Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel 1

worin entweder

X für eine Hydroxyiminogruppe = N-OH, für eine Hydroxygruppe und für ein Wasser¬ stoffatom, für eine Cι-C20-Alkanoyloxygruppe und für ein Wasserstoffaiom oder für zwei Wasserstoffatome und

-AF=B für eine C-C-Doppel- und ^C für eine C-C-Einfachbindung oder

X für eine in Form eines cyclischen Ketals geschützte Ketogruppe und AF^B für eine C-C-

Einfach- und B^'C für eine C-C-Doppelbindung sowie in beiden Fällen Z für ein Sauerstoffatom oder für die Gruppierung OR ² und ein Wasserstoffatom und R ¹ und R- unabhängig voneinander je für ein Wasserstoffatom oder einen C _} -C2 ₍₎ -Aika- noylrest stehen.

Der Substituent OR ¹ am Kohlenstoffatom 1 kann α- oder ß-ständig sein.

Im Fall, daß X für eine in Form eines cyclischen Ketals geschützte Ketogruppe steht, sine die lα-Isomeren bevorzugt.

Ist X eine Alkanoyloxygruppe und ein Wasserstoffatom, kommen beispielsweise die Formyloxy-, Acetyloxy-, Propionyloxy-, Butyryloxy-, Pentanoyloxy-. Hexanoyloxy-, Heptanoyloxy- und Octanoyloxygruppe als Alkanoyloxygruppe inbetracht, von denen wiederum die Acetyloxygruppe bevorzugt ist.

^' Liegt X in der Form einer als cyclisches Ketal geschützten Ketogruppe vor, ist insbesonde¬ re an die Ethylendioxy- oder 2.2-Dimethyl-propylendioxy-Gruppe gedacht. Auch andere Diole kommen als Ketalbildner infrage (J. Am. Chem. Soc. 80, 6350 (1958)).

V

Die Alkanoylgruppen R ¹ und R ² können gleich oder verschieden sein oder R ¹ kann eine

Alkanoylgruppe und R" ein Wasserstoffatom oder umgekehrt bedeuten.

Als Alkanoylgruppen R ¹ und R ² seien beispielsweise genannt: die Formvl-, Acetvl-, Pro- pionyl-, Butyryk Pentanoyl-, Hexanoyl-, Heptanoyl- und Octanoylgruppe.

Die Acetylgruppe ist bevorzugt.

i ^* ~

Bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen R und R~ unab ^¬ hängig voneinander je für ein Wasserstoffatom oder einen C _j -C _j o-Alkanoylrest stehen.

Insbesondere betrifft die Erfindung nachstehende Verbindungen:

(E)-lß,17ß-Dihydroxyestr-4-en-3-on-oxim

(Z)-lß,17ß-Dihydroxyestr-4-en-3-on-oxim

(E)-lß,l7ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en-3-on-oχim

(Z)-lß,17ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en-3-on-oxim

(E)-l ,17ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en-3-on-oxim

(Z)- 1 α, 17ß-B is(acety loxy)estr-4-en-3-on-oxim

Estr-4-en-lß.3ß,17ß-triol

1 ß,3 ß, 17ß-Tris(ace ty loxy)estr-4-en lß-(Acetyloxy)estr-4-en-3ß,17ß-diol

Estr-4-en-lß,17ß-diol

Estr-4-en-lα.l7ß-diol

1 ß, 17ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en

17ß-(Acetyloxy)estr-4-en-lß-ol, lß-(Acetyloxy)estr-4-en-17ß-ol,

3,3-[2,2-Dimethyl-l,3-ρropandiylbis(oxy)]estr-5(10)-en-l α,17ß-diol,

3,3-[2,2-Dimethyl-l,3-propandiylbis(oxy)]estr-5(10)-en-l� �,l7ß-diol-dipentanoat.

3,3-[2,2-Dimethyl-1.3-propandiylbis(oxy)]-lα-hydroxyestr -5(10)-en-17-on,

3,3-[2,2-Dimethyl-1.3-propandiylbis(oxy)]-lα-hydroxyestr -5(10)-en-17-on-pentanoat.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I entfalten nach oraler und subcutaner Appli¬ kation starke estrogene Wirksamkeit.

lß-Hydroxy-19-nor-testosteron (lß,17ß-Dihydroxyestr-4-en-3-on) und lß-Acetoxy-19- nor-testosteron-acetat werden in RECUEIL 84 (1965) 626-632, lß-Hydroxv- und lß-Acei-

oxy-D-Norgestrel und -Norethisteron in EXPERIENTIA 30 (1974) 328-329 beschrieben. Über die pharmakologische Wirkung dieser Verbindungen ist dort wenig ausgesagt.

Aus der deutschen Offenlegungsschrift DE-A-26 14 340 geht hervor, daß lß,17ß-Dihy- droxyestr-4-en-3-on sowie dessen Cj-Cg-Alkyl-l-mono- und 1,17-diester estrogene Akti¬ vität und nidationshemmende Wirkung bei Ratten und eine uterusepithelablösende Wirkung bei adulten Kaninchen haben.

Es wurde nunmehr gefunden, daß die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I sowohl nach subcutaner als auch nach peroraler Applikation in vivo stark estrogen wirksame Substanzen darstellen. Die Bioverfügbarkeit von Estradiol nach oraler Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen ist gegenüber der nach direkter oraler Applikation von Estradiol selbst deutlich erhöht. Außerdem sollte die hepatische Estrogenität der erfindungsgemäßen Verbindungen geringer sein als die von Ethinylestradiol, der in oralen Kontrazeptiva als estrogene Kompopnente fast ausschließlich verwendeten Verbindung.

Das natürliche Estradiol (E2) ist beim Menschen nach transdermaler Applikation ein hepa- tisch schwach wirksames Estrogen (J. Holst, S. Cajander, K. Carlström, M.-G. Damber, B. von Schoultz; Brit. J. Obstet. Gynec. 90, 355-360; 1983). Ethinylestradiol (EE) dagegen, welches aufgrund seiner metabolischen Stabilität einem intensiven enterohepatischen Kreislauf unterliegt, führt unter den gleichen Bedingungen zur Erhöhung von Parametern für hepatische Estrogenität wie SHBG, CBG und HDL-Cholesterin (U. Göbelsmann. C.A. Mashchak. D.R. Mishell: Am. J. Obstet. Gynec. 151, 868-877: 1985).

