[Domaine de l'invention]

La présente invention concerne le domaine de l'enrobage de nucléus dans le cadre de la perliculture (production de perles par des huîtres perlières). La présente invention a donc pour objet un nucléus revêtu d'un film homogène présentant des propriétés antibactériennes, et permettant d'améliorer la qualité de la perle obtenue et de réduire la mortalité consécutive à l'insertion dudit nucléus dans l'huître perlière receveuse et le phénomène de rejet de nucléus.

[État technique antérieur à l'invention]

La perliculture est une activité humaine consistant en la culture, en milieu naturel, d'huîtres perlières Pinctada sp en vue de la production de perles de culture. La première étape concerne la collecte et l'élevage des huîtres perlières qui serviront soit d'huître donneuse soit d'huître receveuse. La greffe consiste en l'opération chirurgicale au cours de laquelle le greffon, une partie de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse (environ 4 mm ² ) est inséré dans la poche perlière de l'huître receveuse, en combinaison avec une bille de nacre, le nucléus. Une fois insérée dans l'huître receveuse, la bordure épithéliale du greffon se multiplie et tapisse la poche perlière pour donner le sac perlier qui englobe le nucléus. Ledit sac perlier dépose des couches de nacre autour du nucléus, résultant en la production de la perle (Montagnani et al., 2009). Afin de garantir la production d'une perle de qualité, la surface du nucléus doit être la plus régulière possible, sans irrégularités.

Des mortalités et des rejets de nucléus se produisent pendant environ 45 jours après la greffe, à des taux variables. Ces phénomènes, qui touchent de 40 à 50% des huîtres dans les trois semaines suivant l'intervention, semblent résulter de pathologies infectieuses, ou d'une pratique de greffe inadaptée. Le développement d'une réaction inflammatoire suite à l'insertion du nucléus et la contamination par des bactéries pathogènes, combinées à l'absence de cicatrisation rapide des tissus incisés lors de la greffe sont probablement les causes principales de rejet de nucléus (Cochennec et al., 2010).

Il existe donc un besoin de procédés ayant pour résultat la diminution du taux d'échec des opérations de greffe, se traduisant notamment par la diminution de la mortalité et du rejet de nucléus, tout en garantissant la production de perles de première qualité.

La demande de brevet JP05219856 décrit l'insertion dans l'huître receveuse, pendant l'étape de greffe et en parallèle du nucléus ou au moyen du nucléus, d'un matériau solide contenant à sa surface un polymère hydrosoluble associé à un antibiotique.

La demande de brevet japonais JP02308869 revendique l'utilisation d'un nucléus recouvert d'un polymère synthétique associé à un agent antisalissure pour améliorer notamment la qualité des perles obtenues, en augmentant l'homogénéité de la surface du nucléus, et pour diminuer les phénomènes de rejet et de mortalité, en évitant par exemple la colonisation du nucléus par divers parasites.

Le brevet US6514614 décrit l'enrobage du nucléus par un polymère hydrosoluble, associé à une substance ayant une activité antibactérienne, ledit polymère étant partiellement dissous par l'eau de mer (le taux de dissolution étant supérieur à 25%) pour permettre une diminution effective des frictions et de la résistance à l'insertion dudit nucléus.

Enfin, la demande de brevet japonais JP03183424 décrit un système d'enrobage du nucléus par un polymère hydrosoluble (ou par tout autre composé permettant une administration différée), permettant l'administration à un taux contrôlé d'un antibiotique associé audit polymère.

Cependant, les solutions proposées dans les publications citées ci-dessus posent un problème environnemental, du fait de la biodégradabilité nulle ou incomplète des éléments utilisés, qu'il s'agisse des agents d'enrobage synthétiques ou des antibiotiques. D'autre part, l'utilisation d'antibiotiques pose également un problème de santé publique, par le biais du développement de résistances bactériennes. Enfin, l'emploi de polymères hydrosolubles entraîne une limitation de l'action de ces composés dans le temps, avec une disparition progressive du composé d'enrobage lors de l'immersion des huîtres dans le milieu aqueux.

De façon surprenante, l'Inventeur a remarqué que l'enrobage du nucléus par un film de polyhydroxyalcanoate (PHA), un polymère naturel, biodégradable et non hydrosoluble, permet de réduire le taux d'échec des opérations de greffe, et d'améliorer la qualité des perles obtenues.

Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les Inventeurs proposent que l'enrobage du nucléus par un film de PHA permettrait d'homogénéiser la surface du nucléus, limitant ainsi la présence d'irrégularités de surface sur la perle. D'autre part, les PHA pourraient limiter l'adhésion de bactéries sur le nucléus, et la croissance bactérienne. Cet effet intrinsèque des PHA, couplé à l'association dudit film de PHA avec des agents bactéricides ou bactériostatiques, comme par exemple les peptides antimicrobiens (PAM), permettrait ainsi de diminuer l'occurrence de contaminations microbiennes. La présence des PHA seuls ou en combinaison avec un agent bactéricide ou bactériostatique permettrait alors de diminuer les échecs de l'étape de greffe, et notamment de diminuer la mortalité des huîtres receveuses et le rejet de nucléus par lesdites huîtres.

[Résumé]

La présente invention concerne un nucléus revêtu ou enrobé d'un film comprenant un ou plusieurs polyhydroxyalcanoates (PHA). Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit PHA est un polymère de HB (PHB), un polymère de HV (PHV) ou copolymère HB-HV (PHB-V).

La présente invention concerne également un PHA, caractérisé en ce qu'il est de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 70/30.

La présente invention concerne en outre une composition et un film comprenant ou consistant en un PHA tel que décrit ci-dessus. Un autre objet de la présente invention est une composition ou un film comprenant un PHA et de l'acide zostérique.

Un autre objet de la présente invention est une composition ou film comprenant un PHA et une ou plusieurs molécules bioactives, choisies parmi les agents cicatrisants ou anti-inflammatoires et les agents bactéricides ou bactériostatiques, tels que par exemple les antibiotiques chimiques et les peptides antimicrobiens.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un film tel que décrit ci-dessus, pour recouvrir une surface, ladite surface étant un nucléus de perliculture ou une surface amenée à être en contact, de préférence en contact répété ou prolongé, avec de l'eau, telle que par exemple de l'eau de mer ou de l'eau douce, ladite surface étant, par exemple, la surface d'un bac, par exemple d'un bac en matière plastique ou métallique, utilisé en aquaculture, de préférence en pisciculture, ou les supports et cordages utilisés lors de l'élevage des huîtres.

Un autre objet de la présente invention est donc une surface recouverte d'un film tel que décrit ci-dessus, ladite surface étant de préférence un nucléus.

