Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Isopropanol in wäßrigen Lösungen zur Steigerung der Trans¬ fektionseffizienz von Nucleinsäuren in pro- und eu- karyontischen Zellen.

Die DE 36 39 949 AI der Anmelderin betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren, insbesondere langkettiger Nucleinsäuren. Dabei werden wäßrige Lösungen (Puffer) relativ niedriger Ionenstärke verwendet, um die zunächst bei niedriger Ionenstärke an einer Anionenaus- tauschermatrix adsorbierten Nucleinsäure zu waschen. Danach werden die Nucleinsäuren mit Puffern höherer Ionenstärke von der Matrix desorbiert . Ethanol kann dabei unter anderem zur Präzipitation von Nucleinsäuren, insbesondere DNA, eingesetzt werden. Niedere Alkohole enthaltende Lösungen werden in der P 43 21904 der Anmelderin vorgeschlagen. Hierbei werden die niedere aliphatische Alkohole enthaltenden Lösungen in Zusammenwirkung mit chaotropen Ionen hoher Konzentration verwendet, um Nucleinsäuren an nicht mit Anionenaustauscher- gruppen modifizierten anorganischen Materialien zu ad¬ sorbieren.

Die so isolierte Nucleinsäure wird anschließend häufig durch chemische oder physikalische Methoden in eukaryontische oder prokaryontische Zellen eingeschleust. Dieses als Transf ktion bezeichnete Verfahren wird angewendet, um den regulatorischen Einfluß von bestimmten Genen bzw. deren Expressionsprodukte auf das Genom der Wirtszelle zu studieren. Solche Verfahren sind sehr arbeits- und zeitaufwendig, da regelmäßig 10 bis 14 Tage für die Durchführung und Auswertung eines einzelnen Experimentes eingeplant werden müssen. Daher ist man sehr daran interessiert, daß beispielsweise die zu untersuchende Plasmid-DNA in möglichst viele Zellen einer Zellkultur eingeschleust wird. Die als Transfektionseffizienz be¬ zeichnete Frequenz der Aufnahme angebotener Fremd-DNA ist von verschiedenen Faktoren abhängig. Neben der Qualität der Zellkultur und Art der Transfektionsmethode, hängt die Transfektionseffizienz üblicherweise ganz entscheidend von der Qualität bzw. Reinheit der verwendeten Plasmid-DNA ab.

In Ehlert et al., Biotechniques 14, 1993, 546, konnte gezeigt werden, daß Plasmid-DNA, die unter Verwendung des QIAGEN ^® Anionenaustauschermaterials gemäß des in DE 36 39 949 be¬ schriebenen Verfahrens präpariert wurde, eine bis zu 70% bessere Transfektionseffizienz ergibt, als die über Caesium- chlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigte DNA.

Durch die Verwendung von Isopropanol in wäßrigen Lösungen, die zur Isolierung von Nucleinsäuren eingesetzt werden, konnte überraschenderweise die aus Biotechniques 14, 1993, 546 bekannte Transfektionsrate um bis zu 20% gesteigert werde .

Die Erfindung betrifft somit eine gegenüber der aus der DE 36 39 949 AI bekannten Isolierung eine Isolierung von Nucleinsäuren, die eine bessere Transfektionsrate aufweist, durch die Verwendung von isopropanolhaltigen wäßrigen Lösun¬ gen zur Trennung und Isolierung der Nucleinsäuren an Anionen- austauschern.

In einer bevorzugten Verwendungsform wird dabei das Isopro¬ panol in einer Menge von 1 - 50 Vol.-%, insbesondere 5 - 25 Vol.-%, besonders bevorzugt von 10 bis 15 Vol.-%, in den wäßrigen Lösungen vorliegen. Dabei können die wäßrigen Lösungen insbesondere auch für Anionenaustauscher übliche chromatographische Salze mono- oder divalenter Kationen, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, etc. oder Kombinationen davon, enthalten. Die wäßrigen Lösungen sind vorzugsweise mit in der Molekularbiologie gebräuchlichen Puffersubstanzen, wie TRIS/HC1, MOPS, etc., gepuffert und weisen pH-Werte zwischen 6 und 9 auf.

Die erfindungsgemäße Verwendung des Isopropanols läßt sich insbesondere bei der Isolation von DNA, wie Plasmid-DNA, anwenden, ist jedoch nicht auf diese DNA-Arten beschränkt.

Die unter erfindungsgemäßer Verwendung von Isopropanol er¬ haltenen Nucleinsäuren sind insbesondere für den Einsatz in gentherapeutischen Verfahren geeignet.

Erfindungsgemäß werden ebenfalls Lösungen beansprucht, die Isopropanol in Mengen von 5 bis 60 Vol.-% enthalten können. Dies sind insbesondere die Waschpuffer, die gemäß DE 36 39 949 AI eingesetzt werden können. Diese Puffer enthalten 0,5 bis 1,5 M Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, 20 bis 80 mM MOPS oder TRIS/HCl bei einem pH-Wert von 6 bis 8. Er¬ findungsgemäß ebenfalls beansprucht werden wäßrige Lösungen unter Verwendung von 5 bis 60 Vol.-% Isopropanol enthaltend darüber hinaus 1,0 bis 2,0 M Natriumchlorid oder Kalium¬ chlorid, 20 bis 80 mM TRIS/HCl bei einem pH-Wert von 8 bis 9.

Die DE 39 13 814 AI beschreibt in allgemeiner Form wäßrige Systeme in Puffern, die zur Elektroelution von Gelen ver¬ wendet werden können. Die dort beschriebenen Puffersysteme weisen beispielsweise Natriumchlorid, Puffersalze, wie MOPS, und niedere Alkohole, insbesondere Cl bis C4-Alkohole, auf.

