CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a peptídeos opioides e composições compreendendo estes peptídeos podendo ser aplicada na indústria farmacêutica e alimentícia.

DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA

O estudo de moléculas codificadas diretamente por genes registrou um avanço considerável a partir das últimas três décadas. Com isso, a prospecção de peptídeos com atividade biológica, revelou-se importante tanto do ponto de vista biotecnológico quanto no ponto de partida em diversos ramos da pesquisa que incluem o desenvolvimento de novas drogas (Viieghe et al., 2010) e a produção de plantas geneticamente modificadas (Brand et al., 2012; Montesinos 2007).

De um modo geral, os peptídeos bioativos têm sido apontados como candidatos ao desenvolvimento de novos fármacos, devido a algumas características intrínsecas à sua atividade biológica, como, alta especificidade, potência, baixa toxicidade e diversidades química e biológica (Mason, 2010).

Dentre as estratégias de otimização para atividade dos peptídeos no organismo, estão: i) as modificações estruturais, corno, a adição de novas moléculas, a substituição por resíduos de aminoácidos não naturais e modificações pós - traducionais; e ii) o processo de entrega da droga, como o encapsulamento de peptídeos em nanoestruturas (Antosova et al., 2009; Neumann &Staubitz, 2010; Rajendran et ai., 2010 ).

Os peptídeos podem apresentar diversas atividades biológicas, como as antimicrobianas (Fjell et al., 201 1 ; Zasioff, 2002), opioides (Goldberg, 201 1 ), hipotensoras (Giménez et ai., 201 1 ), antitrombóticas (Menezes et ai., 201 1 ) entre outras. Em 2010, cerca de 80 peptídeos sintéticos com potencial terapêuticos já estavam disponíveis para comercialização farmacêutica podendo ser empregados em múltiplas patologias como: alergias, asma, artrites, doenças cardiovasculares, diabetes, disfunção gastrointestinal, problemas de crescimento, inflamação, obesidade, doenças infecciosas, câncer, osteoporose, dor, vacinas dentre outras (Stevenson, 2009; Vííeghe et ai., 2010).

O desenho de sequenciamento de novos peptídeos vem sendo utilizado para promover diversas atividades biológicas específicas. Dentre elas, podemos citar antimicrobianas, opioides, hipotensoras e antitrombóticas. Peptídeos bioatívos sintéticos com potencial terapêutico são empregados em múltiplas patologias como: alergias, asma, artrites, doenças cardiovasculares, diabetes, disfunção gastrointestinal, problemas de crescimento, inflamação, obesidade, doenças infecciosas, câncer, osteoporose, dor, vacinas, dentre outras. A produção dos peptídeos bioatívos a partir do processamento de proteínas mais longas pode ser por processamento endógeno enzimático ou mesmo por processos exógenos (Gutstein & Huda, 2006).

Com a necessidade de desenvolvimento de novos compostos para tratar a dor e, principalmente, a dor crónica, novos estudos e estratégias para aprimorar o desenvolvimento de fármacos vêm sendo propostos. Entre estes estudos podem-se citar aqueles relacionados a peptídeos .

Peptídeos opioides são peptídeos formados a partir de proteínas precursoras ou pró-hormônios, os quais sofrem modificações pós- traducionais que levam à formação dos peptídeos com atividades biológicas características. Estudos sobre a ativídade opióde tem contribuído para o aumento do número de peptídeos conhecidos pertencentes às famílias dos opiódes, bem como sub sequente conhecimento de suas localizações e de seus papéis na modulação do processo nociceptivo (Millan, 2002). Existem três tipos de classificação a partir da região N-terminal destes peptídeos: i) as terminações do tipo YGG representam encefalinas e dinorfinas, ii) do tipo Yp podem ser as casomorfinas, morficeptinas, hemorfinas, endomorfinas e ainda íii) do tipo Y-D-isômero (Tyr-D-Ala ou Tyr-D-Met) relatadas como deitorfinas.

São encontrados três diferentes tipos de receptores opiácios, que são: os receptores mu (μ) opioides relacionados ao bloqueio de estímulos de natureza térmica; os receptores delta (δ) relacionados ao bloqueio de estímulos mecânicos; e os receptores kappa (κ) que no sistema nervoso central desempenham atividade de antagonismo de receptores mu opioides, favorecendo a nocicepção.

Os documentos US5885958 e US6303578 descrevem peptídeos sintetizados e seus análogos lineares e cíclicos os quais se ligam ao receptor mu opioide. Os referidos documentos descrevem, ainda, preparações farmacêuticas contendo quantidade efetiva desses peptídeos ou sais para prover analgesia, alívio de transtornos gastrointestinais como diarreia e terapia na recuperação de dependentes de drogas. Os peptídeos citados no documento US5885958 possuem a fórmula geral de Tyr-X1 -X2- X3, aonde X1 é Pro, D-Lys ou D-Grn; X2 é Trp, Phe ou IM-aiquil-Phe, sendo que o alquii contém de 1 a 6 átomos de carbono; e X3 é Phe, Phe~NH2, ou p-Y~Phe, aonde Y é N02, F, Cl ou Br.