La présente invention concerne également un procédé de protection des surfaces, comprenant le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de ladite surface par un film tel que décrit ci-dessus.

La présente invention concerne en outre un procédé d'obtention d'un nucléus tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant une première étape consistant en l'immersion du nucléus dans une solution comprenant un ou plusieurs PHA à une concentration de 0.1 à 10% en poids par rapport au volume de la solution, dans du trifluoroéthanol, ladite première étape étant éventuellement suivie d'une seconde étape consistant en l'immersion du nucléus dans une solution comprenant un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques à une concentration de 1 à 10 CMI.

La présente invention concerne également un deuxième procédé d'obtention d'un nucléus tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant une seule étape consistant en l'immersion du nucléus dans une solution comprenant des PHA à une concentration de 0.05 à 10% en poids par rapport au volume total de la solution et un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques à une concentration de 1 à 10 CMI dans du trifluoroéthanol.

Un autre objet de l'invention est un troisième procédé d'obtention d'un nucléus tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant une seule étape consistant en l'utilisation d'un spray pour pulvériser une composition telle que décrite ci-dessus à l'aide d'un spray sur le nucléus.

La présente invention concerne donc également un spray comprenant ou consistant en une composition telle que décrite ci-dessus.

Un autre objet de l'invention est une huître comprenant un nucléus tel que décrit ci-dessus ou obtenu par l'un des procédés de l'invention.

Encore un autre objet de l'invention est un procédé de greffe d'une huître perlière receveuse comprenant l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon, correspondant à de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse, en combinaison avec un nucléus tel que décrit ci-dessus ou obtenu par l'un des procédés tel que décrit ci-dessus.

La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'une perle de perliculture, comprenant le procédé de greffe décrit ci-avant.

La présente invention concerne en outre une perle obtenue par le procédé de fabrication d'une perle tel que décrit ci-dessus, ou comprenant le nucléus selon l'invention, ou comprenant le film selon l'invention sous une ou plusieurs épaisseurs de nacre.

Un autre objet de l'invention est un procédé d'amélioration de la qualité de la perle et/ou de réduction de l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec correspondant à une mortalité ou à un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse, et ledit procédé comprenant la greffe de l'huître receveuse par un nucléus tel que décrit ci-dessus.

La présente invention concerne également l'utilisation du nucléus selon l'invention, pour réduire l'échec de greffe et/ou améliorer la qualité de la perle obtenue. [Description détaillée]

En perliculture, la production de la perle résulte du dépôt de nacre sur un nucléus inséré dans l'huître receveuse lors de l'étape de greffe. L'étape de greffe du nucléus présente généralement un taux d'échec élevé, du fait d'une faible cicatrisation de l'huître receveuse au niveau de l'incision pratiquée lors de la greffe, ou de contaminations bactériennes. Ainsi, les nucléi utilisés en perliculture sont de plus en plus souvent recouverts d'un revêtement permettant de diminuer l'échec de l'étape de greffe, et de garantir l'homogénéité de la surface du nucléus, résultant en une perle de haute qualité.

La présente invention concerne donc un nucléus revêtu ou enrobé d'un film comprenant un ou plusieurs polyhydroxyalcanoates (PHA). Suivant un mode de réalisation de l'invention, le film de PHA est continu autour du nucléus. Suivant un mode de réalisation de l'invention, le film de PHA présente une épaisseur de 0.1 à 200 μιη, de préférence de 1 à 100 μιη, plus préférentiellement de 5 à 50 μιη.

Il a été clairement démontré que certaines bactéries avaient la capacité de synthétiser, dans des conditions contrôlées, des polymères dont les PHA (polyhydroxyalcanoates) en réponse à des conditions de déséquilibre nutritionnel.

Les PHA bactériens sont des polyesters naturels, 100 % biodégradables et issus de ressources renouvelables. Ces biopolymères sont accumulés au sein des cellules bactériennes sous forme de granules lorsqu'un nutriment nécessaire à la croissance bactérienne devient limitant en présence d'un excès de substrat carboné. Les propriétés physico-chimiques des PHA dépendent de leur composition chimique, elle-même influencée par la nature de la source carbonée utilisée pour la croissance des bactéries et la synthèse de PHA. Ces biopolymères peuvent être produits à l'échelle industrielle et, de par une composition complexe et propre à chaque microorganisme, possèdent des propriétés rhéologiques, physico-chimiques et biologiques leur conférant des applications dans de nombreux secteurs industriels. Au rang de ces propriétés, on peut notamment relever les propriétés adhésives et filmogènes. Les PHA présentent également l'avantage de ne pas être solubles dans l'eau. Les PHA sont des polymères de type polyester constitués de la répétition de l'unité monomérique ci-dessous : dans laquelle R est un groupe alkyl ou alkényl de taille variable, et m et n sont des entiers, de préférence m est égal à 1 ou 2, plus préférentiellement m est égal à 1.

Les PHA peuvent être divisés en 3 classes : les PHAscl (short chain lenght) constitués d'acides hydroxyalcanoïques comptant jusqu'à 5 atomes de carbone, les PHAmcl (médium chain lenght) dont les unités monomériques comptent 6 à 12 atomes de carbone, et les PHAlcl (long chain lenght) dont les unités constitutives comptent de 12 à 16 carbones. Les premiers (sel) sont rigides et cassants tandis que les seconds (mcl et Ici) entrent dans la catégorie des élastomères et adhésifs.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les PHA utilisés dans l'invention sont obtenus par fermentation de bactéries issues de tapis microbiens.