Die Salzkonzentration dieser Puffer ist jedoch recht hoch, da ausdrücklich 1,5 M Natriumchlorid oder mehr verlangt werden.

In bevorzugter Weise kann ein isopropanolhaltiges wäßriges System bei dem Verfahren zur Abreicherung oder Entfernung von Endotoxinen, wie es in der deutschen Patentanmeldung P 44 31 125.7 vorgeschlagen wird, eingesetzt werden. Diese Patentanmeldung schlägt ein Verfahren vor, bei dem Endotoxine aus für den therapeutischen Einsatz vorgesehenen Wirkstoff enthaltenden Präparaten abgereichert oder entfernt werden. Die Präparate werden dabei vorzugsweise gen- und/oder bio¬ technologisch aus natürlichen Quellen gewonnen. Die Ab¬ reicherung oder Entfernung der Endotoxine erfolgt durch Behandlung der Proben mit chromatographischem Material, wobei die natürlichen Quellen aufgeschlossen werden, die erhaltenen Fraktionen gegebenenfalls zentrifugiert, filtriert oder mit affinitätschromatographischem Material behandelt werden. Die erhaltenen Fraktionen werden mit einer wäßrigen Salzlösung und Detergenzien vorinkubiert, mit Anionenaustauschermaterial behandelt und danach mit einer weiteren Salzlösung gewaschen. Die Wirkstoffe werden von dem Anionenaustauscher eluiert, um dann in an sich bekannter Weise weiter aufgereinigt zu werden. Wird beispielsweise Nucleinsäure isoliert, die in gentherapeutischen Verfahren eingesetzt werden kann und einer Endotoxinentfernung oder Abreicherung gemäß P 44 31 125.7 unterzogen wurde, so kann eine Steigerung der Transfektions- effizienz bis zu 50% beobachtet werden im Vergleich zu Präparationen, in denen Ethanol in den Präparationslösungen verwendet wurde.

Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels näher erläutert.

Beispiel 1

Als Nucleinsäuren wurden im folgenden Plasmid-DNA aus E. coli analog dem in DE 36 39 949 AI genannten Verfahren getrennt und isoliert. Dabei wird die Nucleinsäure an dem in der DE 36 39 949 AI beschriebenen Anionenaυstauschermaterial (QIAGEN ^® , Diagen GmbH, Deutschland) adsorbiert. Es wurde mit einem Puffer der Zusammensetzung 1,0 M NaCl, 50 M MOPS, 15% Isopropanol, pH 7,0 gewaschen. Danach wurde die Plasmid-DNA mit dem isopropanolhaltigen Puffer der Zusammensetzung 1,25 M NaCl, 50 mM TRIS/HCl, 15 Vol.-% Isopropanol, pH 8,5 eluiert.

Dabei zeigte sich, daß die Ausbeute von Plasmid-DNA aus E. coli gegenüber der bekannten Präparation unter Verwendung von Ethanol um ca. 10% gesteigert werden konnte.

Mit der so erhaltenen DNA wurden dann Transfektions- experimente durchgeführt. Die Transfektionseffizienz wurde über die Messung der lacZ-Aktivität bestimmt, wobei NIH 3T3- Zellen verwendet wurden. Diese Zellen wurden mit Hilfe der Kalziumphosphatmethode (Graham, F. L. and A. J. van der Eb (1973) "A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA", Virology 52: 456 - 467) mit 1 μg des Reporterkonstrukts pRSVlacZ transfiziert (Lucibello, F. c. and R. Müller (1989) "Sensitive microscale assay for the analysis of promotor activity in eukaryotic cells", Methods Mol. Biol. 1: 9 - 18) .

Die Tabelle zeigt die Transfektionseffizienz bei Verwendung verschiedener Alkohole, Ethanol reinst und vergällt, Iso¬ propanol und n-Butanol.

% lacZ-.Aktivität

Experiment No. 15% Ethanol 15% Ethanol 15% Iso¬ 15% reinst vergällt propanol n-Butanol in Puffer in Puffer in Puffer in Puffer QBT, QC, QF QBT, QC, QF QBT, QC, QF QBT, QC, QF

1 80 78 95 20

2 75 70 92 12

3 70 70 98 9

4 85 80 100 15

5 83 78 97 18

Deutlich erkennbar wird aus den Angaben der Tabelle die überraschend hohe Transfektionseffizienz von DNA, die mit isopropanolhaltigen Puffern gewonnen wurden.

Beispiel 2

Plasmid-DNA wurde gemäß Beispiel 1 isoliert. Das Lysat wurde jedoch vor dem Auftragen auf die Anionenaustauschersäule über eine lose Schüttung von Diatomeenerde, wie in der deutschen Patentanmeldung P 44 32 654.8 beschrieben, gegeben. An¬ schließend wurde eine Endotoxinabreicherung gemäß dem in P 44 31 125.7 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Dabei wurde eine wäßrige Lösung verwendet, die 750 mM Natrium¬ chlorid, 10% Triton-X-100/50 mM MOPS beinhaltete bei einem pH von 7,0, eingesetzt. Die so präparierte DNA wurde mit Hilfe von kationischen Liposomen (DOTAP, Boehringer Mannheim) in LMH-Leberzellen transfiziert. Dabei zeigt sich eine 50%ige Steigerung der Transfektionseffizienz verglichen mit einer DNA-Präparation gemäß dem Stand der Technik aus DE 36 39 664.9 AI.