärke in Polyäthylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasser¬ dampfdurchlässigkeit, ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Antiblockverhalten sowie eine verbesserte Be¬ druckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden. Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Po¬ lyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygrup-

pen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Poly¬ urethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke folgende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeaus¬ dehnungskoeffizienten, Verringerung des SchrumpfVerhaltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Was¬ serdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasseraufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufrißdichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vorhanden sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfe¬ stigkeit .

Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr nur auf Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe, Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50 % herzustellen. Des weiteren sind Stärke/ Polymermischungen gün¬ stig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologische Abbaubarkeit aufweisen.

Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres ex¬ tremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate gewon¬ nen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus aufge¬ pfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die Anwendungs¬ bereiche für diese Superabsorber haben sich in den letzten Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebereich mit Pro¬ dukten Windeln und Unterlagen sowie im landwirtschaftlichen Sektor, z.B. bei Saatgutpillierungen.

Entscheidend für den Einsatz der neuen, gentechnisch veränder¬ ten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Pro¬ teingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzwei¬ gungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallinität, zum ande¬ ren auch die Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Vis¬ kosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur und -

transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrograda- tionsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbil¬ dung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität.

Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer Eingriffe in einer transgenen Pflanze kann zum einen die Eigenschaften der aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahinge¬ hend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemischer oder physikalischer Verfahren nicht mehr notwendig erscheinen. Zum anderen können die durch gentechnische Verfahren verän¬ derte Stärken weiteren chemischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qualität für be¬ stimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese chemischen Modifikationen sind grundsätzlich bekannt. Insbe¬ sondere handelt es sich dabei um Modifikationen durch

- Hitzebehandlung,

- Säurebehandlung,

- Oxidation und

- Veresterungen,

welche zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Weitere organische Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt werden:

- Erzeugung von Stärkeethern

Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether

- Erzeugung von vernetzten Stärken

- Erzeugung von Stärke-Pfropf-Polymerisaten

Zur Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in sense- oder antisense-Orientierung in pflanzlichen Zellen wer¬ den diese mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu

zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Ex¬ pression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage.

Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Be¬ zug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Sinnvolle Promotoren sind z.B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al . , EMBO J. 8 (1989) , 23-29) für eine knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Ge¬ weben sicherstellt, z.B. der ST-LSl-Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) , 7943-7947; Stock¬ haus et al., EMBO J. 8 (1989) , 2445-2451) oder für eine en- dosperm-spezifische Expression der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais.

Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addi¬ tion eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funk¬ tion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al . , EMBO J. 8 (1989) , 23-29) und sind beliebig aus¬ tauschbar.

Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuremoleküle zur Ver¬ fügung, die eine neue in Mais identifizierte Isoform einer Stärkesynthase codierenden. Dies erlaubt nun sowohl die Iden¬ tifizierung der Funktion dieser Isoform bei der Stärkebiosyn¬ these, als auch die Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen, bei denen die Aktivität dieses Enzyms verändert ist. Dies ermöglicht die Synrhese einer Stärke mit veränderter Struktur und somit veränderten physikalisch-chemischen Eigen¬ schaften in derartig manipulierten Pflanzen.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipiell auch dazu verwendet werden, Pflanzen herzustellen, bei denen

die Aktivität der erfindungsgemäßen Stärkesynthase erhöht oder verringert ist und gleichzeitig die Aktivitäten anderer, an der Stärkebiosynthese beteiligter Enzyme verändert sind. Dabei sind alle Kombinationen und Permutationen denkbar. Durch die Veränderung der Aktivitäten einer oder mehrerer Isoformen der Stärkesynthasen in Pflanzen kommt es zur Synthese einer in ih¬ rer Struktur veränderten Stärke. Durch die Steigerung der Ak¬ tivität einer oder mehrerer Isoformen der Stärkesynthasen in den Zellen der stärkespeichernden Gewebe transformierter Pflanzen wie z.B. in dem Endosperm von Mais oder Weizen oder in der Knolle bei der Kartoffel kann es darüber hinaus zu einer Ertragssteigerung kommen. Beispielsweise können Nuclein¬ säuremoleküle, die für ein erfindungsgemäßes Protein codieren oder entsprechende antisense-Konstrukte, in Pflanzenzellen eingebracht werden, bei denen bereits die Synthese endogener GBSS I-, SSS- oder GBSS II-Proteine aufgrund eines antisense- Effektes oder einer Mutation inhibiert ist oder die Synthese des Verzweigungsenzyms inhibiert ist (wie z.B. beschrieben in W092/14827 oder der ae-Mutante (Shannon und Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller und Paschall, Starch:Chemistry and Techno¬ logy, Academic Press, London, 2nd Edition: 25-86)) . Soll die Inhibierung der Synthese mehrerer Stärke-Synthasen in transformierten Pflanzen erreicht werden, so können DNA-Mole¬ küle zur Transformation verwendet werden, die gleichzeitig mehrere, die entsprechenden Stärkesynthasen codierenden Regio¬ nen in antisense-Orientierung unter der Kontrolle eines geeig¬ neten Promotors enthalten. Hierbei kann alternativ jede Se¬ quenz unter der Kontrolle eines eigenen Promotors stehen, oder die Sequenzen können als Fusion von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden. Letztere Alternative wird in der Regel vorzuziehen sein, da in diesem Fall die Synthese der entspre¬ chenden Proteine in etwa gleichem Maße inhibiert werden sollte.

Weiterhin ist die Konstruktion von DNA-Molekülen möglich, bei denen neben DNA-Sequenzen, die Stärkesynthasen codieren, wei¬ tere DNA-Sequenzen, die andere Proteine, die an der Stärkesyn¬ these oder -modifikation beteiligt sind, in antisense-Orien¬ tierung an einen geeigneten Promotor gekoppelt sind. Die Se-

quenzen können hierbei wiederum hintereinandergeschaltet sein und von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden. Für die Länge der einzelnen codierenden Regionen, die in einem derartigen Konstrukt verwendet werden, gilt das, was oben be¬ reits für die Herstellung von antisense-Konstrukten ausgeführt wurde. Eine obere Grenze für die Anzahl der in einem derarti¬ gen DNA-Molekül von einem Promotor aus transkribierten anti¬ sense-Fragmente gibt es nicht. Das entstehende Transkript sollte aber in der Regel eine Länge von 10 kb, vorzugsweise von 5 kb nicht überschreiten.