O documento WO9932510 descreve novos amino peptídeos sintéticos que exibem alta seletividade para receptores opioides kappa e ação periférica, sem significante penetração cerebral. De acordo com o respectivo documento, o uso destes amino peptídeos é indicado para o tratamento de dores abdominais, doenças da bexiga, doença inflamatória intestinal ou doença autoimune e tratamento em outros mamíferos, que não o ser humano.

O documento JP55092352 descreve o desenvolvimento de um composto de peptídeo bio-orgânico que pode se ligar a receptores opioides do cérebro, apresentando baixos efeitos colaterais. O documento US4038222 descreve um peptídeo isolado de glândulas pifuritárias de camelo bem como sua síntese através de processo em fase sólida, apresentando atividade agonista opioide.

Dentre os projetos mais promissores para a indústria farmacêutica destacam-se os que focam no tratamento para câncer, dor e hipertensão (Arrowsmith, 2012).

Os analgésicos opioides atuam nos receptores opioides (mu, kappa e delta), receptores acoplados a proteínas G, localizados principalmente no sistema nervoso central e são considerados a ciasse de drogas mais potente para o tratamento da dor aguda e crónica (Stein et aL, 2003; Stein & Lang, 2009). Eles podem ser prescritos no tratamento de patologias corno o câncer, o sida, a diarreia crónica e para pacientes que fazem desintoxicação de heroína (ibegbu et ai., 201 1 ).

Os estudos sobre peptídeos opioides endógenos possibilitou o conhecimento sobre as estruturas de aminoácidos específicos que interagem com receptores opioides. As encefa!inas, morficeptinas e endomorfina - 2 são peptídeos que contém as seguintes sequências: YGGFL (Leu-encefalina) ou YGGFM (Met-encefalina), YPFP e YPFF respectivamente. Esses opioides estão presentes nos mamíferos, localizadas no SNC, assim como as endorfinas, dinofirnas, endormorfina-1 e beta casomorfina bovina (Janecka et ai., 2010).

Atuaímente, a morfina é o principal alcalóide isolado da papoula (Papaver somniferum), e é utilizada como droga no tratamento da dor por causa das propriedades analgésicas que apresenta (Law & Loh, 2004).

Devido aos principais efeitos indesejáveis que a morfina pode provocar tais como a diminuição da motilidade gastrointestinal, a depressão respiratória e a tolerância, existe o interesse no estudo de novos compostos opioides que possam interagir com alvos específicos, produzindo poucos efeitos indesejáveis, baixo risco de tolerância e com potência elevada (Goldberg, 2010; Gorzo et al., 2010).

Os receptores opioides estão envolvidos na modulação de diversos mecanismos fisiológicos, que incluem: antinocicepção, o humor, a regulação do sistema endócrino e as funções cognitivas. Esses receptores estão distribuídos no sistema nervoso central (SNC) e no trato gastro intestinal humano. Alguns neuropeptídeos (peptídeos opioides endógenos que atuam no SNC) como a beta endorfina estão presentes no sistema límbico, o qual atua no controle da ansiedade e da depressão. (Barfield, et al. 2013; Holzer, 2009; Vieira & Zarate Jr. 201 1 ).

Além do sistema límbico, alguns peptídeos opioides modulam os processos de neurotransmissão nas vias serotoninérgicos, dopaminérgicos, noradrenérgicos, que regulam fisiopatoiogias de desordens depressivas. (Fichna, et a!, 2007), Dentre esses, a neurotransmissão de serototina participa da regulação do stress, humor e controle do apetite. A síntese de serotonina depende da concentração de seu aminoácido precursor que é o triptofano obtido por meio da ingestão de proteínas. A elevação dos níveis de serotonina promove melhora no humor e diminui a vontade de comer. (Peuhkuri et aí, 201 1 ).

Essas vias neurotransmissoras são consideradas alvos terapêuticos promissores para o tratamento de desordens associadas ao humor e os peptídeos opióides apresentam o potencial de agente terapêutico para o desenvolvimento de novos fármacos antidepressivos. (Fichna, et al. 2007).

A maioria dos peptídeos que são biologicamente ativos, ou seja, bioativos, estão encriptados em proteínas de origem animai ou vegetal. Uma das formas de obter peptídeos bioativos é por meio da ingestão de alimentos que contenham proteínas precursoras e que sofram proteólise de enzimas digestivas. As principais enzimas presentes no trato gastrointestinal que realizam proteólise são a pepsina no estômago e a tripsina e quimotripsina no intestino delgado sendo que outras enzimas também participam da clivagem proteica. (Hartmann & Meisei 2007; Korhonen, 2009).

Os alimentos de origem animai que contém peptídeos bioativos são: leites e seus derivados, carne e peixe. Os alimentos de origem vegetal são: soja, trigo entre outros. Um dos alimentos que ganha destaque nesse aspecto, por produzir peptídeos com múltiplas atividades, é o leite. A hidrólise de proteínas do leite por enzimas digestivas libera peptídeos bioativos os quais apresentam atividade opióide, hipotensora, antibacteriana entre outras. Esses peptídeos são oriundos principalmente das proteínas caseínas (α β k), a lactoalbumina, β íactogiobuíina e gíicomacropeptideo (GMP). (Hartmann & Meisei 2007; Korhonen, 2009; Meisei, 2005).