Über das Zustandekommen der hepatischen Estrogenität ist wenig bekannt. Diskutiert wer¬ den unter anderem indirekte Effekte durch estrogen-bedingte Modulation der Freisetzung von Wachstumshormon aus der Hypophyse und dessen Wirkung auf die hepatische Gen¬ expression (B. von Schoultz, K. Carlström; J. Steroid Biochem. 32, 327-334: 1989).

Für die Existenz direkter Estrogenwirkungen spricht das Vorhandensein des Estrogenre¬ zeptors in der Leber (G. Norstedt. Ö. Wränge, J.-A. Gustafsson: Endocrinologv 108. 1190- 1196: 1981). Weiterhin führt bei der Frau transdermal verabreichtes Estradiol zu einem deutlich geringeren Anstieg von SHBG (sexual hormone binding globuline) als bei oraler Applikation (Holst et al.. s. oben). Dies läßt sich am einfachsten durch direkte hepatische

^• f

Estrogenwirkung erklären, da der Estradiol-Spiegel in der Leber nach transdermaler Appli¬ kation nicht die Höhe erreicht wie nach oraler Gabe. Überdies unterliegt Estradiol im Ge¬ gensatz zu 17α-Ethinylestradiol nicht dem enterohepatischen Kreislauf. Andererseits ist Estradiol oral nur gering bioverfügbar, da es bei der Leberpassage rasch metabolisiert wird.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I sind dagegen selbst che¬ misch stabil, setzen aber nach hepatischer Aktivierung spontan Estradiol frei. Sie machen somit nach der ersten Leberpassage das natürliche Hormon Estradiol bioverfügbar. Durch die nach dem initialen Aktivierungsschritt verzögerte Estradiol-Freisetzung bleibt die Hormonkonzentration in der Leber im Vergleich zur oralen Applikation von Estradiol niedrig. Zudem entfällt der enterohepatische Kreislauf, da Estradiol bei der folgenden Leberpassage inaktiviert (metabolisiert) wird.

Die bereits erwähnten l-Hydroxyestr-4-en-3-one entfalten ihre estrogene Wirkung auf¬ grund spontaner Aromatisierung zu Estradiol, und zwar unter physiologischem pH. Bei neutralem pH ist dieser Prozeß langsam, die Reaktionsgeschwindigkeit steigt aber im sauren und alkalischen Milieu.

Die hier beschriebenen Verbindungen der allgemeinen Formel I stellen stabilisierte Deri¬ vate des l-Hydroxyestr-4-en-3-ons dar, welche eine orale Applikation erlauben, danach aber zur entsprechenden 3-Ketoverbindung metabolisieren:

a) die 3-Oxim- bzw. 3-Ketalverbindungen liefern nach Hydrolyse die 3-Keto-Verbin- dung. Dieses Prinzip ist beispielsweise bereits bei dem Gestagen Norgestimat ((+)- 13-Ethyl-l7-hydroxy-18,19-dinor-17α-pregn-4-en-20-in-3-on-o xim-acetat). einem Levonorgestrel-Produg ((-)-13-Ethyl-17-hydroxy-18,19-dinor-17α-pregn-4-en-20- in-3-on), realisiert;

b) die nach Reduktion der 3-Ketogruppe erhaltenen entsprechenden 3-Hydroxvverbin- dungen werden durch enzymatische Dehydrogenierung in das 3-Keton zurückge¬ führt;

c) die nach Reduktion des 3-Dithioketals gebildeten 3-Desoxo-Verbindungen gehen durch enzymatische Hydroxylierung und anschließende Dehydrogenierung wieder

in die aktive 3-Ketoverbindung über. Diese Idee findet sich bereits beim Desoge- strel (13-Ethyl-ll-methylen-18,19-dinor-17α-pregn-4-en-20-in-17-o l) wieder, das durch mikrosomale Oxidation zum 3-Ketodesogestrel reagiert.

Zum Nachweis der estrogenen Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde der Vaginalabstrich-Test nach Allen & Doisy (Ratte) durchgeführt und die Stimulierung des Uteruswachstums untersucht sowie der Verlauf der Estradiol-Plasmaspiegel (Ratte und Meerschweinchen) bestimmt.

Die neuen Verbindungen stellen somit ein neuartiges Prinzip oraler Estrogen-Applikation dar. Nach oraler Einnahme eines geeigneten "Prä-Prodrugs" wird dieses enzymatisch zu l-Hydroxyestr-4-en-3-on umgesetzt. Letztere Verbindung, das eigentliche Prodrug, aromatisiert langsam spontan zu Estradiol.

Durch dieses neuartige Applikationsprinzip sollte eine deutliche Verringerung hepatischer Estrogen-Wirkungen erreicht werden, da im Vergleich zu oraler Gabe von 17α- Ethinylestradiol infolge der verzögerten Estradiol-Freisetzung die akute Estrogenbelastung der Leber viel geringer bleibt. Überdies gelingt es, das natürliche Estrogen Estradiol oral bioverfügbar zu machen. Im Vergleich zu Estradiol, das nach oraler Applikation rasch eliminiert wird, erweisen sich die hier beschriebenen Substanzen durch die zum Teil langanhaltend erhöhten Estradiol-Spiegel als überlegen.

1. Untersuchungen an weiblichen Ratten: a) VAGINALABSTRICH NACH ALLEN & DOISY

Endogene Estrogene führen bei weiblichen Ratten zu einer Proliferation des Vaginalepi¬ thels mit einer Verhornung der oberflächlichen Zellagen und zu einer Gewichtszunahme des Uterus. In ovarektomieπen (OVEX) weiblichen Tieren kann die Proliferation des Ute¬ rusepithels und das Uteruswachstum durch exogen zugeführte Estrogene induziert werden.

TIERE:

Die Untersuchungen werden an weiblichen ovarektomieπen Wistar Ratten (Schering- Zucht) im Gewicht von 190-220 g durchgeführt. Die Tiere werden in Makrolonkäfigen in kontrolliert belichteten Räumen (10 Stunden Dunkelheit : 14 Stunden Helligkeit) bei Raumtemperatur (22°C) gehalten. Das Futter besteht aus einer Standard-Diät (pelletiertes Rattenfutter, Altromin 1324) und Leitungswasser ad libitum.

FORMULIERUNG UND APPLIKATION DER TESTSUBSTANZ:

Die Substanzen werden in Benzvlbenzoat + Rizinusöl (1+4 v/v) gelöst und in einem Volu¬ men von 0,5 ml s.c. appliziert.