Codierende Regionen, die in derartigen DNA-Molekülen in Kombi¬ nation mit anderen codierenden Regionen in antisense-Orientie¬ rung hinter einem geeigneten Promotor lokalisiert sind, können aus DNA-Sequenzen stammen, die für folgende Proteine codieren: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II) und lösliche Stärke¬ synthasen (SSS I und II) , Verzweigungsenzyme, "Debranching"- Enzyme, Disproportionierungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist nur eine beispielhafte Aufzählung. Auch die Verwen¬ dung anderer DNA-Sequenzen im Rahmen einer derartigen Kombina¬ tion ist denkbar.

Mit Hilfe derartiger Konstrukte ist es möglich, in Pflanzen¬ zellen, die mit diesen transformiert wurden, die Synthese meh¬ rerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.

Weiterhin können die Konstrukte in klassische Mutanten einge¬ bracht werden, die für ein oder mehrere Gene der Stärkebiosyn¬ these defekt sind (Shannon und Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller und Paschall, Starch:Chemistry and Technology, Aca- demic Press, London, 2nd Edition: 25-86) . Diese Defekte können sich auf folgende Proteine beziehen: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II) und lösliche Stärkesynthasen (SSS I und II) , Verzweigungsenzyme (BE I und II) , "Debranching"-Enzyme (R-En- zyme) , Disproportionierungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist nur eine beispielhafte Aufzählung.

Mit Hilfe einer derartigen Vorgehensweise ist es weiterhin möglich, in Pflanzenzellen, die mit diesen transformiert wur¬ den, die Synthese mehrerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflan¬ zen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Ver-

fügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Marker¬ gen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw.. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor einge¬ führt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transforma¬ tion von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend ge¬ erntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Ana¬ lysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden einge¬ setzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen ver¬ knüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden cloniert werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle ste¬ hen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA un¬ ter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacte- rium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Pro¬ toplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzel¬ len werden an sich keine speziellen Anforderungen an die ver¬ wendeten Plasmide gestellt . Es können einfache Plasmide wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzen¬ zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri- Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri- Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen bi¬ nären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobak¬ terien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vekto¬ ren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation) . Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzre¬ gion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al . Mol. Gen. Genet. 163 (1978) , 181-187) . Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet .

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzen¬ zellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985) , Chapter V; Fraley et al . , Crit. Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 und An et al . EMBO J. 4 (1985) , 277-287 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmen¬ te, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kulti- vierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert wer¬ den. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten

der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistisehen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Bio- technology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.) , Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge) .

Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al. , Plant Mol. Biol . 22 (1993) , 491-506; Hiei et al . , Plant J. 6 (1994) , 271-282) .

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflan¬ zen sind die Transformation mittels des biolistisehen An¬ satzes, die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.

Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Lite¬ ratur verschiedentlich beschrieben (vgl. z.B. WO95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875) . In EP 292 435 wird ein Verfahren be¬ schrieben, mit Hilfe dessen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen er¬ halten werden können. Shillito et al . (Bio/Technology 7 (1989) , 581) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Regenerierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwen¬ dig ist, von Kallus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich teilende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro Kultivierungszeit von 7 bis 8 Monaten erhalten Shillito et al . Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormalitä- ten in der Morphologie und der Reproduktivität aufweisen. Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989) , 589) beschreiben die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus Mais- Protoplasten der Cateto Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1. Die Auto¬ ren vermuten, daß die Protoplasten-Regeneration zu fertilen Pflanzen abhängig ist von einer Anzahl verschiedener Faktoren,

ie z.B. von Genotyp, vom physiologischen Zustand der Donor- Zellen und von den Kultivierungsbedingungen.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle in¬ tegriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle er¬ halten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomy- cin, Hygromycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der in¬ dividuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion trans¬ formierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al . , Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84) . Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, ge¬ kreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen ha¬ ben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Von den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibe¬ halten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Verwendete Abkürzungen

bp Basenpaar

GBSS granule bound starch synthase (Stärkekorn-gebundene Star kesynthase) IPTG Isopropyl ß-D-Thiogalacto-Pyranosid SS starch synthase { Stärkesynthase) SSS soluble starch synthase (lösliche Stärkesynthase)

In den Beispielen verwendete Medien und Lösungen:

20 x SSC 175,3 g NaCl

88,2 g Natrium-Citrat ad 1000 ml mit ddH ₂ 0 pH 7,0 mit 10 N NaOH

YT 8 g Bacto-Yeast extract

5 g Bacto-Tryptone 5 g NaCl ad 1000 ml mit ddH ₂ 0

Protoplastenisolierungsmedium (100 ml)

Cellulase Onozuka R S (Meiji Seika, Japan) 800 mg

Pectolyase Y 23 40 mg

KN0 ₃ 200 mg

KH ₂ P0 ₄ 136 mg

K ₂ HP0 ₄ 47 mg

CaCl ₂ 2H ₂ 0 147 mg

MgS0 ₄ 7H ₂ 0 250 mg

Bovine serum albumin (BSA) 20 mg

Glucose 4000 mg

Fructose 4000 mg

Saccharose 1000 mg pH 5,8

Omolarität 660 mosm.

Protoplastenwaschlösung 1: wie Protoplastenisolierlösung, aber ohne Cellulase, Pectolyase und BSA

Transformationspuffer

a) Glucose 0,5 M

MES 0,1 %

MgCl ₂ 6H ₂ 0 25 mM pH 5,8 auf 600 mosm. einstellen

PEG 6000- ^• Lösung

Glucose 0,5 M

MgCl ₂ 6H ₂ 0 100 mM

Hepes 20 mM pH 6,5

Dem obigen Puffer unter b) wird PEG 6000 kurz vor Gebrauch der Lösung zugesetzt (40 Gew.-% PEG) . Die Lösung wird durch ein 0,45 μm Sterilfilter filtriert.