Os peptídeos bioativos além de contribuírem para o valor nutricional do alimento, também exercem seu efeito fisiológico. De forma resumida, após a ingestão de proteínas do leite, ocorrerá absorção no trato gastro intestinal, onde enzimas promoverão a hidrólise de proteínas precursoras, liberando os peptídeos com atividade biológica. No caso dos peptídeos opióides, eles são absorvidos na corrente sanguínea e muitos podem atravessar a barreira hematoencefálica e provocar respostas farmacológicas semelhantes à morfina. As principais respostas são relacionadas ao bloqueio do estimulo da dor, a antinocicepção, efeitos no controle do humor e controle da saciedade (Peuhkuri et ai, 201 1 ; Wada & Lonnerdaia, 2014).

Diversos estudos mostram que dentre os macronutrientes utilizados como fonte de energia e presentes nos alimentos, as proteínas promovem maior saciedade quando comparadas aos carboidratos e gorduras. (Van Kleeff , et al., 2012).

Os mecanismos atribuídos à sensação de saciedade de proteínas e peptídeos incluem: 1- a secreção de hormônios intestinais, anorexígenos que favorecem a diminuição de ingestão alimentar, como CCK (colecistoquinina) e GLP-1 (peptídeo semelhante ao gíucagon) ou diminuem a secreção de hormônios intestinais orexigenos, que aumentam a ingestão alimentar, como a greiina. 2- o aumento de energia para digerir proteínas quando comparado com carboidratos e gorduras 3~ a alta concentração de aminoácidos no plasma 4~ peptídeos que são semelhantes aos neuropeptídeos e neurotransmissores que induzem saciedade via mecanismo centrai. (Foltz et al., 2008; Nishi et ai 2003; Duraffourd, et al., 2012).

Neste contexto, a presente invenção apresenta novas alternativas de peptídeos de sequências inéditas com atividade opióide e que possuem a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica apresentando tempo de ação prolongada em relação à morfina. A referida barreira é rica em enzimas e separa o cérebro da circulação sistémica impedindo a ação de drogas no sistema nervoso central.

Além disso, os peptídeos da presente invenção podem apresentar dupla atividade, ou seja, atividade opióide para alivio da dor, por meio do bloqueio da antinocicepção como também favorecer a hipotensão, devido a inibição da enzima conversora de angiotensina (ECA). Esse duplo efeito é interessante para o controle da dor crónica em pacientes hipertensos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação (interação) com receptores opióides similar à naloxona sendo representado pela fórmula:

TyrProPhe-X1 -TrpGlyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

A invenção se refere, ainda, a uma composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um peptídeo opioide definido na invenção com atividade de ligação similar à naloxona ou seu sal e peio menos um carreador farmaceuficamente aceitável.

A invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo peio menos um excipiente farmaceuticamente aceitável e um agente promotor de formação de pelo menos um peptídeo definido na invenção.

A invenção se refere, ainda, a uma composição alimentícia compreendendo pelo menos uma substância de grau alimentício e pelo menos um peptídeo definido na invenção.

A invenção também se refere a uma composição alimentícia compreendendo, peio menos, uma substância de grau alimentício e um agente promotor de formação de pelo menos um peptídeo definido na invenção.

A invenção se refere, ainda, a uma composição nutracêutica compreendendo pelo menos uma substância de grau alimentício e peio menos um peptídeo definido na invenção.

A invenção também se refere a uma composição nutracêutica compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um agente promotor de formação de pelo menos um peptídeo definido na invenção.

A invenção se refere, ainda, ao uso da composição farmacêutica definida na mesma para o provimento de analgesia em um indivíduo. A invenção também se refere ao uso da composição farmacêutica definida na mesma para o provimento de sensação de saciedade em um indivíduo. A invenção se refere, ainda, ao uso da composição farmacêutica definida na mesma para prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo.

A invenção também se refere ao uso da composição alimentícia definida na mesma para o provimento de sensação de saciedade em um indivíduo. A invenção se refere, ainda, ao uso da composição alimentícia definida na mesma para prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo.

A invenção também se refere ao uso da composição nutracêutica definida na mesma para o provimento de sensação de saciedade em um indivíduo.

A invenção se refere, ainda, ao uso da composição nutracêutica definida na mesma para prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo.

A invenção também se refere a um método de ativação do receptor opioide compreendendo a administração, a um indivíduo, de uma quantidade efetiva de pelo menos um peptídeo definido na invenção.

A invenção se refere, ainda, a um método de ativação do receptor opioide compreendendo a administração, a um indivíduo, da uma composição farmacêutica definida na invenção.

A invenção também se refere a um método de ativação do receptor opioide compreendendo a administração, a um indivíduo, da composição alimentícia definida na invenção.

A invenção se refere, ainda, a um método de ativação do receptor opioide compreendendo a administração, a um indivíduo, da composição nutracêutica definida na invenção.

A invenção também se refere a um método de prover analgesia compreendendo a administração, a um indivíduo, de uma quantidade efetiva de pelo menos um peptídeo definido na invenção.

