La présente invention a pour objet un oligoside dérivé d'un polyosid 5 antigénique issu d'un agent pathogène, son procédé de préparation et son usage notamment à titre d'agent vaccinal.

Les bactéries ainsi que des champignons tels que des levures incorporent des polyosides dans leur structure de surface. Ainsi la grande

10 majorité des bactéries sont recouvertes d'un exsudât de nature polyosidique qui est fixé à la bactérie de manière plus ou moins forte mais qui n'est pas proprement parler une enveloppe. Cet exsudât porte le nom de capsule ou de glycocalyx. D'autre part la membrane externe des bactéries gram-négatives es entre autre constituée de lipopolysaccharide (LPS). Enfin, des polysaccharide

15 se retrouvent aussi dans la paroi des champignons. Ces polyosides sont en fait des antigènes de surface qui induisent une réponse immunologique chez un mammifère infecté.

De tels polyosides sont constitués sur la base d'unités répétitives, dan 20 lesquelles les constituants et les liaisons sont définis et qui sont chacune caractéristiques de l'espèce fongique ou bactérienne considérée. Ces unités répétitives contiennent les épitopes, les structures déterminantes de l'antigénicité. A titre d'illustration, on a reporté dans la Figure 1, différents types d'unités répétitives provenant de polyosides capsulaires ou de 25 lipopolysaccharides. Les unités répétitives contiennent souvent des fonctions très labiles telles que par exemple des fonctions phosphates, présentes dans squelette de la molécule ou en position ramifiée ainsi que, par exemple des groupes O-acétyles et pyruvates.

* 30 Un polyoside est en fait constitué d'un ensemble de molécules polymère v contenant des unités osidiques en nombre pouvant varier d'une molécule à un

* autre. Par conséquent, un polyoside ne peut être décrit en terme de poids moléculaire que par un poids moléculaire moyen. Dans le cas d'un homopolyoside, les unités osidiques sont des monosaccharides. Dans le cas d'u

35 hétéropolyoside les unités osidiques forment un enchaînement de constituants liés entre eux de manière définie.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

En ce qui concerne le poids moléculaire moyen d'un polyoside, il peut ëtve apprécié par filtration sur gel. Le poids moléculaire est alors exprimé en terme de constante d'élution (Ko) ou d'équivalent dextran (EqD) selon la méthode décrite par Granath et al, J. Chro . (1967) 28 : 69 que l'on résume comme suit :

Un polyoside en solution est analysé sur une colonne de gel de chromatographie d'exclusion-diffusion qui sépare des éléments en fonction de leur poids moléculaire. Ce type de gel est disponible dans le commerce, par exemple sous les noms commerciaux de Séphadex (Pharmacia), Bio-Gel (Bio-Rad

Fractogel (Toyo-Soda), Sépharose (Pharmacia), et Séphacryl (Pharmacia). La zone de fractionnement du gel doit être bien évidemment adaptée à la gamme des poids moléculaires représentés au sein de la population moléculaire à analyser. A titre d'exemple, on indique que les colonnes de gel de filtration Sépharose 2BCL, 4BCL et 6BCL ont une zone respective de fractionnement déterminée en équivalent dextran de 20.000.000 à 100.000 ; 5.000.000 à 20.000 e 1.000.000 à 10.000. De manière générale, on utilise comme éluant une solution saline, par exemple du chlorure de sodium 0,2 M. Une constante d'élution se calcule selon la formule suivante : Ve - Vo

Vt - Vo dans laquelle

Ve est le volume d'élution de la préparation considérée ; Vt est le volume total de la colonne ; et Vo est le volume mort de la colonne.

A titre d'exemple les Figures 2a et 2b présentent les profils d'élution respectifs des polyosides de Salmonella typhi et de Streptococcus pneumoniae type 1 sur une colonne de Sépharose 4BCL. Le polyoside de S. typhi est donc composé de polymères dont les poids moléculaires les plus élevés ne sont pas appréciables sur Sépharose 4BCL. De même, le polyoside de S. pneumoniae type 1 est essentiellement composé de polymères dont les poids moléculaires varient d'un Ko nul à 0,45. Par définition, la constante d'élution moyenne du polyoside s'apprécie au point d'intersection des tangentes des pentes du profil d'élution . soit de manière approximative, au sommet du profil d'élution. Ainsi, la constante d'élution moyenne des polyosides présentés aux Figures 2a et 2b est respectivement zéro et 0,04.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Sur la base d'une gamme-étalon établie en utilisant du dextran, on peu convertir une constante d'élution en poids moléculaire exprimé en EqD. A titr d'exemple, la Figure 3 présente un modèle de gamme-étalon.

En raison de leur pouvoir antigénique, les polyosides, antigènes de surface d'agents pathogènes e.g. bactériens ou fongiques sont de bons candidats à titre d'agent vaccinal. Des vaccins comprenant un extrait polyosidique se sont en effet révélés efficaces chez les adultes. Toutefois tel n'est pas le cas chez les jeunes enfants. Afin de surmonter ce désagrément majeur, on a proposé avec succès de lier les polyosides de manière covalente à des protéines, ce qui confère aux molécules ainsi obtenues un caractère T- dépendant et augmente leur immunogénicité.