Selon un mode de réalisation, lesdits PHA sont synthétisés dans des conditions contrôlées (déséquilibre nutritionnel et énergétique généré par la limitation d'un élément nécessaire à la croissance bactérienne en présence d'un excès d'une source de carbone) lors de la fermentation de bactéries issues de tapis microbiens. Suivant un mode de réalisation, ces PHA sont choisis parmi ceux synthétisés par des bactéries du genre Pyrococcus sp, Vibrio sp, Alteromonas sp, Pseudomonas sp ou Pseudoalteromonas sp, conformément à la taxonomie en vigueur au jour de la présente invention. Si la taxonomie devait être modifiée, l'homme du métier pourrait adapter les modifications de taxonomie pour en déduire les PHA utilisés dans l'invention. Avantageusement, ces bactéries sont des bactéries hétéro trophes, aérobies, mésophiles.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les bactéries productrices des PHA utilisés dans l'invention sont cultivées pendant 1 à 5 jours, de préférence pendant 2 à 4 jours, plus préférentiellement pendant environ 3 jours sur un milieu appauvri en azote et enrichi en source de carbone dans des conditions suivantes : salinité 35 o, température 30°C, pH 7.6. Selon un mode de réalisation de l'invention, le milieu de culture des bactéries contient une ou plusieurs sources de carbone, de nature carbohydrate ou acide gras. Selon un mode de réalisation de l'invention, la ou les sources de carbone sont sélectionnées parmi le groupe comprenant le glucose, le glycérol, l'acétate, le benzoate, l'octanoate, le pyruvate, le propionate, le valérate, et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation de l'invention, la concentration totale en sources de carbone dans le milieu de culture varie de 1 à 30 g/L, de préférence de 5 à 20 g/L, plus préférentiellement est d'environ 10 g/L. Selon un mode de réalisation, la nature du PHA produit par les bactéries productrices varie selon la concentration en source carbonée, le type de source de carbone utilisée, et, dans le cas d'un mélange, selon le ratio des différentes sources utilisées.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les PHA utilisés dans l'invention sont extraits des bactéries productrices par une méthode comprenant l'extraction du culot bactérien par utilisation de solvants organiques et/ou inorganiques, préférentiellement organiques. Selon un mode de réalisation de l'invention, les PHA sont récupérés par une extraction à l'aide d'un solvant sélectionné dans le groupe comprenant le chloroforme et le dichlorométhane, suivie d'une précipitation du polymère PHA dans l'éthanol.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les PHA utilisés dans l'invention sont des PHA à chaîne courte. Les PHA à courte chaîne sont constitués de monomères d'acide hydroxybutyrique (HB) et/ou d'acide hydroxyvalérique (HV). Des exemples de PHA à courte chaîne sont le PHB (polyhydroxybutyrate), dans lequel R est CH ₃ et m est 1 et le PHB-V (poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)), dans lequel R est CH ₃ ou CH ₂ -CH ₃ et m est 1.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHA utilisé dans l'invention est choisi parmi le groupe comprenant des polymères de HB (PHB), des polymères de HV (PHV) et des co-polymères HB-HV (PHB-V).

Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 70/30. Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 65/35. Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 60/40. Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 55/45. Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB- V, dans lequel le ratio HB/HV est égal à 50/50. Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est égal à 64/36.

Selon un mode de réalisation, le PHB-V selon l'invention possède des propriétés adhésives et/ou filmo gènes.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHB-V selon l'invention n'est pas soluble dans l'eau.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHB-V de l'invention est obtenu par fermentation de bactéries issues de tapis microbiens, de préférence de bactéries marines issues de tapis microbiens.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHB-V de l'invention est synthétisé dans des conditions contrôlées (déséquilibre nutritionnel et énergétique généré par la limitation d'un élément nécessaire à la croissance bactérienne en présence d'un excès d'une source de carbone) lors de la fermentation de bactéries issues de tapis microbiens.

Suivant un mode de réalisation, ce PHB-V est choisi parmi ceux synthétisés par des bactéries du genre Pyrococcus sp, Vibrio sp, Alteromonas sp, Pseudomonas sp ou Pseudoalteromonas sp conformément à la taxonomie en vigueur au jour de la présente invention. Si la taxonomie devait être modifiée, l'homme du métier pourrait adapter les modifications de taxonomie pour en déduire les PHB-V de l'invention. Avantageusement, ces bactéries sont des bactéries hétéro trophes, aérobies, mésophiles.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les bactéries productrices du PHB- V selon l'invention sont cultivées sur un milieu appauvri en azote et enrichi en source de carbone dans des conditions suivantes : salinité 35 o, température 30°C, pH 7.6.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHB-V selon l'invention est extrait de bactéries productrices par une méthode comprenant l'extraction du culot bactérien par utilisation de solvants organiques et/ou inorganiques, préférentiellement organiques. Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHB-V est récupéré par une extraction à l'aide d'un solvant sélectionné dans le groupe comprenant le chloroforme et le dichlorométhane, suivie d'une précipitation du polymère PHA dans l'éthanol.

Un objet de l'invention est une composition comprenant ou consistant en un PHB-V tel que décrit ci-dessus.

Un autre objet de l'invention est un film comprenant ou consistant en un PHB- V selon l'invention. Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit film de PHB-V présente une épaisseur de 0.1 à 200 μιη, de préférence de 1 à 100 μιη, plus préférentiellement de 5 à 50 μιη.

Encore un autre objet de l'invention est un film comprenant ou consistant en un PHB-V selon l'invention pour recouvrir une surface. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite surface est un nucléus de perliculture. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite surface est une surface amenée à être en contact, de préférence en contact répété ou prolongé, avec de l'eau, telle que par exemple de l'eau de mer ou de l'eau douce. Selon ce mode de réalisation, ladite surface peut être, par exemple, la surface d'un bac, par exemple d'un bac en matière plastique ou métallique, utilisé en aquaculture, de préférence en pisciculture. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les surfaces recouvertes par un film comprenant ou consistant en un PHB-V selon l'invention sont utilisées dans le cadre de la perliculture, telles que, par exemple, les supports et cordages utilisés lors de l'élevage des huîtres.

Un autre objet de l'invention est un procédé de protection des surfaces, comprenant le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de ladite surface par un film comprenant ou consistant en un PHB-V selon l'invention. Le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de la surface à protéger permettrait de prévenir la formation d'un biofilm primaire, et consécutivement d'un biofilm bactérien indésirable sur ladite surface. Selon un mode de réalisation, lesdites surfaces sont choisies parmi celles citées ci-dessus.

La composition ou le film de PHB-V selon l'invention peuvent être utiles pour inhiber la croissance bactérienne. En effet, le PHB et le PHB-V sont dégradés en acide β-hydroxybutyrique par l'action de dépolymérases bactériennes et fongiques, par les tissus animaux ou sous conditions alcalines ou acides. Différentes études ont montré que l'acide hydroxybutyrique est un acide gras volatile à courte chaîne, possédant une action inhibitrice sur la croissance bactérienne (Van Immerseel, 2003 et Defoirdt, 2007). Les acides gras volatiles à courte chaîne (dont l'acide hydroxybutyrique) seraient capables de franchir la membrane cellulaire des bactéries et de se dissocier dans le milieu alcalin du cytoplasme, augmentant ainsi la concentration intracellulaire en proton. En conséquence, les cellules bactériennes utiliseraient de l'énergie pour maintenir leur pH intracellulaire à un niveau optimal. Cette énergie ne pourrait pas être utilisée pour d'autres processus métaboliques, la croissance des cellules est donc inhibée. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, l'Inventeur propose l'hypothèse selon laquelle, une fois le nucléus enrobé d'un film de PHB-V selon l'invention introduit dans l'huître receveuse, les tissus de ladite huître dégraderaient les PHB-V en acide hydroxybutyrique, inhibant ainsi la croissance bactérienne.

