FERMENTAÇÃO BACTERIANA PARA USO COMO SUPLEMENTO OU ADITIVO PARA RAÇÃO ANIMAL

CAMPO DA INVENÇÃO

[01] A presente invenção relata a produção de um caldo nutritivo por meio de processos fermentativos utilizando uma bactéria não patogênica geneticamente modificada. Técnicas da engenharia genética e metabólica foram empregadas para o desenvolvimento de uma cepa de Corynebacterium glutamicum capaz de produzir o ácido aminolevulínico (5-ALA). O caldo nutritivo obtido contem açúcares, vitaminas, aminoácidos, entre eles o 5-ALA, ácidos orgânicos e nucleotídeos, e é adicionado à ração animal garantindo benefícios, como maior crescimento e melhor imunidade de animais como gado, porcos, aves, peixes e pequenos animais como cães e gatos (pet food).

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[02] Os processos fermentativos são realizados a partir do uso de diferentes microrganismos, sendo bactérias ou fungos, para a produção de várias biomoléculas que apresentam um interesse comercial. Microrganismos metabolizam diferentes substratos presentes no meio reacional gerando metabólitos primários, por exemplo, aminoácidos, e secundários, como antibióticos. Os processos fermentativos, são empregados em indústrias de diversos ramos, como alimentício, cosmético, farmacêutico e pecuário. Em escala industrial a tecnologia de fermentação está envolvida na produção de aminoácidos, vitaminas, enzimas, ácidos orgânicos, entre outras biomoléculas.

[03] Com o desenvolvimento e aprimoramento de novas ferramentas para a análise genômica foi possível um maior conhecimento dos microrganismos. Essas novas técnicas garantiram o emprego da engenharia genética e metabólica para a realização de mutações específicas, com isso, possibilitaram uma maior e melhor produção de biomoléculas de interesse comercial.

[04] Com a utilização dos conhecimentos e ferramentas da engenharia genética é possível a realização de mutações em genes específicos, sendo evitadas alterações indesejadas no genoma microbiano que podem prejudicar a produção de metabólitos de interesse. As modificações genéticas são capazes de aumentar ou diminuir a expressão de uma determinada proteína, sendo possível a inserção e expressão de genes de diferentes organismos no genoma microbiano.

[05] O ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) é um aminoácido presente em plantas e animais. Esse aminoácido pode ser encontrado em alguns alimentos, como vinho tinto e chá (KR 101 180266). O 5-ALA é precursor de biomoléculas como clorofila e vitamina 12 (CN 101863703). A biossíntese do 5-ALA, geralmente, ocorre a partir de succinil-CoA e glicina pela ação da enzima ácido 5- aminolevulínico sintase (US 9333156).

[06] O método mais utilizado para a produção do 5-ALA é a síntese química, porém, esse processo apresenta desvantagens, como o custo mais elevado, baixa conversão e poluição ambiental. Os processos fermentativos surgem como uma alternativa para evitar a síntese química, nesse caso determinados microrganismos são modificados geneticamente para produzir o aminoácido de maneira mais eficiente e viável economicamente sem gerar danos ambientais (CN 10445081 2).

[07] O 5-ALA já conhecido por sua vasta aplicação, sendo utilizado em tratamentos de câncer, acne, entre outros problemas de pele, como também em plantas para melhorar a produção de clorofila e promover um melhor crescimento das plantas (KR 20100083425, KR 101 180266, CN 101863703, KR 20090027269). Na aplicação em ração animal de gado, frango, dentre outros, aumenta a imunidade e promove o crescimento (KR 20100083425, CN 102870970, KR 20090027269). [08] Certos microrganismos conhecidos e estudados são empregados na produção industrial de metabólitos. Esses microrganismos apresentam um grande interesse comercial por serem fáceis de manipular, mais seguros, possuírem menos contaminantes e obterem maiores produções de biomoléculas em grande escala. Com isso, genes diferentes são introduzidos nesses microrganismos com o intuito de obter diversos metabólitos de interesse comercial que são difíceis de serem produzidos em grade escala pelos seus organismos de origem.

[09] A bactéria Corynebacterium glutamicum é um microrganismo que apresenta interesse comercial. Por ser um microrganismo não patogênico é utilizado na indústria para a produção de L-glutamato e outros aminoácidos, apresentando um potencial para a produção de ácidos orgânicos e biocombustíveis. A C. glutamicum é aplicada na indústria biotecnológica e vem sendo estudada para a produção de 5-ALA, isso devido ao fato de que o L- glutamato é um precursor do ALA e o microrganismo é considerado seguro, não apresentando riscos à saúde humana (YU et al., 2015).