Bei oraler Anwendung wird die Testsubstanz in einer Trägerflüssigkeit (85 mg Myrj in 100 ml 0,9% w/v ΝaCl-Lösung) suspendiert und die Tagesdosis in einem Volumen von 0,5 ml verabreicht.

VERSUCHSDESIGΝ:

Die Tiere werden 10 Tage vor Versuchsbeginn unter Ethernarkose ovarektomiert.

dl Substanzapplikation d2 d3 Vaginalabstrich d4 Vaginalabstrich d5 Vaginalabstrich und Autopsie

Die Vaginalabstriche werden mit einer angefeuchteten, mit Watte umwickelten, stumpfen Stecknadel durchgeführt und mikroskopisch folgendermaßen begutachtet:

I. Diöstrus (Leukozyten)

II. Proöstrus (kernhaltige Epithelzellen)

III. Östrus (kernlose Hornschollen)

IV. Metöstrus (wenige kernlose Hornschollen, viele Leukozyten, Epithelzellen. Schleim)

Als positives Behandlungsergebnis wird das Auftreten von Proöstrus, Östrus und Met¬ östrus gewerlet.

Am fünften Tag werden die Tiere mit Cθ2-Gas getötet, die Uteri entnommen, gewogen (Feuchtgewicht) und nach 4 Stunden Trockenzeit bei 60°C nochmals gewogen -(Trocken¬ gewicht).

b) VERLAUF DER ESTROGEΝ-PLASMASPIEGEL Tiere und Substanzformulierung wie unter (1).

VERSUCHSDESIGΝ

Die Tiere werden 10 Tage vor Versuchsbeginn unter Ethernarkose ovarektomiert.

3-

dl ( 0 Std.) Blutabπahme + Substanzapplikation d2 (24 Std.) Blutabnahme d3 (48 Std.) Blutabnahme d4 (72 Std.) Blutabnahme d5 (96 Std.) Blutabnahme und Autopsie

Die Blutentnahme erfolgt unter leichter Cθ2-Narkose aus dem Retroorbitalplexus. Am Tag 5 werden die Tiere mit Cθ2-Gas getötet und die Uterusgewichte wie unter (a) beschrieben bestimmt.

c) VERLAUF DER ESTROGEN-SERUMSPIEGEL (Bestimmung der Fläche unter der Kurve)

Tiere und Substanzformulierung wie unter (1).

VERSUCHSDESIGN

Die Tiere werden JO Tage vor Versuchsbeginn unter Ethernarkose ovarektomoiert.

d5 (96 Std.) Blutabnahme + Autopsie

Die Blutabnahme erfolgt unter leichter Cθ2-Narkose aus dem Retroorbitalplexus. Am Tag 5 werden die Tiere mit Cθ2-Gas getötet und die Uterusgewichte wie unter (a) beschrieben bestimmt.

* Die E2-Spiegel sind nur bis 48 Stunden dargestellt, da dann die Basalwerte wieder erreicht werden.

%

Die Estradiol-Spiegel zu den unterschiedlichen Zeitpunkten werden radioimmunologisch bzw. durch kombinierte HPLC-RIA-Analytik bestimmt.

II. Untersuchungen an weiblichen Meerschweinchen a) VERLAUF DER ESTROGEN-PLASMASPIEGEL

TIERE:

Die Untersuchungen werden an weiblichen ovarektomierten Meerschweinchen (Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld) im Gewicht von ca. 800 g durchgeführt. Die Tiere werden in Makrolonkäfigen in kontrolliert belichteten Räumen (10 Std. Dunkelheit, 14 Std. Hellig¬ keit) bei Raumtemperatur (22°C) gehalten. Das Futter besteht aus Vitamin C angereicher¬ ten Pellets und Leitungswasser ad libitum. Zusätzlich werden frischer Salat und Möhren gefüttert.

FORMULIERUNG UND APPLIKATION DER TESTSUBSTANZ: Wie für die Versuche (s.c.) an Ratten beschrieben.

VERSUCHSDESIGN:

Die Tiere werden 10 Tage vor Versuchsbeginn unter Ether-/Penthrane-Narkose ovarek¬ tomiert.

dl ( O Std.) Blutabnahme + Substaπzappiikation

(0.5 Std.) Blutabnahme

(1.5 Std.) Blutabnahme

(4,5 Std.) Blutabnahme

(12 Std.) Blutabnahme d2 (24 Std.) Blutabnahme + Autopsie

Die Blutentnahme erfolgt unter leichter Ether-Narkose aus dem Retroorbitalplexus. Am Tag 2 werden die Tiere mit Cθ2-Gas getötet und die Uterusfeuchtgewichte bestimmt.

Die Estradiol-Spiegel zu den unterschiedlichen Zeitpunkten werden radioimmunologisch bestimmt.

Folgende Verbindungen wurden untersucht:

(Z)-lß,17ß-Bis(acetyl)(oxy)estr-4-en-3-on-oxim (A); lß,3ß,17ß-Tris(acetyl)(oxy)estr-4-en (B); Estr-4-en-lß,17ß-diol (C);

3,3-[2,2-Dimethyl-l,3-propandiylbis(oxy)]estr-5(10)-en-l� �,17ß-diol (D); 3,3-[2,2-Dimethyl-l,3-propandiylbis(oxy)]-lα-hydroxy-estr-5 (10)-en-17-on (E); Estra-l,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (F).

Die getesteten Verbindungen A, B, C und D erweisen sich nach peroraler Applikation von jeweils lO Mol Substanz an der Ratte als estrogen wirksam (Abb. 1). Die Stimulierung des Uteruswachstums schon nach Einmalapplikation der Substanzen deutet auf eine lang¬ anhaltende Wirkung hin. Dies wird durch Verfolgung der Estrogen-Spiegel im Serum über 24 Std. (Abb. 2) bestätigt: noch 24 Std. nach Applikation sind erhöhte Estradiol-Spiegel nachweisbar. Es zeigt sich eine gute Korrelation zwischen der estrogenen Wirkstärke der Testsubstanzen und der Höhe bzw. Stimulierungsdauer der Estradiol-Spiegel.

Außerdem wurden die Estradiol-Spiegel sowohl nach subcutaner als auch nach peroraler Verabreichung von je 2,5 Mol der Verbindung (A) an ovarektomierten Ratten radioim¬ munologisch bestimmt (Abb. 3). Noch 24 Std. nach Applikation der Substanz zeigen sich signifikant erhöhte Estradiolwerte. Auch findet sich eine klare Dosis-Wirkungsbeziehung hinsichtlich der Stimulierung des Uteruswachstums (Abb. 4) und der Wirkung im Allen - Doisy-Test (Abb. 5).