Suivant un mode de réalisation, le ou les PHA, notamment le ou les PHB-V selon l'invention sont natifs. Suivant un autre mode de réalisation, le ou les PHA, notamment le ou les PHB-V selon l'invention peuvent être chimiquement ou physiquement modifiés. Suivant un mode de réalisation de l'invention, le PHA utilisé dans l'invention est modifié par ajout de groupement(s) sulfate, sulfonate, acétate, lactate, succinate, pyruvate, ou de groupements modifiant la balance hydrophobe/hydrophile des PHA résultant, de préférence lesdits groupements sont sélectionnés parmi le groupe comprenant les groupements époxyde, alcool, acide carboxylique. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le PHA utilisé dans l'invention est modifié par dépolymérisation afin d'obtenir des polymères de plus bas poids moléculaire. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le PHA utilisé dans l'invention est modifié par greffage d'un polymère, de préférence d'un oligomère, telle que par exemple un exopolysaccharide (EPS).

Il a été démontré que certaines bactéries ont la capacité de synthétiser, dans des conditions contrôlées, des exopolymères dont les exopolysaccharides (EPS), en réponse à des conditions de déséquilibre nutritionnel. Les exopolysaccharides peuvent être définis comme des macromolécules formées de l'enchaînement de glucides similaires (appelés couramment sucres ou oses). Ces exopolysaccharides peuvent être produits à l'échelle industrielle, et possèdent, entre autres propriétés, des propriétés adhésives (liées à la fonction de ces molécules dans la nature) et filmogènes.

Les EPS peuvent être produits par de nombreux microorganismes tels que des bactéries gram positive ou gram négative, des archeae, des champignons, et quelques algues. Avantageusement, les EPS sont produits par des bactéries gram positives ou gram négatives, des archeae ou des algues.

Les EPS peuvent être extraits à partir de cultures de microorganismes par des méthodes d'extraction physiques ou chimiques bien connues comme par exemple sonication, centrifugation, traitement alcalin, extraction à l'éthanol, extraction enzymatique...

Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS peuvent être choisis parmi ceux produits par des organismes marins tels que Bacillus, Halomonas, Planococcus, Enterobacter, Alteromonas, Pseudoalteromonas, Rhodococcus, Zoogloea, Cyanobactéries, Vibrio, comme décrit dans Satpute et al. (Biotechnology Advances 2010, 28 :436-450). Si la taxonomie devait être modifiée, l'homme du métier pourrait adapter les modifications de taxonomie pour en déduire les EPS pouvant être utilisés dans l'invention.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS peuvent être obtenus par fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds. Plus particulièrement, ces EPS sont ceux synthétisés dans des conditions contrôlées (déséquilibre nutritionnel généré par un rapport Carbone/ Azote élevé dû à un milieu nutritionnel enrichi en carbohydrates) lors de la fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds (voir par exemple Guezennec, J. (2002). Deep- sea hydrothermal vents: A new source of innovative bacterial exopolysaccharides of biotechnological interest? Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 29: 204- 208).

Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS sont choisis parmi HE 800, EPS 721, M0245, GG1, HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, et HYD 1666, de préférence MO 245, HE 800, GG1, HYD 721 et ST 716.

Suivant un mode de réalisation, les EPS sont natifs. Suivant un autre mode de réalisation, les EPS peuvent être chimiquement ou physiquement modifiés (comme par exemple par ajout de groupement(s) sulfate, acétate, lactate, succinate ou pyruvate).

De façon tout à fait inattendue, les Inventeurs ont remarqué que l'utilisation d'un nucléus recouvert d'un film de PHA, préférentiellement de PHB-V selon l'invention diminue la mortalité des huîtres receveuses consécutivement à la greffe. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, l'Inventeur suggère que la présence d'un film de PHA à la surface du nucléus modifie les propriétés physico-chimiques de la surface, limitant la formation d'un biofilm primaire, et consécutivement celle du biofilm indésirable. La présence d'un biofilm indésirable à la surface du nucléus pourrait résulter en une contamination bactérienne des tissus de l'huître, et en une mortalité de ladite huître.

Un autre objet de l'invention est une composition ou un film comprenant ou consistant en un ou plusieurs PHA, préférentiellement en un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, associé à un agent renforçant l'inhibition de formation des biofilms du ou des PHA, de préférence ledit agent est l'acide zostérique. L'acide zostérique est décrit comme permettant la prévention de la formation de biofilms sur des surfaces (US5384176, US607741, incorporés par référence).

Selon un mode de réalisation de l'invention, l'association entre le film de PHA et le ou les agents décrits ci-dessus résulte d'un phénomène d'adsorption ou d'une réaction chimique entre les PHA et lesdits agents.

Suivant un mode de réalisation, l'acide zostérique est natif. Suivant un autre mode de réalisation, l'acide zostérique peut être un dérivé modifié chimiquement, préférentiellement un dérivé de l'acide zostérique est un ester d'acide zostérique tel que décrit dans US2007/128151, incorporée par référence. Suivant un mode de réalisation préféré, le dérivé de l'acide zostérique est un dérivé acide de l'acide zostérique.

Suivant un mode de réalisation, l'acide zostérique est extrait de l'algue Zostera marina. Un autre objet de l'invention est un film comprenant ou consistant en un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention associé à un agent renforçant l'inhibition de formation des biofilms du ou des PHA, de préférence l'acide zostérique pour recouvrir une surface.

Selon un mode de réalisation, ladite surface est un nucléus.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite surface est une surface amenée à être en contact, de préférence en contact répété ou prolongé, avec de l'eau, telle que par exemple de l'eau de mer ou de l'eau douce. Selon ce mode de réalisation, ladite surface peut être, par exemple, la surface d'un bac, par exemple d'un bac en matière plastique ou métallique, utilisé en aquaculture, de préférence en pisciculture. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les surfaces recouvertes par un film comprenant ou consistant en un PHB-V selon l'invention sont utilisées dans le cadre de la perliculture, telles que, par exemple, les supports et cordages utilisés lors de l'élevage des huîtres.

Un autre objet de l'invention est un procédé de protection des surfaces, comprenant le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de ladite surface par un film comprenant ou consistant en un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB- V selon l'invention, associé à un agent renforçant l'inhibition de formation des biofilms du ou des PHA, de préférence l'acide zostérique tel que décrit ci-dessus. Le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de la surface à protéger permettrait de prévenir la formation d'un biofilm primaire, et consécutivement d'un biofilm bactérien indésirable sur ladite surface. Selon un mode de réalisation, lesdites surfaces sont choisies parmi celles citées ci-dessus.