[010] O aminoácido 5-ALA pode ser convertido no organismo em hemoglobina e promover o desenvolvimento e maturação das hemácias. A hemoglobina é uma molécula importante no transporte de oxigénio, responsável por dilatar os vasos sanguíneos, manter o pH estável no organismo e promover o crescimento saudável do animal (CN 102870970). Uma maior produção da hemoglobina interfere diretamente no transporte de oxigénio e transporte de nutrientes, nos gados, por exemplo, aumenta a resistência a doenças e ativa o metabolismo (KR 100459918).

[01 1 ] Devido ao uso de antibiótico para prevenir e tratar doenças nos animais de importância comercial, eles desenvolveram resistência aos antibióticos e acumularam resíduos dessas drogas podendo representar risco para a saúde humana. Com isso e uma maior regulamentação na utilização de antibióticos na pecuária, novas alternativas são necessárias para reduzir o uso dessa substância (KR 20100083425, KR 20090027269, KR 100459918).

[012] A União Europeia já se mobilizou quanto ao assunto e proibiu a adição de antibióticos, responsáveis por promover o crescimento, na ração animal, além disso, restringiu o uso dos mesmos para o tratamento de certas doenças (KR 20090027269).

[013] O aminoácido 5-ALA apresenta alguns benefícios para animais como gado, porcos, frangos, além de animais como peixes, cães e gatos. Dentre esses benefícios estão promover um maior crescimento dos animais, aumentar a imunidade evitando/reduzindo o uso de antibióticos, melhorar o porte físico e o metabolismo e no caso das aves, aumentar a produção de ovos (KR 20100083425, KR 20090027269, CN 102870970, KR 100459918).

[014] Para garantir benefícios melhores e mais rápidos, o meio proveniente da fermentação com a bactéria C. glutamicum deve ser adicionado à ração animal, juntamente com o 5-ALA produzido no processo, que podem conter ainda outros aminoácidos, açúcares, nucleotídeos, ácidos orgânicos e vitaminas (CN 102870970, KR 100459918).

ESTADO DA ARTE

[015] A patente KR No 100459918 relata a produção de um suplemento alimentar para animal (pecuária) contendo o ácido aminolevulínico. Como é citado na patente, o aminoácido pode ser proveniente de uma fermentação, podendo ser o produto fermentado, contendo o ALA, adicionado à ração. Os inventores não descrevem a composição desse meio fermentado e nem o microrganismo utilizado. A presente invenção se diferencia pelo fato de que o caldo fermentado proveniente da fermentação de C. glutamicum modificada geneticamente é incorporado à ração animal, sendo o ingrediente ativo o caldo contendo açúcares, aminoácidos, entre eles o 5-ALA produzido pela fermentação, ácidos orgânicos, vitaminas e nucleotídeos. [016] A patente sul-coreana No 2012136786 retrata um aditivo alimentar para frangos e porcos contendo o 5-ALA e uma mistura fermentada de Sanguisorba officinalis e Rhus japonica por Aspergillus oryzae ou Lactobacillus casei. Nesse caso o aminoácido foi adicionado a uma mistura fermentada, ele não tem origem da fermentação e toda a mistura é considerada como o ingrediente ativo. A patente KR No 20100040165 descreve também uma mistura de um fermentado com a adição do 5-ALA. Nesse caso a quitosana é fermentada. A mistura da quitosana fermentada e do 5-ALA garante uma melhor taxa de crescimento e imunidade.

[017] O pedido de patente KR No 20090027269 expõe uma composição de ração animal para substituir o uso de antibióticos que apresenta diferentes compostos complexo como milho, melaço e soja, e o ALA. O aminoácido é adicionado para compor a ração animal. O ALA é responsável por aumentar a imunidade do animal, sendo possível uma administração menor de antibióticos. A presente invenção descreve uma composição a ser adicionada à ração animal, o caldo fermentado contendo o aminoácido ALA, no caso o aminoácido é produzido pelo processo fermentativo e não adicionado ao meio.