A invenção se refere, ainda, a um método de prover analgesia compreendendo a administração, a um indivíduo, da composição farmacêutica definida na invenção. A invenção se refere, ainda, a um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo a administração, a um indivíduo, de uma quantidade efetiva de pelo menos um peptídeo definido na invenção.

A invenção também se refere a um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo a administração, a um indivíduo, da composição farmacêutica definida na invenção.

A invenção se refere, ainda, a um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo a administração, a um indivíduo, da composição alimentícia definida na invenção.

A invenção se refere, ainda, a um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo a administração, a um indivíduo, da composição nutracêutica definida na invenção.

A invenção também se refere um método de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo compreendendo a administração, a um indivíduo, da composição farmacêutica definida na invenção,

A invenção também se refere a um método de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo compreendendo a administração, a um indivíduo, da composição alimentícia definida na invenção.

A invenção se refere, ainda, a um método de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo compreendendo a administração, a um indivíduo, da composição nutracêutica definida na invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - índice de antinocicepção, no teste de retirada da cauda, representado com símbolos (*, **, #) referente a atividade estatisticamente significativa (S) e ou quando não ocorre diferenças significativas (NS) do SEQ ID NO: 1 quando comparado com a salina, morfina e Leu~encefalina. Em ( ^* ) início da atividade do SEQ ID NO: 1 P < 0.001 (S). ( ^** )SEG ID NO: 1 x Morfina com P > 0.05 (NS). (#) leu- encefalina x SEQ ID NO: 1 P > 0.05 (NS).

Figura 2 - índice de antinocicepção, no teste de retirada da cauda, referente ao SEQ ID NO: 2 quando comparado com a salina, morfina e Leu- encefalina. Em ( ^* ) início da atividade do SEQ ID NO: 2 , P < 0.001 (S). ( ^** )SEQ ID NO: 2 x Morfina com P > 0.005 (NS). (#) leu- encefaiina x SEQ ID NG: 2, P > 0.05 ( NS).

Figura 3 - índice de antinocicepção, na placa quente, referente ao SEQ ID NO: 1 quando comparado com a salina, morfina e Leu-encefaiina. Em ( ^* ) início da atividade do , P < 0.01 (S). ( ^** )SEQ ID NO: 1 x Morfina com P > 0.05 (NS). (#) leu- encefalina x SEQ ID NO: 1 , P > 0.05 ( NS). (##)SEQ ID NO: 1 x SEQ ID NO: 1 + naloxona P > 0.05 (NS).

Figura 4 - índice de antinocicepção, na placa quente, referente ao SEQ ID NO:2 quando comparado com a salina, morfina e Leu-encefalina. Em ( ^* ) início da atividade do SEQ ID NO:2 P < 0.001 (S). ( ^** )SEQ ID NO:2 x Morfina com P > 0.005 (NS). (#) leu- encefalina x SEQ ID NQ:2, P > 0.05 (NS). (##)SEQ ID NO:2 x SEQ ID NO:2 + naloxona P > 0.05 (NS).

Figura 5 - Ã. Determinação da área a baixo da curva, no teste de retirada da cauda, para o SEQ ID NO: 1 ; B. Determinação da área a baixo da curva, no teste de retirada da cauda, para o SEQ ID NO:2

Figura 6 - A. Determinação da área a baixo da curva, no teste da placa quente, para o SEQ ID NO: 1 ; B. Determinação da área a baixo da curva, no teste da placa quente, para o SEQ ID NO:2

Figura 7. Representação dos fragmentos obtidos nos diferentes tempos de incubação com a enzima tripsina. Análise realizada por espectrometria de massa , MALDI. O primeiro espectro, indicado pela letra A, é referente ao tempo de 15 minutos; o segundo espectro marcado peia letra B, indica o tempo de 30 minutos; o C o tempo de 1 hora; o D o tempo de 2 horas; o E o tempo de 4 horas e por último o F é o peptídeo (SEQ ID NQ:2) controle. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O termo "paciente" utilizado nesta invenção inclui humanos e também outros mamíferos tais como animais de criação intensiva e extensiva, animais de zoológico, animais de companhia tais como gato, cachorro e cavalo.

O termo "carreador farmaceuticamente aceitável" utilizado na presente invenção se refere a um diluente ou adjuvante ou excipiente ou veículo com o qual ou no qual o composto ativo é administrado. O termo "quantidade terapeuticamente efetiva" utilizado na invenção se refere à quantidade de composto ativo que, quando administrado a um paciente para prevenir ou tratar uma condição (tal como dor, sensação de fome, etc) é suficiente para efetivar tal tratamento. A quantidade terapeuticamente efetiva varia de acordo com o composto ativo, a condição do paciente, a severidade da condição, a idade, peso e outras características do paciente,

O termo "nutracêutico" utilizado na invenção se refere a um alimento ou parte de um alimento que proporciona benefícios médicos e de saúde, que incluem prevenção e/ou tratamento de uma condição.

A presente invenção se refere a um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naioxona sendo representado peia sequência: TyrProPhe~X1 ~TrpGiyGly~X2~ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, a presente invenção se refere a peptídeos ou seus sais com atividade de ligação similar à naioxona e com sequências representadas por SEQ ID NO: 1 e SEQ !D NO:2.