Parmi les vaccins à base de polyosides on compte à ce jour des vaccin contre les infections à Neissei'ia meningitidis groupe A, C, Y ou 135 à Streptococcus pneumoniae, à Eaemophilus influenzae type B et à Salmonella typhi.

Bien que les polyosides antigèniques d'agents pathogènes soient potentiellement intéressants à titre d'i munogènes, leur emploi se révèle délicat en raison de l'importance de leur poids moléculaire moyen qui peut atteindre plusieurs millions d 'équivale nt-dextran. En particulier, lorsque l'on souhaite utiliser un polyoside sous forme de conjugué, c'est-à-dire couplé à une protéine, on se heurte à des problèmes techniques difficiles à résoudre.

Au cours du processus de couplage, un gel ou un floculat peut se former, rendant ainsi le conjugué difficile à stériliser par filtration.

Afin de surmonter cet écueil, on a déjà proposé de réduire la taille de polyosides pour les rendre plus aisément manipulables. A cette fin, on a préconisé diverses méthodes de clivage. Ainsi il existe par exemple des méthodes bien établies telles que une fragmentation aux ultra-sons ou par hydrolyse en milieu acide, basique ou enzymatique. Toutefois, ces méthodes d fragmentation sont loin d'être satisfaisantes. En effet, elles conduisent trop souvent à la destruction totale ou partielle des épitopes caractéristiques par

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perte de fonctions chimiques essentielles pour la spécificité antigénique.

Ainsi, l'hydrolyse acide ou basique du polyoside capsulaire de S. typhi ou de N. meningitidis groupe A élimine les groupements acétyles qui sont nécessaires à la spécificité antigénique du polyoside. De plus la réacétylation correcte des fragments obtenus par hydrolyse est très difficile sinon impossible.

D'autre part, avec la méthode de fragmentation par hydrolyse, il n'est pas toujours possible d'obtenir des fragments de taille relativement homogène, alors que la pratique pharmaceutique requiert des produits homogènes, de qualité constante et standardisée.

En ce qui concerne la fragmentation aux ultra-sons, on a par exemple montré que les groupements phosphates terminaux du polyoside d'JT. influenzae type B sont perdus par traitement aux ultra-sons. Ceci peut laisser craindre que des groupements phosphates en position ramifiée sur les chaînes polyosidiques soient de même éliminés au cours d'un tel traitement.

E plus, bien que des fragments de taille relativement homogène puissent être obtenus aux ultra-sons, l'obtention de fragments de teille suffisamment faible par la méthode aux ultra-sons nécessite un temps de traitement très long, ce qui peut provoquer entre autres inconvénients, une détérioration rapide de l'appareillage. Son efficacité étant limitée, l'application des ultra-sons à l'échelle industrielle est à exclure.

Finalement, l'utilisation de la dépolymérisation enzymatique des polyosides se limite aux polyosides pour lesquels des enzymes appropriées sont connues. Cet inconvénient majeur est toutefois inhérent au caractère hautement spécifique des enzymes vis à vis de leur substrat.

Pour le domaine vaccinal un progrès technique et économique important serait donc de pouvoir disposer d'un procédé de dépolymérisation qui ne présente plus les divers inconvénients des procédés de l'état de la technique. En d'autres termes, il faudrait notamment pouvoir disposer d'un

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procédé de dépolymérisation de polyosides antigéniques qui présente un ensemble de propriétés avantageuses parce que :

Il permet d'obtenir des oligosides ayant un nombre d'unité osidiques réduit tout en conservant les déterminants structure essentiels d'au moins un épitope du polyoside à fragmenter.

Il est possible de l'utiliser pour n'importe quelle structure polyosidique antigénique envisagée.

Il permet d'obtenir des fragments de taille suffisament homogène, et

Il est d'un faible coût et d'une très grande simplicité de mise en oeuvre.

De manière surprenante, on a maintenant trouvé que ces objectifs so atteints par une réaction de dépolymérisation par oxydo-réduction.

Jusqu'à présent, une telle méthode, souvent désignée en langue anglaise sous le sigle ORD, a été mise en oeuvre pour fragmenter des polyosides tels que l'héparine, l'acide hyaluronique, le dextran et l'ADN et ce à des fins totalement différentes de celles poursuivies par la présente demande. Il s'agissait par exemple de réduire la viscosité des produits ou, dans le cas d'une molécule linéaire telle que l'héparine d'obtenir des fragments de taille réduite dont il était connu qu'ils ont une activité anticoagulante différente. Bien entendu, comme les produits auxquels cette méthode était appliquée ne présentaient pas d'intérêt immunogenique, l'étude de l'intégrité des unités répétitives des fragments obtenus n'était pas abordée.

D'autre part, il existe de nombreuses publications antérieures telles que par exemple, K. Uchida, Carbohydrate Research, (1988) 173 : 89-99 ; H. Uchiyama, Journal of Biological Chemistry, (1990) 265 : 7753-7759 ; S.W. Green The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry IB ; Académie Press

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(1980) : 1132 ; A. Herp, The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry IB ; Académie Press (1980) : 1276 ; Kochetkov et al, Radiation Chemistry of Carbohydrates, Pergammon Press, Oxford, (1979) qui décrivent la réaction OR comme destructrice soit des groupes phosphates, soit des cycles carbohydrat par clivage des liaisons carbone-carbone du cycle.