W5 Lösung

CaCl ₂ 125 mM

NaCl 150 mM

KC1 5 mM

Glucose 50 mM

Protoplasten-Kulturmedium (Angaben in mg/l)

KN0 ₃ 3000

(NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 500

MgS0 ₄ 7H ₂ 0 350

KH ₂ P0 ₄ 400

CaCl ₂ 2H ₂ 0 300

Fe-EDTA und Spurenelemente wie im Murashi

(Physiol. Plant, 15 (1962) , 473) .

m-Inosit 100

Thiamin HCl 1,0

Nicotinsäureamid 0,5

Pyridoxin HCl 0,5

Glycin 2,0

Glucuronsäure 750

Galacturonsäure 750

Galactose 500

Maltose 500

Glucose 36.000

Fructose 36.000

Saccharose 30.000

Asparagin 500

Glutamin 100

Prolin 300

Caseinhydrolysat 500

2, 4 Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) 0,5 pH 5,8

Osmolarität 600 mosm.

In den Beispielen werden die folgenden Methoden verwendet :

1. Clonierungsverfahren

Zur Clonierung in E.coli wurde der Vektor pBluescript II SK (Stratagene) verwendet.

2. Bakterienstämme

Für den Bluescript-Vektor und für die pUSP-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laborato¬ ries, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo excision wurde der E.coli-Stamm XLl-Blue verwendet.

3. Transformation von Mais

(a) Herstellung von Protoplasten der Zellinie DSM 6009

Protoplastenisolierung

2 - 4 Tage, vorzugsweise 3 Tage nach dem letzten Me¬ diumswechsel einer Protoplastensuspensionskultur wird das Flüssigmedium abgesaugt und die zurückbleibenden Zellen mit 50 ml Protoplastenwaschlösung 1 gespült und nochmals trockengesaugt. Zu jeweils 2 g der geernteten Zellmasse wird 10 ml Protoplastenisolierungsmedium ge¬ geben. Die resuspendierten Zellen und Zellaggregate werden bei 27 ± 2° C unter leichtem Schütteln (30 bis 40 rpm) 4 bis 6 h im Dunkeln inkubiert.

Protoplastenreinigung

Sobald die Freisetzung von mindestens 1 Mio. Protopla¬ sten/ml erfolgt ist (mikroskopische Beobachtung) , wird die Suspension durch ein Edelstahl- und Nylonsieb von 200 bzw. 45 μm Maschenwerte gesiebt. Die Kombination eines 100 μm und eines 60 μm Siebs ermöglicht die Ab¬ trennung der Zellaggregate genauso gut. Das protopla- stenhaltige Filtrat wird mikroskopisch beurteilt. Üb¬ licherweise enthält es 98 - 99 % Protoplasten. Der Rest sind unverdaute Einzelzellen. Protoplastenpräpa- rationen mit diesem Reinheitsgrad werden ohne zusätz¬ liche Gradientenzentrifugation für Transformationsex¬ perimente verwendet. Durch Zentrifugation (100 UpM im Aufschwingrotor (100 x g, 3 min) werden die Protopla¬ sten sedimentiert . Der Überstand wird verworfen und die Protoplasten in Waschlösung 1 resuspendiert. Die Zentrifugation wird wiederholt und die Protoplasten danach im Transformationspuffer resuspendiert.

(b) Protoplastentransformation

Die in Tranformationspuffer resuspendierten Protopla¬ sten werden bei einem Titer von 0,5 - 1 x 10 Proto¬ plasten/ml in 10 ml Portionen in 50 ml Polyallomer- Röhrchen eingefüllt . Die zur Transformation verwendete DNA wird in Tris-EDTA (TE) Puffer gelöst. Pro ml Pro- toplastensuspension werden 20 μg Plasmid-DNA zugege¬ ben. Als Vektor wird dabei ein Phosphinotricinresi- stenz vermittelndes Plasmid verwendet (vgl. z.B. EP 0 513 849) . Nach der DNA-Zugabe wird die Protopla- stensuspension vorsichtig geschüttelt, um die DNA ho¬ mogen in der Lösung zu verteilen. Sofort danach wird tropfenweise 5 ml PEG-Lösung zugetropft . Durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen wird die PEG-Lösung homogen verteilt. Danach werden nochmals 5 ml PEG-Lösung zugegeben und das homogene Durchmischen

wiederholt. Die Protoplasten verbleiben 20 min der PEG-Lösung bei ± 2° C. Danach werden die Protoplasten durch 3-minütiges Zentrifugieren (100 g; 1000 Upm) se- dimentiert. Der Überstand wird verworfen. Die Proto¬ plasten werden durch vorsichtiges Schütteln in 20 ml W5-Lösung gewaschen und danach erneut zentrifugiert. Danach werden sie in 20 ml Protoplastenkulturmedium resuspendiert, nochmals zentrifugiert und erneut in Kulturmedium resuspendiert. Der Titer wird auf 6 - 8 x IO ⁵ Protoplasten/ml eingestellt und die Protoplasten in 3 ml Portionen in Petrischalen (0 60 mm, Höhe 15 mm) kultiviert. Die mit Parafilm versiegelten Petrischalen werden bei 25 ± 2° C im Dunkeln aufgestellt.

(c) Protoplastenkultur

Während der ersten 2 - 3 Wochen nach der Protopla- stenisolierung und -transformation werden die Proto¬ plasten ohne Zugabe von frischem Medium kultiviert. Sobald sich die aus den Protoplasten regenerierten Zellen zu Zellaggregaten mit mehr als 20 - 50 Zellen entwickelt haben, wird 1 ml frisches Protoplastenkul¬ turmedium zugegeben, das als Osmoticum Saccharose (90 g/1) enthält.