A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo, peio menos, um peptídeo opioide ou seu sai com atividade de ligação similar à naioxona e, pelo menos, um carreador farmaceuticamente aceitável. O referido peptídeo da composição farmacêutica é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGíy-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição farmacêutica da presente invenção são representados por SEQ ID NO:1 e/ou SEQ !D NO:2.

Na composição farmacêutica da invenção a concentração de peptídeo ou seu sai com atividade de ligação similar à naioxona varia, preferencialmente, de 0,001 % (p/p) a 99,999% (p/p). Em uma concretização alternativa da composição farmacêutica da invenção, a referida composição compreende, adicionalmente, um composto analgésico. Preferencialmente, o referido composto analgésico é morfina. Diversas são as formas farmacêuticas que a composição farmacêutica da presente invenção pode assumir. Entre estas podem ser citadas: comprimido, cápsula, elixir, solução, suspensão, emulsão, loção, creme, pomada, granulado, pó ou pó iiofilizado.

A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um carreador farmaceuticamente aceitável e um agente promotor de formação de, peio menos, um peptídeo com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe~X1 ~TrpGiyGly~X2~ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, o peptídeos da composição farmacêutica da presente invenção são representados por SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2.

Em uma concretização preferenciai da referida composição farmacêutica, o agente promotor é um microrganismo geneticamente modificado.

Diversas são as formas farmacêuticas nas quais as composições farmacêuticas da presente invenção podem se apresentar. Entre essas formas pode-se citar o comprimido, cápsula, elixir, solução, suspensão, loção, creme, pomada, granulado, pó ou pó Iiofilizado.

A presente invenção se refere, ainda, a uma composição alimentícia compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyG!y-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição alimentícia da presente invenção são representados por SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2. Na composição alimentícia da presente invenção, a concentração de peptídeo ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona varia, preferencialmente, de 0,001 % (p/p) a 99,999% (p/p).

A presente invenção também se refere a uma composição alimentícia compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um agente promotor de formação de, peio menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGíyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição alimentícia da presente invenção são representados por SEQ !D NO:1 e/ou SEQ !D NO:2. Em uma concretização preferencial da referida composição alimentícia da invenção, o agente promotor de formação de peptídeo é um microrganismo geneticamente modificado.

A presente invenção se refere, ainda, a uma composição nufracêutica compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGíyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição nufracêutica da presente invenção são representados por SEQ ID NG:1 e/ou SEQ ID NO:2.

Na composição nufracêutica da presente invenção, a concentração de peptídeo ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona varia, preferencialmente, de 0,001 % (p/p) a 99,999% (p/p).

A presente invenção também se refere a uma composição nufracêutica compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um agente promotor de formação de, peio menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naioxona. O referido peptídeo é representado peia sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGlyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição nutracêutica da presente invenção são representados por SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2. Em uma concretização preferencial da referida composição nutracêutica da invenção, o agente promotor de formação de peptídeo é um microrganismo geneticamente modificado.

A presente invenção se refere, ainda, ao uso de peptídeo definido na invenção com o intuito de prover analgesia em um indivíduo. O referido peptídeo é um peptídeo opioide ou seu sai com atividade de ligação similar à naioxona sendo representado peia sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, a invenção se refere ao uso de pelo menos um peptídeo selecionado dentre aqueles com sequência representada por SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2 com o intuito de prover analgesia em um indivíduo.

A presente invenção se refere, ainda, ao uso de peptídeo definido na invenção com o intuito de prover a sensação de saciedade em um indivíduo, O referido peptídeo é um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naioxona sendo representado peia sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGíy-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, a invenção se refere ao uso de pelo menos um peptídeo selecionado dentre aqueles com sequência representada por SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2 com o intuito de prover a sensação de saciedade em um indivíduo. A presente invenção se refere, ainda, ao uso de peptídeo definido na invenção com o intuito de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo. O referido peptídeo é um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naioxona sendo representado peia sequência: TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, a invenção se refere ao uso de pelo menos um peptídeo selecionado dentre aqueles com sequência representada por SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2 com o intuito de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo.

A invenção também se refere ao uso das composições farmacêuticas descritas na invenção para prover analgesia em um indivíduo. A referida analgesia se dá via receptor opioide.

A invenção se refere, ainda, ao uso das composições farmacêuticas descritas na invenção para prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo.

A invenção se refere, ainda, ao uso das composições farmacêuticas descritas na invenção para prover a sensação de saciedade em um individuo. A referida sensação de saciedade se dá via receptor opioide.

A invenção também se refere ao uso das composições alimentícias descritas na invenção para prover a sensação de saciedade em um indivíduo. A referida sensação de saciedade se dá via receptor opioide.

A invenção se refere, ainda, ao uso das composições alimentícias descritas na invenção para prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo. A invenção também se refere ao uso das composições nutracêuticas descritas na invenção para prover a sensação de saciedade em um indivíduo. A referida sensação de saciedade se dá via receptor opioide. A invenção se refere, ainda, ao uso das composições nutracêuticas descritas na invenção para prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo. Outro objeto da invenção é um método de ativação do receptor opioide compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma quantidade efetiva de peio menos um peptídeo opioide ou seu sai com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGiy-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos administrados são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2.