[018] O pedido de patente chinesa No 1 02870970 descreve um promotor de crescimento para animais da pecuária. O promotor é baseado na mistura de aminoácidos, como o 5-ALA e a lisina, além da coenzima Q10, e um carreador é utilizado, o pó de zeolite. A invenção aqui descrita não utiliza um carreador para o meio fermentado e o 5-ALA além do resto da composição do caldo é proveniente da fermentação.

[019] A publicação WO No 2007141 1 1 1 relata um processo para a produção de um aditivo de ração animal baseado em um meio fermentado contendo um alto teor de L-lisina. A fermentação ocorre utilizando bactérias corineforme selecionadas de mutações. A invenção relata a possibilidade da biomassa bacteriana ser incorporada a ração animal juntamente com o caldo fermentado, uma vez que a bactéria é considerada segura, como a C. glutamicum. De maneira semelhante, a patente de número US5840358A descreve o uso de um produto obtido por via fermentativa, de modo que o processo emprega E. coli ou C. glutamicum modificados geneticamente para a produção de L-lisina. O produto final resultante é constituído da biomassa rica em nutrientes e do caldo fermentado com alta concentração de L-lisina produzida pelos microrganismos.

[020] A invenção aqui descrita relata o uso da bactéria não patogênica C. glutamicum geneticamente modificada empregada em um processo fermentativo visando a produção do 5-ALA. O produto final, a ser utilizado como ração para animais, é caracterizado por uma mistura de diferentes componentes onde apenas o caldo fermentativo ou esse em conjunto com a biomassa bacteriana inativa podem ser incorporados na formulação final.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[021 ] A presente invenção trata do uso de estirpes de C. glutamicum geneticamente modificadas a fim de produzir o ácido 5-aminolevulínico. O diferencial aqui proposto envolve o uso do caldo fermentado das referidas estirpes composto por uma mistura rica em nutrientes, além do ácido 5- aminolevulínico, utilizado como aditivo ou suplemento para ração de animais como bovinos, caprinos, aves, suínos, peixes e cães e gatos (pet food).

[022] Para que a presente invenção seja sustentável, as etapas envolvidas para a fabricação do produto final são caracterizadas por (a) processo fermentativo utilizando uma estirpe de C. glutamicum produtora de 5-ALA, (b) obtenção do caldo fermentado contendo a biomassa ou separação da biomassa e caldo fermentado por centrifugação ou filtração, (c) redução do pH para preservação do produto e inativação de biomasa, (d) secagem parcial ou total do caldo fermentado com ou sem biomassa e (d) preparo do produto final por meio da mistura do caldo fermentado contendo ou não biomassa com outros componentes que compõem ração animal. [023] A estirpe de C. glutamicum ATCC 13032 empregada como chassi para as modificações genéticas foi utilizada por ser uma estirpe selvagem e possuir o seu genoma completamente sequenciado (Ikeda, 2003).

[024] A produção do 5-ALA na C. glutamicum pode ocorrer pela modulação da expressão gênica por meio do aumento do número de cópias do gene de interesse a ser inserido no cromossomo, uso de promotor regulado ou constitutivo, a fim de induzir, aumentar ou diminuir a expressão do gene desejado, alteração do códon de iniciação, ou uso do gene em um plasmídeo que possua estabilidade quando inserido na estirpe de interesse.

[025] Tanto por meio da inserção de plasmídeos, por eletroporação ou choque- térmico, quanto por meio da inserção dos cassetes gênicos no cromossomo da estirpe chassi, por recombinação homóloga como relatado por Jiang e colaboradores, 2017, para que a estirpe seja capaz de produzir o 5-ALA de maneira viável é necessário que os seguintes genes sejam expressos:

a) hemA da bactéria Rhodobacter capsulatus, otimizado por meio de algoritmo especializado para expressão em C. glutamicum. O gene codifica para a enzima 5-aminolevulinato sintase (ALAS), a qual produz ácido 5- aminolevulínico a partir de L-glicina e succinil-CoA;

b) glyA, da própria estirpe, que resulta na produção da enzima serina hidroximetiltransferase, levando à produção de glicina a partir do aminoácido L- serina e tetrahidrofolato;

c) ser A, serB e serC, da própria estirpe, que resulta na produção das enzimas fosfoglicerato sintase, fosfoserina aminotransferase e fosfoserina fosfatase, respectivamente;

d) xylA e xylB de Escherichia coli, que resulta na produção das enzimas xilose isomerase e xiluloquinase, respectivamente

e) araA, araB, araD e araE de E. coli, que codificam para as enzimas arabinose isomerase, ribuloquinase, ribulose-5-fosfato-4-epimerase, e para o transportador de arabinose, respectivamente f) glpF, glpK e glpD de Corynebacterium diphteriae, que codificam para a proteína transportadora de glicerol e para as enzimas glicerol quinase e glicerol- 3-fosfodihidrogenase, respectivamente.