L'impression d'ensemble qui s'est dégagée de l'état antérieur de la technique a fait que la réaction ORD est généralement reconnue comme destructive.

Rien ne laissait donc penser que l'ORD serait meilleure que par exempl la méthode par hydrolyse ou par traitement aux ultra-sons en vue des buts recherchés i.e., la conservation des épitopes.

C'est pourquoi, avant la présente invention il n'avait jamais été démontré qu'il était possible d'obtenir des oligosides, dont la structure de l'unité répétitive caractéristique est conservée, par fragmentation oxydo- réductive des polyosides respectifs, afin de pouvoir les utiliser à titre d'agen actif dans des formulations permettant de renforcer les défenses immunitaires d'un individu.

On a maintenant découvert qu'il est possible de mettre en oeuvre la méthode ORD pour obtenir des oligosides ayant conservé au moins un déterminant antigénique du polyoside de départ.

Par ailleurs, on a aussi constaté que la méthode de dépolymérisation par oxydo-réduction appliquée à un polyoside antigénique permettait d'obtenir dans de bonnes conditions des fragments tout à fait satisfaisants du point de vue de l'homogénéité de la taille, malgré le fait qu'il est connu que la réaction ORD est une réaction radicalaire clivant le polyoside de manière aléatoire.

En conséquence, l'invention propose un oligoside ayant conservé au moins un déterminant antigénique d'un polyoside antigénique issu d'un agent pathogène, caractérisé en ce qu'il est préparé par un procédé comprenant les étapes consistant à (i) soumettre ledit polyoside à une réaction de dépolymé-

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risation par oxydo-réduction, (ii) récolter l'oligoside ainsi obtenu et, si désir (iii) le coupler à un partenaire de conjugaison ou à un porteur pour obtenir ledit oligoside sous la forme d'un conjugué ou lié à un porteur.

5 Par "oligoside", on entend un ensemble de molécules ; chaque molécule ayant un nombre réduit d'unités osidiques, par rapport au polyoside de départ, et contenant par exemple de 4 à 500 unités osidiques.

Le poids moléculaire moyen d'un oligoside est défini selon les règles 0 explicitées ci-avant pour un polyoside. Généralement, un oligoside selon l'invention peut avoir une constante d'élution moyenne sur une colonne Sépharose 4BCL de 0,3 à 0,9, en particulier de 0,4 à 0,8, par exemple de 0,6 0,7. Autrement exprimé, un tel oligoside a un poids moléculaire moyen de 200.000 à 2.000 EqD, notamment de 150.000 à 10.000 EqD, en particulier de 5 60.000 à 30.000 EqD.

Selon un aspect préféré de la présente invention, le polyoside antigénique est un antigène de surface issu d'un agent pathogène qui peut être un champignon ainsi qu'une bactérie Gram- négative ou Gram-positive, 0 notamment du genre Staphylococcus, Streptococcus, Elebsiella, Salmonella,

Escherichia, Neisseria, Shigella ou Haemophilus.

L'agent pathogène bactérien est par exemple Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi ou Haemophilus influenzae. 5

L'agent pathogène fongique peut être une levure, plus particulièrement sélectionnée parmi les genres Candida, Cryptococcus, Hansenula, Lipomyces, Rhinocladiella et Rhodotorula.

;- Aux fins de la présente invention, une réaction d 'oxydo-réduction est mise en oeuvre en présence d'au moins un système oxy do-réducteur qui peut être notamment sélectionné parmi des thiols e.g., glutathion, cystéine ; l'oxygène ; l'hydroquinone ; des ions de métaux à plusieurs valences, e.g., fe et cuivre ; l'acide ascorbique, le peroxyde d'hydrogène ; ces deux derniers 5 étant préférés.

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Les différents paramètres expérimentaux qui peuvent influencer la cinétique de la réaction (concentration des produits, pH, température, temps de réaction.) peuvent être facilement déterminés par l'homme du métier en fonction des caractéristiques du polyoside de départ, du système d'oxydo- réduction sélectionné, et de la taille moyenne des fragments qu'il souhaite obtenir. Lorsque ces fragments sont destinés notamment à des fins vaccinale l'homme du métier prendra en particulier soin d'ajuster les différents paramètres de manière à obtenir des fragments d'une taille moyenne convenable, c'est-à-dire conservant un bon. pouvoir antigénique et éventuellement adaptés à la mise en oeuvre de conjugués ; par exemple, d'un ordre de grandeur tel que précédemment indiqué. D'une manière générale, les conditions réactionnelles optimales peuvent être déterminées lors de tests de routine. A titre d'indication, on précise toutefois dans les exemples ci-après des valeurs expérimentales permettant d'obtenir de bons résultats.

Un polyoside destiné à être soumis à un procédé selon l'invention peut être extrait et purifié selon des méthodes connues, en particulier par précipitation à l'alcool ou au bromure de cétyltriméthylam onium ou par filtration sur gel. Pour une revue de ces méthodes, on se réfère en particulie à R.I. Whistler, in Methods in Carbohydrate Chemistry, (1965) I : 3-62.