A referida administração do peptídeo opioide da invenção pode ocorrer através de aplicação externa, enteral ou parenteral.

Também objeto da invenção é um método de ativação do receptor opioide compreendendo, tal método, a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica compreendendo, peio menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona e, pelo menos, um carreador farmaceuticamente aceitável. O referido peptídeo da composição farmacêutica é representado peia sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição farmacêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NG:2.

A referida administração da composição farmacêutica da invenção pode ser efetivada através de aplicação externa, enteral ou parenteral

Outro objeto da invenção é um método de ativação do receptor opioide compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um carreador farmaceuticamente aceitável e um agente promotor de formação de, pelo menos, um peptídeo com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val. Preferencialmente, os peptídeos da composição farmacêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2. Também preferencialmente, o agente promotor da composição farmacêutica é um microrganismo geneticamente modificado.

A referida administração da composição farmacêutica da invenção pode ser efetivada através de aplicação externa, enteral ou parenteral

Também objeto da invenção é um método de ativação do receptor opioide compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma composição alimentícia compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naioxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe~X1 ~TrpGiyGly~X2~ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val,

Preferencialmente, os peptídeos da composição alimentícia são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NQ:2.

Também objeto da invenção é um método de ativação do receptor opioide compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma composição alimentícia compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um agente promotor de formação de, pelo menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naioxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos são representados por SEQ !D NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2. Em uma concretização preferencial, o agente promotor de formação de peptídeo é um microrganismo geneticamente modificado.

Outro objeto da invenção é um método de ativação do receptor opioide compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma composição nutracêutica compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGlyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição nutracêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ !D NO:2.

Também objeto da invenção é um método de ativação do receptor opioide compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma composição nutracêutica compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um agente promotor de formação de, peio menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGlyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2. Em uma concretização preferencial, o agente promotor de formação de peptídeo é um microrganismo geneticamente modificado.

Outro objeto da invenção é um método de prover analgesia compreendendo tal método a administração, a um individuo, de uma quantidade efetiva de peio menos um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGíy-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos administrados são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2.

A referida administração do peptídeo opioide da invenção pode ser efetivada através de aplicação externa, enteral ou parenteral

Também objeto da invenção é um método de prover analgesia compreendendo, tal método, a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica compreendendo, peio menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naioxona e, pelo menos, um carreador farmaceuticamente aceitável. O referido peptídeo da composição farmacêutica é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição farmacêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID:2.

A referida administração da composição farmacêutica da invenção pode ser efetivada através de aplicação externa, enferal ou parenteral

Outro objeto da presente invenção é um método de prover analgesia compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um carreador farmaceuticamente aceitável e um agente promotor de formação de, pelo menos, um peptídeo com atividade de ligação similar à naioxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, o peptídeos da composição farmacêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2. Também preferencialmente, o agente promotor da composição farmacêutica é um microrganismo geneticamente modificado.

A referida administração da composição farmacêutica da invenção pode ser efetivada através de aplicação externa, enteral ou parenteral

Também objeto da presente invenção é um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma quantidade efetiva de pelo menos um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naioxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde: X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos administrados são representados por SEQ !D NO: 1 e/ou SEQ !D NO:2.

Outro objeto da invenção é um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo, tal método, a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica compreendendo, peio menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona e, pelo menos, um carreador farmaceuticamente aceitável, O referido peptídeo da composição farmacêutica é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGlyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição farmacêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2.

Também objeto da invenção é um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo, tal método, a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica compreendendo, peio menos, um carreador farmaceuticamente aceitável e um agente promotor de formação de, pelo menos, um peptídeo com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGíyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, o peptídeos da composição farmacêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2. Também preferencialmente, o agente promotor da composição farmacêutica é um microrganismo geneticamente modificado.

Outro objeto da invenção é um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo, tal método, a administração, a um indivíduo, de uma composição alimentícia compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGlyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição alimentícia são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ !D NO:2.

Também objeto da invenção é um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma composição alimentícia compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um agente promotor de formação de, pelo menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2. Em uma concretização preferencial, o agente promotor de formação de peptídeo é um microrganismo geneticamente modificado.

Outro objeto da invenção é um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma composição nutracêutica compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGíy-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição nutracêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2.

Também objeto da invenção é um método de prover saciedade a um indivíduo compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma composição nutracêutica compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um agente promotor de formação de, pelo menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2. Em uma concretização preferencial, o agente promotor de formação de peptídeo é um microrganismo geneticamente modificado.

Também objeto da presente invenção é um método de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo compreendendo tal método a administração, a um indivíduo, de uma quantidade efetiva de pelo menos um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gíy ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos administrados são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2.

Outro objeto da invenção é um método de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo compreendendo, tal método, a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica compreendendo, peio menos, um peptídeo opioide ou seu sai com atividade de ligação similar à naloxona e, pelo menos, um carreador farmaceuticamente aceitável. O referido peptídeo da composição farmacêutica é representado pela sequência:

TyrProPhe~X1 ~TrpGiyGly~X2~ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição farmacêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2.