(d) Selektion transformierter Maiszellen und Pflanzenrege¬ neration

3 - 10 Tage nach der Zugabe von frischem Medium können die aus Protoplasten entstandenen Zellaggregate auf Agar-Medien mit 100 mg/l L-Phosphinothricin plattiert werden. N6-Medium mit den Vitaminen des Protoplasten- kulturmediums, 90 g/1 Saccharose und 1,0 mg/l 2, 4D ist ebenso geeignet wie ein analoges Medium beispielsweise mit den Makro- und Mikronährsalzen des MS-Mediums (Murashige und Skoog (1962) , siehe oben) . Auf dem Selektivmedium können die aus stabil transfor¬ mierten Protoplasten hervorgegangenen Kalli ungehin-

dert weiterwachsen. Nach 3 - 5 Wochen, vorzugsweise 4 Wochen können die transgenen Kalli auf frisches Selek¬ tionsmedium transferiert werden, welches ebenfalls 100 mg/l L-Phosphinothricin enthält, das aber kein Auxin mehr enthält. Innerhalb von 3 - 5 Wochen differenzie¬ ren ca. 50 % der transgenen Maiskalli, die das L-Phos- phinothricinacetyltransferase-Gen in ihr Genom inte¬ griert haben, auf diesem Medium in Gegenwart von L- Phosphinothricin erste Pflanzen.

(e) Aufzucht transgener Regeneratpflanzen

Das embryogene transformierte Maisgewebe wird auf hor¬ monfreiem N6-Medium (Chu CC. et al . , Sei. Sin. 16 (1975) , 659) in Gegenwart von 5xl0 ^"4 M L-Phosphinothri¬ cin kultiviert. Auf diesem Medium entwickeln sich Maisembryonen, die das Phsphinothricinacetyltransfe- rase-Gen (PAT-Gen) hinreichend stark exprimieren, zu Pflanzen. Nicht transformierte Embryonen oder solche mit nur sehr schwacher PAT-Aktivität sterben ab. So¬ bald die Blätter der in vitro-Pflanzen eine Länge von 4 - 6 mm erreicht haben, können diese in Erde transfe¬ riert werden. Nach Abwaschen von Agarresten an den Wurzeln werden die Pflanzen in ein Gemisch von Lehm, Sand, Vermiculit und Einheitserde im Verhältnis 3:1:1:1 gepflanzt und während der ersten 3 Tage nach dem Verpflanzen bei 90 - 100 % relativer Luftfeuchte an die Erdkultur adaptiert. Die Anzucht erfolgt in einer Klimakammer mit 14 h Lichtperiode ca. 25000 Lux in Pflanzenhöhe bei einer Tag/Nachttemperatur von 23 ± 1/17 ± 1° C. Die adaptierten Pflanzen werden bei einer Luftfeuchte von 65 ± 5 % kultiviert.

4. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt .

Beispiel 1

Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung einer cDNA, die eine neue Isoform einer Stärkesynthase aus Zea mays co¬ diert

Zur Identifizierung einer cDNA, die eine neue Stärkesynthase aus Mais codiert, wurde die Strategie der funktionellen Ex¬ pression in einer geeigneten E. coli-Mutante gewählt. E. coli synthetisiert auf bestimmten Nährmedien (Vollmedium mit 1% Glucose) als Speicherkohlenhydrat Glyeogen, ein Polysaccharid, das dem Amylopektin in seiner Struktur ähnlich ist, jedoch stärker verzweigt ist (7-10% Verzweigungspunkte gegenüber 4- 5%) und normalerweise ein höheres Molekulargewicht aufweist. Der höhere Verzweigungsgrad bedingt auch eine unterschiedliche Färbung mit Jod. Glyeogen wird mit Jod bräunlich, Amylopectin lila und Amylose blau angefärbt.

In E. coli sind essentiell drei Gene für die Glycogensynthese verantwortlich, glgA, glgB und glgC, die Glycogensynthase, das Verzweigungsenzym und die ADP-glucosepyrophosphorylase codie¬ ren. Dieses System ist analog dem der Stärkebiosynthese in Pflanzen. Wird eine pflanzliche Stärkesynthase in Wildtyp E. coli-Zellen exprimiert, so ist der Einfluß des Enzyms auf die Eigenschaften des Glycogens mittels Jodfärbung nur sehr schwer oder gar nicht zu detektieren, da die von der Stärkesynthase produzierten Glucane von dem Verzweigungsenzym genauso ver¬ zweigt werden, wie die von der Glycogensynthase produzierten Glucane .

Deshalb wurde ein E.coli-Stamm erstellt, der ein einfaches Screening nach der funktionellen Expression einer Stärke¬ synthase mittels Jodfärbung erlaubt. Hierfür wurde die Mutante

HfrG6MD2 (Schwartz, J. Bacteπol . 92 (1966) , 1083-1089) , in der sämtliche glg-Gene deletiert sind, transformiert mit dem Plasmid pACAC. Dieses Plasmid enthält ein DNA-Fragment, das die ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (AGPase) aus E. coli co¬ diert, unter der Kontrolle des lac Z-Promotors. Das Fragment war als ca. 1,7 kb großes Dral/Haell-Fragment aus dem Vektor pEcA-15 (siehe B. Müller-Röber (1992) , Dissertation, FU Ber¬ lin) isoliert worden und nach Glättung der Enden in einen mit HindiII lmearisierten pACYC184-Vektor cloniert worden. Dieses Plasmid vermittelt die Expression einer mutierten, deregulier¬ ten ADP-Glucose-Pyrophosphorylase aus dem E. coli-Stamm LCB 618, der größere Mengen an Glyeogen, aufgrund der Mutation dieses Enzyms, akkumuliert (Preiss und Romeo in Advances in Microbial Physiology, Academic Press, London, Vol. 30, 183- 238) . Dies gewährleistet die Bereitstellung ausreichender Men¬ gen von ADP-Glucose, dem Substrat der Stärkesynthasen, und soll bei gleichzeitiger funktioneller Expression von Stärke¬ synthasen die Synthese von mit Jod blau anfärbbaren linearen α-1,4-Glucanen in E. coli HfrG6MD2 gewährleisten. Weiterhin ist das Plasmid pACAC als Derivat des Vektors pACYC184 mit Plasmiden wie pBluescript SK (-) kompatibel.