Le polyoside est avantageusement préparé en solution aqueuse à une concentration de 5 mg/ml. On indique qu'une concentration avantageuse peut varier de 0,5 à 50 mg/ml, en particulier de 0,5 à 10 mg/ml. Une telle solution aqueuse est utilisable comme produit de départ.

Un système oxydo-réducteur tel que défini ci-dessus est ajouté à la préparation polyosidique en une seule fois ou de façon continue ou discontinue dans un rapport pondéral final système oxydo-réducteur : polyoside pouvant varier notamment de 0,01 à 10, en particulier de 0,1 à 5, par exemple de 0,1 à 1.

Un procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre à un pH de 3 à 8,5, en particulier de 3 à 6,5. De même, la température du milieu réactionnel n'est pas critique ; elle peut notamment varier de 4 à 60 ^* C, en particulier de

18 à 40'C.

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Le temps nécessaire pour parvenir à une fragmentation souhaitée du polyoside est généralement de 30 min à 1 h sauf cas particulier ; par exempl pour le polyoside Vi de S. typhi, le temps de réaction est sensiblement plus long. Le temps de réaction peut être adapté en fonction de la taille des fragments que l'on souhaite obtenir.

Selon un mode de réalisation particulier, à une préparation aqueuse d'u polyoside ayant une concentration de 0,5 à 50 mg/ml, en particulier de 0,5 à 10 mg/ml, on ajoute de l'acide ascorbique jusqu'à une concentration finale de

0,01 à 25 mg/ml, en particulier de 0,1 à 10 mg/ml. L'oxygène naturellement dissous dans le milieu réactionnel est généralement suffisant ; si tel n'était pas le cas, on pourrait en injecter dans le milieu. Afin d'accélérer la réaction on opère de préférence, en présence d'un sel soluble d'un métal à plusieurs degrés d'oxydation, tel que le fer ou le cuivre. Le ou les sel(s) métallique(s) peut(vent) être ajouté(s) à une concentration de 1 μM à 100 mM, en particuli de 1 à 10 mM.

Selon un mode de réalisation alternatif à celui énoncé ci-dessus, on remplace l'acide ascorbique par du peroxyde d'hydrogène qui peut être ajout jusqu'à une concentration de 0,1 à 100 mM, en particulier de 0,5 à 10 mM, éventuellement en présence d'un sel métallique.

Un oligoside préparé en soumettant un polyoside à une réaction de dépolymérisation par ORD est constitué d'un ensemble de molécules dont la constante d'élution moyenne est inférieure à celle du polyoside dont il dérive par fragmentation (la comparaison étant bien évidemment mise en oeuvre en utilisant une même colonne de chromatographie). L'oligoside peut être isolé selon une technique conventionnelle, par exemple par précipitation à l'aide d'un agent précipitant approprié e.g., acétone ou alcool, par filtration sur membrane ayant un seuil de séparation approprié, par chromatographie d'exclusion-diffusion ou d'échange d'ions. Par la suite, on peut aussi choisir de n'utiliser que certaines fractions de l'oligoside contenant des molécules ayant une constante d'élution égale à, ou aux alentours de la constante d'élution moyenne.

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De manière optionnelle, l'oligoside selon l'invention peut être couplé pa liaison covalente à un composé de nature peptidique, protéique ou à un autr polymère organique comme par exemple le polyacrylate pour former un conjugué capable de favoriser l'immunogénicité de l'oligoside notamment chez un mammifère. Le partenaire de conjugaison peut être notamment une protéin bactérienne, par exemple une toxine, l'anatoxine correspondante ou une sous- unité d'une toxine multimérique ainsi qu'une protéine de membrane, une sous unité d'une protéine de membrane multimérique ou une protéine cytoplasmiqu A titre d'exemple, on cite la toxine Pertussis, la toxine cholérique, la toxine tétanique et la toxine diphtérique. Ces protéines peuvent être extraites à partir des bactéries d'origine ou bien être obtenues par voie recombinante.

Une réaction de couplage, par liaison covalente, d'un oligoside avec un partenaire de conjugaison de façon à obtenir un conjugué utilisable en tant que vaccin peut être mise en oeuvre de manière conventionnelle. On peut par exemple faire apparaître sur l'oligoside une fonction capable de réagir avec u groupement fonctionnel du partenaire de conjugaison. On peut également faire réagir un agent de couplage bi-fonctionnel avec l'oligoside puis avec un partenaire de conjugaison, ou inversement. Pour une revue de ces diverses méthodes de couplage, o se réfère en particulier à W.E. Dick et M. Beur et, in Conjuguâtes Vaccines, J.M. Cruse, R.E. Lewis Jr Eds, Contrib. Microbiol. I munol. Basel, Karger, (1989) 10 : 48. Par ailleurs, le procédé de fragmentation par oxydo-réduction introduit des groupements réducteurs, notamment dans les oligosides dérivés des polyosides de S. pneumoniae type 6B et 19F _. S. influenzae et N. meningitidis groupe A. Ceci permet donc d'utiliser la technique de conjugaison par amination réductrice.

L'immunogénicité d'un oligoside selon l'invention peut également être favorisée en utilisant des liposomes porteurs auxquels les oligosides sont liés de manière covalente. Favorisent également l'immunogénicité, des vecteurs, qui retiennent l'oligoside par incorporation à l'aide de forces ioniques ou hydrophobes, tels que par exemple les cyclodextrines, les liposomes et les isco s.