[026] Muitos processos fermentativos em escala industrial visando a produção de biomoléculas de interesse comercial fazem uso de organismos geneticamente modificados. No caso da presente invenção, o objetivo é obter um produto o qual possui em sua constituição o caldo fermentado que contenha ou não a biomassa, de modo que no caso da presença de biomassa, essa deve ser devidamente inativada de modo a não conter nenhum traço do organismo vivo.

[027] No caso da presente invenção, a estirpe resultante modificada geneticamente pode ser empregada em processos fermentativos que utilizam diferentes tipos de meio de cultivo, podendo conter diferentes tipos de carbono e nutrientes.

[028] O processo fermentativo para a produção da referida mistura rica em nutrientes contendo diferentes compostos, como sacarídeos, ácidos nucleicos, lipídeos e aminoácidos, dentre eles o ácido 5-aminolevulínico, deve conter: a) pelo menos uma fonte de carbono, como por exemplo glucose, xilose, arabinose, entre outras, desde que a estirpe seja capaz de metabolizar essas moléculas;

b) pelo menos uma fonte de nitrogénio, como por exemplo extrato de levedura, peptona ou sais inorgânicos;

c) pelo menos uma fonte de fósforo, como fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico, fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico, ou outro sal inorgânico composto por fósforo que seja assimilado pelo referido microrganismo;

d) sais inorgânicos derivados de minerais ou vitaminas, como cloreto de sódio, carbonato de cálcio, sulfato de amónio, entre outros, desde que sejam assimilados pelo referido organismo. e) pelo menos um ácido orgânico como ácido cítrico, ácido succnínico, ácido acético, entre outros.

[029] O processo para produção do caldo fermentado deve ser realizado preferencialmente em bioreatores com condições controladas de temperatura, pH, alimentação, agitação e aeração. O referido processo também pode ser realizado em frascos como erlenmeyers ou frascos semelhantes, desde que as condições para crescimento da biomassa sejam fornecidas.

[030] Em relação a temperatura, o crescimento do microrganismo deve ser realizado nas faixas de temperatura ambiente a 37°C, preferencialmente de 25°C a 34°C, mais preferencialmente de 28°C a 32°C.

[031 ] Em relação ao pH, o crescimento do microrganismo deve ser realizado em faixa de pH de 5,0 a 7,5, preferencialmente de 5,5 a 7,0, mais preferencialmente de 6,0 a 6,5.

[032] Em relação a alimentação, o processo fermentativo pode o crescimento do microrganismo pode ser iniciado com concentrações de fonte de carbono variando de 5g/L a 60g/L, preferencialmente de 20g/L a 50g/L, mais preferencialmente de 30g/L a 40g/L. Ainda, a alimentação pode ser realizada de forma constante ou em pulsos, desde que a concentração da fonte de carbono seja mantida de 2g/L a 8g/L, preferencialmente de 4g/L a 6g/L, mais preferencialmente de 5g/L.

[033] Em relação a agitação e aeração, o crescimento do microrganismo deve ser realizado com uma faixa de agitação que varia de 150 a 250 rpm e aeração entre 1 a 3 vvm, preferencialmente agitação de 180 a 230 rpm e aeração entre 1 ,5 a 2 vvm.

[034] Em relação a biomassa, o crescimento do microrganismo deve ser iniciado com um inoculo onde a concentração de células seja correspondente a ϋ.Odoo de valor entre 1 a 10, preferencialmente 5 a 15, mais preferencialmente [035] O processo fermentativo pode se dar por 12 a 96 horas, preferencialmente por 24 a 60 horas, mais preferencialmente por 36 a 48 horas de acordo com as condições previamente mencionadas.