Dieser Stamm wurde mit einer cDNA-Bibliothek transformiert, die in dem Vektor pBluescript SK (-) enthalten war und aus RNA aus Blättern von Zea mays, Linie B73 , hergestellt worden war. Diese wurde erstellt indem ca. 10 Phagen einer cDNA-Bibliothek aus RNA aus Blättern von Zea mays, Linie B73 , enthalten m dem Vektor Uni-ZAPTMXR (Stratagene GmbH,Heidelberg) , mittels in vivo excision zunächst in Phagmide überführt wurden. E. coli XLl-Blue Zellen wurden mit diesen Phagmiden infiziert und 3xl0 ⁵ Transformanden wurden auf festem, selektivem (enthaltend Ampicillin) Nährmedium plattiert. Nach Wachstum wurden die Zellen abgeschwemmt und aus diesen Plasmid-DNA präpariert . Der Transfer der Plasmid-DNA in die Bakterienzellen erfolgte nach der Methode von Hanahan (J. Mol. Biol . 166 (1983) , 557-580) . Ca. 4x10 transformierte E. coli-Zellen wurden auf Agarkulturmedien mit folgender Zusammensetzung ausgestrichen:

YT-Medium mit :

1,5% Bacto-Agar

1 % Glucose

10 mg/l Chlorampnenicol

50 mg/l Ampicillin

1 mM IPTG

2 mM Diaminopimelmsäure

Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Zellen mit Jod bedampft. Eine blaufärbende Kolonie wurde erhalten. Aus dieser wurde Plasmid-DNA isoliert und diese zur nochmaligen Transfor¬ mation eingesetzt. Die erhaltenen Transformanden wurden auf Replikaplatten ausgestrichen. Eine der Replikaplatten wurde wiederum angefärbt . Blaufärbende Clone wurden zur Praparation größerer Mengen an Plasmid-DNA angezogen.

Nach Überprüfung der Größe des cDNA-Fragments wurde der Clon pSSZm weiter analysiert.

Beispiel 2

Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pSSZm

Aus einem entsprechend Beispiel 1 erhaltenen E. coli-Clon wurde das Plasmid pSSZm isoliert und seine cDNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxynucleotidmethode (Sanger et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) , 5463- 5467) bestimmt. Die Insertion ist 2651 bp lang und stellt eine partielle cDNA dar. Die Nucleotidsequenz ist unter Seq ID No. 1 angegeben. Die korrespondierende Aminosäuresequenz ist unter Seq ID No. 2 dargestellt.

Eine Sequenzanalyse und em Sequenzvergleich mit bekannten Se¬ quenzen zeigte, daß die unter Seq ID No. 1 dargestellte Se¬ quenz neu ist und eine partielle codierende Region umfaßt, die gewisse Homologien zu Stärkesynthasen aus verschiedenen Orga¬ nismen aufweist. Weiterhin stellt das codierte Protein eine neue Isoform von Stärkesynthasen dar, daß sich den bisher be¬ schriebenen Klassen nicht eindeutig zuordnen läßt. Das durch diese cDNA-Insertion oder durch hybridisierende Sequenzen co-

dierte Protein wird im Rahmen dieser Anmeldung als SSZm be¬ zeichnet. Mit Hilfe dieser partiellen cDNA-Sequenz ist es für eine in der Molekularbiologie erfahrene Person ohne weiteres möglich, die gesamte codierende Region enthaltende Vollängen- clone zu isolieren und seine Sequenz zu bestimmen. Dazu wird z.B. eine blattspezifische cDNA-Expressionsbank aus Zea mays, Linie B73 (Stratagene GmbH, Heidelberg) , nach Standardverfah¬ ren mittels Hybridisierung mit einem 5' -Fragment der cDNA-In¬ sertion des Plasmids pSSZM (200 bp) auf Vollängen-Clone hin durchgemustert. So erhaltene Clone werden sodann sequenziert. Eine andere Möglichkeit zum Erhalt der noch fehlenden 5'-ter¬ minal gelegenen Sequenzen besteht in der Anwendung der 5'-Race Methode (Stratagene o.vgl. Hersteller) .

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(l) ANMELDER:

(A) NAME: Jens Koßmann

(B) STRASSE: Golmer Fichten 9

(C) ORT: Golm

(E) LAND: Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: 14476

<ιι) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Nuclemsaeuremolekuele aus Pflanzen codierend Enzyme, die an der Staerkesynthese beteiligt sind

(ni) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER : Floppy disk

(B) COMPUTER : IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 2652 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA (in) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN

(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Zea mays

(B) STAMM: B73

(F) GEWEBETYP: Blattgewebe

(vil) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(A) BIBLIOTHEK: cDNA-Bibliothek in pBluescriptSK-

(B) CLON(E) : pSSZm

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 9..2213

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

GAATTCGG CAC GAG AAT TTT CTA AAA GGA AAG CTT ATT GAG ATA ACT GAG 50 His Glu Asn Phe Leu Lys Gly Lys Leu Ile Glu Ile Thr Glu 1 5 10

ACA GAG GAG AGT CTA TTC AAG TTG GAG AAA GAG TGT GCT CTT CTA AAT 98 Thr Glu Glu Ser Leu Phe Lys Leu Glu Lys Glu Cys Ala Leu Leu Asn 15 20 25 30

GCT TCC CTT AGG GAG CTC GAG TGT ACA TCC ACT TCT GCC CAA TCT GAT 146 Ala Ser Leu Arg Glu Leu Glu Cys Thr Ser Thr Ser Ala Gin Ser Asp 35 40 45

GTG TTG AAA CTT GGC CCT CTG CAA CAA GAT GCC TGG TGG GAG AAA GTA 194 Val Leu Lys Leu Gly Pro Leu Gin Gin Asp Ala Trp Trp Glu Lys Val 50 55 60