L'invention concerne donc un oligoside tel que défini précédemment présenté

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sous diverses formes, en particulier sous la forme d'un conjugué, ou couplé un liposome porteur, ou incorporé dans un vecteur. Selon un aspect préféré de la présente invention, l'oligoside est sous forme de conjugué.

Un oligoside selon l'invention est notamment utile pour renforcer les défenses immunitaires d'un individu, chez les mammifères et notamment chez les humains, par exemple pour prévenir ou atténuer les effets d'une infectio induite par un agent pathogène e.g., une infection bactérienne ou une mycos Sont également utiles, les mélanges d'oligosides selon l'invention dérivés de différents polyosides antigeniques, ainsi que les mélanges d'un oligoside selo l'invention avec des agents actifs autres qu'un oligoside selon l'invention. De tels mélanges se prêtent à la préparation de vaccins polyvalents.

En conséquence, l'invention propose également :

Une composition pharmaceutique qui comprend à titre d'agent actif au moins un oligoside selon l'invention ; la composition est notamment un vaccin ;

- L'usage thérapeutique d'un oligoside selon l'invention ;

- Une méthode pour renforcer les défenses immunitaires d'un individu e.g., de vaccination, qui comprend l'acte d'administrer, en quantité suffisante d'un point de vue thérapeutique, au moins un oligoside selon l'invention, à un sujet ayant besoin d'un tel traitement e.g., d'une telle vaccination ;

L'utilisation d'un oligoside selon l'invention comme ingrédient actif dans la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à renforcer les défenses immunitaires d'un individu ;

Un procédé de préparation d'une composition phar aceu tique telle que définie précédemment, caractérisé par le fait que (i) on soumet le polysi de départ à une réaction de dépolymérisation par oxydo-réduction, que (ϋ), si désiré, soit, on couple l'oligoside obtenu avec un partenaire de

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conjugaison ou un liposome, soit, on l'incorpore dans des liposomes, des iscomβ ou des cyclo-dextrines et que (ϋi) l'on met le produit obtenu sou une forme pharmaceutique appropriée.

Une composition pharmaceutique préférée comprend au moins un oligoside sous forme de conjugué.

La composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier on associe un oligoside selon l'invention avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique, par exemple une solution saline physiologique apyrogene. En outre, une composition selon l'invention peut contenir des ingrédients usuels tel qu'un tampon, un agent conservateur ou stabilisant, un adjuvant et le cas échéant, un excipient de lyophilisation. Un oligoside selon l'invention peut êtr conservé en présence d'un diluant, d'un support ou d'un ingrédient tel que précédemment évoqué. De manière alternative, un diluant, un support ou un ingrédient peut être ajouté juste avant emploi.

C'est pourquoi l'invention propose de manière alternative un kit contenant :

a) une composition pharmaceutique essentiellement constituée d'au moins un oligoside selon l'invention, à titre d'agent actif ;

b) une composition comprenant au moins un élément sélectionné parmi un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique, un composé ayant un pouvoir tampon, un agent conservateur ou stabilisant et un adjuvant ;

c) des instructions pour l'administration concomitante e.g., sous form de mélange des compositions décrites sous a) et b).

Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle, en particulier par voie sous-cutanée, par voie

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intra-musculaire, par voie intra-veineuse, par exemple sous forme de suspension injectable ou par voie orale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, p exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration. On indique toutef que de bons résultats peuvent être obtenus avec une dose unitaire de 1 à μg d'oligoside sous un volume d'environ 0,5 ml .

L'invention est présentée plus en détail dans les exemples suivants e par référence aux Figures 1 à 4.

La Figure 1 présente les formules des unités répétitives du polyoside capsulaire de S. pneumoniae type 14 (a), type 1 (b), de S. typhi (c), de S. pneumoniae type 6B (d), d'fi. influenzae type B (e), de S. pneumoniae type (f), de N. meningitidis groupe A (g), de S. pneumoniae type 18C (h), type 2 (i) Klebsiella ozaenae sérotype K4 (j), Shigella flexneri sérotype lb (k) et

Cryptococcus neoformanβ souche 98 (1) . On remarque que (a) correspond à polyoside neutre, que (b) et (c) correspondent à des polyosides possédant acides uroniques dans la chaîne polyosidique, que (d) à (i) correspondent à des polyosides phosphorylés, que (j) et (k) correspondent à des lipopolysaccharides, respectivement anionique et neutre et que (1) correspo à un polyoside fungique anionique.

Les Figures 2a et 2b représentent les profils d'élution des polyosides non-frag entés de S. typhi (2a) et de S. pneumoniae type 1 (2b) sur une colonne de Sépharose 4BCL. Les conditions de chromatographie sont comme suit : on applique sur la colonne de Sépharose préalablement équilibrée ave du NaCl 0,2 M, 2 ml d'une solution de polyoside à 5 mg/ml. L'élution est mis en oeuvre avec du NaCl 0,2 M à une vitesse de 42 ml/h. Le profil d'élution automatiquement analysé en mesurant la densité optique à 206 nm. En 2a et 2b, le volume mort de la colonne est de 76,56 ml tandis que le volume total de 201,84 ml.