[036] Ao término da fermentação, o conteúdo total ou parcial do fermentador pode ser submetido a dois processos:

a) separação do caldo fermentado e biomassa por um processo de centrifugação em centrífuga industrial a velocidades de 1000 a 14000 rpm, preferencialmente de 2000 a 8000 rpm, mais preferencialmente de 3000 a 4000 rpm. Ainda, a separação pode ser realizada por filtração ou ultrafiltração, preferencialmente a vácuo, utilizando filtros de 0,45 micrometros de porosidade, preferencialmente de 0,22 um de porosidade,

b) inativação da biomassa por meio da adição de qualquer reagente ácido de modo que o pH da solução seja reduzido para o valor de 3,0 a 3,5. O ácido a ser empregado nessa etapa pode ser preferencialmente o ácido cítrico, mas não limitado a esse, sendo que podem ser utilizados também ácido ascórbico, ácido acético, ácido lático, ácido málico, ácido fumárico, ácido glucônico, entre outros.

[037] O caldo fermentado, contendo a biomassa inativada ou não, pode ser misturado a outros componentes para formulação de ração animal na forma líquida, ou pode ser submetido a secagem parcial ou total, a vácuo ou não, sob temperaturas de 40 a 80°C, preferencialmente de 50 a 70°C, mais preferencialmente de 55 a 65°C, de modo que a umidade residual seja de 0,1 a 99,9%, preferencialmente de 5 a 90%, mais preferencialmente de 10 a 80%, mais preferencialmente de 20 a 50%. O conteúdo obtido pode então ser utilizado como pó, grânulos ou líquido e ser misturados a outros compostos visando a formulação de ração para animais.

[038] O produto resultante do processo fermentativo descrito anteriormente pode ser misturado a outros componentes em diferentes proporções a fim de gerar uma formulação de ração animal. Esses outros moléculas podem ser sacarídeos, aminoácidos ou peptídeos, ácidos nucleicos e outros ácidos orgânicos, lipídeos, micronutrientes como sais inorgânicos e ainda enzimas ou fatores de crescimento.

[039] A formulação final da ração a ser disponibilizada para bovinos, aves, suínos, caprinos, peixes e animais de pequeno porte como cães e gatos, pode- ser constituída, além do produto oriundo do processo fermentativo descrito, os seguintes compostos:

a) grãos de milho e seus subprodutos, como silagem, quirera, farelo, fubá, farinha, grãos secos de destiladores (Distiller Dried Grain), grãos secos de destiladores com solúveis (Distiller Dried Grain with Solubles) e qualquer outro subproduto obtido a partir de qualquer tipo de processamento envolvendo grãos de milho,

b) grãos de soja e seus subprodutos, como silagem, casca, farelo, farinha, proteína de soja texturizada, proteína de soja micronizada, proteína de soja concentrada, extrato hidrosolúvel de soja, flocos desengordurados, lecitinas e qualquer outro subproduto obtido a partir de qualquer tipo de processamento envolvendo grãos de soja,

c) grãos de trigo e seus subprodutos, como silagem, casca, farelo fino, farelo grosso, farinha e qualquer outro subproduto obtido a partir de qualquer tipo de processamento envolvendo grãos de trigo,

d) grãos de sorgo e seus subprodutos, como silagem, casca, farelo, farinha, grãos secos de destiladores, grãos secos de destiladores com solúveis, proteína de sorgo processada, e qualquer outro subproduto obtido a partir de qualquer tipo de processamento envolvendo grãos de sorgo,

e) grãos de arroz e seus subprodutos, como silagem, casca, farelo gordo, farelo estabilizado, quirera, amido, farinha, proteína do endosperma, e qualquer outro subproduto obtido a partir de qualquer tipo de processamento envolvendo grãos de arroz,

f) grãos de centeio e seus subprodutos, como silagem, casca, flocos, farelo, farinha, e qualquer outro tipo de subproduto obtido a partir de qualquer tipo de processamento envolvendo grãos de centeio, g) grãos de cevada e seus subprodutos, como silagem, casca, flocos, farelo, farinha, bagaço, e qualquer outro tipo de subproduto obtido a partir de qualquer tipo de processamento envolvendo grãos de cevada,

h) bagaços de vegetais como cana de açúcar, laranja, maçã, uva, caju, entre outros, processados de diferentes maneiras, como em pó, farelo, farinha, pellets, grânulos ou pedaços, ou qualquer outro tipo de subproduto obtido a partir de qualquer tipo de processamento envolvendo bagaços em geral,

i) melaços ou melados de vegetais como cana de açúcar, milho, soja, arroz, sorgo, entre outros, processados de diferentes maneiras, como em pó, líquido concentrado contendo diferentes graus de umidade, ou qualquer outro tipo de subproduto obtido a partir do processo de produção de melaços ou melados.