GAA AAT TTG GAA GAC TTG CTT GAT TCC ACA GCA AAC CAA GTG GAG CAT 242 Glu Asn Leu Glu Asp Leu Leu Asp Ser Thr Ala Asn Gin Val Glu His 65 70 75

GCT TCT TTG ACG CTA GAT GGT TAC CGT GAT TTC CAG GAT AAG GTT GAC 290 Ala Ser Leu Thr Leu Asp Gly Tyr Arg Asp Phe Gin Asp Lys Val Asp 80 85 90

AAA CTA AAA GCA TCA TTG GGA ACA ACA AAC GTA TCA GAG TTC TGT CTT 338 Lys Leu Lys Ala Ser Leu Gly Thr Thr Asn Val Ser Glu Phe Cys Leu 95 100 105 110

TAT TTG GTT GAT ATT TTG CAG CAA AGG GTA AAA TCA GTA GAA GAG CGC 386 Tyr Leu Val Asp Ile Leu Gin Gin Arg Val Lys Ser Val Glu Glu Arg 115 120 125

TTT CAA GCA TGT AAT CAT GAA ATG CAT TCA CAA ATT GAA CTT TAT GAA 434 Phe Gin Ala Cys Asn His Glu Met His Ser Gin Ile Glu Leu Tyr Glu 130 135 140

CAC TCA ATA GTG GAG TTT CAT GGT ACT CTC AGC AAA CTA ATA AAT GAA 482 His Ser Ile Val Glu Phe His Gly Thr Leu Ser Lys Leu Ile Asn Glu 145 150 155

AGT GAG AAA AAG TCA ATG GAG CAT TAT GCA GAA GGC ATG CCA TCA GAG 530 Ser Glu Lys Lys Ser Met Glu His Tyr Ala Glu Gly Met Pro Ser Glu 160 165 170

TTC TGG AGT AGG ATC TCT CTT CTG ATT GAT GGG TGG TCG CTT GAG AAG 578 Phe Trp Ser Arg Ile Ser Leu Leu Ile Asp Gly Trp Ser Leu Glu Lys 175 180 185 190

AAA ATA TCC ATT AAT GAT GCA AGT ATG TTG AGA GAA ATG GCT TGG AAA 626 Lys lie Ser Ile Asn Asp Ala Ser Met Leu Arg Glu Met Ala Trp Lys 195 200 205

AGG GAT AAT CGC CTC CGG GAA GCT TAC TTG TCA TCC AGA GGA ATG GAA 674 Arg Asp Asn Arg Leu Arg Glu Ala Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Met Glu 210 215 220

GAG AGG GAA CTG ATA GAT AGT TTT CTA AAG ATG GCA CTA CCA GGA ACA 722 Glu Arg Glu Leu Ile Asp Ser Phe Leu Lys Met Ala Leu Pro Gly Thr 225 230 235

AGT TCT GGT TTG CAC ATT GTC CAC ATA GCA GCA GAG ATG GCT CCT GTC 770 Ser Ser Gly Leu His Ile Val His Ile Ala Ala Glu Met Ala Pro Val 240 245 250

GCA AAG GTT GGT GGT CTG GCA GAT GTG ATC TCT GGT CTT GGG AAG GCA 818 Ala Lys Val Gly Gly Leu Ala Asp Val Ile Ser Gly Leu Gly Lys Ala 255 260 265 270

CTT CAA AAA AAG GGG CAC CTT GTA GAG ATT ATT CTT CCC AAA TAT GAT 866 Leu Gin Lys Lys Gly His Leu Val Glu Ile Ile Leu Pro Lys Tyr Asp 275 280 285

TGC ATG CAG CAT AAC CAA ATA AAT AAT CTT AAG GTT CTA GAT GTT GTG 914 Cys Met Gin His Asn Gin Ile Asn Asn Leu Lys Val Leu Asp Val Val 290 295 300

GTG AAG TCT TAC TTT GAA GGA AAT ATG TTT GCC AAC AAG ATA TGG ACT 962 Val Lys Ser Tyr Phe Glu Gly Asn Met Phe Ala Asn Lys Ile Trp Thr 305 310 315

GGA ACT GTT GAA GGT CTT CCG GTC TAC TTT ATT GAA CCG CAA CAT CCA 1010 Gly Thr Val Glu Gly Leu Pro Val Tyr Phe Ile Glu Pro Gin His Pro 320 325 330

GGT AAG TTC TTC TGG AGG GCA CAA TAC TAC GGA GAG CAT GAT GAC TTC 1058 Gly Lys Phe Phe Trp Arg Ala Gin Tyr Tyr Gly Glu His Asp Asp Phe 335 340 345 350

AAA CGT TTT TCG TAC TTT AGC CGT GTT GCA CTG GAA TTG CTT TAC CAA 1106 Lys Arg Phe Ser Tyr Phe Ser Arg Val Ala Leu Glu Leu Leu Tyr Gin 355 360 365

TCT GGG AAG AAA GTT GAC ATA ATT CAC TGC CAT GAC TGG CAG ACT GCA 1154 Ser Gly Lys Lys Val Asp Ile Ile His Cys His Asp Trp Gin Thr Ala 370 375 380

TTT GTT GCA CCT CTT TAC TGG GAT GTA TAT GCA AAC CTG GGC TTC AAC 1202 Phe Val Ala Pro Leu Tyr Trp Asp Val Tyr Ala Asn Leu Gly Phe Asn 385 390 395

TCA GCT AGA ATT TGT TTT ACC TGT CAC AAT TTT GAA TAT CAA GGA ATC 1250 Ser Ala Arg Ile Cys Phe Thr Cys His Asn Phe Glu Tyr Gin Gly Ile 400 405 410

GCT CCA GCT CAG GAC TTA GCA TAT TGT GGT CTT GAT GTT GAT CAC CTG 1298 Ala Pro Ala Gin Asp Leu Ala Tyr Cys Gly Leu Asp Val Asp His Leu 415 420 425 430

GAT AGA CCA GAC AGA ATG CGG GAT AAT TCA CAT GGC AGA ATA AAT GTT 1346 Asp Arg Pro Asp Arg Met Arg Asp Asn Ser His Gly Arg Ile Asn Val 435 440 445