La Figure 3 représente une gamme-étalon de dextran de 500.000 à 20.

Les Figures 4a et 4b représentent les profils d'élution des

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oligosides obtenus par fragmentation oxydo-réductivβ des polyosides de S. typhi (4a) et de S. pneumoniae type 1 (4b) sur une colonne de Sépharose 4BCL. Les conditions de chromatographie sont telles que précédemment énoncées dans la description de la Figure 2.

Exemple 1 : Fragmentation du polyoside Vi de S. typhi en présence d'acide ascorbique.

Une poudre sèche du polyoside Vi obtenue selon la méthode de Gotschlich et al, Prog. Immunobiol. Standard. (1972) 5_ : 485 est reprise dans de l'eau apyrogene à raison de 1 mg/ml. Le poids moléculaire (PM) moyen du polyoside correspond à un KD nul sur une colonne de Sépharose 4BCL .

A 500 ml de cette préparation pré-chauffée à 37 ^* C, on ajoute lentement en continu pendant 2 h, 12,5 ml d'une solution aqueuse contenant 100 mM d'acide ascorbique, 10 mM de CuSOi et 10 mM de FeSOt ; soit une concentration finale d'acide ascorbique de 0,44 mg/ml. Le pH du milieu réactionnel ainsi obtenu est d'environ pH 4. La réaction est poursuivie sous agitation douce environ 3 h (temps d'addition du réactif compris) à 37 ^* C.

Le mélange réactionnel est ensuite filtré sur une membrane d'ultrafiltration 3K (seuil de coupure : 3 kilodaltons). Le rétentat est lavé une première fois avec une solution de NaCl 0,5 M, puis une seconde fois avec de l'eau. Le rétentat est repris dans environ 100 ml d'eau, puis lyophilisé pour conservation.

Le taux de clivage est de l'ordre de 95 % tel que calculé par intégration des courbes obtenues par filtration sur gel de Sépharose 4BCL (Figure 4.a). Par ailleurs, on estime le PM moyen de l'oligoside ainsi obtenu par la méthode de Granath & al (supra). Celui-ci, exprimé en constante d'élution moyenne est de l'ordre de 0,6, soit un PM de 60 000 EqD (en prenant pour référence le dextran).

L'analyse de l'oligoside en spectrométrie RMN (résonance magnétique nucléaire) indique clairement que la structure de l'unité répétitive

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caractéristique du polyoside a été conservée après fragmentation. En particulier, il n'y a pas eu de perte de groupements fonctionnels ramifiés ou de sucres du squelette polyosidique.

Les fonctions chimiques caractéristiques de l'unité répétitive du polyoside Vi sont analysées par dosage colorimétrique. Le groupement 0- acétyle en position ramifiée est dosé par la méthode de Hestrin, Biol. Chem. (1949) 188 : 249 tandis que le polyacide de la structure linéaire est dosé par la méthode de Stone et al, Clin. J. Microbiol. (1988) 28 : 719. Les dosages son effectués en parallèle sur du polyoside Vi non-fragmenté et sur l'oligoside formé.

Les rapports [O-acétyle] / [polyacide] mesurés pour le polyoside et l'oligoside sont identiques. Ceci montre bien que la méthode de fragmentation du polyoside a permis de conserver la totalité des groupements O-acétyle labiles.

Exemple 2 : Fragmentation du polyoside Vi de S. typhi en présence de peroxyde d'hydrogène (HA).

Une poudre sèche du polyoside Vi obtenu selon la méthode de Gotschlich et al, (supra) est reprise en tampon phosphate 0,2 M pH 7,5 à raison de 0,4 mg/ml. Le PM du polyoside correspond à un Kn nul sur une colonne de Sépharose 4BCL.

A 100 ml de cette préparation pré-chauffée à 37 ^* C, on ajoute lentemen sous agitation douce, 11 ml d'une solution aqueuse contenant 0,3 mg/ml d'H_02 et 1,1 ml d'une solution de CuSO, à 2,6 mg/ml. La réaction est poursuivie sou agitation douce environ 1 h à 37 ^* C.

L'expérience est renouvelée dans les même conditions à l'exception du temps de réaction qui est de 2 heures au lieu d'une.

Dans les deux cas, chaque oligoside ainsi obtenu est ensuite recueilli e purifié tel que décrit dans l'Exemple 1.

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De même, les caractéristiques des oligosides ainsi obtenus sont mises en évidence selon les méthodes citées dans l'Exemple 1. Les résultets sont comme suit :

- Dans les deux cas, le taux de clivage du polyoside Vi est de l'ordre de 100 %.

- Le PM moyen des oligosides formés après une et deux heures correspond respectivement à un KB de l'ordre de 0,7 et 0,8 ; soit 30.000 et 10.000 EqD.

- Dans les deux cas, on ne constate pas de modification dans la structure de l'unité répétitive.

Exemple 3 : Fragmentation du polyoside de N. meningitidis groupe A

Une poudre sèche du polyoside de N. meningitidis groupe A telle que obtenue par la méthode de Gotschlich et al (supra) est reprise en tampon phosphate 0,2 M pH 7,5 soit à raison de 1 mg/ml, soit à raison de 5 mg/ml. Le PM moyen du polyoside correspond à un KB de 0,15 tel que mesuré sur une colonne de Sépharose 4BCL.