Vergleichbare Estrogen-Spiegel treten nach einmaliger s.c. Gabe von 2,5 «Mol der Ver¬ bindung (A) an ovarektomierten Meerschweinchen (Abb. 6) auf.

Zusätzlich wurden die Verbindungen (D) und (E) nach einmaliger peroraler Applikation in zwei niedrigeren Dosierungen (0,1 und 1.0 «mol) im Vergleich zu Verbindung (F; getestet und die E2-Spiegel über 48 Stunden bestimmt. Im Vergleich zu Substanz (F) zeigten sich für die Verbindungen (D) und (E) (Abb. 7 und 8) deutlich erhöhte E2-Spiegel (AUC = area under the curve) über 4S Stunden.

Die pharmakologischen Ergebnisse sind in den nachstehenden Abbildungen 1 bis S zusammengefaßt:

Aö

Abb. 1: Uterusgewichte ovarektomierter Ratten nach oraler Einmalapplikation von jeweils 10 «Mol ausgewählter Estrogen-Prodrugs. a) Uterusfeuchtgewichte b) Uterustrockengewichte

Die oberhalb der Balken angegebenen Zahlen (6/6 bzw. 0/6 geben die Anzahl der Allen-Doisy-positiven Tiere an. Abb. 2: Profile der Estradiol-Spiegel im Serum mit ausgewählten Testsubstanzen behan¬ delter Ratten.

Den Tieren wurden zu den angegebenen Zeiten nach Substanzapplikation Blut¬ proben entnommen und der Estradiol-Gehalt radioimmunologisch bestimmt.

Abb. 3: Estradiol-Spiegel im Serum p.o. bzw. s.c. mit Verbindung (A) behandelter Ratten. Zu den angegebenen Zeiten nach Substanzapplikation wurden Serumproben gewonnen und der Estradiolgehalt radioimmunologisch bestimmt.

Abb. 4: Estrogen-Wirkung der Verbindung (A) nach peroraler bzw. subcutaner Applikation (Allen-Doisy-Test) bei ovarektomierten Ratten.

Abb. 5: Dosisabhängigkeit der Stimulierung des Uteruswachstums durch Verbindung (A). Ovarektomierten Ratten wurden steigende Mengen der Testsubstanz s.c. bzw. p.o. appliziert und das Uterus-Feucht- bzw. Trockengewicht nach 5 Tagen bestimmt.

Abb. 6: Verlauf der Plasma-Estradiol-Spiegel ovarektomierter Meerschweinchen nach s.c. Applikation von 2,5 μMol Verbindung (A).

Abb 7: Estradiol-Spiegel im Serum zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einmaliger p.o. Applikation von Verbindung (D) im Vergleich zu Verbindung (F). Die Tabelle zeigt die relative Bioverfügbarkeit von Substanz (D) im Vergleich zu (F).

Abb. S: Estradiol-Spiegel im Serum zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einmaliger p.o. Applikation von Verbindung (E) im Vergleich zu Verbindung (F). Die Tabelle zeigt die relative Bioverfügbarkeit von Substanz (E) im Vergleich zu (F).

AA

Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel I zur Behandlung von Estrogenmangelerscheinungen und zur Fertilitätskontrolle bei der Frau.

Die erfindungs gern äßen Verbindungen können in der gleichen Weise wie Ethinylestradiol, welches das am meisten verwendete Estrogen ist, formuliert und eingesetzt werden. Sie werden mit den in der galenischen Pharmazie üblichen Zusätzen, Trägerssubstanzen und/oder Geschmackskorrigentien nach an sich bekannten Methoden zu den üblichen Arz¬ neimittelformen verarbeitet. Für die orale Applikation kommen insbesondere Tabletten, Dragees, Kapsein, Pillen, Suspensionen oder Lösungen infrage. Für die parenterale Appli¬ kation kommen insbesondere ölige Lösungen, wie z. B. Sesamöl- oder Rizinusöllösungen, infrage, die gegebenenfalls zusätzlich noch ein Verdünnungsmittel, wie z.B. Benzvlbenzo¬ at oder Benzylalkohol, enthalten können.

Die Wirkstoffkonzentration in den pharmazeutischen Zusammensetzungen ist abhängig von der Applikationsform und dem Anwendungsgebiet. So können z. B. Kapseln oder Tabletten zur Behandlung von Estrogenmangelerscheinungen 0,01 bis 10,0 mg Wirkstoff, ölige Lösungen zur intramuskulären Injektion pro 1 ml etwa 0,01 bis 0,1 mg Wirkstoff enthalten.

Zur Kontrazeption bei der Frau können die erfindungsgemäßen Estrogene in Kombination mit Gestagenen angewandt werden. Tabletten oder Dragees zur täglichen Einnahme einer Tablette oder eines Dragees sollen vorzugsweise 0,03 bis 100 mg des erfindungsgemäßen Estrogen-Prodrugs und 0,05 bis 0.5 mg eines Gestagens enthalten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bei Estrogenmangelerscheinungen der Frau, wie z. B. Amenorrhoe, Dysmenorrhoe. Sterilität, Endometritis, Kolpitis und klimak- terischen Beschwerden und zur Prävention der Osteoporose verwendet werden. Ferner können die Verbindungen als estrogene Komponente in hormoneilen Kontrazeptiva (Em¬ phasen- und Mehrphasen-sowie Mehrstufenpräparate) eingesetzt werden. Außerdem sind sie in Verbindung mit anderen Wirkstoffen zur Verwendung in hormontragenden Intra- uterinpessaren. implantierbaren Wirkstoffträgern sowie in transdermalen Applikationssvs- temen geeignet.

Auch für die Therapie des hormonabhängigen Mammacarcinoms sind die erfindungsge¬ mäßen Verbindungen aufgrund ihres geringen Nebenwirkungspotentials geeignet. Die hierfür erforderliche tägliche Dosis liegt im Bereich von 5 bis 500 mg.