Un autre objet de l'invention est une composition ou un film comprenant ou consistant en un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, associé à une ou plusieurs molécules bioactives.

Selon un mode de réalisation de l'invention, l'association entre le film de PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, et la ou les molécules bioactives résulte d'un phénomène d'adsorption ou d'une réaction chimique entre les PHA et lesdites molécules. Suivant un mode de réalisation, ces molécules bioactives sont des agents cicatrisants ou anti-inflammatoires tels que collagène, fibrinogène, laminine, ou facteurs de croissance. En perliculture, l'ajout d'un agent cicatrisant ou anti-inflammatoire sur le nucléus pourrait permettre d'accélérer la cicatrisation de l'incision réalisée pendant la greffe, ou d'en limiter l'inflammation, phénomène pouvant conduire à la mort de l'huître.

Suivant un autre mode de réalisation, ces molécules bioactives sont des agents bactéricides ou bactériostatiques. En perliculture, l'ajout d'un agent bactéricide ou bactério statique sur le nucléus permettrait de limiter l'occurrence de contaminations bactériennes chez l'huître receveuse, pouvant conduire à un rejet du nucléus ou à la mort de ladite huître.

Suivant un mode de réalisation de l'invention, les agents bactéricides ou bactériostatiques sont choisis parmi les antibiotiques chimiques comme par exemple la tétracycline, kanamycine, sulfamonométhoxyne, ampicilline.

Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, les agents bactéricides ou bactériostatiques sont choisis parmi les peptides antimicrobiens (PAM). Les peptides antimicrobiens (PAM) sont des molécules effectrices de l'immunité innée, conservées au cours de l'évolution et répandues dans tout le règne vivant. Une grande variété de PAM a été identifiée au cours des dernières années, révélant une grande diversité en termes de structures, tailles et modes d'action. Les PAM sont généralement caractérisés par une forte représentativité en acides aminés cationiques et hydrophobes. Ces molécules ont le plus souvent un caractère amphiphile essentiel pour leur interaction avec les membranes bactériennes (Bulet et al. 2004). Les PAM tuent les microorganismes, soit en perméabilisant leur membrane par un effet de type détergent ou par la formation de pores, soit par le blocage de la synthèse de peptidoglycane composant la paroi bactérienne, soit encore par l'inhibition des voies métaboliques bactériennes (Brodgen 5 et al., 2005).

Par rapport aux antibiotiques chimiques généralement utilisés, les PAM présentent l'avantage d'être totalement biodégradables. Ils apparaissent comme de bons candidats en substitution aux antibiotiques chimiques conventionnels, du fait de leurs propriétés biologiques. En effet, ils présentent un large spectre d'activité antimicrobienne, peu de spécificité, différents modes d'action, une innocuité sur le milieu.

Les PAM peuvent être produits par synthèse chimique ou par l'expression en système recombinant (clonage, expression, purification) bactérien ou levure. Selon un mode de réalisation de l'invention, les PAM sont synthétisés par synthèse chimique. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les PAM sont synthétisés par synthèse biologique en système recombinant bactérien ou fongique et de préférence, en système levure.

Suivant un mode de réalisation de l'invention, les PAM peuvent appartenir à la famille des PAM linéaires à hélice alpha, à la famille des PAM présentant une surreprésentation en un ou plusieurs acides aminés, à la famille des PAM à épingles à cheveux (bêta Hairpin) avec 1 ou 2 ponts disulfures, à la famille des PAM cycliques à feuillet bêta et hélice alpha avec 3 ponts disulfure ou plus (Bulet et al., Immunological reviews, 2004, 198 : 169-184 ; Brogden, Nature Review Microbiology, 2005, 3 :238- 250).

Des exemples de PAM linéaires à hélice alpha incluent, mais ne sont pas limités à, cécropine, stomoxyne, ponéricine, spinigérine, l'oxyopinine, la cupiennine, clavanine, styeline, pardaxine, misgurine, pleurocidine, parasine, oncorhyncine, moronécidine, magainine, temporine, cathelicidine, indolicidine.

Des exemples de PAM enrichis en un ou plusieurs acides aminés, proline, arginine, glycine, ou tryptophane, incluent, mais ne sont pas limités aux bacténicines, PR-39, abaecines, apidaecines, drosocine, pyrrhocoricines, Cg-Prp, prophenine, indolicine.

Des exemples de PAM en épingles à cheveux contenant 2 à 4 cysteines incluent, mais ne sont pas limités à, la tachyplesine, la protégrine, la thanatine, l'androctonine, la gomesine, la polyphemusine, l'hepcidine, la brevinine, l'esculentine, la tigerinine ou la bactenecine.

Des exemples de PAM cycliques contenant 6 ou plus résidus de cystéines ou à cycle ouvert incluent, mais ne sont pas limités à, défensines (de vertébrés, d'invertébrés ou de plantes), termicine, héliomicine, drosomycine, ASABF, pBD, pénaeidines, ALF, big-défensines.

Des exemples de défensines d'invertébrés sont les défensines d'huître Cg-Defs ou les défensines de moules MGD.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le PAM est choisi parmi la tachyplesine et les défensines d'huître Cg-Defs.

Un autre objet de l'invention est un film comprenant ou consistant en un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, associé à une ou plusieurs molécules bioactives, tel que décrit ci-dessus pour recouvrir une surface.

Selon un mode de réalisation, ladite surface est un nucléus.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite surface est une surface amenée à être en contact, de préférence en contact répété ou prolongé, avec de l'eau, telle que par exemple de l'eau de mer ou de l'eau douce. Selon ce mode de réalisation, ladite surface peut être, par exemple, la surface d'un bac, par exemple d'un bac en matière plastique ou métallique, utilisé en aquaculture, de préférence en pisciculture. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les surfaces recouvertes par un film comprenant ou consistant en un PHB-V selon l'invention sont utilisées dans le cadre de la perliculture, telles que, par exemple, les supports et cordages utilisés lors de l'élevage des huîtres.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le film comprenant des PHA, préférentiellement des PHB-V selon l'invention, optionnellement associé à des molécules biactives ou à un agent renforçant l'inhibition de formation des biofilms du ou des PHA, de préférence l'acide zostérique résiste au lavage par l'eau de mer et est stable pendant plus de 3 semaines, préférentiellement plus d'un mois, encore plus préférentiellement plus de 6 mois à des températures variant entre 4 et 30°C. Ainsi, le film selon l'invention ne se dissout pas lors de la mise en contact avec l'eau de mer et ce, pendant au moins 3 semaines. La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'un nucléus revêtu ou enrobé d'un film comprenant un ou plusieurs polyhydroxyalcanoates (PHA), de préférence le PHB-V selon l'invention, ledit film pouvant être associé à des molécules biactives ou à un agent renforçant l'inhibition de formation des biofilms du ou des PHA, de préférence l'acide zostérique, tel que décrit ci-dessus.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention comprend une première étape consistant en l'enrobage du nucléus par le film de PHA, de préférence par le film de PHB-V selon l'invention, éventuellement suivi d'une seconde étape consistant en l'association au film de PHA formé d'une ou plusieurs autres molécules, telles que décrites ci-dessus.

Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé comprend une première étape d'immersion du nucléus dans une solution comprenant un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, dans du trifluoroéthanol (CF ₃ CH ₂ OH, TFE). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite solution de PHA possède une concentration en PHA de 0.1 à 10 % poids/volume, plus préférentiellement de 0.5 à 5 , encore plus préférentiellement de 1 % en poids de PHA par volume de la solution de TFE.

Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du nucléus dans une solution contenant un ou plusieurs PHA est réalisée à une température constante, préférentiellement à température ambiante (i.e. de 15 à 25 °C), plus préférentiellement environ 20°C. Selon ce mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du nucléus dans une solution contenant un ou plusieurs PHA est réalisée préférentiellement pendant 10 minutes à 3 heures, plus préférentiellement pendant 20 minutes à 1 heure, encore plus préférentiellement environ 30 minutes.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du nucléus dans une solution contenant un ou plusieurs PHA est réalisée à une température constante, préférentiellement de 1 à 10°C, plus préférentiellement environ 4°C. Selon ce mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du matériau dans une solution contenant un ou plusieurs PHA est réalisée préférentiellement pendant 10 minutes à 3 heures, plus préférentiellement pendant 20 minutes à 1 heure, encore plus préférentiellement pendant environ 30 minutes.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le nucléus enrobé est ensuite séché sous vide.

Lorsque le film enrobant le nucléus comprend également une ou plusieurs autres molécules, tels de l'acide zostérique, ou une molécule bioactive, telle que, par exemple, un agent bactéricide ou bactériostatique, la première étape décrite ci-dessus est suivie d'une seconde étape d'association desdites molécules. Selon un mode de réalisation de l'invention, lorsque lesdites molécules sont des agents bactéricides ou bactériostatiques, la seconde étape comprend l'immersion du nucléus enrobé d'un film de PHA dans une solution comprenant un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques à une concentration de 1 à 10 CMI.

Selon l'invention, l'agent bactéricide ou bactériostatique est en solution dans un solvant polaire biologiquement acceptable tel que l'eau, l'éthanol, le TFE ou leur mélange comme par exemple eau/TFE, de préférence le trifluoroéthanol (CF ₃ CH ₂ OH).

Selon un mode de réalisation de l'invention, la seconde étape d'immersion du nucléus est réalisée à une température constante, préférentiellement de 1 à 10°C, plus préférentiellement environ 4°C.

Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite seconde étape d'immersion du nucléus est réalisée préférentiellement pendant 1 à 120 heures, plus préférentiellement pendant 12 à 96 heures, encore plus préférentiellement pendant 24 à 72 heures.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le nucléus enrobé est ensuite séché sous vide.

Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé comporte optionnellement une étape de rinçage du nucléus entre la première étape d'immersion et la seconde étape d'immersion. Selon ce mode de réalisation, le nucléus est rincé par un volume de 10 à 1000 mL d'eau distillée, préférentiellement 100 à 300 mL d'eau distillée, plus préférentiellement environ 200 mL d'eau distillée. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un nucléus revêtu d'un film comprenant un ou plusieurs PHA, de préférence par un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, et un ou plusieurs autres molécules, telles que par exemple une ou plusieurs biomolécules, par exemple un ou plusieurs agents bactériostatiques ou bactéricides, ledit procédé comprenant une seule étape d'immersion du nucléus dans une solution comprenant des PHA et des agents bactériostatiques ou bactéricides, dans du TFE.

Selon un mode de réalisation, les PHA sont présents dans la solution à une concentration de 0.05 à 10 % en poids par rapport au volume total de la solution, préférentiellement de 0.1 à 5 , plus préférentiellement à une concentration de 1 %.

Selon un mode de réalisation, les agents bactéricides ou bactériostatiques sont présents dans la solution à une concentration de 1 à 10 CMI.

Selon un mode de réalisation, cette étape d'immersion est réalisée à une température constante, de 1 à 10°C, préférentiellement 4°C, et pendant 1 à 128 h, préférentiellement pendant 12 à 96 heures, et plus préférentiellement pendant 24 à 72h.

La présente invention concerne également un procédé d'enrobage d'un nucléus par un film comprenant un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, éventuellement en association avec une ou plusieurs molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant l'action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, telles que les agents cicatrisants ou anti-inflammatoires, et les agents bactériostatiques ou bactéricides, de préférence les PAM, comprenant l'utilisation d'un spray pour pulvériser la composition selon l'invention sur la surface du nucléus.

La présente invention concerne un spray comprenant ou consistant en des PHA, de préférence comprenant ou consistant en des PHB-V selon l'invention.

La présente invention concerne un spray comprenant ou consistant en un ou des PHA, de préférence un ou des PHB-V selon l'invention en association avec une ou plusieurs autres molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant l'action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, telles que les agents cicatrisants ou antiinflammatoires, et les agents bactériostatiques ou bactéricides, de préférence les PAM.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le nucléus est d'origine naturelle, plus préférentiellement ledit nucléus est en nacre de moule du Mississipi appartenant au genre Amblema sp., de préférence Amblema plicata. Des exemples de nucléus sont ceux vendus par Aming (Standard Aming) ou par Poe Import.

Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit nucléus a un diamètre de 1 à 20 mm, préférentiellement de 2 à 15 mm, plus préférentiellement de 2 à 4 mm, et encore plus préférentiellement de 2,1 à 3.5 mm.

Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit nucléus a un diamètre de 2 à 2.5 BU, de préférence d'environ 2.4 BU. Le BU est une unité de mesure, 1BU correspondant à 3,03 mm.

L'invention a également pour objet une huître comprenant un nucléus tel que décrit ci-dessus ou obtenu par un procédé tel que décrit ci-dessus. De préférence, l'huître appartient au genre Pinctada sp., plus préférentiellement, aux espèces Pinctada fucata, Pinctada maxima, Pinctada margaritifera.