Les préparations à 1 et 5 mg/ml sont pré-chauffées à 37 ^* C.

3a) A 100 ml de la préparation à 1 mg/ml, on ajoute 0,75 ml d'une solutio réactionnelle contenant 100 mM d'acide ascorbique, 10 mM de CuSO. et 10 mM de FeSOt. La réaction est poursuivie sous agitation 1 h 30 à 37 "C. Puis on ajoute à nouveau 0,75 ml de la solution réactionnelle ; on obtient ainsi une concentration finale d'acide ascorbique de 0,26 mg/ml. La réaction est poursuivie à nouveau pendant 1 h 30 dans les mêmes conditions.

3b) A 100 ml de la préparation à 5 mg/ml, on ajoute 1,5 ml d'une solution réactionnelle contenant 100 mM d'acide ascorbique,

FEUILLE DE REMPLACEMENT

10 M de CuSOt et 10 mM de FeSOt ; soit une concentration finale d'acide ascorbique de 0,26 mg/ml. La réaction est poursuivie sous agitation 1 h 30 à 37 ^* C.

Les oligosides obtenus en 3a) et 3b) sont recueillis et purifiés tel qu décrit dans l'Exemple 1. De même, les analyses sont mises en oeuvre tel que mentionné dans l'Exemple 1. Dans les deux cas, on observe un teux de clivag de 100 %, sans détérioration de la structure de l'unité répétitive comme analysée par RMN. Le PM moyen de l'oligoside obtenu en 3a) correspond à u KB de 0,7 (soit 30.000 EqD) tendis que le PM moyen de l'oligoside obtenu en

3b) correspond à un K _D de l'ordre de 0,4 (soit 110.000 EqD).

L'ensemble de ces résultats indique qu'en faisant varier les condition expérimentales (concentration en polyoside et en agent réactif oxydo-réducte ainsi que le mode d'addition de l'agent réactif et le temps de réaction) on peut obtenir des oligosides de PM moyen substantiellement différent, tout en consei'vant un taux de clivage de 100%.

Enfin cet exemple ainsi que l'Exemple 2, montrent bien qu'il s'agit d'une fragmentation par oxydo-réduction et non par hydrolyse acide ou basique dans la mesure où cette fragmentation peut être mise en oeuvre à u pH proche de la neutralité.

Exemple 4 : Fragmentation du polyoside de S. pneumoniae des types 1 et 19F et d'iT. influenzae du type B, en milieu tamponné.

L'Exemple 3 (3a et 3b) est répété en utilisant les polyosides de S. pneumoniae types 1 et 19F tels que obtenus selon la méthode décrite dans la demande de brevet française FR 2 495 939 publiée le 18 juin 1982 ainsi que l polyoside d'23. infuenzae type B obtenu selon la méthode de Gotschlich et al (supra) ;

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Les résultets sont comme suit

ND : non déterminé

L'analyse de l'oligoside en spectrométrie RMN (résonance magnétique nucléaire) indique clairement que la structure des unités répétitives caractéristiques des polyosides a été conservée après fragmentation.

Exemple 5 : Fragmentation des polyosides N. meningitidis groupe

A et de S. pneumoniae types 1, 14, 18C, 19F et 23F en milieu non-temponné.

Les préparations de polyosides ainsi que les réactions sont mises en oeuvre comme décrit dans les Exemples 3 et 4 compte tenu des exceptions suivantes : (i) les préparations de polyosides sont préparées à 5 mg/ml en eau apyrogene, (ii) la solution réactionnelle est ajoutée une seule fois à une concentration finale de 2,5 mg/ml et (iii) la réaction est poursuivie seulement pendant 1 heure.

Les oligosides obtenus sont recueillis et purifiés tel que décrit dans l'Exemple 1. Leurs caractéristiques sont évaluées

FEUILLE DE REMPLACEMENT

ainsi que mentionné dans l'Exemple 1. Le teux de clivage de chacun des polyosides est de 100 % sans qu'il y est détérioration de la structure des unités répétitives. Ce dernier point a également été mis en évidence par dosage colorimétrique : Les hexoses sont dosés par la méthode de Scott et a Anal. Chem. (1953) 25 : 1650, les hexosa ines par la méthode de Gatt et al, Anal. Biochem. (1965) 15 : 167, le rhamnose par la méthode de Dische et al, J Biol. Chem. (1948) 175 : 595 et le phosphate par la méthode de Chen et al, Anal. Chem. (1956) 28 ; 1756. En ce qui concerne le polyoside de S. pneumon type 14 et l'oligoside qui en est dérivé par fragmentation, les rapports [hexose]/[hexosamine] sont substantiellement identiques. Il en est de même d l'apporte [rhamnose ]/[hexose] et [ phosphate ]/[hexose] respectivement considérés dans le cas de S. pneumoniae types 18C et 23F.

L'analyse par spectro étrie RMN des oligosides ne met pas en éviden de signaux indiquant une hétérogénéité dans les unités répétitives et montr ainsi que les oligosides sont constitués d'une unité répétitive intacte.