Die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden hergestellt, indem

a) wenn X letztendlich für eine Hydroxyiminogruppe = N~OH (syn oder anti) stehen soll, l - oder lß,17ß-Dihydroxy-estr-4-en-3-on gegebenenfalls partiell und/oder sukzessive die 1- und/oder 17-Hydroxygruppe (n) verestert sowie das 3-Keton mit einem Hydroxylammoniumsalz [NH3θH] _π L (L=C1, Br und n = 1; L = SO4 und n = 2) in ein

Z/E-Gemisch der entsprechenden 3-Oxim-Verbindung überführt und das Gemisch gewünschtenfalls getrennt sowie eine l-OAcyl-3-hydroxyimino-17ß-hydroxy-

Verbindung gewünschtenfalls zum 17-Keton oxidiert wird (werden), oder

b) wenn X letztendlich für zwei Wasserstoffatome stehen soll, lß,17ß-Dihydroxy-estr-4- en-3-on zu einem entsprechenden 3,3-Dithioketal umgesetzt und die Dithioketalgruppe anschließend reduktiv mit einem elektropositiven Metall in flüssigem Ammoniak abge¬ spalten, in dem entstandenen lß,17ß-Dihydroxyestr-4-en die 1- und/oder 17-Hydroxy- gruppe(n) partiell und/oder sukzessive verestert, gewünschtenfalls das lß,17ß- Dihydroxyestr-4-en (Diol) oder ein entsprechender 17-Monoester davon in 1- und gegebenenfalls 17-Stellung mit Chromtrioxid/Pyridin, Pyridiniumchlorochromat (PCC), Pyridiniumdichromat (PDC) oder einem anderen, in der Steroidchemie für die Oxidation einer 1- und gegebenenfalls 17-Hydroxygruppe verwendbaren Oxidationsmittel oxidiert und anschließend das entstandene 1,17-Diketon bzw. den entstandenen! -Keto-17-ester mit einem Alkali-Selectride zum lα,17ß-Diol bzw. lα- Hydroxy-17-ester reduziert und gegebenenfalls nach Verseifung der Estergruppe(n) und gewünschter partieller und/oder sukzessiver Veresterung der 1- und /oder 17- Hydroxygruppe(n) in eine Verbindung der allgemeinen Formel Ib

Λ

H

worin R ¹ und R- die in der Formel I angegebene Bedeutung haben, überführt, sowie gewünschtenfalls - wenn R^ für ein Wasserstoff atom steht - die 17-

Hydroxy- zur 17-Ketogruppe oxidiert wird (werden), oder

c) wenn X ietztendlich für die Hydroxygruppe und für ein Wasserstoffatom oder für eine Cι-C20-Alkanoyloxygruppe und für ein Wasserstoffatom stehen soll, l - oder lß,17ß- Dihydroxyestr-4-en-3-on gewünschtenfalls partiell und/oder sukzessive verestert, die 3- Keto- zur 3-Hydroxygruppe reduziert sowie gewünschtenfalls die 3-Hydroxygruppe verestert wird, oder

d) wenn X letztendlich eine in Form eines cyclischen Ketals geschützte Ketogruppe sein soll, 17ß-Hydroxyestr-4-en-3-on mit dem entsprechenden Ketalbildner und gewün¬ schtenfalls nach Veresterung oder Oxidation der 17ß-Hydroxygruppe zu einem Ketal der allgemeinen Formel I'd

^" -

worin K eine in Form eines cyclischen Ketals geschützte Ketogruppe bedeutet sowie Z die in Formel I angegebene Bedeutung hat, umgesetzt, anschließend das Ketai unter Verschiebung der Doppelbindung in 1 -Position mikrobiologisch zur Iß- und/oder lα- Hydroxyverbindung hvdroxvliert sowie gegebenenfalls zur 17-Ketoverbindun oxidiert

anschließend die 1 -Hydroxygruppe gewünschtenfalls verestert, die 17-Ketogruppe gewünschtenfalls reduziert und gewünschtenfalls verestert wird.

Die in den Beispielen 813, HA sowie 11B beschriebenen mikrobiologischen lα- Hydroxylierungen und die entsprechenden lα-Hydroxy Verbindungen sind neu. Die beschriebenen Verfahren und die hergestellten Produkte gehören daher auch zum Gegenstand vorliegender Erfindung.

Die übrigen Reaktionsschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens (Veresterung; Oximbildung; Oxidation der 17-Ketogruppe; Herstellung der 3,3-Dithioketale; Verseifung der Estergruppen: Reduktion der 3-Ketogruppe; Ketalisierung der 3-Ketogruppe) werden für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I jeweils nach den in den Beispielen offenbarten Vorschriften oder analog zu den in den Beispielen gemachten Angaben unter Anpassung der erforderlichen entsprechenden Reaktionspartner nach in der Steroidchemie für diese Reaktionen gebräuchlichen Verfahren ausgeführt.

Die Z- und E-Isomeren der Oxime lassen sich auf chromatographischem Wege trennen. Die reduktive Spaltung der Dithioketalgruppe zur Erzeugung der 3-Desoxoverbindungen verläuft insbesondere unter den Bedingungen einer Birch-Reduktion (Lithium/fl. Ammoniak).

Die Reduktion der 1- und gegebenenfalls 17-Ketogruppe (Verfahrensvariante b)) gelingt besonders gut mit einem Alkali-Selectride (Kalium-tri-sec.-butylborhydrid, Kalium- trisiamylborhydrid, Lithium-tri-sec.-butylborhydrid, Lithium-trisiamylborhydrid, Natrium tri-sec.-butylborhydrid) als Reduktionsmittel. Bei der Oxidation/Reduktion eines lß,17ß- Diols bzw. eineslß-Hydroxy-17-esters wird dabei die Stereochemie am Kohlenstoffatom umgekehrt.

Bei der Reduktion der 3-Ketogruppe zur 3-Hydroxygruppe, beispielsweise mit Natriumborhydrid, entsteht in überwiegender Menge die entsprechende 3- Hydroxyverbindung, jedoch läßt sich bei Durchführung größerer Ansätze auch die 3α- Hydroxyverbindung als Reaktionsprodukt nachweisen.

Die Veresterung freier Hydroxygruppen erfolgt nach den Methoden, die man üblicher¬ weise in der Steroidchemie zur Veresterung sekundärer Hydroxygruppen verwendet. As geeignete Methode zur Veresterung sei beispielsweise die Umsetzung der Steroide mit Säureanhydriden oder Säurechloriden bzw. -bromiden, die den entsprechenden,

einzuführenden C - bis C20-Alkanoylrest liefern, in Gegenwart basischer Katalysatoren, wie Natriumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat, Natri¬ umhydroxid, Kaliumhydroxid, Pyridin, Lutidin, Collidin oder 4-Dimethylaminopyridin, genannt. Die Veresterung sekundärer Hydroxygruppen ist nach etwa 10-20 Stunden bei Raumtemperatur beendet.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung.