GTT AAG GGT GCA GTT GTA TAT TCC AAC ATT GTG ACA ACT GTA TCA CCA 1394 Val Lys Gly Ala Val Val Tyr Ser Asn Ile Val Thr Thr Val Ser Pro 450 455 460

ACA TAT GCA CAA GAG GTT CGC TCA GAG GGT GGG CGT GGG CTC CAA GAT 1442 Thr Tyr Ala Gin Glu Val Arg Ser Glu Gly Gly Arg Gly Leu Gin Asp 465 470 475

ACA CTC AAA GTG CAC TCC AAG AAA TTT GTT GGA ATA CTT AAT GGC ATT 1490 Thr Leu Lys Val His Ser Lys Lys Phe Val Gly Ile Leu Asn Gly Ile 480 485 490

GAC ACA GAT ACT TGG AAT CCG TCT ACG GAT AGG TTT CTC AAG GTT CAA 1538 Asp Thr Asp Thr Trp Asn Pro Ser Thr Asp Arg Phe Leu Lys Val Gin 495 500 505 510

TAC AGT GCT AAT GAT CTA TAT GGA AAG TCA GCA AAC AAA GCA GCT CTT 1586 Tyr Ser Ala Asn Asp Leu Tyr Gly Lys Ser Ala Asn Lys Ala Ala Leu 515 520 525

AGG AAG CAG TTG AAG CTT GCT TCC ACA CAA GCT TCT CAA CCA TTA GTT 1634 Arg Lys Gin Leu Lys Leu Ala Ser Thr Gin Ala Ser Gin Pro Leu Val 530 535 540

GGT TGC ATT ACG AGG CTA GTT CCT CAA AAG GGT GTA CAT CTC ATC AGG 1682 Gly Cys Ile Thr Arg Leu Val Pro Gin Lys Gly Val His Leu Ile Arg 545 550 555

CAT GCA ATA TAT AAA ATA ACT GAG TTG GGT GGT CAA TTT GTT CTG CTG 1730 His Ala Ile Tyr Lys Ile Thr Glu Leu Gly Gly Gin Phe Val Leu Leu 560 565 570

GGT TCA AGT CCA GTA CAG CAT ATC CAG AGA GAG TTC GAG GGT ATT GCG 1778 Gly Ser Ser Pro Val Gin His Ile Gin Arg Glu Phe Glu Gly Ile Ala 575 580 585 590

GAC CAA TTT CAG AAC AAC AAC AAT GTC AGG CTG CTT TTG AAG TAT GAT 1826 Asp Gin Phe Gin Asn Asn Asn Asn Val Arg Leu Leu Leu Lys Tyr Asp 595 600 605

GAT GCT CTG GCA CAT ATG ATC TTT GCA GCA TCA GAC ATG TTC ATT GTT 1874 Asp Ala Leu Ala His Met Ile Phe Ala Ala Ser Asp Met Phe Ile Val 610 615 620

CCT TCT ATG TTT GAA CCA TGT GGC CTC ACT CAG ATG GTA GCT ATG CGA 1922 Pro Ser Met Phe Glu Pro Cys Gly Leu Thr Gin Met Val Ala Met Arg 625 630 635

TAT GGT TCT GTG CCA GTT GTT CGG AGA ACC GGC GGT TTG AAT GAC AGT 1970 Tyr Gly Ser Val Pro Val Val Arg Arg Thr Gly Gly Leu Asn Asp Ser 640 645 650

GTC TTC GAT TTG GAC GAT GAA ACG ATA CCC ATG GAG GTG CGA AAT GGC 2018 Val Phe Asp Leu Asp Asp Glu Thr Ile Pro Met Glu Val Arg Asn Gly 655 660 665 670

TTC ACC TTT TTG AAG GCT GAT GAG CAG GAT TTT GGT AAT GCA CTG GAA 2066 Phe Thr Phe Leu Lys Ala Asp Glu Gin Asp Phe Gly Asn Ala Leu Glu 675 680 685

AGA GCT TTC AAC TAC TAC CAC AGA AAA CCT GAA GTT TGG AAA CAG TTG 2114 Arg Ala Phe Asn Tyr Tyr His Arg Lys Pro Glu Val Trp Lys Gin Leu 690 695 700

GTG CAG AAA GAC ATG AAG ATA GAT TTC AGC TGG GAT ACT TCA GTT TCT 2162 Val Gin Lys Asp Met Lys Ile Asp Phe Ser Trp Asp Thr Ser Val Ser 705 710 715

CAA TAC GAA GAA ATC TAT CAG AAA ACA GCC ACT CGA GCC AGG GCA GCG 2210 Gin Tyr Glu Glu Ile Tyr Gin Lys Thr Ala Thr Arg Ala Arg Ala Ala 720 725 730

GCA TAAACAGCAG AGACATTGAG ACAGTTCCCT GCTGTCTCCA TGAAGTCTCC 2263

Ala

735

TAGATGCTGT GCTTAACCGT ATGGTAAAGA AATATGGTCT GTATCAGCTC AGAATTAAGC 2323

ATCTGCCGAG GAAGCGCGGT GCATCCGGAC TCGGGTGTAC AAGGGGCGAC GTGGCGTTAC 2383

GTGCAGTCCC CAACGAAGCA AAGAGACAGA AGTACAGCTG TACAGAACGG ATATCTTGTG 2443

AAGCACACAT TGGGATCAGG ACGTTTGGTG CTGCAGCTAC TTTCGGTGCA GAAGCACATA 2503

TATACGAGAC CTGCCAGGGC GAGCAAATAC CCAGTTATAC ACGCGATTGC TCAGCTCTAT 2563

CAAGCTGTGA ATTGAAAGAT TTCTATAGTG TATTCACGCG ACGTTTTCAT AAACTAGTGT 2623

GAGTTATGTA CTCTGACCAA AAAAAAAAA 2652

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 735 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