Também objeto da invenção é um método de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo compreendendo, tal método, a administração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um carreador farmaceuticamente aceitável e um agente promotor de formação de, pelo menos, um peptídeo com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, o peptídeos da composição farmacêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2. Também preferencialmente, o agente promotor da composição farmacêutica é um microrganismo geneticamente modificado.

Outro objeto da invenção é um método de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo compreendendo, tal método, a administração, a um indivíduo, de uma composição alimentícia compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado peia sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição alimentícia são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2.

Também objeto da invenção é um método de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo compreendendo, tal método, a administração, a um indivíduo, de uma composição alimentícia compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um agente promotor de formação de, pelo menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado peia sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys; X2 é representado por He ou Val,

Preferencialmente, os peptídeos são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2. Em uma concretização preferencial, o agente promotor de formação de peptídeo é um microrganismo geneticamente modificado.

Outro objeto da invenção é um método de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo compreendendo, ta! método, a administração, a um individuo, de uma composição nutracêutica compreendendo, pelo menos, uma substância de grau alimentício e um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGíy-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por He ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos da composição nutracêutica são representados por SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2.

Também objeto da invenção é um método de prover a diminuição da pressão arterial em um indivíduo compreendendo, tal método, a administração, a um indivíduo, de uma composição nutracêutica compreendendo, peio menos, uma substância de grau alimentício e um agente promotor de formação de, peio menos, um peptídeo opioide ou seu sal com atividade de ligação similar à naloxona. O referido peptídeo é representado pela sequência:

TyrProPhe-X1 -TrpGiyGly-X2-ProPro onde:

X1 é representado por Gly ou Lys;

X2 é representado por lie ou Val.

Preferencialmente, os peptídeos são representados por SEQ !D NO: 1 e/ou SEQ ID NO:2. Em uma concretização preferencial, o agente promotor de formação de peptídeo é um microrganismo geneticamente modificado.

Experimentos realizados e resultados obtidos:

Síntese de peptídeos: A síntese dos peptídeos da presente invenção foi conduzida utilizando-se a estratégia Fmoc/t-butiia (9- fluoreniimetoxicarbonila) de síntese manual em suporte sólido (Chan & White, 2000) seguida de purificação por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizando uma coluna semipreparativa de fase reversa C18 (Vydac).

Análises in vivo: Foram realizados testes em camundongos da espécie Mus musculus da linhagem/raça Swiss, nos quais foram empregados testes de nocicepção (Placa quente e teste de retirada da cauda) de acordo com Le Bars e colaboradores (2001 ). As injeções foram aplicadas via intraperitonea! (i.p.). As doses utilizadas foram baseadas na dose e moiaridade da morfina (10 mg/kg de animal). Como controle positivo foi utilizado além da morfina, a Leu-encefalina (19,3 mg/kg de animal). Como controle negativo foi utilizada solução salina de cloreto de sódio e, para suspender o efeito antinocicepfivo da Leu-encefalina e do peptídeo, foram injetadas doses seriadas (a cada hora) de Naioxona (4 mg/kg de animai).

Digestão do precursor com pepsina imobilizada: o peptídeo de sequência SEQ ID NO:2 foi digerido utilizando pepsina imobilizada por um período de 4 horas à 37°C sob agitação de 1400 RPM avaliando o índice de fragmentação nos tempos de 15 minutos, 30 minutos, 2 horas e 4 horas.

As Figuras 1 ,2,3 e 4 representam os dados brutos obtidos dos experimentos após análise estatística. Os símbolos ( ^* , ^** , #) indicam o início da atividade estatisticamente significativa (S) ou as diferenças estatisticamente não significativas (NS). As análises da atividade opióide foram realizadas em dois modelos clássicos de estudos para esta atividade: Tail Fiick ou teste de retirada da cauda e o Hot Plate ou teste da placa quente.

Com a realização da análise estatística, foi possível determinar em qual tempo (após a aplicação) o peptídeo começou apresentar uma atividade antinociceptiva estatisticamente significativa e compará-la com os outros grupos, nos testes de retirada da cauda e placa quente.

No teste de retirada da cauda, mostrado na Figura 1 , o peptídeo SEQ ID NO: 1 iniciou sua ação estatisticamente significativa a partir de 90 min. ( ^* ) até 240 min. com P < 0.001 , em relação à solução salina, grupo controle negativo. Comparando com a morfina, controle positivo, o SEQ ID NO: 1 não exibiu diferença significativa a partir dos 90 min. ( ^** ) com valores de P > 0.05. Já com a Leu-encefalina, controle positivo peptídico, não houve diferença significativa durante todo o ensaio, ou seja, o SEQ ID NO: 1 apresentou um perfil de atividade similar ao da Leu- encefaiina (#) com P > 0.05.

Com exceção do tempo de 30 min., houve diferenças significativas entre o SEQ ID NO: 1 e o SEQ ID NO: 1 + naioxona durante as 4 horas de análise, com valores de P < 0, 001 .

Como era esperado, não ocorreram diferenças significativas no perfil de atividade entre os seguintes grupos: salina, naioxona, SEQ ID NO: 1 + naioxona e Leu-encefalina + naioxona.