A b

Beispiel 1

Herstellung von (E)-lß,17ß-Dihydroxyestr-4-en-3-on-oxim (LA) und (Z)-lß,17ß-Dihydroxyestr-4-en-3-on-oxim dB)

Eine Lösung von 10 g Hydroxylammoniumchlorid in 250 ml Ethanol wird mit 5 g lß,17ß- Dihydroxyestr-4-en-3-on (Herstellung siehe Recueil 84, 626 (1965)) versetzt und 22 Stun¬ den bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Reaktionslösung in Wasser eingerührt und dreimal mit Dichlormethan und anschließend dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden zur Trockne gebracht und der Rückstand an Kie¬ selgel mit Hexan/Aceton chromatographiert. Es werden 1,8 g der Verbindung LA nd aus der polaren Fraktion 2,1 g der Verbindung 1J3 erhalten.

1A: Fp.: 130°C (Ethylacetat); [ ]ß ² = -81° (CHCI3; c = 1,025) 1B: Fp.: 211°C (Ethylacetat); [α]^ ² = -15° (CHCI3; c = 1,010)

Beispiel 2

Herstellung von (E)-lß,17ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en-3-on-oxim C2A") und (Z)-lß,17ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en-3-on-oxim (2B)

Eine Lösung von 5 g Hydroxylammoniumchlorid in 250 ml Ethanol wird mit 5 g lß,17ß- Bis(acetyloxy)estr-4-eπ-3-on (Herstellung siehe Recueil 84, 626 (1965)) versetzt und 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Reaktionslösung in Wasser einge¬ rührt das ausgefallene Rohprodukt abgesaugt, getrocknet und an Kieselgel mit Hexan/- Ethylacetat chromatographiert. Es werden 1,71 g der Verbindung 2A und als polarere Fraktion 1,38 g der Verbindung 2B erhalten.

2A: Fp.: 13S°C (Hexan); [a]ß~ = -56° (CHCI3; c = 1,010)

2B: Fp.: 170°C (Diisopropylether); [ ]^ ² = -39° (CHCI3: c = 1,015) Beispiel 3

Herstellung von Estr-4-en-lß,3ß,17ß-triol (3)

Bei 0°C werden 572 mg Certrichlorid in 10 ml Methanol vorgelegt. Dazu werden bei der gleichen Temperatur 600 mg lß,17ß-Dihydroxyestr-4-en-3-on, gelöst in 15 ml Methanol, getropft. Danach werden 61 mg Natriumborhydrid in kleinen Portionen zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 90 Minuten bei 0°C gerührt, dann in Wasser gegossen und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Natri¬ umsulfat getrocknet und am Vakuum eingeengt. Nach Säulenchromatographie an Alumi¬ niumoxid (neutral, Stufe III) mit Hexan/Ethylacetat werden 330 mg der Titelverbindung 3 als weißer Schaum erhalten.

3: Fp.: 19S°C (Methanol); [ ]ß ² = -40° (MeOH; c = 0,505)

Beispiel 4

Herstellung von lß,3ß,l7ß-Tris(acetyloxy)estr-4-en £4}

4,1 g der in Beispiel 3 hergestellten Verbindung werden mit 20 ml Acetanhydrid in 10 ml wasserfreiem Pyridin über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann vorsichtig in Wasser gegossen und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Vaku¬ um eingedampft. Chromatographie mit Hexan/Ethylacetat an Kieselgel ergibt 4.95 g der Titelverbindung 4 als weißen Schaum.

4: Fp.: 95°C (Hexan/Diisopropylether); [ ]ß ² = -98° (CHC1 ₃ ; c = 0,510)

Beispiel 5

Herstellung von lß-(Acetyloxy)estr-4-en-3ß.l7ß-diol £5}

λl

570 mg Natriumborhydrid werden unter Eiskühlung portionsweise zu 5,5 ml Trifluoressig säure, 5,5 ml Eisessig und 10 ml Acetonitril so zugegeben, daß die Innentemperatur +10° reicht übersteigt. Nach Beendigung der Wasserstoffentwicklung tropft man die Lösung bei Raumtemperatur zu 290 mg lß,l7ß-Dihydroxyestr-4-en-3-on in 5 ml Dichlormethan, rühr 30 Minuten nach und versetzt vorsichtig mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung bis zur annähernden Neutralität. Anschließend wird die organische Phase mit Wasser ge¬ waschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und am Vakuum eingedampft. Durch Chroma tographie mit Hexan/Ethylacetat an Kieselgel werden 60 mg der Titelverbindung 5 erhal¬ ten.

5: Fp.: <70°C Zers. (Hexan/Aceton); [α]^~ = +86° (CHC1 ₃ ; c = 1,010)

Beispiel 6

Herstellung von Estr-4-en-lß,17ß-diol £6B)

A. 3,3-[1.2-Ethandiylbis(thio)]estr-4-en-lß,17ß-diol (6A)

Zu einer Lösung von 290 mg lß,17ß-Dihydroxyestr-4-en-3-on und 84 «1 1,2-Ethandithiol in 4 ml Eisessig wird bei 0°C langsam eine Lösung von 95 mg p-Toluolsulfonsäure in 1 Eisessig getropft. Das Reaktionsgemisch wird zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. dann bei 0°C vorsichtig mit 2 M NaOH versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die or¬ ganische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Vaku¬ um eingeengt. Säulenchromatographie an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat ergibt 252 mg der Titelverbindung 6A als weißen Schaum.

6A: Fp.: 153°C (Diisopropylether); [ ] ²² = +50° (CHCI3; c = 0,505)

A

B _i Estr-4-en-lß,17ß-diol (6B)

100 ml flüssiger Ammoniak werden in einen auf -70°C gekühlten Kolben einkondensiert. 315 mg Lithium wird portionsweise im Stickstoffstrom zugegeben. Dann wird 30 Minuten bei -70°C gerührt. Eine Lösung von 810 mg der unter 6A hergestellten Verbindung in 10 ml absolutem Tetrahvdrofuran wird zugetropft, dann wird eine Stunde bei derselben Tem¬ peratur gerührt. Anschließend wird tropfenweise soviel Wasser hinzugegeben, daß sich die Reaktionslösung entfärbt. Der Ammoniak wird abgedampft und der Rückstand wird mit Wasser verdünnt sowie mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingedampft. Chromatographie des Rückstandes mit Hexan/- Ethylacetat an Kieselgel ergibt 440 mg der Titelverbindung 6B als weißen Schaum.