La présente invention a également pour objet un procédé de greffe d'une huître perlière receveuse, de préférence appartenant aux genres et espèces cités ci-dessus, par un nucléus revêtu ou enrobé d'un film de PHA, de préférence de PHB-V, éventuellement associé à de l'acide zostérique ou à une molécule bioactive, tel que décrit ci-dessus. La figure 1A présente les différentes étapes de la greffe. Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de greffe comprend l'ouverture manuelle de l'huître perlière receveuse, la réalisation d'une incision dans les tissus de l'huître perlière receveuse, pour accéder à la poche perlière et permettre, dans une troisième étape, l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon, correspondant à une partie de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse (environ 4 mm ² ), en combinaison avec un nucléus enrobé ou recouvert d'un film de PHA, de préférence de PHB-V, tel que décrit ci-dessus.

La présente invention a également pour objet un procédé de production ou de fabrication d'une perle de perliculture, comprenant une étape de greffe d'une huître perlière receveuse pas un nucléus, selon le procédé décrit ci-dessus.

La présente invention concerne également un procédé d'obtention de perle comprenant l'utilisation du nucléus enrobé tel que décrit ci-dessus, ou obtenu selon un procédé d'enrobage tel que décrit ci-dessus.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé d'obtention de perle comprend la greffe d'un nucléus selon l'invention dans la poche perlière d'une huître receveuse, en combinaison avec une partie de l'épithélium du manteau d'une huître donneuse.

Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé de production, de fabrication ou d'obtention de perle comprend une première étape comprenant la collecte et l'élevage des huîtres perlières, de préférence appartenant aux genres et espèces cités ci-dessus, pour obtenir des huîtres perlières donneuses et des huîtres perlières receveuses.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres perlières donneuses et receveuses sont ensuite nettoyées pour retirer d'éventuels parasites.

Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé de production, de fabrication ou d'obtention de perle comprend en outre, à la suite de la greffe, une étape de culture des huîtres perlières receveuse, de préférence pendant une durée de 10 à 24 mois, de préférence de 12 à 20 mois, encore plus préférentiellement de 16 à 18 mois. Pendant la période de culture, la bordure épithéliale du greffon se multiplie et tapisse la poche perlière, pour donner un sac perlier englobant le nucléus, et qui va déposer des couches de nacre autour du nucléus, résultant ainsi en la production d'une perle (figure 1B). La présente invention concerne également la perle obtenue par le procédé tel que décrit ci-dessus.

L'invention concerne également une perle comprenant un nucléus revêtu selon l'invention, ou un nucléus obtenu par un procédé selon l'invention.

La présente invention concerne également une perle dont le nucléus est recouvert d'un film de PHA, éventuellement en association avec une ou plusieurs molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, telles que les agents cicatrisants ou anti-inflammatoires, et les agents bactériostatiques ou bactéricides, de préférence les PAM.

La présente invention concerne également une perle comprenant un film de PHA, de préférence de PHB-V selon l'invention, éventuellement en association avec une ou plusieurs molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant l'action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, telles que les agents cicatrisants ou antiinflammatoires, et les agents bactériostatiques ou bactéricides, de préférence les PAM, sous une ou plusieurs épaisseurs de nacre.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la perle a une taille, de préférence un diamètre de 2 à 20 mm, de préférence de 5 à 15 mm, encore plus préférentiellement de 6.8 à 10 mm.

De façon surprenante, le déposant a remarqué que l'enrobage du nucléus par un film de PHA, de préférence de PHB-V selon l'invention, éventuellement associé avec une ou plusieurs molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant l'action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, permet de réduire le taux d'échec des opérations de greffe. Ainsi, l'utilisation d'un nucléus enrobé selon l'invention diminue le taux de mortalité des huîtres receveuses dans les 30 jours post-greffe et augmente le taux de maintien du nucléus dans l'huître receveuse (Exemple 3). Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les Inventeurs proposent que l'enrobage du nucléus par ledit film permettrait de diminuer les contaminations bactériennes au sein de l'huître receveuse. De plus, l'association dudit film de PHA avec des agents bactéricides ou bactériostatiques, comme par exemple les peptides antimicrobiens (PAM), permettrait de diminuer encore l'occurrence de contaminations microbiennes. La présence des PHA, de préférence de PHB-V selon l'invention, seuls ou en combinaison avec un agent bactéricide ou bactériostatique permettrait ainsi de diminuer les échecs de l'étape de greffe, et notamment de diminuer la mortalité des huîtres receveuses et le rejet de nucléus par lesdites huîtres.

La présente invention a donc également pour objet un procédé de réduction de l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec correspondant à une mortalité ou à un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse, et ledit procédé comprenant la greffe de l'huître receveuse par un nucléus enrobé ou recouvert de PHA, de préférence de PHB-V selon l'invention, tel que décrit ci-dessus.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un nucléus enrobé ou recouvert de PHA, de préférence de PHB-V tel que décrit ci-dessus pour réduire l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec correspondant à une mortalité ou à un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse.

La présente invention concerne également un procédé d'inhibition du rejet du nucléus lors de la greffe, ledit procédé comprenant l'utilisation d'un nucléus enrobé selon l'invention lors de la greffe.

La présente invention concerne en outre un procédé de réduction de la mortalité des huîtres receveuses consécutive à l'étape de greffe, comprenant l'utilisation d'un nucléus enrobé selon l'invention lors de la greffe. Selon un mode de réalisation de l'invention, la mortalité prévenue par le procédé de l'invention est due à une infection de l'incision réalisée lors de la greffe.

L'enrobage des nucléus de perliculture par un film de PHA, de préférence de PHB-V, éventuellement associé avec une ou plusieurs molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, tel que décrit ci-dessus permettrait d'améliorer l'homogénéité de la surface du nucléus, et ainsi d'améliorer la qualité de la perle obtenue par limitation de l'apparition de défauts de surface.

La présente invention concerne également un procédé d'amélioration de l'homogénéité d'un nucléus, comprenant l'enrobage dudit nucléus par un film tel que décrit dans la présente invention.

La présente invention a donc également pour objet un procédé d'amélioration de la qualité de la perle obtenue à la suite de la greffe de l'huître perlière receveuse, ledit procédé comprenant l'utilisation d'un nucléus enrobé ou recouvert de PHA, de préférence de PHB-V, tel que décrit ci-dessus.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un nucléus enrobé ou recouvert de PHA, de préférence de PHB-V, tel que décrit ci-dessus pour améliorer la qualité de la perle obtenue.