Enfin, en ce qui concerne le PM moyen des oligosides, les résultets sont comme suit :

Souche PM moyen du PM moyen de polyoside l'oligoside

(exprimé en KB) dexprimé en KB)

N. eningitidis A 0,15 0,66 S. pneumoniae 1 0,04 0,72 S.pneumoniae 14 0,01 0,72 S.pneumoniae 18(t 0,03 0,75 S.pneumoniae 19]' 0,04 0,67 S.pneumoniae 231 ' 0,07 0,57

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Exemple 6 : Préparation d'un conjugué oligoside Vi de S. typhi / sous-unité B de la toxine cholérique.

6a) Introduction d'un groupe NHt sur l'oligoside Vi.

Un lyophilisât de l'oligoside Vi tel qu'obtenu dans l'Exemple 1 est repris dans un tampon phosphate pH 8 à raison de 10 mg/ml. A cette préparation, on ajoute du diaminohexane et du NaCNBHj en solutions ; chacun une concentration finale de 12,5 mg/ml. La réaction est poursuivie pendant 6 jours à température ambiante. La préparation est ensuite dialysée contre de l'eau et lyophilisée.

Par dosage selon la méthode de Shnyder et al, Anal. Biochem. (1975) 64

: 284, on contrôle que des groupes NH. ont bien été introduits. De même, par dosage selon Hestrin, on montre que les groupes O-acétyles sont toujours conservés.

6b) Introduction d'une fonction réactive.

Le lyophilisât obtenu en 6a) est repris en solution à raison de 40 mg/ml. A 20 ml de cette préparation, on ajoute 80 ml d'une solution à 40 g/ ml de disuccinimidyl subérate (DSS) en diméthylsulf oxyde (DMSO). La réaction est poursuivie pendant une heure à température ambiante. La préparation est ensuite précipitée dans un mélange de DMSO/dioxane.

6c) Conjugaison.

Le précipitât obtenu en 6b) est repris dans une solution de NaCl 0,5 M à raison de 40 mg/ml. En parallèle, on prépare une solution de sous-unité B de la toxine cholérique (Tayot et al, Eur. J. Biochem. (1981) 113 : 249) en tampon phosphate 0,2 M pH 6,5 à raison de 10 mg/ml.

Les deux solutions ainsi préparées sont mélangées

FEUILLE DE REMPLACEMENT

ensemble. Le rapport pondéral oligoside/protéine est de 1 environ. La réacti est poursuivie à température ambiante pendant 15 heures.

6d) Purification.

Le mélange est ensuite filtré sur une minicassette d'ultrafiltration (Millipore) équipée d'une membrane dont le seuil de séparation est de 5.10* daltons, afin d'éliminer la protéine et l'oligoside non-couplé. Le rétentat est lavé en NaCl 0,3 M puis conservé à raison de 200 μg/ml en NaCl 8/1.000, merthiolate 1/10.000, à 4'C, après filtration stérile.

Exemple 7 : Préparation de conjugués oligoside/anatoxine tétanique.

On conjugue les oligosides tels qu'obtenus à partir des polyosides de S. pneumoniae types 14 et 23F dans l'Exemple 5, ainsi que l'oligoside obtenu partir du polyoside Vi de S.typhi dans l'Exemple 1, en opérant de manière analogue au protocole reporté dans l'Exemple 6 et en remplaçant la sous-unit B de la toxine cholérique par l'anatoxine tétanique préparée selon la méthode de Mueller et Miller, J. Bact. (1954) 67 : 671.

Les conjugués obtenus à partir d Oligosides de S. pneumoniae sont conservés à 250 μg/ml.

Exemple 8 : Mise en évidence du pouvoir immunogène des conjugués.

Des souris OF1 (If fa Credo) sont réparties par lot de 8. Chaque souri d'un lot reçoit 0,5 ml d'une des solutions préparées aux Exemples 6 et 7 ou parallèle, 0,5ml des polyosides natifs correspondants. Les injections s'effectuent par voie sous-cutanée. Ces injections sont répétées 14 jours après. En parallèle, un lot témoin reçoit uniquement de l'eau physiologique.

14 et 28 jours après la première injection, on effectue un prélèvemen sanguin et on titre les anticorps IgG anti-polyoside par dosage Elisa

FEUILLE DE REMPLACEMENT

(les plaques de titrage sont recouvertes de polyoside non-fragmenté). Le teu d'anticorps à 14 et 28 jours montre que les conjugués sont immunogenes. Da chacun des cas, le taux d'anticorps est supérieur à celui induit par le polyoside natif correspondant. De plus on observe un effet rebond caractéristique d'un antigène T-dépendant.

Exemple 9 : Composition pharmaceutique vaccinale comprenant des conjugués à titre d'agents actifs.

Les conjugués oligosides Vi de S.typhi/anatoxine tétanique obtenus selon l'Exemple 7 sont formulés dans une dose vaccinale de 0,5 ml destinée à être injectée chez l'homme par voie sous-cutanée. La composition par dose étant :

- Oligosides Vi de S.typhi conjugués 10 μg

- Tampon phosphate à pH 7 475 μg (en ionsPO )

- NaCl 4250 μg

- Merthîolate 0,05 μg

- Eau p.p.i. qsp 0,5 ml

FEUILLE DE REMPLACEMENT