6B: Fp.: 95°C (Hexan/Aceton); [a] ² = -37° (CHC1 ₃ ; c = 0,500)

Beispiel 7

Herstellung von lß,17ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en £7}

Wie unter Beispiel 4 beschrieben werden aus 350 mg der Verbindung 6B mit 0,5 ml Acetanhydrid in 2 ml Pyridin 377 mg der Titelverbindung 7 als farbloses Öl erhalten.

7: !H-NMR(CDCl3): ό = 5,43 ppm (lH,m.H-4); 5,10 pp (lH,m.H-l ); 4.58 pp (lH.dd breit J=8,5 Hz und J=S.0Hz,H-17α); 2.03 ppm (6H,s.H-Acetyl) _; 0,82 ppm (3H,s,H-18).

IR (CHCl ₃ ): 1715 (Acetat)

Beispiel 8

Herstellung von 3,3-[2,2-Dimethyl-l,3-propandiylbis(oxy)]estr-5(10)-en-l ,17ß-diol £8B} und 3,3-[2.2-Dimethyl-l,3-propandiylbis(oxy)]-lα-hydroxyestr-5( 10)-en-17-on (8Q

A 3,3-[2,2-Dimethyl-l,3-propandiylbis(oxy)]estr-5-en-17ß-ol fδA')

9,2 g 17ß-Hydroxyestr-4-en-3-on werden mit 8,9 g 2,2-Dimethyl-l,3-propandiol, 4,9 ml Trimethylorthoformiat und einer Spatelspitze p-Toluolsulfonsäure in 100 ml Dichlorme¬ than vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird in gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen. Die wäßrige Phase wird mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen, über Natri¬ umsulfat getrocknet und am Vakuum eingeengt. Durch Chromatographie an Kieselgel mit Ethylacetat/Hexan erhält man 8,7 g 8A als weißen Schaum. Fp.: 138°C (Diisopropylether)

R, 3,3-[2,2-Dimethyl-l,3-propandiylbis(oxy)]estr-5(10)-en-l ,17ß-diol (8B) und 3,3-[2.2-Dimethyl-l,3-propandiylbis(oxy)]-lα-hydroxyestr-5( 10)-en-17-on (8C

Ein 2 1 Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterili¬ sierten Nährlösung aus 1% Glucose und 1% Sojabohnenmehl enthält, wird mit einer Lvo- philkultur des Stammes Botryodiplodia malorwn (CBS 13450) beimpft und 72 Stunden bei 30°C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Mit 300 ml dieser Vorkultur wird ein 1 Liter-Glasfermenter beimpft, der mit 4,7 Litern eines sterilisierten Nährmediums gleicher Zusammensetzung gefüllt ist. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel wird bei 29°C unter Belüftung und Rühren germiniert und nach 24 Stunden das Substrat in Form einer Lösung von 2,5 g der Verbindung 8A in 25 ml N,N-Dimethylformamid zugegeben. Nach 130 Stunden Fermentationszeit wird die Kulturbrühe filtriert, das Filtrat zweimal mi je 5 1 Methylisobutylketon extrahiert und die vereinigten Extrakte im Vakuum zur Trockn eingeengt. Der hinterbliebene Rückstand wird an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat chro¬ matographiert. Man erhält 160 mg des 17-Ketons 8C und 130 mg des Diols 8B als weiße Schäume.

SB: Fp.: 169°C (Hexan/Diisopropylether)

!H-NMR (CDCI3): 6 = 4,32 ppm (lH,d,breit J=10Hz,H-lß); 3,69 ppm (lH,dd breit J=9,5Hz und J=9,0Hz,H-17α); 3,67-3,44 ppm (4H,m,H-Ketal); 1,00 ppm (3H,s,H-Ketal); 0,97 ppm (3H,s,H-18); 0,77 ppm (3H,s,H-Ketal).

8C: [α]^ ² = +40° (CHCI3; c = 1,010)

Beispiel 9

Herstellung von 17ß-(Acetyloxy)estr-4-en-lß-ol (9A) und lß-(Acetyloxy)estr-4-en-17ß-ol C2B)

3,5 g der in Beispiel 6B hergestellten Verbindung werden in 30 ml wasserfreiem Pyridin und 10 ml Dichlormethan gelöst, langsam mit 1,2 ml Acetanhydrid versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann vorsichtig in Was¬ ser gegossen und mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wer¬ den mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser und gesättigter Natriumchlo¬ ridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingedampft. Chro¬ matographie mit Hexan/Ethylacetat an Kieselgel ergibt als unpolarste Fraktion 520 mg des in Beispiel 7 beschriebenen Diacetats. Als nächstpolarere Fraktion erhält man 1,3 g des 17- Monoacetats 9A, dann folgen 470 mg des 1-Monoacetats 9B, und als polarste Fraktion werden 650 mg des Diols 6B zurückgewonnen.

9A: Fp: 132°C (Diisopropylether): [ ] ²² = +43° (CHCI3; ^c = 0,510)

9B: !H-NMR (CDCI3): 5,42 ppm (lH.m,H-4); 5,09 ppm (lH,ddd breit J=6Hz und J=4Hz und J=4Hz,H-lα); 3,63 ppm (lH.dd breit J=8Hz und J=8Hz,H-17α); 2.04 ppm (3H.S.H- Acetat); 0,77 ppm (3H.S.H-1S).

Beispiel 10

Herstellung von Estr-4-en-l ,17ß-diol (10B

A. Estr-4-en-l,17-dion HO AI

Bei 0°C werden 600 mg Chrom(VI)oxid protionsweise in 3 ml Pyridin gelöst. Nach einer halben Stunde werden 170 mg der in Beispiel 6B hergestellten Verbindung, gelöst in 3 ml Dichlormethan, zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird sechs Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann in 2 molare wäßrige Natriumhydroxidlösung gegossen. Die wäßrige Phase wird dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 2 molarer wäßriger Natriumhydroxidlösung und mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingedampft. Durch Chromatographie mit Hexan/Ethylacetat an Kieselgel werden 120 mg des Diketons 10 A als weißer Schaum erhalten.

10A: *H-NMR (CDCI3): 5,52 ppm (lH,m,H-4); 0,90 ppm (3H,s,H-18).

B, Estr-4-en-lα,17ß-diol flOB)

100 mg der unter 10A hergestellten Verbindung werden in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und vorsichtig bei 0°C mit 1,1 ml einer 1 molaren Lösung von L-SelectrideW versetzt. Nach Zugabe eines Tropfens Eisessig wird das Reaktionsgemisch in Wasser gegossen und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingedampft. Chromatographie des Rückstandes mit Hexan/Ethylacetat an Kieselgel ergibt 49 mg der Titelvεrbindung 10B als weißen Schaum.