Analisando os resultados para o peptídeo de SEQ ID NO: 2 (Figura 2), sua atividade foi iniciada a partir de 90 min. quando comparado com a salina ( ^* ) P < 0.001 e perdurou até o final do ensaio com exceção no tempo de 150 min. o qual não foi encontrado diferença significativa com a salina P < 0.05. Em relação à morfina, a partir do tempo de 120 min. não houve diferenças significativas (P > 0.005) com o SEQ ID NO: 2 até terminar o ensaio aos 240 min. Quando comparado com a Leu-encefalina, a partir do tempo de 60 min. o SEQ ID NO: 2 não apresentou diferenças significativas (#) com P > 0.05.

Nos outros tempos (anterior aos 60 min.) a diferença foi estatisticamente significativa com P <0.01 ). A partir dos 60 min. houve diferença significativa no perfil de atividade entre o SEQ ID NO: 2 quando comparado com o SEQ ID NO: 2 + naioxona com P < 0.001 e foi mantido até 240 min.

Não ocorreram diferenças significativas no perfil de atividade entre os seguintes grupos: salina, naioxona, SEQ !D NO: 2 + naioxona e Leu encefaiina + naioxona.

No teste do Hot Plate ou teste da placa quente mostrado na Figura 3, o SEQ ID NO: 1 , inicou sua atividade aos 60 min., pois apresentou diferenças estatisticamente significativas em relação a salina com P < 0.01 ( ^* ). Vale ressaltar que no tempo de 120 min. não ocorreu diferença significativa, P > 0.05.

Comparando o perfil de atividade do SEQ D NO: 1 com a morfina, no tempo de 30 min., houve diferença significativa com P < 0.001 . A partir dos 60 min. não ocorreram diferenças estatisticamente significativas permanecendo até os 240 min.( ^** ) com P > 0.05. Também não existiram diferenças estatisticamente significativas entre o SEQ D NO: 1 e a Leu- encefalina (#) com o valor de P > 0,05 sendo este valor constante ao longo do teste. Nos ensaios com o SEQ D NO: 1 + naloxona quando comparado com o SEQ D NO: 1 , não houve diferenças significativas apenas nos tempos de 210 min. e 240 min. (##) P > 0.05 que são os tempos no qual o peptídeo voltou a atuar, após interrupção da administração da naloxona. Na interrupção da administração da naloxona, no grupo naloxona + Leu encefalina, pode-se observar que atividade da Leu encfalina também foi retomada.

Não ocorreram diferenças significativas no perfil de atividade entre os seguintes grupos (o que era esperado): salina, naloxona, SEQ D NO: 1 + naloxona e Leu encefalina + naloxona

Desde o inicio do ensaio, o peptídeo SEQ !D NO:2 (Figura 4) começou a atuar. Houve diferenças estatisticamente significativas, em relação à salina ( ^* ) com P < 0.001 o qual perdurou ao longo do teste. O SEQ !D NO:2 quando comparado com a morfina ( ^** ) e a Leu - encefalina (#), não apresentou diferenças estatisticamente significativas, com P > 0.05 durante a realização de todo o ensaio.

Nos tempos de 180 min. até 240 min. não houve diferenças estatisticamente significativas entre o SEQ ID NO:2 + naloxona e o SEQ ID NO:2, (##) com P > 0.05. Os outros tempos exibiram diferenças significativas com P < 0.001 .

Não ocorreram diferenças significativas no perfil de atividade entre os seguintes grupos: salina, naloxona, SEQ ID NO:2 + naloxona e Leu encefalina + naloxona. Além da análise de variância, também foi realizada a determinação da área abaixo da curva, para cada grupo experimental e controles positivos (morfina e encefalina). Essa análise visou obter valores para o efeito acumulado adquirido durante o ensaio, A Figura 5 A mostra que o SEQ !D NO: 1 , no teste de retirada da cauda, apresentou um efeito acumulado ao longo do tempo superior à morfina e semelhante à Leu- encefalina, o qual não apresentou diferenças estatísticas significativas ao longo do ensaio com P > 0.05 (NS).

Em relação à área abaixo da curva pode-se notar que o SEQ ID NO:2 no teste de retirada da cauda, apresentou efeito acumulado inferior a morfina e a Leu- encefalina (Figura 5 B).

A área abaixo da curva na placa quente, demonstra que o SEQ ID NO: 1 (Figura 6 A) exibiu um efeito acumulado superior à morfina e semelhante à Leu-encefaiina, porque não houve diferença significativa (SEQ ID NO: 1 X Leu-encefalina) com valor de P > 0,05 (NS) durante todo o ensaio.

O efeito acumulado do SEQ ID NQ:2 no teste da placa quente (Figura 6 B) também apresentou índices de área abaixo da curva maior que a morfina e semelhante à Leu~encefaiina (P> 0.05).

A digestão do íon precursor referente ao SEQ ID NO:2, (Figura 7) mostra que ao longo da incubação com a enzima tripsina, (enzima presente no trato gastro intestinal) o pico majoritário, do SEQ ID NO:2 vai reduzindo sua intensidade. Por meio desse experimento foi possível tentar observar in vitro a digestão do peptídeo.