[040] A formulação da ração animal pode seguir diferentes padrões de composição utilizando os componentes descritos acima, de modo que uma mistura de todos ou de alguns dos referidos ingredientes pode compor a ração final.

[041 ] A formulação da ração animal pode ainda conter moléculas adicionais como espessantes, emulsificantes, acidulantes, texturizantes, flavorizantes, aromatizantes, estabilizantes, entre outros, de modo que torne o produto final com características bromatológicas e sensoriais aceitáveis para cada animal a ser destinado.

[042] Após a mistura dos componentes, a ração pode ser produzida em diferentes formatos, como pó, pellets, grânulos finos, grânulos grossos, pasta, entre outros, sejam estes secos ou umedecidos, de modo que represente a melhor condição para disponibilização para o animal a ser destinado.

[043] O exemplo descrito na presente invenção trata apenas de uma representação do processo fermentativo e posterior formulação de um aditivo ou suplemento para ração animal a fim de ilustrar uma das várias possibilidades de uso da mistura nutritiva, de modo que não limite as aplicações possíveis do produto aqui descrito a apenas este caso.

[044] Exemplo 1 :

[045] Preparo de uma mistura nutritiva por processo fermentativo utilizando uma estirpe de C. glutamicum produtora de ácido 5-aminolevulínico a ser incorporada a ração animal como aditivo ou suplemento:

[046] Uma única colónia da estirpe NB_CgALA05 presente em placa microbiológica é inoculada em 1 5mL de meio contendo 10g/L de triptona, 5g/L de extrato de levedura, 10g/L de cloreto de sódio. Esse pré-inóculo é incubado a 30°C por 16 horas sob agitação de 180rpm. A amostra anterior é adicionada à em 500mL do mesmo meio e incubada sob as mesmas condições, a fim de gerar maior quantidade de biomassa. Por fim, o inoculo anterior é diluído em 1 L do meio para o processo fermentativo em bioreator de 5L. O meio de cultura para o processo fermentativo é composto inicialmente de 40g/L de glucose, 10g/L de triptona, 5g/L de extrato de levedura, 10g/L de cloreto de sódio e 10g/L de L- glicina.

[047] O processo fermentativo é mantido com um mínimo de 4g/L e máximo de 40g/L de glicose disponível no meio e o pH mantido entre 6,0 e 6,5 por meio da adição de hidróxido de sódio ou outra base. A fermentação ocorre por até 72 horas a 30°C sob agitação de 300rpm e adição constante de 2 v.v.m. de oxigénio.

[048] Após o tempo de fermentação o conteúdo total é submetidos a redução de pH por adição de ácido cítrico até o pH atingir valor próximo a 3,0. Esse processo garante a completa inativação da biomassa. Após, o produto é submetido a secagem até conter entre 10 a 15% de umidade e então armazenado de 4-6°C.

[049] A mistura para formulação da ração animal é realizada por meio da agitação mecânica dos componentes sólidos na forma de pó ou grânulos finos. A ração aqui descrita é constituída de 0,1 -1 % do produto oriundo do processo fermentativo, 50-70% de co-produto a base de milho oriundo da produção de etanol (neste caso grãos secos de destiladores com solúveis - DDGS), 10-17,5% de levedura hidrolisada, 10-30% de farelo de soja, 5-10% de melaço de cana de açúcar e 1 ,5-3% de componentes, como espessantes, flavorizantes, acidulantes, entre outros.

[050] A mistura dos componentes se dá em misturador de ração industrial sob agitação de 480 rpm por cerca de 1 hora a temperatura ambiente. Após completo o processo de mistura, a ração é disponibilizada para frangos na forma de ração farelada fina.

REFERÊNCIAS

IKEDA, M., NAKAGAWA, S. The Corynebacterium glutamicum genome: features and impacts on biotechnological processes. Applied Microbiology and Biotechnology. 62(2-3):99-109 (2003).

JIANG, Y. et al. CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum. Nature Communications. 8:15179 (2017).

YU, X. et al. Engineering Corynebacterium glutamicum to produce 5- aminolevulinic acid from glucose. Microbial Cell Factories, 14:183 (2015).

Patentes referenciadas: KR 101 180266, CN 101863703, US 9333156, CN 104450812, KR 20100083425, KR 20090027269, CN 102870970, KR

100459918, US5840358A.