10B: Fp.: 182-1S4°C (Diisopropylether); [a] ^~ = +89°(CHC1 : c=0,510).

Beispiel 11

Herstellung von (E)-lα,17ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en-3-on-oxim (11D^ und (Z)-lα,17ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en-3-on-oxim {πΕ)

A lα-Hydroxyestr-4-en-3,17-dion (11 )

Zwei 2 Liter-Erlenmeyerkolben, die je 1000 ml einer 30 Minuten bei 120°C im

Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3,0 % Glucose, 1,0 % Com steep liquor, 0,2 % NaNO ₃ , 0,1 % KH ₂ PO ₄ , 0.2 % K ₂ HPO ₄ , 0,05 % MgSO ₄ 7 H ₂ O, 0,002 % FeSO ₄ . 7

H2O und 0,05 % KC1 enthalten, werden mit einer Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Nigrospora sphaerica (ATCC 13289) beimpft und 2,5 Tage bei 30°C auf einem Rotationschüttler geschüttelt. Mit 1500 ml dieser Anzucht wird ein 30 Liter-Fermenter, der mit 23,5 1 sterilen Mediums oben genannter Zusammensetzung beschickt ist, beimpft. Nach einer Anwachsphase von 12 Stunden bei 0,7 bar Überdruck unter Belüftung (25 1/min) und Rühren (220 Upm) wird eine sterilfiltrierte Lösung von 25 g Estr-4-en-3,17- dion in 250 ml N,N- Dimethylformamid hinzugegeben und weiter gerührt und belüftet. Schaumbildung wird durch Zugabe von Silicon SH kontrolliert. Nach 5 Stunden Kontaktzeit wird die Kulturbrühe einmal mit 12,5 1 und zweimal mit 8 1 Methylisobutylketon extrahiert, die Extrakte werden vereinigt und am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und das Siliconöl durch Filtration abgetrennt. Der verbleibende Rückstand (23,5 g) wird aus Methylisobutylketon kristallisiert. Man erhält 7,6 g 11A. Durch Chromatographie der Mutterlauge werden weitere 4,7 g 11A erhalten.

11 A: Fp.: 228-230°C.

R. lα,17ß-Dihydroxyestr-4-en-3-on (11B)

Ein 2 Liter-Erlenmeyerkolben, der 1200 ml einer 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3 % Glucose, 1,0 % Com steep liquor, 0,2 % NaN03, 0,1 %

KH ₂ PO ₄ , 0,2 % K ₂ HPO ₄ , 0,05 % MgSO ₄ 7H ₂ O, 0,002 % FeSO ₄ 7H ₂ O und 0,05 % KCl

' enthält, wird mit einer Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Cladosporium resinae (ATCC 11274) beimpft und 2,5 Tage bei 30°C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Mit dieser Vorkultur wird ein 28 Liter-Fermenter beimpft, der mit 18,8 1 sterilen Mediums oben genannter Zusammensetzung beschickt ist. Nach einer Anwachsphase von 12 Stunden bei 0,7 bar Überdruck unter Belüftung (20 1/min) und Rühren (220 Upm) wird eine sterilfiltrierte Lösung von 4 g der unter 11A hergestellten Verbindung in 100 ml N,N- Dimethylformamid hinzugegeben und weiter gerührt und belüftet. Schaumbildung wird durch Zugabe von Silicon SH kontrolliert. Nach 40 Stunden Kontaktzeit wird die Kulturbrühe einmal mit 10 1 und zweimal mit 6,5 1 Methylisobutylketon extrahiert, die Extrakte werden vereinigt und am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und das Siliconöl durch Filtration abgetrennt. Der verbleibende Rückstand (4,71 g schwarzes Öl) wird an feinem Kieselgel mit einem Gradienten aus Hexan und Aceton chromatographiert. Man erhält 1,7 g 11B.

HB: Fp.: 206-208°C

C_lα,l 7ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en-3-on (11C)

350 mg der unter 11B hergestellten Verbindung werden in 7 ml Methylisobutylketon gelöst und 1,4 ml Essigsäureanhydrid sowie 140 mg 4-(Dimethylamino)pyridin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird unter Stickstoff 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend mit 20 ml Methylisobutylketon verdünnt, zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und zweimal mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Diisopropylether umkristallisiert. Man erhält 230 mg 11C.

11C: Fp.: 202-204°C

(E)-lα,17ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en-3-on-oxim (HD) und (Z)-lα,17ß-Bis(acetyloxy)estr-4-en-3-on-oxim (HE)

Wie unter Beispiel 1 beschrieben werden aus 1,85 g der Verbindung 11C mit 1,85 Hydroxylammoniumchlorid in 93 ml Ethanol 230 mg der Verbindung HD und 90 mg der Verbindung HE erhalten.

HD: Fp.: 250-252°C (Diisopropylether) 11E: Fp.: 219-221°C (Diisppropylether)

Beispiel 12

Herstellung von 3,3-[2,2-Dimethyl-l,3-propandiylbis(oxy)]estr-5(10)-en-l ,17ß-diol- dipentanoat (12)

500 mg der unter 8B hergestellten Verbindung werden in 10 ml Methylisobutylketon gelöst, mit 2,5 ml Pentansäureanhydrid und 50 mg 4-(Dimethylamino)pyridin versetzt und zwei Stunden bei 40°C unter Stickstoff gerührt. Die Reaktionslösung wird in 50 ml 8%ige wäßrige Schwefelsäurelösung eingetropft. Das ölig ausgefallene Produkt wird mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und anschließend mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Man erhält 680 mg der Verbindung 12 als helles Öl.

[ ] ²² = +36° (CHC1 ₃ ; c=0.500)

Beispiel 13

Herstellung von 3,3-[2,2-Dιmethyl-l,3-propandiylbis(oxy)]-lα-hydroxyestr-5 (10)-en- 17-on-pentanoat (13)

Wie unter Beispiel 12 beschrieben werden aus 500 mg der Verbindung 8C mit 2,5 mi Pentansäureanhydrid und 50 mg 4-(Dimethylamino)pyridin in 10 ml Methylisobutvlketon 620 mg der Verbindung 13 als farbloses Öl erhalten.

*t>

11

[a.]ß~ = +103° (CHC1 ₃ ; c=0,500)