His Glu Asn Phe Leu Lys Gly Lys Leu Ile Glu Ile Thr Glu Thr Glu 1 5 10 15

Glu Ser Leu Phe Lys Leu Glu Lys Glu Cys Ala Leu Leu Asn Ala Ser 20 25 30

Leu Arg Glu Leu Glu Cys Thr Ser Thr Ser Ala Gin Ser Asp Val Leu 35 40 45

Lys Leu Gly Pro Leu Gin Gin Asp Ala Trp Trp Glu Lys Val Glu Asn 50 55 60

Leu Glu Asp Leu Leu Asp Ser Thr Ala Asn Gin Val Glu His Ala Ser 65 70 75 80

Leu Thr Leu Asp Gly Tyr Arg Asp Phe Gin Asp Lys Val Asp Lys Leu 85 90 95

Lys Ala Ser Leu Gly Thr Thr Asn Val Ser Glu Phe Cys Leu Tyr Leu 100 105 110

Val Asp Ile Leu Gin Gin Arg Val Lys Ser Val Glu Glu Arg Phe Gin 115 120 125

Ala Cys Asn His Glu Met His Ser Gin Ile Glu Leu Tyr Glu His Ser 130 135 140

Ile Val Glu Phe His Gly Thr Leu Ser Lys Leu Ile Asn Glu Ser Glu 145 150 155 160

Lys Lys Ser Met Glu His Tyr Ala Glu Gly Met Pro Ser Glu Phe Trp 165 170 175

Ser Arg Ile Ser Leu Leu Ile Asp Gly Trp Ser Leu Glu Lys Lys Ile 180 185 190

Ser Ile Asn Asp Ala Ser Met Leu Arg Glu Met Ala Trp Lys Arg Asp 195 200 205

Asn Arg Leu Arg Glu Ala Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Met Glu Glu Arg 210 215 220

Glu Leu Ile Asp Ser Phe Leu Lys Met Ala Leu Pro Gly Thr Ser Ser 225 230 235 240

Gly Leu His Ile Val His Ile Ala Ala Glu Met Ala Pro Val Ala Lys 245 250 255

Val Gly Gly Leu Ala Asp Val Ile Ser Gly Leu Gly Lys Ala Leu Gin 260 265 270

Lys Lys Gly His Leu Val Glu Ile Ile Leu Pro Lys Tyr Asp Cys Met 275 280 285

Gin His Asn Gin Ile Asn Asn Leu Lys Val Leu Asp Val Val Val Lys 290 295 300

Ser Tyr Phe Glu Gly Asn Met Phe Ala Asn Lys Ile Trp Thr Gly Thr 305 310 315 320

Val Glu Gly Leu Pro Val Tyr Phe Ile Glu Pro Gin His Pro Gly Lys 325 330 335

Phe Phe Trp Arg Ala Gin Tyr Tyr Gly Glu His Asp Asp Phe Lys Arg 340 345 350

Phe Ser Tyr Phe Ser Arg Val Ala Leu Glu Leu Leu Tyr Gin Ser Gly 355 360 365

Lys Lys Val Asp Ile Ile His Cys His Asp Trp Gin Thr Ala Phe Val 370 375 380

Ala Pro Leu Tyr Trp Asp Val Tyr Ala Asn Leu Gly Phe Asn Ser Ala 385 390 395 400

Arg Ile Cys Phe Thr Cys His Asn Phe Glu Tyr Gin Gly Ile Ala Pro 405 410 415

Ala Gin Asp Leu Ala Tyr Cys Gly Leu Asp Val Asp His Leu Asp Arg 420 425 430

Pro Asp Arg Met Arg Asp Asn Ser His Gly Arg Ile Asn Val Val Lys 435 440 445

Gly Ala Val Val Tyr Ser Asn Ile Val Thr Thr Val Ser Pro Thr Tyr 450 455 460

Ala Gin Glu Val Arg Ser Glu Gly Gly Arg Gly Leu Gin Asp Thr Leu 465 470 475 480

Lys Val His Ser Lys Lys Phe Val Gly Ile Leu Asn Gly Ile Asp Thr 485 490 495

Asp Thr Trp Asn Pro Ser Thr Asp Arg Phe Leu Lys Val Gin Tyr Ser 500 505 510

Ala Asn Asp Leu Tyr Gly Lys Ser Ala Asn Lys Ala Ala Leu Arg Lys 515 520 525

Gin Leu Lys Leu Ala Ser Thr Gin Ala Ser Gin Pro Leu Val Gly Cys 530 535 540

Ile Thr Arg Leu Val Pro Gin Lys Gly Val His Leu Ile Arg His Ala 545 550 555 560

Ile Tyr Lys Ile Thr Glu Leu Gly Gly Gin Phe Val Leu Leu Gly Ser 565 570 575

Ser Pro Val Gin His Ile Gin Arg Glu Phe Glu Gly Ile Ala Asp Gin 580 585 590

Phe Gin Asn Asn Asn Asn Val Arg Leu Leu Leu Lys Tyr Asp Asp Ala 595 600 605

Leu Ala His Met Ile Phe Ala Ala Ser Asp Met Phe Ile Val Pro Ser 610 615 620

Met Phe Glu Pro Cys Gly Leu Thr Gin Met Val Ala Met Arg Tyr Gly 625 630 635 640

Ser Val Pro Val Val Arg Arg Thr Gly Gly Leu Asn Asp Ser Val Phe 645 650 655

Asp Leu Asp Asp Glu Thr Ile Pro Met Glu Val Arg Asn Gly Phe Thr 660 665 670

Phe Leu Lys Ala Asp Glu Gin Asp Phe Gly Asn Ala Leu Glu Arg Ala 675 680 685

Phe Asn Tyr Tyr His Arg Lys Pro Glu Val Trp Lys Gin Leu Val Gin 690 695 700

Lys Asp Met Lys Ile Asp Phe Ser Trp Asp Thr Ser Val Ser Gin Tyr 705 710 715 720

Glu Glu Ile Tyr Gin Lys Thr Ala Thr Arg Ala Arg Ala Ala Ala 725 730 735