[Définitions]

Par « nucléus », on entend un élément, généralement sphérique, formé d'un composé naturel (par exemple en nacre de moule du Mississipi, Amblema plicata) ou synthétique (par exemple en Bironite) introduit dans l'huître receveuse lors de l'étape de greffe, et servant de support au dépôt de nacre par l'huître perlière receveuse. Ledit nucléus peut-être enrobé de substances particulières pour améliorer la qualité de la perle obtenue.

Par « perliculture », on entend une activité humaine ayant pour but la production de perle de cultures par des huîtres perlières, appartenant généralement au genre Pinctada sp.

Par « agent bactéricide », on entend une substance ayant une action bactéricide, i.e. entraînant la mort des bactéries.

Par « agent bactériostatique », on entend une substance ayant une action bactériostatique, i.e. bloquant le développement, la croissance et/ou la division des bactéries.

Par « film primaire », on entend un film conditionnant composé de protéines ou de fragments protéiques, de glucides, de lipides, de matières minérales comme par exemple des sels minéraux, issus du milieu environnant. Ce film primaire stimule l'adhésion bactérienne.

Par « biofilm indésirable », on entend un film de microorganismes, généralement des bactéries, qui viennent s'accrocher au film primaire, dans une première étape d'adhésion réversible puis irréversible.

Par « CMI », on entend la concentration minimale à partir de laquelle un agent inhibe la croissance visible d'un microorganisme après incubation sur la nuit. Les méthodes de détermination de la CMI d'un agent sont bien connues dans l'état de l'art.

Par « aquaculture », on entend l'ensemble des activités humaines de production animale ou végétale en milieu aquatique, notamment en milieu aquatique marin, de rivière ou d'étant. L'aquaculture concerne notamment la production de poissons (on parle alors de pisciculture), de coquillages (conchyliculture ou perliculture notamment), de crustacés (astaciculture et pénéiculture notamment), ou encore d'algues (algoculture).

Par « nacre », on entend une structure biominéralisée formée de cristaux d'aragonite (constituant près de 90% de la nacre) et de conchyoline ; l'aragonite étant un composé chimique de formule CaC0 ₃ + traces de Sr ; Pb ; Zn.

[Description succincte des figures]

La figure 1 est un schéma présentant les différentes étapes de la greffe et de la formation de la perle. A : Greffe. B : Formation du sac perlier et de la perle au sein de la poche perlière (Illustration C. Montagnani).

La figure 2 est un assemblage de photos obtenues par microscopie à balayage, des nucléi non enrobé (a) et enrobés (b et c). Les marques correspondent à des déchirements volontaires afin de conforter la présence du film.

Les exemples qui suivent montrent des modes de réalisation particuliers de l'invention, qui illustrent non limitativement l'invention. [Exemples]

Exemple 1 : Présence du film de PHA

Des nucléi ont été revêtus d'un film comprenant le PHB-V bactérien FAK1402. FAK1402 est un PHA de type PHB-V dans lequel le ratio HB/HV est égal à 64/36. Ces nucléi ont été obtenus par immersion pendant 10 min à une température constante de 20°C dans un solvant TFE additionné de FAK1402 résultant de procédés biotechnologiques de fermentation à une concentration de 1% poids/volume, suivie d'un séchage sous-vide.

La figure 2 obtenue par microscopie à balayage montre sans ambiguïté la présence d'un film. La figure a montre un nucléus non enrobé. Les figures b et c montrent la présence du film suite à une déchirure, respectivement sans lavage et après un lavage à l'eau.

Exemple 2 : Activité antimicrobienne

Expérimentations :

Des nucléi de diamètre standard ont été utilisés pour les études portant sur l'influence d'un prétraitement des surfaces par un film de PHA d'origine bactérienne.

Les nucléi sont revêtu d'un film comprenant le PHB-V FAK1402 seul ou en combinaison avec de la tachyplesine (PAM).

Ces nucléi sont obtenus par un procédé en deux étapes :

immersion pendant 10 min à une température constante de 20°C dans un solvant TFE additionné de FAK1402 résultant de procédés biotechnologiques de fermentation à une concentration de 1% poids/volume, suivie d'un séchage sous-vide ;

(optionnellement) immersion des nucléi enrobés du film de PHA dans une solution comprenant 10 CMI (soit, 70 mg/L) de tachyplesine, suivie d'un séchage sous-vide.

Un test classique d'inhibition de croissance bactérienne a été réalisé sur ces nucléi : les nucléi ont été mis en contact avec une solution bactérienne en phase exponentielle de croissance de la souche Vibrio isolée de Pinctada margaritifera lors d'un greffe à Tahiti pendant 18h à 30°C. La solution bactérienne est ensuite étalée sur boite de pétri (milieu Zobell Agar) et les colonies développées sont ensuite comptées. Des nucléi non enrobés sont utilisés comme contrôles négatifs.

Résultats :

Les nucléus non enrobés ou enrobés avec un film de polyhydroxyalcanoate FAK1402 seul n'ont pas montré d'effet inhibiteur de la croissance bactérienne. Par contre, les nucléus enrobés par un peptide antimicrobien associé à un film de polyhydroxyalcanoate FAK1402 ont montré une activité bactéricide.

Exemple 3 : Efficacité des nucléi de l'invention dans des expériences de greffe

1. Mortalité

Des nucléus non enrobés, ou enrobés par un PHA de l'invention (PHB-V dans lequel le ratio HB/HV est égal à 64/36), seul ou en combinaison avec un PAM (la tachyplésine) ont été greffés à des huîtres receveuses en combinaison avec une partie de l'épithélium du manteau d'une huître receveuse (greffon). 64 huîtres donneuses ont été utilisées pour cette expérience. 8 expériences de greffe ont été réalisées par type de nucléus et par donneuse.

La mortalité des huîtres receveuses a été évaluée 30 jours post-greffe en pourcentage par rapport aux huîtres ayant reçu un nucléus non enrobé. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous :

La présence du film de PHA ou de PHA + PAM inhibe la mortalité des huîtres de près de 20% et 30%, respectivement.

2. Maintien de greffe

Des nucléus non enrobés, ou enrobés par un PHA de l'invention (PHB-V dans lequel le ratio HB/HV est égal à 64/36), seul ou en combinaison avec un PAM (la tachyplésine) ont été utilisés dans des expériences de greffe telles que décrites ci-dessus.

Le maintien des nucléi 30 jours post-greffe a été mesuré. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous, et sont exprimés par rapport aux huîtres ayant reçu un nucléus non enrobé.

La présence du film de PHA ou de PHA + PAM augmente le maintien des nucléi dans l'huître receveuse de plus de 6.5%.